负载口蹄疫病毒VP4蛋白质抗原的树突状细胞启动的T细胞应答.pdf

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1、分类号：S墨55：笪窆：委密级：公珏一单位代码：学号：!QQ墨鱼2QQ墨垒§垒负载口蹄疫病毒VP4蛋白质抗原的树突状细胞启动的T细胞应答TlymphocyteresponsetriggeredbydendriticcellspulsedwithproteinantigenofFMDVVP4学位申请人：张丽指导教师：王家鑫教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一一年五月二十九日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含

2、其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑宴垦盛些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：葫f丽签字日期：Ⅵ}f年6月V日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑兰垦壅些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑皇垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权

3、书)学位论文作者签名：签字日期：、011年6月1El学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：签字日期：Ml}年6月L日电话：邮编：摘要口蹄疫(Foot．and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDvirus，FMDV)感染偶蹄动物引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMDV的抗原易发生变异，因此到目前还没有有效的预防措施。FMDV的4种结构蛋白中VP4几乎不发生变异。并已证明，FMDV结构蛋白1A(VP4)富含T细胞抗原表位与B细胞抗原表位的抗原分子。树突状细胞(dendriticcells，DCs)是目前发现的功能

4、最强大的专职抗原提呈细胞(antigenpresentingcell，APC)。实验证明，FMDV野毒株并不感染DC，但在培养基上驯化的FMDV却可以感染DC，并且与抗体结合后的FMDV也可以感染DC，导致其抗原提呈功能丧失，而当DC负载灭活FMDV免疫复合物后却能够有效地刺激T细胞。而细胞免疫应答在抗病毒感染过程中发挥重要作用。被DC活化的T细胞在IL-12的作用下，可分化为Thl细胞，介导细胞免疫应答并产生调理性抗体(IgG)，从而清除胞内病原体感染。而在IL-4的作用下，有利于Th细胞向Th2细胞分化，介导体液免疫应答，产生中和抗体，清除外周循环中

5、的病原体。目前尚不清楚DC启动细胞免疫应答的机制。本研究根据农业部2008年12月12日发布的《动物病原微生物实验活动生物安全要求细则》，既不使用活病毒，也不使用灭活病毒，首先按照GenBank上已公布的O型口蹄疫病毒的核苷酸序列合成pBluescriptIISK(+)．VP4，然后将pBluescriptIISK(+)．VP4通过BamHI和XhoI位点插／X．至lJpET-32a(+)原核表达载体，构建VP4的原核表达载体pET-32a-VP4。将VP4表达载体转化宿主菌BL21，制备工程菌进行原核表达。通过对诱导表达条件的优化，根据SDS—PAGE

6、确定表达蛋白的最佳表达条件，利用载体的His-Tag标签做Westernblot鉴定。通过电洗脱纯化VP4蛋白质抗原。将荷载了FMDVVP4蛋白质抗原的DCs与淋巴结T细胞共培养，并以DCs+T细胞和DCs作为对照组，在共培养3h，9h，24h和48h后，取其共培养上清液，ELISA检测其中IFN吖和IL．4的水平，从而研究FMDVVP4蛋白质抗原对T细胞的活化效应。本研究构建的原核表达载体pET-32a．VP4经B锄HI和XholXX酶切，得到了符合预期大小的特异性片段，测序结果与GenBank中Foot-and．mouthdiseasevirusOi

7、solateO／NYOO基因编码VP4序列完全一致，同源性为100％，证明原核表达载体pET-32a-VP4构建成功。SDS．PAGE检测宿主菌BL21表达目的蛋白的结果显示：在IPTG浓度为1mmol／L，诱导后5h时表达量最大。经Westernblot鉴定其在25kDa处有杂交条带，与预期目的蛋白大小相符。细胞共培养ELISA检测结果显示，负载FMDVVP4的DC能够有效地激活淋巴结T细胞。这些结果不仅为进一步研究DCs对FMDVVP4抗原的提呈途径打下了基础，而且为新型疫苗设计与开发提供理论指导。关键词：口蹄疫病毒；树突状细胞；VP4；抗原提呈J霉

8、。Tlymphocyteresponsetriggeredbydendritic