成果详细介绍.doc

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1、成果详细介绍综合介绍随着人们生活节奏的加快和饮食结构的变化，罹患癌症的人群增多，对癌症的前期诊断和术后的监控尤为重要。前期研究发现miR-196a-5p和miR-125a-5p在肺癌发生发展中起重要作用，它们的表达水平被应用于临床检验，有望成为肺癌早期诊断及区分肺癌不同分期的客观指标。基于海胆状金纳米粒子的表面增强拉曼散射技术（SERS）和侧向层析分析技术（GICA）的各自特点，我们通过结合SERS和侧向层析技术来建立一种新型的miRNA检测方法-SERS-GICA技术。该方法充分发挥了SERS和GICA各自的优势，利用海胆状金纳米粒子的SERS技术可实现对病例样本中目标miR

2、NA的高灵敏、定量化检测，减少主观因素的影响，有利于监测病人病情变化及治疗情况。GICA中硝酸纤维（NC）膜不仅成本低、易操作、简便、快捷，而且SERS标记探针高度集中在约150mm宽的检测线（T线），可采集到更为均匀的信号。本课题研究开展的重点工作，主要是：（1）基于海胆状金纳米粒子和金纳米多巴胺树脂（PDR@GNPs）复合微球构建“三明治”结构SERS传感器，对水溶液中miR-196a-5p进行定量检测。（2）制备多线多重SERS-GICA核酸试纸条，将其用于检测皮下异种肿瘤移植的小鼠肺癌发生发展阶段外周血中miR-196a-5p和miR-125a-5p的表达变化。（3）为

3、了进一步鉴定这两种miRNA作为肺癌标志物的潜力，基于多线多重SERS-GICA核酸试纸条检测miR-196a-5p和miR-125a-5p在肺癌患者和健康人外周血、尿液和痰液中的表达水平。研究这两种miRNA在不同分期肺癌患者外周血、尿液和痰液中表达情况，并分析两者之间的相关性。（4）建立SERS-GICA单线多重检测miRNA的方法，实现单线同时检测人肺癌细胞系中miR-196a-5p和miR-125a-5p的表达水平。本研究拓展了miRNA检测方法，对实现肺癌早期诊断和病情监控具有重要意义。该试纸为肺癌早期诊疗做出贡献，同时也可以为其他疾病的检测提供通用平台。1.研究目标

4、（1）制备形貌均一、单分散性好和表面增强拉曼散射（SERS）效应强的海胆状金纳米粒子（UGNs）。（2）选择最优条件，制备形貌好且SERS效应强的金纳米多巴胺树脂（PDR@GNPs）复合微球。构建UGNs-SHprobe-miRNA-Tprobe-PDR@GNPs“三明治”结构的SERS传感器，并将其用于检测溶液中miRNA-196a-5p的浓度。（3）以海胆状金纳米粒子作为增强基底，构建多线多重和—10—单线多重检测miRNA的表面增强拉曼散射侧向层析（SERS-GICA）核酸试纸条。建立快速、定量检测细胞、外周血、尿液和痰液中miRNA的新方法。④探明在肺癌不同时期，肺癌患

5、者外周血、尿液和痰液中miRNA-196a-5p和miRNA-125a-5p表达水平的变化。2.研究内容（1）采用种子介导生长法制备海胆状金纳米粒子。研究改变反应体系中反应物浓度和反应条件对产物的形貌、光学性质以及SERS效应的影响，从而提出最适合的合成条件。（2）以多巴胺作为反应单体来制备多巴胺树脂（PDR）微球。接着将金纳米颗粒（GNPs）通过简单地原位吸附还原的方法成功地包裹在PDR微球的表面形成PDR@GNPs复合微球。研究不同浓度的氯金酸对PDR@GNPs复合微球表面形貌的影响。优化条件，制备形貌好且SERS效应强的PDR@GNPs复合微球。（3）在海胆状金纳米粒子和

6、PDR@GNPs复合微球的表面分别固定检测探针（SHprobe）和捕获探针（Tprobe），待测物miR-196a-5p与SHprobe和TProbe部分杂交构建一种“三明治”结构的SERS传感器，用于检测不同浓度的miR-196a-5p。（4）在传统的侧向层析核酸试纸条的基础上，通过在试纸中间的硝酸纤维素膜（NC膜）上的不同位置固定相应的捕获探针Tprobe，即增加检测线（T线）的数量，将海胆状金纳米粒子表面修饰拉曼信号分子对巯基苯甲酸（4-MBA）和检测探针SHprobe，利用“三明治”结构检测模型，构建多线多重检测肺癌患者外周血、尿液和痰液中miR-196a-5p和miR

7、-125a-5p的SERS-GICA核酸试纸条。根据试纸条中T线的位置可知待测miRNA的种类。通过不同T线处4-MBA特征峰的强度间接检测miRNA的表达水平。研究在不同分期肺癌患者外周血、尿液和痰液中这两种miRNA表达水平的差异，分析它们的表达水平与病程进展的相关性。（5）为了能够同时检测几种miRNA，建立SERS-GICA单线多重检测miRNA的方法。选择两种具有可区分特征峰的拉曼信号分子硫堇和尼罗蓝A（NBA），标记到海胆状金纳米粒子的表面。在NC膜上设计一条质控线（C线）和一条