GBT 19439-2004 H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法

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1、ICS11.220一一B‘’疡J中华人民共和国国家标准GB/T19439-2004H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法ProtocolofdetectingavianinfluenzavirussubtypeH5usingNASBA2004-02-14发布2004-02-15实施率督豁臀撬嘘臀蓬臀臀暴发“GB/T19439-2004月ii胃高致病性禽流感由正粘病毒科流感病毒属中A型流感病毒引起，世界动物卫生组织（OIE）列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病。依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离

2、方法相当，并具有检测速度快、特异性强、与鸡胚病原分离方法符合率高、易于操作的特点。本标准是在综合我国科研成果的基础上，参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》(2000年版），并结合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的。本标准附录A、附录B、附录C为规范性附录，附录D为资料性附录。本标准由上海市质量技术监督局和中华人民共和国上海出人境检验检疫局提出。本标准由国家质量监督检验检疫总局归口。本标准起草单位：中华人民共和国上梅出人境检验检疫局、上海市质量技术监督局、香港基因晶片开发有限公司。本标准起草人：单松华、陈家华、谢燕

3、、杨锡全、倪旦红、刘乐庭、刘俊平。GB/T19439-2004H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法1范围本标准规定了NASBA快速检测H5亚型禽流感病毒技术规范的材料准备、操作方法和结果判定。本标准适用于禽类、禽肉产品中H5亚型禽流感病毒的快速检测、诊断。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T1893

4、6-2003高致病性禽流感诊断技术3原理NASBA(Nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA，依赖核酸序列的扩增技术）是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶（反转录酶、核糖核酸酶H,噬菌体T7核糖核酸聚合酶）和两条寡核昔酸引物。上游引物5‘末端含有噬菌体’r7的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子序列，下游引物的5’末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列。在扩增步骤中，两个5'端都整合进扩增序列中，这样既成为产生互补RNA序列的模板，又能特异性结合检测步骤中的ECL

5、探针。扩增底物与ECL探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光（ECL）反应。已杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成比例对应。4材料准备4.1试验环境干净的环境，最好分区。分为核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个区，4.2器材采用常规的分子生物学器材，包括：一次性手套、移液器（量程5pL到200pL)、枪头、无RNA酶的1.5mL塑料离心管、1.5ml.离心管架、5ML试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、温度计（精度士2C)、加热器、水浴锅、5mL聚丙烯试管（VWR)

6、、封口膜等。如果采用ECI.方法，需要NucliSens阅读器或者等同的仪器。如果采用ELISA方法，需要酶标仪。4.3引物上游引物AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCAIAAAGA(C/T)AGACCAGCTA下游引物GATGCAAGGTCGCATATGAGGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGAC4.4检测试剂所有检测试剂在使用前，使其达到室温。a）裂解缓冲液：5mol/I.异硫氰酸肛,10写TritonX-100,10mmol/LTris-HC1,pH8.3;b）冲洗缓冲液：5mol/I.异硫

7、氰酸肌，IOmmol/LTris-HCI,pH8.3;0500mg/mI,硅土：500mg/ml,盐酸活化的二氧化硅；GB/T19439-2004d）洗脱缓冲液：10mmol/LTris-HCI,pH8.3;e)酶溶液（参见附录A);f)H5捕捉探针：10mmol/L生物素化寡聚核昔酸；探针序列为Biotin-GC(A/G)AGTTC(C/T)CTAGCACTGGCAATg）电化学发光法属别检测探针（10mMgenericECLdetectionprobe)：钉标记的DNA寡聚核昔酸；ECL序列为GATGCAAGGTCGCATATGAG

8、GTGA(C/T)AATGAATG(C/T)ATGGAAh）仪器调试参照液：10mmol/l.NASBACP;1mmol/LTris-HCIpH8.3;3mmol/LNASBA-ECL;i)检测稀释液：15