大鼠肝脏组织总RNA提取.doc

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1、大鼠肝脏组织总RNA提取实验前准备:1.试剂RNApreppureTissueKit(TIANGEN)，无水乙醇，巯基乙醇，DEPC2．试验用具的处理去RNase处理：1〉配制0.1%DEPC水（1000ml水加1mlDEPC，用转子于通风橱内搅拌至完全溶解）。2〉将需要用的枪头，枪头盒和EP管等浸泡入DEPC水中，过夜。将枪头装入枪头盒中，120C灭菌30min。60C烘干过夜。3〉DEPC水于120C灭菌30min。配制DNaseI工作液：取9ulDNaseI存储液放入新的RNase-Free的离心

2、管中，加入71ulRDD溶液，轻柔混匀。试验步骤1.准备碎冰以及液氮，将肝脏组织从-80C转移到液氮中。2.称取10-20mg肝脏组织（注意称取组织的部位尽量相同、不含其它结缔组织成分）与RNase-Free的2mlEP管中。3.加入300ul裂解液，匀浆器匀浆（中号探头，最高速度），其间间歇性地将EP管置于冰上以防止组织裂解液过热。4.匀浆后，将探头插入水中洗涤30s（开动状态下），转移到新的水中再次洗涤30s，然后与DEPC水中洗涤30s。进行下一个样品的匀浆。5.加入590ulRNase-Free

3、ddH2O和10ul蛋白酶K，混匀后56C处理15min。6.13000rpm离心3min，取800ul上清加入400ul无水乙醇（0.5倍体积），混匀。将混匀液转入吸附柱中（吸附柱放在收集管中），13000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。7.向吸附柱中央加入350ul去蛋白液，13000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。8.向吸附柱中央加入80ul的DNaseI工作液，室温放置15min。9.向吸附柱中央加入350ul去蛋白液，13000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱

4、放回收集管中。10.向吸附柱中央加入500ul漂洗液，室温放置2min。13000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。11.向吸附柱中央加入500ul漂洗液，室温放置2min。13000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。12.13000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底凉干吸附材料中残余的漂洗液。13.将吸附柱转入一个新的RNase-Free的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加70ulRNase-FreeddH2O，室温放置2min，13000r

5、pm离心2min，得到RNA溶液。浓度：终浓度（ng/ul）=（OD260）X（稀释倍数n）X40