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1、基因工程的基本工具 和基本操作程序安福二中王宇清高频考点突破考点一基因工程的概念理解和理论基础1.基因工程的概念理解(1)操作环境：体外——关键步骤“表达载体的构建”的环境。(2)操作水平：分子水平。(3)原理:基因重组。(4)优点①与杂交育种相比：克服远缘杂交不亲和障碍。②与诱变育种相比：定向改造生物性状。(5)本质:甲(供体提供目的基因)乙(受体表达目的基因),即基因未变、合成蛋白质未变,只是合成场所的转移。2.基因工程的基本原理和理论基础概括如下图提醒若题目强调“目的基因”的表达过程,则只包括“转录和翻译”两个过程,不包括目的基因的复制。考点二基因工程的操作工具1.限制性核酸内切酶——
2、“分子手术刀”(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)化学本质：蛋白质。(3)作用(4)作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。(5)切割方式(6)切割部位：磷酸二酯键催化作用,所以可重复利用可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割错位切：产生两个相同的黏性末端平切：形成平末端提醒①切割的化学键为磷酸二酯键。②在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶,目的是产生相同的黏性末端。③将一个基因从DNA分子上切割下来,产生两个切口,同时形成四个粘性末端,切割载体产生一个切口，形成两个粘性末端。④不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同,同一个D
3、NA分子用不同的限制酶产生的黏性末端不相同。2.DNA连接酶——“分子缝合针”常用类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能连接黏性末端连接黏性末端或平末端结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键拓展提升DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶作用实质都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键是否需模板不需要需要连接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上,形成磷酸二酯键作用结果将两个DNA片段连接成重组DNA分子合成新的DNA分子3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(
4、1)类型提醒①质粒本质是DNA,不是细胞器;②特点:小型环状。(2)功能：将目的基因导入受体细胞。(3)应具备条件①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；②有一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源基因连接；③有特殊的遗传标记基因,供重组DNA的检测和鉴定。最常用载体:质粒其他载体:λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等提醒①一般来说,天然载体往往不能满足人类的所有要求,因此人们根据不同的目的和需要,对某些天然的载体进行人工改造。②常见的标记基因有抗生素基因、产生特定颜色的表达产物基因、发光基因等。③作为载体必须具有多个限制酶切点,而且每种酶的切点最好只有一个。因为某种限制酶只能识别单一切点,若载体上有
5、一个以上的酶切点,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有某种限制酶的一个切点,则酶切后既能把环打开接纳外源DNA片段,又不会丢失自己的片段。④注意与细胞膜上载体的区别,两者的化学本质和作用都不相同。⑤质粒能自我复制,既可在自身细胞、受体细胞也可在体外复制。考点三基因工程的基本操作程序1.基因工程图解:抗虫棉的培育过程二、基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取(1)目的基因：指编码蛋白质的。(2)获取目的基因的方法①从基因文库(基因组文库或cDNA文库)中获取a．基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多，导入的群体中储存，各
6、个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。结构基因受体菌DNA片段文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种之间的基因交流可以部分基因可以说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的盲目性b.基因文库的种类c．目的基因的获取依据：(ⅰ)基因的序列；(ⅱ)基因的功能；(ⅲ)基因在染色体上的位置；(ⅳ)基因的产物mRNA；(ⅴ)基因的翻译产物蛋白质。核苷酸转录②人工合成目的基因:常用的方法有化学合成法和反转录法。化学合成法:蛋白质氨基
7、酸序列RNA碱基序列DNA碱基序列用4种脱氧核苷酸人工合成目的基因反转录法:分离出供体细胞mRNA单链DNA合成目的基因分析推测推测逆转录酶DNA聚合酶③利用PCR技术扩增目的基因a．PCR的含义：是一项在生物体外特定DNA片段的核酸合成技术。b．目的：获取大量的目的基因c．原理：DNA复制d．前提条件：有一段已知目的基因的和根据该序列合成的e．过程：目的基因受热形成，与引物结合，在的作用下延伸形成DNA。f
