免疫学检测技术的基本原理及其应用ppt课件.ppt

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1、第二十三章免疫学检测技术的基本原理P226提要免疫学检测技术主要应用：对多种免疫性疾病的诊断、疗效评估、发病机制探讨;对抗原性物质、免疫细胞、细胞因子、粘附分子或细胞受体等的定性、定量检测。第一节抗原或抗体的检测抗原-抗体反应包括：沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应、中和反应等。抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。第一节抗原或抗体的检测免疫标记技术包括：免疫酶技术、免疫荧光技术、同位素标记技术、化学发光免疫技术、免疫胶体金技术等。抗原-抗体反应的特点：P226抗原-抗体的特异性结合。抗原抗体分子表面的非共价键结合。反应的

2、两个阶段：特异性结合阶段；可见的反应阶段。是否呈现可见的反应现象，与抗原和抗体两者的分子浓度和比例密切相关。抗原抗体比例对反应现象的影响抗原-抗体反应的影响因素1.电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠（适当浓度的电解质）作为稀释液。2.温度：反应常在37℃水浴或孵育箱中进行。3.酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度为PH6-8。抗原-抗体反应受多种因素影响抗原抗体的检测方法凝集反应沉淀反应中和反应用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应凝集反应(Agglutination)细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合、凝集的现象。1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，

3、出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法（定性试验）和试管法（半定量试验）。凝集反应(Agglutination)2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，形成致敏颗粒，与相应抗体反应出现的颗粒凝集现象。血球凝集沉淀反应（Precipitation)血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应（Precipitation)沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大多数沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。单向免疫扩散(SingleImmunodiffusion)将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中

4、制琼脂板；打孔，将抗原加入孔中扩散。抗原与抗体相遇，形成沉淀环，环的直径与抗原含量成正比。常用于测定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗体的凝胶沉淀环双向免疫扩散（DoubleImmunodiffusion)将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。含两种以上的抗原抗体系统，可出现两条以上的沉淀线。常用于抗原或抗体的定性、组成和两种抗原相关性分析的检测。免疫电泳（Immunoelectrophoresis)将待测血清标本作琼脂凝胶电泳，不同分子量蛋白组分开，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，与不同区带的蛋白抗原作双向

5、免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。常用于血清蛋白种类分析。火箭电泳（RocketElectrophoresis)也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。特点：需时较短，用于快速沉淀标本中抗原含量的测定。火箭电泳示意图免疫标记技术用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。能极大地提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。免疫荧光显微技术(I

6、mmunofluorescenceTechnique)将荧光素（异硫氰酸荧光素，FITC、藻红蛋白，PE)与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，对标本中抗原的鉴定和定位。包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。优点：是特异性强。缺点：每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。优点：敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测。补体结合免疫荧光法：在间接法的第一步抗原-抗体反应时加入补体，使之与抗原-抗体复合物结合

7、；再用荧光素标记的抗C3抗体进行示踪。间接免疫荧光法示意图免疫荧光显微技术流式细胞术（FlowCytometry,FCM)FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析。流式细胞术流式细胞仪工作原理酶免疫测定(EnzymeImmunoassay,EIA)用酶（常用辣根过氧化物酶，即HRP或碱性磷酸