常用的分子生物学技术原理及应用(2009)课件.ppt

《常用的分子生物学技术原理及应用(2009)课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、2021/10/23SuzhouUniversity1常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication2021/10/23SuzhouUniversity2第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology2021/10/23SuzhouUniversity3定义：核酸分子杂交(nucleicacidybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单

2、链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理2021/10/23SuzhouUniversity4复性RNADNA2021/10/23SuzhouUniversity5（一）印渍技术Blotting首先由EdwenSouthern在1975年提出。Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质，并加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、

3、RNA和蛋白质的检测.2021/10/23SuzhouUniversity6（二）探针技术probe将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。2021/10/23SuzhouUniversity71、探针的制备方法探针长度一般以50~300bp为宜。制备方法：1）利用DNA重组技术2）PCR扩增3）化学合成2021/10/23SuzhouUniversity82、探针的分类：据制备方法及

4、核酸性质不同，可分为：（1）基因组DNA探针（2）cDNA探针（3）RNA探针（4）寡核苷酸探针2021/10/23SuzhouUniversity93、合成寡核苷酸探针注意原则：1）长度（10-50bp);2)G:C对含量40%-60%；3）探针内避免互补；4）避免同一碱基连续出现；5）与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。Home2021/10/23SuzhouUniversity104、核酸探针的标记为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号

5、。2021/10/23SuzhouUniversity11（1）标记的种类同位素：32P、35S、3H、125I等标记探针非同位素：生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。2021/10/23SuzhouUniversity122021/10/23SuzhouUniversity13（3）一个理想的标记物：1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同;2）特异性强、本底低、重复性好；3）操作简单、节时；4）安全、无环境污染。2021/10/23SuzhouUniver

6、sity14（4）探针的标记方法1）缺口平移法2）随机引物标记法3）末端标记法4）生物素光照标记法NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP2021/10/2315SuzhouUniversity随机引物标记探针5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-dNTP6bpprimerKlenow,dNTP变性-复姓2021/10/2316SuzhouUniversity2021/10/23SuzhouUniversity173、DNA末端标

7、记2021/10/23SuzhouUniversity18（三）印渍技术的类别及应用DNA印迹技术SouthernblottingRNA印迹技术Northernblotting蛋白质印迹技术Westernblotting斑点印迹Dotblotting原位杂交insituhybridizationDNA点阵DNAarrayDNA芯片技术DNAchip2021/10/23SuzhouUniversity191、DNA印迹技术Southernblotting（1）定义：又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究

8、DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。2021/10/23SuzhouUniversity202、基本方法将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片