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1、第18卷第6期色谱Vol.18No.62000年11月CHINESEJOURNALOFCHROMATOGRAPHYNov.2000卵类粘蛋白柱手性拆分酮基布洛芬王解静,曹桂芳,徐诗伟(中国科学院微生物研究所,北京100080)摘要:在卵类粘蛋白柱上,考察了酮洛芬对映体在3种流动相体系下的保留行为,建立了同时分离酮洛芬及其甲酯两对对映体的较佳色谱条件。方法可用于酶法立体选择性水解或酯化过程中生成的4种化合物的同时测定。关键词:高效液相色谱法;卵类粘蛋白;酮洛芬及其甲酯;手性拆分中图分类号:O658;R9文献标识码:A文章编号:10008713(2000)060536031前言酮基布洛芬[
2、简称酮洛芬,化学名()2(3苯甲酰苯基)丙酸]是一种优良的非甾体抗炎镇痛药。其S(+)构型具有较高生理或药理活性,而R(-)酮洛芬对牙周病有极好的防治作用。对手性药物酮洛芬的拆分研究,不仅可提高其外消旋体的疗效,降低药物毒性,还可以将两种对映体分别开发为不同适应症的治疗药物[1]。为此,我们开展酶法立体选择性水解或酯化拆分酮洛芬的研究,首先要建立一种简便快速分离对映体和测定对映体过量(e.e.)的方法[2]。天然蛋白质通常有较高的手性识别能力,对手性药物对映体选择性高。现有多种蛋白质,如牛血清白蛋白(BSA)、酸性糖蛋白(AGP)、人血清白蛋白(HSA)、胃蛋白酶(pepsin)和卵类
3、粘蛋白(OVM)等[3~7]键合微粒硅胶的手性固定相被商品化。卵类粘蛋白是一类新型的蛋白质色谱填料,具有众多手性识别位点和宽的对映选择范围,已被应用于一些药物的手性拆分[8~10]。本文建立了用卵类粘蛋白柱同时分离酮洛芬及其甲酯两对对映体的高效液相色谱(HPLC)分析方法,考察了一些热力学因素对酮洛芬对映体分离的影响,并比较了3种流动相体系下的手性拆分效果。2材料和方法21仪器和试剂法国GilsonHPLC仪;SP4290积分仪;DiGiSensepH计(ColeParmer)。乙腈(Fluka)为色谱纯;甲醇、乙醇(北京化工厂)和KH2PO4(北京红星化工厂)等试剂均为分析纯;酮洛芬
4、(KE)样品由西南合成制药厂赠送,酮洛芬甲酯(MKE)样品由本实验室化学合成。22色谱条件色谱柱UltronESOVM(5m,150mm46mmi.d.)购自惠普公司;流动相以磷酸盐(KH2PO4)溶液为主体,选择乙腈、甲醇和乙醇作为改良添加剂,流速(F)08mL/min~12mL/min;检测波长255nm,检测灵敏度01AUFS;纸速025cm/min;柱温为室温;进样量4L。23样品制备分别在电子天平(Sartorius)上准确称取20mg样品(KE和MKE),用甲醇20mmol/LKH2PO4(pH30)(体积比为35)溶液各自配制成质量浓度为025g/L的溶液。同时分离KE
5、和MKE时,上述溶液以11的体积比混合进样。3结果与讨论31流动相组成对分离的影响试验了流动相中添加不同体积分数的有机溶剂(甲醇、乙醇和乙腈)对手性分离的影响。为了保护蛋白柱免受破坏,流动相中有机溶剂的体积分数不宜超过50%。311甲醇体积分数的影响表1为不同体积比的甲醇和30mmol/LKH2PO4(pH30)组成的流动相对酮洛芬对映体分离的容量因子(k)和分离度(Rs)的影响。在该流动相体系中,甲醇比例增加,k值减小,而Rs值明显降低。选择甲醇30mmol/LKH2PO4的体积比为34100时对映体既得到较好分离,且保留时间也短。但甲醇的体积分数较大时,柱压也随之升高,而该蛋白柱允
6、许最大操作压力为20MPa,因此甲醇的体积分数应视系统压力的情况而定。312乙醇体积分数的影响试验了不同体积比的乙醇和20mmol/LKH2PO4(pH25)组成的流动收稿日期:19991129;修回日期:20000313作者简介:王解静(1975),女,硕士,现在北京红惠制药有限公司工作,电话:(010)62553081,Email:wxj111@263.net。第6期王解静等:卵类粘蛋白柱手性拆分酮基布洛芬537相对分离的影响(见表2)。增加乙醇比例,k和Rs值均相应降低,其中对Rs影响尤为明显。选择乙醇20mmol/LKH2PO4体积比为14100作为流动相时,既可达到完全分离,
7、分离时间也较短,但由于流动相pH值偏低,易使蛋白柱造成不可逆的损坏(通常pH值应不低于30)。将磷酸盐的pH值升至30时,虽Rs值可从148提高至160,但保留时间显著增加,k值几乎相应增大1倍。考虑到大量微生物筛选的需要,还应进一步设法缩短分析时间。表1流动相中甲醇体积分数对酮洛芬对映体分离的影响*Table1Effectofmethanolvolumefractionontheseparationofketoprofenenantiomer
