DB32∕T 2260-2012 甘蓝品种纯度及真实性 SSR 分子检测方法.pdf

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1、ICS65.020.20B31备案号：37037-2013DB32江苏省地方标准DB32/T2260-2012甘蓝品种纯度及真实性SSR分子检测方法SSR-basedMethodtoAssayPurityandGenuinenessinCabbage(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)2012-12-28发布2013-02-28实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2260-2012前言本标准按照GB∕T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由江苏省农业科学院提

2、出。本标准由江苏省农业科学院负责起草。本标准主要起草人：曾爱松、严继勇、宋立晓、高兵。DB32/T2260-2012甘蓝品种纯度及真实性SSR分子检测方法1范围本标准依据SSR分子标记原理，规定了进行甘蓝杂交种和亲本自交系的品种纯度及真实性检测方法的仪器设备及试剂、引物筛选、试验步骤、纯度检测和真实性鉴定。本标准适用于甘蓝杂交种及亲本自交系的纯度及真实性检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1品种纯度varietalpurity品种在DNA分子标记带型方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表示。2.2品种真实性varietalgenuine

3、ness供检品种与标准品种在DNA分子标记带型方面的符合程度。2.3SSR分子标记simplesequencerepeatmarker由寡核苷酸为单位的简单串联重复序列。2.4引物primer结合在模板DNA上的互补短链，提供3＇-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。3原理在甘蓝基因组中普遍存在着由寡核苷酸为基本单位的简单串联重复序列，品种间因其重复次数不同而存在多态性，据此可以利用适宜引物进行PCR扩增，从而检测出特定SSR位点的多态性，以鉴别品种的纯度及真实性。4仪器设备及试剂4.1仪器设备PCR扩增仪；DNA序列分析电泳槽；高压电泳仪（3000V，400

4、mA，400W）；电子天平（感量0.01g，0.001g）；冰箱；微量加样器（0.5μL～10μL，20μL～200μL，100μL～1000μL）；磁力搅拌器；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计等。1DB32/T2260-2012烧杯；镊子；刻刀；量筒；容量瓶（500mL，1000mL）；离心管（0.5mL，1.5mL）；吸头(10μL，200μL，1000μL)；注射器（100mL）；96孔深孔板；96孔PCR板；封板膜；一次性手套；离心管架；染色盒（55cm×38cm×8cm）；水平仪；夹子等。4.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）

5、；盐酸（HCl，36%）；氢氧化钠(NaOH)；10倍PCR缓冲液（不含Mg2+），保存条件为-20℃；氯化镁（MgCl2）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs），保存条件为-20℃；TaqDNA聚合酶（5U/μL），保存条件为-20℃；SSR引物，保存条件为-20℃；矿物油；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；尿素；亲和硅烷（BindingSilane）；剥离硅烷（RepelSilane）；无水乙醇；四甲基乙二胺；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液等。4.3试剂制备DNA提试剂、PCR反应试剂、电泳试剂和银染试剂的成分及配制按附录A执行。5引物筛选适宜

6、引物筛选应遵守扩增后的杂交种SSR电泳谱带含有双亲谱带，而且带型清晰、重复性好的原则。可以利用已经公开发表的引物，也可以自行筛选引物。自行筛选时，取测试杂交种种子10粒及父母本种子各5粒，利用一系列引物进行分析，从中确定适宜的引物。常见适用于甘蓝品种的纯度及真实性分析的SSR引物名称及序列参见附录B。6方法步骤6.1DNA提取本研究采用CTAB法对材料提取DNA，具体步骤如下：6.1.11.5ml离心管中加入离心管盖大小的叶片2片。6.1.2离心管中加入50μlCTAB，轻轻研磨至浆状，再加入600ulCTAB。6.1.365℃水浴1h，每10min轻摇1次，以避DNA凝成团。6.

7、1.4置于4℃冰箱或室温下冷却至15℃以下。6.1.5加入650μl氯仿：异戊醇(24：1)，上下混匀5min。6.1.612000rpm离心10min。6.1.7吸取上清液450μl，加入预冷的无水乙醇650μl。6.1.84℃放置30min以上。6.1.912000rpm离心10min，弃上清，晾干。6.1.10加入100μl的TE或超纯H2O，每100μl加入0.5μl(2mg/ml)的RNAase，混匀。6.1.1137℃水浴1h。6.1.12琼脂糖凝胶电泳检