冷冻干燥保种.docx

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1、冷冻干燥保菌一．实验准备1.安瓿管准备保菌安瓿管规格（直径：8mm，高100mm，中性玻璃），先用2%盐酸浸泡8-10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水刷洗2-3次，烘干；管口塞好脱脂棉塞，121℃下高压灭菌20分钟，备用。2.保护剂的选择和准备选取新鲜、清洁、无抗生素污染的牛奶作为保护剂，牛奶要先脱脂，用离心方法（5000r/m下离心10min，出去上层奶皮，如此重复两次）去除上层油脂，115℃下高压灭菌25min，备用。（可以购买袋装或者盒装的超高温灭菌优质脱脂牛奶直接使用，无需再灭菌，或将脱脂奶粉制成还原乳，同上灭菌后使用

2、）10%脱脂无糖奶粉（或脱脂牛奶），4000rpm离心10分钟，吸去上清油脂，然后10磅灭菌10分钟可以配制20%的脱脂牛奶，然后在保存菌种时，脱脂牛奶和菌液等体积加入。也可以使用新鲜牛奶去脂后即可使用。一般细菌的保存最好在对数生长期，芽孢杆菌的保存最好在芽孢形成后再行保存。冻干法是长期保存细菌、酵母、真菌、病毒和立克次氏体的标准方法（Franks1985；Berny等1991；Smith1993；Day，Mclellan1995）。在冻干前一般要加冷冻保护剂，这样可使细胞免除在冷冻初期因形成冰晶而造成的损害。ATCC常规用1

3、0％脱脂奶或12％蔗糖作为冷冻保护剂，而美国农业部（USDA）的农业研究服务机构的实验人员用牛或马血清作为微生物的冷冻保护剂（Halliday，Baker1985）。在菌液中加入甘油和二甲亚砜（DMSO）也可防止冷冻中微生物的死亡，但实际操作中应根据不同微生物决定应用或不用防冻剂。用于冻干的实验设施成本为2.5万美元（Colwell1986），但准备冻干培养物的实际花销不高。用冻干法保存的细胞其长期活力很好，这种方法也许是目前所使用的微生物保存法中效果较好和最经济的方法（Halliday，Baker1985）。但有的微生物不适

4、宜应用该技术，如病原微生物在冻干过程中往往由于细胞飞溅而发生污染或感染事故，所以，对于某些病原微生物还必须使用其他的贮存方法保存。3.冻干样品的准备菌株准备及分装液体培养的菌种，经离心收集和用生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂（10ml脱脂牛奶中加1g米孢子粒）悬浮制成菌悬浮液。悬液中菌数要求达到108-1010个/ml为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用灭菌长嘴毛吸管或长针注射器，每管分装量约0.1-0.2ml（0.3-0.5ml，单管式冷冻管球形装液区内的装液量应为球体积的一半左右），分装安瓿管时间尽量要短，

5、最好在1-2小时内分装完毕并且预冻，分装时应注意在无菌条件下操作。4.预冻-80℃冰箱预冻1-2小时。二．冷冻干燥1.将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机上（冷冻干燥机要先开机预冷30分钟以上才开泵），开始冷冻干燥，时间一般为数小时。终止干燥时间应该根据以下情况判断：安瓿管内冻干物呈酥块状或者松散状；真空度接近空载时的最高值；选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结。（注意：确认干燥后，要先开启冷冻室的进气阀，让真空释放，然后停泵，打开冷冻室，将冷冻干燥管取出。）2.真空封口将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封

6、。一．保藏安瓿管保藏在-20℃冰箱中。二．活化如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管得外壁消毒，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，，在安瓿管中加入0.5-1ml液体培养基，慢慢旋转安瓿管，使冻干菌种复苏，然后直接接种到琼脂斜面或涂布平板。