石蜡切片技术ppt课件.ppt

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1、生物制片技术——石蜡切片和H-E染色【目的要求】通过制作动物石蜡切片和苏木精-伊红染色，了解石蜡切片制作和染色的基本原理和一般方法。【基本原理】——生物制片涂片法/滴片法压片法装片法/撕片法磨片法徒手切片法切片法石蜡冰冻火棉胶切片法概述先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，再用精密的切片机制作切片，这种方法称为包埋法。常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶、水和塑料等。根据包埋剂的不同，分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等，它们各有长处，但是使用得最多的还是石蜡切片技术。优点：石蜡能切出极薄的蜡片（2～10μm）；切片时能连成蜡带，便于制作连续切片

2、；操作较容易，组织块可以包埋在石蜡中长期保存。缺点：制作过程较长，步骤很多，一步不慎往往导致前功尽弃；处理会引起组织块或多或少地收缩；切片时受湿度影响比较大。【实验用品】1、器材：手术器械、双面刀片、青霉素玻璃小瓶、烘箱、酒精灯、塑料面盆、单面刀片、蜡铲、台木、切片机、切片刀、毛笔、蜡带盘、水浴锅、染色缸、载玻片、显微镜等。2、试剂的配制：固定液、酒精、二甲苯、石蜡、蛋清、甘油、苏木色精、氨水、盐酸、伊红、中性树胶。【基本步骤】1、取材2、固定3、漂洗4、脱水5、透明6、透蜡7、包埋8、修块9、切片10、贴片11、复水12、染色13、脱水14、透明15、封藏1.取材材料新鲜，

3、操作迅速。刀要锐利，避免挤压细胞。材料应小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度2-5mm，长宽5-10mm。2.固定用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的溶化和消失。使组织适当硬化以便于随后的处理。改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。固定剂固定剂的作用对象主要是蛋白质。良好的固定剂必须具备的特征：穿透速度快；不使组织膨胀或收缩以保持原形；硬化组织的程度适中；增加细胞内含物的折光度；增加媒染和染色能力；具有保存剂作用。简单固定剂和混合固定剂简单固定剂：乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。混合固定剂Bouin

4、液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）Zenker液（升汞5g＋重铬酸钾2.5g＋硫酸钠1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸镏水）Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）固定剂的种类甚多，必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。固定时注意事项足够的量，一般为组织块体积的10～15倍。固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几十小时，有时中间需要更新固定剂。一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，要在使用前才混合。组织块修整适度（后固定）3.漂洗目的：洗去渗入组织中的固定液，终止固定。以免影响对组

5、织内结构的观察、分析和研究。原则和方法：一般情况下是置水龙头下以自来水流水冲洗。1）各种以水配制的固定液如甲醛，都必须用流水冲洗，大块组织24小时，小块组织2—10小时。2）多聚甲醛固定用于免疫组织化学等特殊染色时，应将组织投入PB缓冲液中，每60分钟更新洗涤液一次，累计6小时。3）固定液为酒精时，一般不需用水冲洗，可直接进行脱水的程序。4）经含有苦味酸的固定液固定的组织块，应充分冲洗。水溶性固定液固定的组织块一般须冲洗12小时，再进入70%的酒精溶液洗涤；酒精溶性固定液固定的组织块直接进入70%的酒精溶液洗涤，可以脱掉苦味酸的黄色，但最好从50%酒精开始洗涤。5）用锇酸或含

6、有锇酸的固定液固定的组织，必须用流水彻底冲洗干净。6）冲洗好的组织可存放在75%酒精内。脱水剂能与水以任何比例相混合。脱水剂有两类：非石蜡溶剂，如乙醇、丙酮等，脱水后必须再经过透明，才能透蜡包埋；兼石蜡溶剂，如正丁醇，脱水后即可直接透蜡。常用的脱水剂是乙醇，因为它价格便宜，易于得到。4.脱水梯度酒精脱水目的避免剧烈的扩散引起的组织强烈收缩。（15%）-30%-50%-70%-80%-95%-95%-100%-100%脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h。如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中。因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆

7、化组织作用，放置时间不能过长。另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。5.透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。透明剂既可与脱水剂相混合又能和石蜡相混合可置换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用。使组织呈现不同程度的透明状态，有利于光线的透过。透明剂较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时