圆二色光谱实验报告.docx

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1、实验四—圆二色光谱实验姓名：张瑞芳学号：2013E班级：化院413班培养单位：上海高等研究院指导教师：李向军组别：2013年12月23日第三组圆二色光谱实验一、实验目的1、了解圆二色（CD）光谱的原理和使用方法。2、学会用圆二色光谱检测蛋白质二级构象的基本原理和方法，并学会分析物质的手性。3、了解圆二色光谱仪的基本构造，并学会使用。二、实验原理1.CD光谱的基本知识圆二色性是研究分子立体结构和构象的有利手段。在一些物质的分子中，没有任意次旋转反映轴，不能与镜像相互重叠，具有光学活性。电矢量相互垂直，振幅相等，位相相

2、差四分之一波长的左和右圆偏振光重叠而成的是平面圆偏振光。平面圆偏振光通过光学活性分子时，这些物质对左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，就是该物质的圆二色性。圆二色性用摩尔系数系数差ΔεM来度量，且有关系式：ΔεM=εL–εR，其中，εL和εR分别表示左和右偏振光的摩尔吸收系数。如果εL–εR>0，则ΔεM为“+”，有正的圆二色性，相应于正Cotton效应；如果εL–εR<0，则ΔεM为“-”，有负的圆二色性，相应于负Cotton效应。由于这种吸收差的存在，造成了矢量的振幅差，因此从圆偏振光通过介质后变成了椭

3、圆偏振光。圆二色性也可用椭圆度θ或摩尔椭圆度[θ]度量。[θ]和ΔεM之间的关系式：[θ]=3300*Δε圆二色光谱表示的[θ]或ΔεM与波长之间的关系，可用圆二色谱仪测定。一般仪器直接测定的是椭圆度θ，可换算成[θ]和ΔεM：[θ]=100θ/cl，ΔεM=θ/33cl其中，c表示物质在溶液中的浓度，单位为mol/L；l为光程长度（液池的长），单位为cm。输入c和l的值，一般仪器能自动进行换算，给出所需要的关系。2.定性分析原理圆二色光谱仪需要将平面偏振调制成左、右圆偏振光，并用很高的频率交替通过样品，因而设备复

4、杂，完成这种调制的是电致或压力致晶体双折射的圆偏振光发生器（也称Pocker池或应力调制器）。圆二色谱仪一般采用氙灯作光源，其辐射通过由两个棱镜组成的双单色器后，就成为两束振动方向相互垂直的偏振光，由单色器的出射狭缝排除一束非寻常光后，寻常光由CD调制器制成交变的左圆偏振光、右圆偏振光，这两束圆偏振光通过样品产生的吸收差由光电倍增管接受检测。测试时要通入氮气赶走管路中的水蒸气和光源产生的臭氧（臭氧会腐蚀反射镜）。光学活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率不同，其光吸收的差值ΔA(Al-Ad)称为该物质的圆二色性(cir

5、culardichroism，简写作CD)。圆二色性的存在使通过该物质传播的平面偏振光变为椭圆偏振光，且只在发生吸收的波长处才能观察到。所形成的椭圆的椭圆率θ为：θ=tg-1（短轴/长轴）根据Lambert-Beer定律可证明椭圆率近似地为：θ=0.576lc(εl-εd)=0.576lcΔε公式中l为介质厚度，c为光活性物质的浓度，εl及εd分别为物质对左旋及右旋圆偏振光的吸收系数。测量不同波长下的θ(或Δε)值与波长λ之间的关系曲线，即圆二色光谱曲线。在此光谱曲线中，如果所测定的物质没有特征吸收，则其Δε值很小

6、，即得不到特征的圆二色光谱。当εl>εd时，得到的是一个正的圆二色光谱曲线,即被测物质为右旋；如果εl<εd,则得到一个负的圆二色光谱曲线，即被测物质为左旋。三、实验试剂和仪器试剂：D/L苯丙氨酸；蒸馏水仪器：J-815CDSpectrometer；1cm比色皿*2圆二色光谱仪的基本构造如下图：图1.圆二色光谱仪的基本结构图四、实验步骤1.样品制备。实验所需样品由助教提前制备好待用。2.开机。打开高纯氮气，通入光路。打开计算机，进入操作界面，设置相关参数开启氙灯，等约30min，待仪器充分预热后，方可使用。3.测试

7、将光路径为1cm的样品池放入样品室中，进入测试界面，输入测试参数：灵敏度1000mdeg；扫面范围350-200nm；扫速50nm/min；响应时间2s；响应波长宽度1.0nm；扫描次数1次。先测试蒸馏水背景，再分别测试配制的两份溶液。4.关机打开样品室，取出样品池；退出操作界面，关闭氙灯；关闭氮气，关闭主机电源；关闭计算机和打印机；清洗样品池。五、数据处理实验测定DL苯丙氨酸样品均得到三组数据，分别为CD（θ），电压（HV），吸光度（Abs），以波长为横坐标作图。图2.D-苯丙氨酸的圆二色光谱图图3.L-苯丙氨

8、酸的圆二色光谱图分析：苯丙氨酸D型和L型的圆二色光谱图有显著区别，D型的CD值大于零，而L型的CD值小于零。根据圆二色光谱图CD值的不同可以判断手性物质为左旋或右旋，区别异构体，也可以作为定性鉴定物质的依据。另一方面，样品的吸光度则与浓度成正比相关，可作为定量分析。六、思考与讨论1.圆二色光谱在手性物质分析中的应用？答：光学活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率