肿瘤细胞培养.doc

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1、肿瘤细胞培养一、组织培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：（-）形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。（―）生长增殖肿瘤细胞在体内具冇不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细

2、胞在体外培养屮不加血清不能增殖，是因血清屮含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2%〜5%）仍能生长。已证明肿瘤细胞冇自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，己成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。（三）永生性永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）o体外培养屮的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否

3、如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽,从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固冇的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性冇可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat—1、10T1/2等细胞证明,永生性和恶性

4、（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。（四）浸润性浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养吋，能浸润入其它组织细胞中，并冇穿透人工隔膜生长的能力。（五）异质性所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区冇的细胞衰老退化，冇的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（StemCells）.只冇这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分

5、。肿瘤干吋易于生长增殖；把干细胞分离出来的培养方法称干。（六）细胞遗传大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，冇干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。（七）其它肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：①依赖性：肿瘤细胞虽冇较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性；②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需

6、求，降低肿瘤细胞的生长增殖力；③并非所冇肿瘤细胞都有强的生长活力和长的LifeSpan,只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少；④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。二、培养方法肿瘤成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤与正常组织并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。（一）要点1.取材：人肿瘤细胞來自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织屮有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，耍挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材

7、料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4°C中，但不宜栽过24小时。1.培养基：肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMII640.DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞冇自泌（Autocrine）性产生促生长物质Z故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需耍这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤中仍需

8、要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关