过表达RIP3增强乳腺癌细胞对小白菊内酯的敏感性的作用机制研究.docx

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1、过表达RIP3增强乳腺癌细胞对小白菊内酯的敏感性的作用机制研究目的：构建含有RIP3基因的真核表达载体,研究过表达RIP3基因对小白菊内酯抗乳腺癌细胞作用的影响及机制。为其作为抗乳腺癌新药的临床应用提供理论基础。方法：反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测及比较4株人乳腺癌细胞系MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,T47D及正常人乳腺上皮细胞MCF10A中RIP3mRNA的表达水平。以正常人乳腺上皮细胞MCF10A反转录cDNA为模板,PCR扩增RIP3基因cDNA全长,将合成的RIP3基因克隆入mCherry载体

2、的N末端,构建重组质粒mCherry-RIP3,测序证实mCherry-RIP3重组质粒构建正确与否。通过慢病毒法构建稳定过表达RIP3的MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞株。荧光显微镜下观察mCherry-RIP3蛋白在MCF-7及MDA-MB-231细胞内的表达效率及定位。RT-PCR及WesternBlot检测目的基因RIP3在MCF-7及MDA-MB-231细胞内mRNA及蛋白质的表达水平。用不同浓度小白菊内酯分别处理过表达RIP3及表达空载体乳腺癌细胞,显微镜下观察不同处理组乳腺癌细胞形态的变化,荧光显微镜下

3、观察不同处理组乳腺癌细胞核形态的改变,MTT比色法检测不同处理组乳腺癌细胞增殖的变化及量效关系,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内活性氧(ROS)水平,WesternBlot检测PARP蛋白及其裂解片段表达水平,小白菊内酯处理细胞的同时加用抗氧化剂NAC(N-乙酰半胱氨酸,N-acetyl-L-cysteine),MTT法检测乳腺癌细胞增殖的变化。结果：1.RT-PCR检测到MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,T47D细胞中RIP3基因普遍低表达,但在正常乳腺癌细胞MCF10A中高表达。2.重组载体测序鉴定该序列与Ge

4、nBank中的序列相同。获得外源性RIP3稳定转染的乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞株,荧光显微镜下观察到红色荧光蛋白表达率达90%以上,并且定位于胞质。RT-PCR及WesternBlot检测到目的基因RIP3在转染细胞中为过表达。3.随着小白菊内酯浓度的增加,MCF-7及MBA-MB-231细胞逐渐缩小变圆,细胞膜边界不清、胞膜破裂、细胞溶解死亡,与表达空载体MCF-7及MBA-MB-231细胞相比过表达RIP3细胞出现上述形态变化较明显。另外,过表达MCF-7及MBA-MB-231细胞相比表达空载体乳腺癌细胞表现出更多

5、的核固缩及碎裂。4.MCF-7及MDA-MB-231细胞的增殖率随小白菊内酯药物浓度的增高而降低。其中,过表达RIP3的MCF-7及MBA-MB-231细胞在相同浓度小白菊内酯的处理下增殖率较表达空载体乳腺癌细胞低(P<0.05)。5.同等浓度小白菊内酯处理下,过表达RIP3基因的MCF-7及MBA-MB-231细胞凋亡率明显高于相应的表达空载体细胞组(P<0.05)。6.同等浓度小白菊内酯处理下,过表达RIP3基因的MCF-7及MBA-MB-231细胞内PARP蛋白裂解片段的表达高于相应的表达空载体细胞组。7.刚等浓度小

6、白菊内酯处理下,过表达RIP3基因的MCF-7及MBA-MB-231细胞内ROS水平明显高于表达空载体细胞组(P<0.05)。联用抗氧化剂NAC后,各组乳腺癌细胞对小白菊内酯的敏感性下降,且过表达RIP3基因的MCF-7及MBA-MB-231细胞与表达空载体细胞增殖率相比差异无统计学意义。结论：1.RIP3基因在乳腺癌细胞MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,T47D中普遍低表达,而在正常乳腺细胞MCF10A中表达水平较高。本实验成功构建RIP3基因过表达重组质粒,获得稳定过表达外源性RIP3的乳腺癌MC

7、F-7及MDA-MB-231细胞株。2.小白菊内酯对于乳腺癌细胞的杀伤呈浓度依赖性,过表达RIP3基因可增强小白菊内酯对MCF-7及MDA-MB-231细胞的DNA损伤、生长抑制及凋亡诱导作用。3.过表达RIP3基因增强小白菊内酯对MCF-7及MDA-MB-231细胞杀伤作用的机制可能与其促使细胞内ROS的积聚有关。