荧光原位杂交(FISH)实验步骤.doc

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1、仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OLYMPUSBX51荧光显微镜；4、OLYMPUSDP11数字显微照相机。FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。（6）杂交后洗涤液：20×SSC4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。实验步骤1

2、、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵

3、育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。检测：9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水

4、分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。扩增：12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16）每张切片滴3

5、0μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。5、细胞核染色：1）张切片加10μl～20μlDAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。PRINS步骤1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；2、用0.2mol/L盐酸处理5min；3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃15min；4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；5、加PCR混合液25μL(10

6、mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2，各加200μmol/LdATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/Ldig-11-dUTPl.5μl，引物250ng，TaqDNA聚合酶2U)，加盖片；6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；8、片于65℃10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次；9、经BufferI液洗后滴加20％羊血清封闭30min；10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h；11、Buf

7、ferⅢ液洗5min；12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色；13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。