肾宁合剂微生物限度检查方法验证

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1、肾宁合剂微生物限度检查方法验证　　[摘要]目的验证肾宁合剂微生物限度检查方法。方法测定肾宁合剂中5种试验菌的回收率，以大肠埃希菌作为控制菌，金黄色葡萄球菌作为阴性对照菌，考察控制菌检查的专属性。结果5种试验菌的回收率均达到70%以上，细菌、真菌及酵母菌数测定均可采用常规法进行检验。结论肾宁合剂的微生物限度检查方法可行，能有效控制该制剂质量。[关键词]肾宁合剂；微生物限度检查；验证；大肠埃希菌[中图分类号]R927[文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2013）06（b）-0078-02肾宁合剂是本院结合临床研制的医院制剂，由黄芪、益母草、败酱草、川芎等组成，具有益

2、气活血、利水消肿、调节免疫功能的功效，用于急慢性肾炎、肾病综合征、糖尿病性肾病、急慢性肾功能衰竭等疾病。据调查目前微生物限度不合格是医院制剂不合格的主要因素之一[1]，为控制产品质量，本研究按照2010年版《中华人民共和国药典》（简称“中国药典”）附录的相关规定[2]，参考相关文献对肾宁合剂微生物限度检查方法进行了验证[3-4]，以保证患者用药的安全有效，现报道如下。71仪器与试药1.1供试品肾宁合剂，规格：100ml，由本院制剂室生产；批号：20120413。1.2培养基营养琼脂培养基，批号：110116；营养肉汤培养基，批号：110112；玫瑰红钠琼脂培养基，批号：11

3、0112；4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG），批号：100820；pH7.0改良马丁琼脂培养基，批号：101106；无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，批号：100824。以上培养基均由北京三药科技开发公司提供。1.3验证试验用菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]，大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]，枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63501]，黑曲霉（Aspergil1usniger）[CMCC（F）98003]，白色念珠菌（Candidaalbicans

4、）[CMCC（F）98001]。以上菌种均由中国药品生物制品检定研究院提供。1.4仪器和设备7SHINVA立式压力蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司），超净工作台（蚌埠净化设备厂），LRH-250生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），HTY-2000A集菌仪，HTY反复使用集菌培养器（杭州高得医疗器械有限公司）等。2细菌、真菌及酵母菌计数方法的验证2.1菌液制备接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，经25℃培养18～24h，取1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5，为50～100CFU/ml菌悬液备用。接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌

5、与枯草芽胞杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基上，经35℃培养18～24h，取1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6～10-7（50～100CFU/ml）的菌悬液备用。接种黑曲霉菌的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，25℃培养5d，加入0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5ml，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每毫升含孢子数50～100CFU的孢子悬液，备用。将上述5种菌液分别接种至相应的培养基上，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌，35℃培养2d；黑曲霉、白色

6、念珠菌，25℃培养2～3d。2.2供试液制备取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1︰10的供试液。2.3细菌、真菌及酵母菌计数方法的验证7供试品对照组：取1∶10的供试液1ml，立即倾注琼脂培养基，凝固后，置规定温度下，细菌培养24～48h，白念珠菌和黑曲霉菌培养48～72h，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。试验组：取1∶10的供试液1ml和50～100CFU/ml试验菌，分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基及玫瑰红钠琼脂培养基，5种试验菌株每株试验菌分别制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。菌液组：取各试验菌50～100CFU注入平皿中，立

7、即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，凝固后，置规定温度下，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉菌培养48～72h，测定所加入的实验菌数。试验组回收率计算：回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%。验证结果提示，5株试验菌人工染菌回收率达到70%以上，表明采用常规法做验证试验，方法可行（表1）。3控制菌检查方法的验证（常规法）试验组：取1∶10的供试液10ml和小于100CFU/ml大肠埃希菌试验菌液加到100ml胆盐乳糖増菌培养基中，35℃培养24～48h。取培养物0.