登革热样本采集、保存和运输ppt课件.ppt

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1、登革热实验室检测云南省寄生虫病防治所2014年10月概要检测目的检测对象检测内容实验室检测复核检测检测方法样本采集、保存和运输检测目的及时发现、诊断病例。病毒分型和溯源。为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。检测对象疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。检测内容实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体。登革热疑似病例实验室检测流程检测内容复核检测送州/市CDC或云南省寄生虫病防治所的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/

2、或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG抗体和/或中和抗体检测。检测方法病原学检测主要适用于急性期血液标本。1、抗原检测：一般发病后5天内血液标本NS1抗原检出率高。标本中检出NS1抗原可以确诊病毒感染，适用于现场快速检测，可用于早期诊断2、核酸检测：一般发病后6天内血液

3、标本病毒核酸检出率高。在病人血清中检出病毒核酸，可确诊而且能够分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作3、病毒分离：一般发病后5天内血液标本病毒分离率较高。将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养，出现病变以后，用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。分离到登革病毒可以确诊，但其耗时长，不适于快速诊断。检测方法血清学检测主要适用于发病5天以后血液样本，但需注意可能与其他黄病毒感染发生交叉反应。1、血清特异性IgM抗体：采用ELISA、免疫层析等方法检测。IgM抗体阳性，提示患者可能

4、新近感染登革病毒，适用于登革热早期诊断，但单份标本不能确诊2、血清特异性IgG抗体：采用ELISA、免疫荧光（IFA）、免疫层析等方法检测。患者恢复期血清IgG抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊3、中和抗体：采用空斑减少中和实验、微量中和实验等方法检测，可用于分型。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原检测仪器设备和材料加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法）酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原操作步骤1、将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡3

5、0分钟，使用前将试剂轻轻震荡混匀。2、配液：将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释。3、编号：将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔。4、加稀释液：每孔加稀释液50µL，空白孔除外。5、加样：分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各50µL，空白孔除外。6、温育：用封板膜封板后，置37℃温育60分钟。7、每孔加酶标试剂50µL，空白孔除外，轻轻震荡混匀。8、温育：用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。9、洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。10、显色：每孔加入显色剂A、B液各50µL，轻轻震荡混匀，37

6、℃避光显色15分钟。11、测定：每孔加终止液50µL，10分钟内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处（建议使用双波长450nm/600-650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原结果判定1、临界值计算：临界值=0.10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0.05者以0.05计算）。2、阴性对照的正常值范围：阴性对照孔A≤0.1（若1孔A大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照大于0.1，应重复实验）。3、阳性对照正常值范围：A≥0.8.4、阳性判定：样品A值≥临界值者为登革病毒抗原阳性。5、阴性判定：样品A值

7、＜临界值者为登革病毒抗原阴性。意义结合临床信息，阳性结果可以诊断为登革病毒感染，但阴性结果并不排除登革病毒感染的可能。胶体金免疫层析法检测登革病毒NS1抗原检测仪器设备和材料加样器、登革热病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）检测步骤1、将试剂盒和待检样本自冰箱中取出平衡至室温。2、当准备好测试时，打开密封的铝箔袋，取出检测卡，平放于水平桌面上。3、在检测卡上标记病人的样本号。4、加样：用滴管从样本中取1滴（约30-45µL）血清或血浆标本，加于检测卡/条上的加样区内，另外加1滴（约30-45µL）稀释液，保证操作过程中没有气泡产生。（如果加样后30秒钟，没有

8、看到样本移动，可能是由于样本太黏稠，可在样本加样孔内再加1滴样本稀释液。5、加入样本后20-2