核酸分子杂交技术课件.ppt

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1、核酸分子杂交技术nucleicacidhybridization医学分子生物学.第八章温州医学院检验医学院1主要内容第一节核酸杂交概述及基本原理第二节核酸探针技术第三节核酸分子杂交技术第四节基因芯片2核酸定性或定量检测基因克隆、突变及其表达研究疾病的临床诊断主要用途3第一节核酸杂交概述及基本原理一、核酸杂交概述二、核酸变性三、核酸复性四、核酸分子杂交41961年Hall等建立核酸杂交技术，探针与靶序列溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体；60年代中期Nygaard等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础；70年代末期到80年代早期，分

2、子克隆技术的出现，各种质粒和噬菌体DAN载体系统的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富。第一节核酸杂交概述及基本原理一、核酸杂交概述580年代中期，PCR技术的发明与核酸分子杂交有机的结合，又使得核酸分子杂交技术的灵敏度大大提高；90年代，基因芯片技术的出现使得一次性对大量样品序列进行检测和分析成为可能，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。第一节核酸杂交概述及基本原理一、核酸杂交概述6第一节核酸杂交概述及基本原理一、核酸杂交概述-核酸的结构一级结构：核苷酸的排列循序稳定键：磷酸二酯键二级结构：双螺旋结构稳定键：氢键、碱基堆积力、疏水

3、键高级结构：染色体7CGA一级结构二级结构高级结构8第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性变性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到蒲怀，DNA由双螺旋变成单链过程。化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变910加热极端的pH有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-DNA的变性因素11变性能导致DNA的

4、一些理化性质及生物学性质发生改变第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-变性DNA的性质溶液黏度降低DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性结构，DNA黏度明显下降溶液旋光性发生改变变性后DNA分子的对称性及局部构型改变紫外吸收增加DNA变性后，DNA溶液的紫外吸收增强双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸12DNA的紫外吸收光谱增色效应（hyperchromiceffect）：DNA变性时其溶液OD260增高的现象第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-变性DNA的增色效应13DNA分子在250－280nm波长具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260nm紫外吸收

5、的结构基础是：DNA分子中碱基间电子的相互作用，变性后，双链解开，碱基间电子的相互作用更有利于紫外吸收，产生增色效应增色效应可以作为DNA变性的指标不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在20－30%之间第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-变性DNA的增色效应14第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-解链曲线通常利用DNA变性后在波长260nm处吸光度（A260）的增加来监测DNA变性的过程。如果以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。典型DNA变性曲线呈S型15第一节核酸杂交

6、概述及基本原理二、核酸变性-融解温度增色效应与温度有十分密切的关系，这主要是变性温度取决于DNA自身的性质。融解温度（meltingtemperature，Tm）：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度16特点：爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的融化现象，故名融解温度狭窄性：变性温度范围很小第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度17Tm的影响因素：1．DNA分子大小和碱基的组成2．溶液的离子强度3．pH值4．变性剂DNA复杂度对Tm的影响第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度18（一

7、）DNA分子大小和碱基的组成不同来源DNA间的Tm存在差别，在溶剂相同的前提下，这种差别主要是由DNA本身下列两方面的性质所造成的DNA的均一性DNA的（G+C）含量第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度19DNA的均一性有二种含义DNA分子中碱基组成的均一性：如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段，与天然DNA比较，其Tm值范围就较窄。因前者变性时氢键断裂几乎可“齐同”进行待测DNA样品组成的均一性：如