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1、免疫学实验技术免疫学技术--抗原抗体反应可对抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测影响因素:电解质、温度酸碱度免疫标记技术:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂,标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应特点:高度灵敏、特异、快速,定性、定量、定位分类:免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定Ⅰ.ELISAⅡ.免疫组化Ⅲ.荧光抗体标记Ⅳ.荧光原位杂交（FISH）Ⅴ.分光光度法Ⅰ.酶联免疫吸附实验（enzymelinked immunosorbentassay，ELI
2、SA）以酶标记抗体或抗原进行的抗体抗原反应.酶结合物具有双功能:高度特异的免疫反应、生物催化放大作用基本方法:间接法、双抗体夹心法、竞争法、生物素-亲和素系统间接法a.将已知可溶性抗原吸附于载体b.温育后清洗c.加入可能含特异性抗体的待检液d.温育后清洗e.加入酶标记的二抗f.温育后清洗g.加入酶作用底物h.测定反应颜色深浅a.将已知抗体吸附于载体上b.温育后清洗c.加入可能含特异性抗原的待检液d.温育后清洗e.加入酶标记特异性抗体f.温育后清洗g.加入酶作用底物h.测定颜色反应深浅双抗体夹心法a、将已知抗体吸附于载体上b
3、、温育后清洗c、加入可能含特异性抗原的待检液和酶标记的已知抗原液d、温育后清洗e、加入酶作用底物f、测定颜色反应深浅竞争法生物素-亲和素系统（biotin-avidinsystem）生物素:一种维生素H,经活化后可与抗体、抗原、酶以多配一方式共价结合,且不影响它们的活性亲和素:从卵蛋白中提取的一种碱性糖蛋白,可与酶偶合,以一配多的方式对生物素有很强的亲和力BAS用于检测的基本方法：BAB法或BRAB法/BA法/ABC法生物素-亲和素系统BAS法与常规酶法ELISA操作注意事项1.待检样品不应反复冻融2.加样前充分混匀样品3
4、.洗板:保证洗涤次数,确保冲洗干净4.加完终止液在要求时间内上机检测,反应温度最好在37℃ELISA检测标本1.血清或血浆2.尿液3.脑脊液、关节液等体液4.细胞培养上清等ELISA试验用耗材、试剂及仪器耗材:移液器、吸头、酶标板、滤纸试剂:酶标抗体、抗体稀释液、封闭液、底物溶液、终止液仪器:酶标仪ELISA结果分析1.根据标准品的含量及检测OD值结果,应用线性回归方程进行统计分析,可求得待测样品的定量值2.上机前将标准品的数量及含量按要求在酶标仪上进行设置,机器自动计算打印出标准曲线及各待测样品的定量结果Ⅱ.免疫组织化学
5、技术免疫组化是组织化学的一种,是利用已知的抗体或抗原能特异性结合的特点,通过化学反应使结合在特异性抗体上显示剂(酶、金属离子、同位素等)显示一定的颜色,在显微镜下观察颜色的变化,在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质1.阳性标记色度特征免疫组化细胞阳性程度与抗原含量、分布密度、标记方法有关.一般抗原含量越多、密度越高、标记方法越敏感,阳性显色则越强.淡黄色,弱阳性;黄色,阳性;棕黑色,强阳性.结果判断中,后两者有意义,前者除标本处理和方法学因素外,与细胞轻度异常表达及某些细胞摄取了周围组织抗原有关2.阳性
6、标记细胞学特征免疫组化阳性细胞反映抗原在细胞中的定位和分布情况.阳性细胞以拟标记的细胞为前提,阳性表达必须在细胞特定的抗原部位,若不在抗原所在部位的阳性表达和非目标细胞即使阳性也不应作为判断依据.根据抗原在细胞中分布和阳性颗粒沉淀部位可分5种类型：⑴胞膜型阳性颗粒主要分布于细胞膜表面,形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞.此类型常见于某些膜抗原,如上皮膜抗原（EMA）、白细胞共同抗原（LCA）及B细胞、T细胞、粒细胞相关抗原（GAA）⑵胞核型阳性颗粒定位于细胞核,呈均匀分布位于核膜下,有的呈小斑块状不规则分布.多见增殖细胞核抗
7、原、Ki-67及激素受体中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和基因p53等⑶胞浆型阳性颗粒主要分布于细胞浆.大部分抗原均属此型,如细胞角蛋白、波形蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶及前列腺特异性抗原（PSA）等.抗原在胞浆内分布通常为弥漫性或局限性.弥漫性是阳性颗粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆,局限性是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞浆中的某一部位、核周或细胞浆的一侧⑷微绒毛型抗原颗粒主要分布于腺癌细胞的微绒毛,胞浆和胞膜可以是阳性或阴性表达.此形最常见于各种腺癌,如甲状腺、乳腺、胃肠、胆道、卵巢浆液
8、性腺癌等.特点是阳性颗粒靠近腔面,基底部可呈阴性反应.在肿瘤标记物中多见于上皮膜抗原、上皮特异性抗原、结肠相关抗原、卵巢癌抗原等,甲状腺腺癌中甲状腺球蛋白常以该形式出现⑸复合型常规免疫组化标记中,同一种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞核和胞浆、微绒毛和胞浆,很少发现胞膜和胞核同时表达.应注意组织标本固定
