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1、PCR技术及其应用分子生物学与临床中山大学主讲：杨中汉（yangzhonghan163）目录PCR的概念PCR技术的创建PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:DNA聚合酶基因组DNA引物DNA聚合酶DNA片段体外扩增PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana
2、的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。KaryB.Mullis（1944－）karymullis三篇重要论文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationof
3、DNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段限制性内切酶裂解基因组DNA基因重组转化细菌体外包装基因
4、组DNA文库DNA文库20kBfragments插入噬菌体载体细菌扩增裂解变性显影从基因组文库中筛选目的基因probe放射性核素标记转印DNA克隆目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子DNA聚合酶引物引物M13噬菌体Sanger的测序技术引物DNA聚合酶1977年引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)405060708090100100806040201988年Sai
5、ki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术72℃94℃55℃PCR循环PCR技术的原理1PCR技术的基本原理无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类引物复习5’3’加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的
6、氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火2PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2）特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序
7、列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作
8、复杂,一般需要数周时间。目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子4）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变性,退火
