PCR实验室污染与对策.pdf

《PCR实验室污染与对策.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、PCR实验室的污染与对策河北医科大学第三医院冯忠军PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，该技术通过重复高温变性、低温退火、中温延伸等简单的3个温度循环，能将靶DNA扩增数百万倍，获得极高的检测敏感性。30次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget121cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon243cycle=8Amplicon384cycle=16Amplicon4165cycle=32Amplicon5326cycle=64Amplicon664201,048,57

2、67cycle=128Amplicon301,073,741,824Mullis在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。PCR发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛。PCR专利官司斗争不断也是基于其带来的巨大的效益。最令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的结果。如果形成气溶胶污染而扩散，则可引起整个PCR实验室的污染。处理方法：极其麻烦，甚至要关闭PCR实验室。难忘的1995年-------

3、被称之为PCR临床检验爆炸年？天下大乱！到天下大治！某实验室污染的经历某实验室曾经遭遇过气溶胶的污染，所幸的是经过一段时间的处理，最终将PCR实验室污染排除掉了。（一）实验室情况l实验室设置实验室分为试剂准备区、标本制备区、扩增区三个区，试剂存放在试剂准备区，标本是在标本制备区处理，处理完的标本置于扩增区上机扩增。l使用试剂试剂是由国内某公司提供的乙型肝炎病毒(HBV)荧光定量PCR试剂。证件齐全，符合国家要求。l操作人员经过卫生部临检中心组织的理论和操作培训并通过考试取得合格证。（二）污染的发现2004年8月12日，该实验室按正常的操作规程检测HBVDNA标本

4、，同时设立了阴性对照和阳性对照(均为试剂盒中配备)，扩增结束分析结果时，发现HBVDNA所有的标本及阴、阳性对照均为阳性，提示操作过程中出现污染，但具体是什么原因引起的污染还不清楚。（三）污染源的追踪出现污染后，工作人员首先考虑可能是试剂的污染，更换新批号的HBV试剂重新检测后，结果仍然为全部标本阳性。将HBV标本拿到其他正规的PCR实验室检测，结果标本中阴、阳性结果都有，阴性对照是阴性，阳性对照是阳性，说明标本没有被污染。将两种批号的HBV试剂拿到其他规范的PCR实验室检测，显示试剂没有问题。该实验室用消毒液擦拭工作台面后，打开所有的紫外灯照射一天，将所使用微

5、量进样器、离心管、枪头、手套、记号笔、记录本等都更换掉，再将HBV标本进行检测，结果全部标本仍然为阳性。第2天，仍然用消毒液擦拭工作台面后，再打开所有的紫外灯照射一天，将HBV标本重新检测，同时设置了两个阴性对照(A和B)。A对照：打开试剂反应管的盖子，在空气中暴露10min，盖上盖子，上机检测；B对照：试剂的反应管不开盖子，直接上机检测。结果：全部标本和A对照为阳性，而B对照为阴性。至此，虽然还查找不到污染源是什么，但有一点可以肯定，PCR实验室污染是气溶胶扩散而引起的。经过调查，发现污染是由于该实验室新来了一个清洁工人，没有经过培训就直接上岗，在打扫实验室卫

6、生时，用扩增区的扫笤和拖把打扫了标本制备区的卫生引起。（四）污染的排除在确定了污染的原因后，工作人员就开始着手排除污染，每天都打开整个PCR实验室的门窗和排气扇，让整个实验室通风，用消毒液擦拭整个PCR实验室，打开所有的紫外灯照射。每隔3天按上述步骤检测一次，一直这样处理了一个多月，A阴性对照才转为阴性。连续检测3次A和B阴性对照,每次结果都均为阴性,才确定PCR实验室恢复正常。（五）体会PCR强大扩增能力+检测的敏感性l经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍l极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题lPCR实验过程中，防止污染是

7、很重要的一个工作。应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，这是造成假阳性最大的可能。开始做PCR试验时，由于接受了“PCR极易污染”这样的培训后，当然一点都不会马虎，每次PCR都做阴性对照和阳性对照，持续相当长一段时间内都不会发生污染。孰能生巧之后……严谨之下的熟练？偷工减料，投机取巧？可能渐渐就对书上说的那一套不以为然了，心里说：我在阴性对照里面吐点口水，看你有没有阳性结果出来（不过，估计谁也没有真这么干过！呵呵）。再后来，有可能做PCR就不再设对照了。如果在后续工作中还没有出现什么问题，有的人便越发对污染看的淡了。通常我们对PCR实验室污染的预防是

8、采取不同操作分区进行、分