生物大分子分离纯化技术

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1、第二章生物大分子分离纯化技术12.4.生物大分子的色谱分离纯化技术22.4.1高效毛细管电泳高效毛细管电泳(High-performanceCapillaryElectrophoresis,HPCE)是荷电粒子在直流高压的作用下，在毛细管中迁移，从而进行高效、快速分离的一种电泳新技术。其分离是基于带电离子在电场中的不同的电泳淌度。它的基本原理与常规凝胶电泳或自由电泳并无本质的差别。所以，HPCE可以看成是一种仪器化程度比较高的电泳方式。3由于毛细管具有良好的散热性能，从而可以在毛细管两端加上高达30000V的高压、分离可以在很短时间内完成

2、，分离效率非常高。这种方法所需样品体积只有L-nL级。所以，HPEC法的特点为：高效、快速、微量、易于实现自动化，而且溶剂消耗少、环境污染小等等。4仪器HPCE仪器的基本组成如图所示，它由毛细管，带电极的容器，高压直流电源，进样系统，检测器及数据采集和记录系统组成。比较先进的HPCE仪器还配有毛细管恒温设备，自动采样器，微制备组分收集器和基于计算机的自动化及数据评价系统。561．毛细管HPCE在毛细管中进行，管内径一般在25~100m之间，外径在100—400m之间．长度为0.1~1m。除了石英毛细管外，玻璃、聚四氟乙烯(PTPE)

3、及聚氟乙烯-丙烯毛细管也有使用。72．进样系统为了保证HPCE分离的高效性，进样系统应尽量把nL-pL级的样品以最短的样品区带引入到毛细管中。一般可采用电动法或流体力学法。83．高压直流电源高压电源需提供高达30kV的直流电压。检测器位于毛细管的接地端，电流在3~300A之间。电源应能以恒电压或恒电流(ITP)或恒功率的方式工作，其稳定件应达到设置值的0.1%。另外，电源的正负极应可以切换，以适应带不同电荷的样品的分离。94．检测HPEC这种方法的灵敏度及高效性都依赖于检测器的高灵敏度，实际已经采用的检测器类型有多种。10HPEC中的

4、主要检测技术检测原理最低检出浓度(mol/L)最低检出量适用范围紫外－可见吸收法10-6－10-410-15－10-13通用/特殊情况基于一般光源的荧光法10-8－10-510-18－10-13特殊情况基于激光的荧光法10-12－10-910-21－10-18特殊情况热光吸收法10-8－10-510-17－10-14通用/特殊情况折射率法10-7－10-510-16－10-14通用电导法10-8－10-610-19－10-17特殊情况安培法10-8－10-610-19－10-17特殊情况质谱法10-9－10-510-17－10-15通用放

5、射测定法10-9－10-710-19－10-17特殊情况11分离模式HPCE的操作模式有多种，如毛细管区带电泳(CapillaryZoneElectrophoresis,CZE)；毛细管等速电泳(CapillaryIsotachophoresis，CITP)，毛细管胶束电动色谱(CapillaryMicellarElectrokineticChromatography，CEKC)；毛细管凝胶电泳(CapillaryGelElectrophoresis，CGE)和毛细管等电聚焦法(CapillaryIsoelectricFocusing，C

6、IEF)等。12CZE是基于溶质在自由溶液中淌度差异的电泳分离方法，是目前应用最广泛的一种，如氨基酸、多肽及无机离子的分析，手性对映体分离，蛋白质纯度鉴定及构型研究等。13CGE主要在生物学上用于大分子的分离分析，如蛋白质和核酸。它是基于分子的尺寸，让样品在合适的起分子筛作用的聚合物网孔内进行电泳分离。CGE可用于DNA序列分析，蛋白质分析。14pBR332DNA的MSPI酶解片段混合物的CGE分离(峰(bP)：1，26；2，34；3,67；4,76；5,90；6,110；7,123；8、9,147,10,11，160；12，180；13

7、，190；14，201；15，2I7；16，238；17，242。缓冲液：TEB。进样：3s，30mW。TEB组成：89mmol/LTris,89mmol/L硼酸盐及2mmol/LEDTA)。200V/cm，毛细管有效长度：7cm，EB的浓度为1g/ml15标准蛋白质的分离162.4.2液相色谱法液相色谱是目前对生物大分子的分离纯化能力最强、效率最高、使用最广泛的手段之一。液相色谱大都在室温下操作，所用流动相可以用与生理液相近的缓冲水溶液。所用固定相的表面经过化学修饰和覆盖，为生物大分子的分离分析提供了温和的条件，有利于保持生物大分子的

8、构象和活性。17在生物大分子分离分析及纯化中最常用的色谱方法是空间排阻色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石(用于单链和双链DNA的纯化和鉴定)及液—液分配