流式细胞术课件.ppt

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1、流式细胞术及应用文金生博士温州医学院，微免教研室2009年10月27日一、流式细胞术工作原理二、荧光染料选择三、抗体选择四、样品制备及对照设置五、数据分析处理六、流式细胞术的应用内容一、流式细胞术工作原理（一）流式细胞术的概念流式细胞术（FCM，FlowCytomytry）指利用流式细胞仪(FlowCytomyter)对处于快速流动的荧光染色的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。凡是能被荧光素标记的且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。特点：1、测量速度快，每秒钟测数千至上万个细胞；2、可进行多参数

2、测量；3、可把指定特征的细胞分离出来（分选技术）。美国B-D公司型号：FACSCalibur（二）、流式细胞仪工作示意喷嘴荧光信号激光鞘液（三）、流式细胞仪光信号1、散射光信号：FSC和SSC前向散射光信号(FSC)：与激光束方向同轴的称前向散射光信号，反映细胞大小，细胞越大，前向散射光信号越强；FSC信号与细胞的折射率有关，可用于表示细胞的凋亡，区分死/活细胞时，可用于设门。侧向散射光信号(SSC)：与激光束方向垂直的称为侧向散射光信号，主要反映了细胞的内部结构，内部结构越复杂，SSC信号越强，反映细胞内颗粒性。外周全血细胞（红细胞溶解后），FSC和SSC。1、散射光信号中性粒细

3、胞单核细胞淋巴细胞荧光素与特异抗体结合（荧光抗体）或荧光素；荧光素吸收激光（激发光波长）能量；荧光素释放光量子（发射光波长）；荧光抗体与细胞抗原结合越多，荧光信号越强；荧光素与细胞核酸结合，荧光强度(FL)反映核酸含量;荧光强度可区分荧光标记细胞与无荧光标记细胞，也可区分高FL细胞与低FL细胞。一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测出13个FL。2、荧光信号双色直接染色2、荧光信号二、荧光染料的选择选择荧光染料要考虑:1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光

4、染料；2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长；3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。PE-Cy5与APC干扰。FITC：异硫氰酸荧光素，绿色，513nmPE：藻红素，橙黄色575nm，信号最强PerCP：多甲藻黄素-叶绿素蛋白，深红色，675nmPE-Cy5(PC5)：670nmPE-Cy5.5(PC5.5)：667nmPE-Cy7(PC7)：767nmPI(碘化丙啶）：617nm二、荧光染料的选择488nm激光激发的染料：633nm激光激发的染料:APC：异藻蓝蛋白，红色660nm非特异性荧光来源：自发荧光检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（

5、如APC），可以得到较好的S/N比值。自发荧光不太高的细胞，荧光抗体选择范围大。二、荧光染料的选择非特异结合有些荧光标记抗体表现出低水平的非特异结合，会造成阴性细胞的荧光水平升高。如（Cy3、Cy5和Cy5.5）和TexasRed标记的抗体，以及某些复合染料如ECD，与某些细胞结合力增强。颜色补偿荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可以通过“颜色补偿”校正这一干扰。单标管用于调补偿。二、荧光染料的选择Fluorescein(FITC)400nm500nm600nm700nmWav

6、elengthProteinExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE)ProteinFITC和PE荧光光谱补偿模型图补偿调节前后对比二、荧光染料的选择1.细胞表型分析双色分析：FITC与PE三色分析：双色分析+PE-CY5或PerCP-CY5.5。四色分析：三色分析+APC或PE-CY5。2.胞内蛋白与周期的关系分析蛋白标记：FITC或GFP，DNA标记：PI3.凋亡与坏死分析：凋亡用AnnexinV-FITC，坏死用PI

7、。三、抗体选择选择商业化的流式用单克隆抗体，此类抗体非特异荧光弱。最好用直标抗体。样本来源：1、单细胞：外周血，细针穿刺，洗脱液等；2、组织：骨髓，肝，脾，淋巴结等；3、培养细胞：4、液体：血清、血浆、培养上清、细胞裂解液。四、样品制备及对照设置评价样品制备优劣的指标：1、细胞的密度高于1×106/ml；2、非特异荧光，不超过1％；3、无细胞碎片和聚集体，不能出现肉眼可见的团块。空白管：未染色细胞，调电压单染对照：单荧光素染色，调补偿同型对照：同型抗体，去除非特异性染