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《猪牙皂皂苷抗肝癌作用机制的研究及其微球制剂的制备.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、猪牙皂皂苷抗肝癌作用机制的研究及其微球制剂的制备目的:本课题通过国内外文献调研和药理实验研究发现我国传统中药猪牙皂具有明显的抗肿瘤作用,其主要活性成分是三萜皂苷类化合物[1-6]。在前期研究的基础上,本课题拟采用中药化学分离、纯化和药理实验相结合的活性跟踪法制备猪牙皂皂苷,通过药理实验探讨猪牙皂皂苷（SFGS）是否具有抗肿瘤作用以及是否具有对索拉非尼的化疗增敏作用,并阐明其可能的药理作用机制。由于猪牙皂皂苷气味辛辣,对人体黏膜有一定刺激性,为方便猪牙皂皂苷的临床应用,本课题考虑以壳聚糖为载体材料制备猪牙皂纳米微
2、球,并进行表征测定和药效学评价。方法:试验一猪牙皂皂苷类化合物的分离纯化及抗肝癌活性研究1.进行猪牙皂总皂苷提取方法的研究,考察各单因素（提取方法和提取溶剂）对猪牙皂总皂苷提取率的影响。2.称取50g猪牙皂,制备总浸膏,用大孔吸附树脂法分离纯化,通过皂苷的检识反应和体外抗肝癌药理实验,进行活性部位的筛选。3.称取29kg猪牙皂,按照优化后的提取工艺制备猪牙皂总浸膏,并用大孔吸附树脂法分离纯化。根据预实验结果,选取药理活性最好的洗脱部位,用硅胶柱层析法分离纯化（洗脱剂为二氯甲烷-甲醇溶剂体系）,并对各洗脱部位进行体外抗肝癌活性筛选。4
3、.选取药理活性最好的硅胶柱洗脱部位,用MCI柱层析法分离纯化（洗脱剂为乙醇-水溶剂体系）,并对各洗脱部位进行体外抗肝癌活性筛选。5.选取药理活性最好的MCI柱洗脱部位,进行质谱分析,对里面的成分进行结构鉴定,然后用紫外分光光度法测定皂苷含量。试验二猪牙皂皂苷与索拉非尼联用抗肝癌药理作用机制的研究1.通过体外抗肝癌药理实验验证猪牙皂皂苷与索拉非尼联用是否具有协同增效作用。用免疫印迹法（WesternBlot,WB）法检测在不同给药情况下,肝癌细胞中凋亡相关蛋白（cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9）的表达
4、水平。2.通过WB法检测内质网应激（ERS）相关蛋白（GRP78、CHOP）的表达水平,验证猪牙皂皂苷是否能够激活肝癌细胞的ERS。通过体外抗肝癌药理实验和WB法检测ERS是否能够影响猪牙皂皂苷对索拉非尼的化疗增敏作用。3.通过WB法检测Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白（GSK-3β、β-catenin、TCF-4）的表达水平,验证猪牙皂皂苷是否能够抑制Wnt/β-Catenin信号通路。用β-Catenin特异性抑制剂（XAV939）处理肝癌细胞并进行相关检测,验证抑制Wnt/β-Catenin信号通路是否能够诱导肝癌细
5、胞凋亡。4.通过体外抗肝癌药理实验和WB法验证猪牙皂皂苷是否通过激活ERS介导Wnt/β-Catenin信号通路。用内质网应激激活剂（Thapsigargin,TG）处理肝癌细胞并进行相关检测,验证ERS是否能够介导Wnt/β-Catenin信号通路。5.建立H22荷瘤小鼠模型,验证猪牙皂皂苷与索拉非尼联用的体内抗肿瘤作用。试验三壳聚糖-猪牙皂皂苷纳米微球的制备及抗肿瘤作用研究1.选择壳聚糖-猪牙皂皂苷纳米微球的制备方法,并进行纳米微球制备工艺的研究,以外观、粒径、PDI、Zeta电位和包封率为评价指标,考察各单因素对纳米微球剂型的
6、影响。2.制备壳聚糖-猪牙皂皂苷纳米微球并进行表征测定。3.建立H22荷瘤小鼠模型,验证壳聚糖-猪牙皂皂苷纳米微球与索拉非尼联用的体内抗肿瘤作用。结果:试验一猪牙皂皂苷类化合物的分离纯化及抗肝癌活性研究1.经过比较,提取溶剂为75%乙醇,提取方法为加热回流法时,猪牙皂皂苷的提取率最高。2.通过泡沫试验和醋酐-浓硫酸反应,可知皂苷类化合物主要存在于大孔吸附树脂柱的30%乙醇洗脱部位和70%乙醇洗脱部位,且皂苷的主要类别为三萜皂苷。通过体外药理实验,证明70%乙醇洗脱部位的抗肝癌活性最好。3.通过体外药理实验,可知硅胶柱的二氯甲烷-甲醇
7、（2:1）洗脱部位抗肝癌活性最好。4.通过体外药理实验,可知MCI柱的60%乙醇洗脱部位的抗肝癌活性最好。5.将MCI柱的60%乙醇洗脱部位进行质谱检测,通过结构分析,鉴定了17个三萜皂苷类化合物,然后通过香草醛-高氯酸显色法测定皂苷含量,可知皂苷含量为77.4±2.1%。试验二猪牙皂皂苷与索拉非尼联用抗肝癌药理作用机制的研究1.通过体外抗肝癌药理实验,可知猪牙皂皂苷与索拉非尼联用组的抗肝癌药理活性均高于索拉非尼同等剂量单用组。此外,猪牙皂皂苷与中剂量索拉非尼（20μM/mL）联用组的抗肝癌药理活性高于高剂量索拉非尼（30μM/mL
8、）单用组的抗肝癌药理活性。检测肝癌细胞中cleavedcaspase-3蛋白、cleavedcaspase-9蛋白表达水平,猪牙皂皂苷和索拉非尼联用组要高于SFGS或索拉非尼单用组。2.猪牙皂皂苷能够激活肝癌细胞的ERS,上调肝癌细胞
