缓冲液的配制.doc

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1、Elisa相关试剂的配制1、抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/LpH7.2PBSNaH2PO4·2H2O——0.39克;Na2HPO4——1.27克;NaCl——0.85克;NaN3——200mg;H2O(蒸馏水)至1000ml2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液PH7.4,PBSTNaCl——2.0克;KH2PO4——0.2克;Na2HPO4·12H2O——2.9克;KCl——0.2克;NaN3——0.2克;H2O至1000ml吐温(Tween)200.5ml;4°C保存备用3、包被液(简称CB)pH9.6Na2CO3——1.59克;NaHCO3——2

2、.93克;NaN3——0.2克;H2O至1000ml密封盖好,4°C存放备用4、ELISA底物液(可溶性底物) 磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0 0.1mol/L柠檬酸(21.014克/100ML)——24.3ml;0.2mol/L Na2 HPO4(28.4克/L)——25.7ml;H2O ——50ml; 4°C存放备用 5、DAB底物液(不溶性底物,组化病理等)0.05mol/LpH7.6tris-HCLTris——6.05克;HCL(36%)——3.15克(约2.7ml浓HCL);H2O至1000mlDAB为3´,3´二氧基联苯胺,不溶性底物,呈棕红色ELIS

3、A试剂配制及实验流程是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。以双抗体夹心法举例说明。 试剂配制: (1) 包被缓冲液(PH9.6 +0.2  0.05M碳酸盐缓冲液):  Na2CO3——1.59g ;NaHCO3 ——2.93g ;加蒸馏水至1000ml。(用时稀释成1x,加0.1%BSA) (2)洗涤缓冲液(PH7.4  0.15M PBST):0.05%Tween-20——0.5ml;加在PBS缓冲液1000ml中。PBS缓冲液: KH2PO4——0.2g ;Na2PO4·12H2O——2

4、.9g ;NaCl——8g ;KCl——0.2g; 加蒸馏水至1000ml。 (3)封闭缓冲液:牛血清白蛋白(BSA)2%——2g ;(或5%脱脂奶粉)加洗涤缓冲液100ml。(4)稀释液 :牛血清白蛋白 0.1 % ——0.1g ;加PBS 缓冲液100ml。(5) 底物缓冲液(PH5.0):0.2M  Na2HPO4(无水28.4g/L,带12结晶水71.7g/L) 取25.7ml 0.1M 柠檬酸(无水19.2g/L,带1结晶水21.01g/L)取24.3ml;加蒸馏水至100ml。 (或Na2HPO4·12H2O——1.84g ;柠檬酸·H2O ——0.

5、51g 加蒸馏水至100ml)  (6)TMB(四甲基联苯胺)显色液(显蓝色):TMB(2mg/ml水)——0.05ml; 底物缓冲液——0.95ml; 30%  H2O2——0.001ml ;总体积1ml。(7) 或配OPD(邻苯二胺)显色液(显黄棕色)(现配避光):OPD(干粉)——0.004g ;底物缓冲液——10ml ;30% H2O2 ——0.015ml ;总体积——10ml。(8)终止液(2M H2SO4):在178.3ml水中,逐滴加入浓硫酸(18M,约98%)21.7ml,边加边摇。 操作步骤: 1. 包被:用包被液将抗体(一抗)稀释至蛋白质含量

6、为1~10μg/ml。在每板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜(或37℃温育2~3小时)。次日,弃去孔内溶液,用洗涤液冲洗3次,中间振荡。(简称洗涤,下同)。 2. 封闭:加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中,置37℃温育2小时。然后洗涤3次 3. 加样:加待检样品0.1ml于反应孔中,置37℃温育1~2小时。然后洗涤。(同时做空白孔(不加样品),阴性对照孔(野生型)及阳性对照孔)。 4.  加一抗:各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37℃温育1~2小时。然后洗涤。   5. 加酶标二抗:各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37℃温育45分钟~1小

7、时,洗涤5次。6. 加底物液显色:各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml(或OPD显色液),37℃暗处温育5~20分钟,或室温暗处10~40分钟充分变色。 7. 终止反应:各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。(TMB底物蓝色变黄色,OPD底物黄色变棕色)8.结果判定:白色背景上肉眼直接观察结果,反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,可以依据所呈颜色的深浅,用“+”、“-”号表示测OD值:在ELISA检测仪上,TMB底物法使用450nm测各孔OD值,OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性(以空白对

8、照孔调零后计算)。4 间

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