常用中药的生物鉴定ppt课件.ppt

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1、常用中药的生物鉴定之聚合酶链式反应常用中药的生物鉴定方法免疫鉴定法电泳鉴定法生物效价鉴定法单纯指标鉴定法细胞生物学鉴定法DNA遗传标记鉴定法mRNA差异显示鉴定法聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。少量DNA样品快速扩增amplify技术。(inventedbyKaryMullis,wonaNobelPrizeinChemistryin1993)原理PCR要件模板Template引物P

2、rimers:SmallpiecesofDNA.Madeupof15to30bases.BindstheDNAataspecificregion.forwardandreverse正向和逆向酶Enzyme:TaqDNApolymerasePCR核酸Nucleotides:Substrate,fourdeoxyribonucleotides(A,C,G,T)dNTPMDistH2O117ul10Xbuffer15uldNTP12ulPrimer13ulPrimer23ulTaqpolymerase0.75u

3、l200ultubePipette上下混合取出15ul剩下的加入3ulTemplateDNA用pipette上下混合分装入tube15ul/支标上1…….51234554°C56586062RunPCRTcTc55°C不加模板的对照组M加入1ul模板DNA不加引物但有模板的对照Pc15ulMTC3ultemplate(T)PipettemixTC15ul/tubepcPC123451ultemplateTTCPC1234554555657586062oCRNUProgramDenature95°C5min

4、Denaturation变性：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，一般加热至90－95℃,30secAnnealing褪火：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链，55－70℃，固称其为褪火。mostimportantfactorinthePCR,45secExtension延伸：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链,温度为70－75ºC,1.5minFinalextension72°C,5min2x106优点:needver

5、ysmallamountofsample缺点:amplifiedproductmaybecontaminatedwithothersamplesnotrelatedtotheoneFactorsaffecttoPCRMg+2concentration,Mg+2specificity0.1~5mmol/LMg+2预实验Primer(引物)specificityDegenerateprimer---tofindthetargetgeneinthecloselyrelatedspeciesspecifici

6、ty,nonspecificproductsAnnealingTemperatureToohighnoPCRproductToolowmuchnonspecificproductgradientTempPCRmachinefindthesuitableTempTaqpolymerasequalityTemplate(模板)DNAqualityPCR产物鉴定Agarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%AgaroseinTAEbuffer(17ml)boilPou

7、rintothetray(assembledgelapparatus)AfterPCRamplificationAgarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%agarosein17mlTAE(4mmthick)5ulproductadd1ul6Xloadingdyemix1Kbmarker2.5ul100Vrun25-30minEBstain10min(EB致癌物,戴手套),photograph1.51.00.50.2Kb10gammaprimerMismatch3

8、base10gammaprimercompletematchPCR的应用1.detectiongeneticallymodificationorganism(GMO)检测转基因生物，找出特异的基因或片段findspecificgeneorfragment(promoter)2.unculturedmicroorganism3.pathogenidentification4.detectioninsertionsequence(