固定化细胞课件.ppt

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1、第七章酶催化反应酶是具有高度选择性的催化剂，而一般情况下的酶反应均是在温和条件下进行的（如常温、常压和中性溶液），酶的这些特性使酶能在食品、饮料和诊断工业中广泛应用。同样这些特性使酶能在各种化合物的合成，尤其是在药物、手性中间体、特殊的聚合物和生化物质合成中显示出了潜在的吸引力。酶作为一种特殊的催化剂正越来越受到人们的重视，对其应用研究也更趋广泛，从生物体系的酶到非生物体系的酶催化，从酶的固定化到非水相酶反应，酶的潜在能力正获得越来越多的开发和利用。7.1酶和细胞的固定化7.1.1酶和细胞的固定化

2、方法固定化酶：通过物理或化学的方法将溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到完全或局部约束的一种不溶于水，但仍具活性的酶。它能以固相状态作用于底物进行催化反应。固定化细胞：将完整的细胞限定在一定空间内活动的一种固定化生物催化剂。注意：由于是具有催化活性的蛋白质的固定化，所以必须严格操作条件，尽可能避免酶的高级结构受到损害。7.1.1酶和细胞的固定化方法★常用方法：吸附法、包埋法、交联法、化学共价法、逆胶束包囊法等★常用载体：活性炭、多孔玻璃、纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸盐、明胶、

3、合成的高分子化合物等1）吸附法（最古老、最简便经济）特点：●蛋白质与载体之间的结合力很弱●在很多情况下，酶的非特异性吸附常会引起部分或全部失活，且高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附。吸附剂的种类（1）：◆各种矿物质和其他无机载体：高岭土、多孔玻璃、氧化铝、二氧化硅等蛋白质结合量通常很低◆纤维素粉：糖苷水解酶在纤维素上有较强的吸附◆离子交换剂（目前最常用）：羧甲基纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖以及合成的离子交换剂等作用原理：静电吸引缺点：当离子强度增加或者介质的pH、温度改变时

4、，这种结合发生分解。如果通过化学方法增加酶蛋白上的电荷则可使这些影响得到改善。第一个用于工业生产的固定化酶：固定化氨基酰化酶——将氨基酰化酶吸附在DEAE-纤维素或DEAE-葡聚糖上制得。吸附剂的种类（2）：吸附剂的种类（3）：◆蛋白质载体：胶原蛋白是最常用的一般胶原蛋白载体预先制成膜状（胶原膜），胶原膜溶胀，然后浸入酶溶液，酶渗入膜内并被吸附，制成酶膜。◆生物特异性吸附剂：如，伴刀豆球蛋白A-琼脂糖，可有效地固定一些以糖蛋白为结构的酶。伴刀豆球蛋白A具有凝集红血球细胞和肿瘤细胞的作用，这种作用主

5、要是由于伴刀豆球蛋白A能够与细胞表面上的单糖和低聚糖发生特异性结合。因此，当琼脂糖上结合有伴刀豆球蛋白A以后，它就能够与溶液中的多糖和糖蛋白发生特异性结合。2）包埋法（普适性）包埋法：将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法特点：●酶分子本身不直接参加反应●条件较温和●酶活力回收较高●对底物分子和产物分子的大小有限制，当底物和产物的相对分子质量小时，扩散阻力就小。载体（1）：格子型包埋法载体常用的：海藻酸盐、K-角叉菜、琼脂、三醋酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶等★海藻酸盐：价格便宜、来源丰富，无毒

6、性，目前应用较广特点：△操作简便、条件温和△在高浓度的电介质（K+、Na+等）溶液中，固定化颗粒会不稳定；△Ca2+等多价离子在磷酸缓冲液中会沉淀，固定化颗粒的机械强度将降低，最后重新溶解。因此用此法包埋的固定化酶或细胞不能用于磷酸缓冲溶液中。一般操作方法：先将海藻酸盐溶于水中，使其具有一定粘度；然后加入一定量的细胞菌体，并且充分搅拌，使之分散均匀；通过注射器或毛细管将此菌体悬浮液逐滴注入含有Ca2+、Zn2+、Al3+等多价离子的溶液中，由于离子转移的胶凝作用，海藻酸盐液滴便形成珠状的固定化细胞

7、颗粒。待颗粒经过一定时间的硬化后洗净，即可用于催化反应。★聚丙烯酰胺凝胶：蛋白质的固定量较高，可达10~100mg/g单体，目前常用的聚合物载体特点：△聚丙烯酰胺凝胶中孔的大小分布很不均匀，因此要防止酶的漏失。△调节单体和交联剂的用量可以改善聚丙烯酰胺凝胶的渗透性。操作方法：在含酶（或细胞）的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲撑双丙烯酰胺；然后在催化剂（二甲氨基丙腈）和引发剂（过硫酸钾）的作用下低温（水浴）聚合；产生的聚合物凝胶便是固定化酶，可通过机械方法分散成一定大小的粒子

8、。载体（2）：微胶囊包埋材料常用的：火棉、尼龙、聚脲等半渗透的界面聚合物膜如，将含有1,6-二氨基己烷的酶水溶液分散到与水互不相溶的含有己二酰二氯的有机溶剂中去，水相与有机相界面上的二胺和二酰氯发生聚合，形成一个包围在水相酶溶液珠滴外面的聚酰胺薄膜（即尼龙-6,6-薄膜）。3）交联法★交联法：利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使酶发生分子间交联因而得到固定的方法。★常用的试剂：戊二醛、1,6-亚己基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯-马来酸酐共聚物等。★双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用