猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白纳米抗体的筛选及其抗病毒功能研究.docx

《猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白纳米抗体的筛选及其抗病毒功能研究.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白纳米抗体的筛选及其抗病毒功能研究猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由PRRS病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的病毒性传染病,该病在临床上主要引起母猪流产以及各年龄段猪的呼吸道疾病,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。由于PRRSV具有高变性和抗体依赖的增强作用,现有的疫苗并不能给猪群提供完全的保护作用,因此有必要尝试研发新型抗病毒策略。PRRSV的非结构蛋白9(Nonst

2、ructuralprotein9,Nsp9)具有RNA依赖的RNA聚合酶(RNAdependentRNAplolymerase,RdRp)活性,在病毒生命周期中发挥重要作用,并且与其他病毒蛋白相比Nsp9具有更高的保守性,是研发抗PRRSV药物的理想靶蛋白。纳米抗体(nanobody)具有分子量小、结构稳定、可溶性好、特异性强、生产成本低以及可以识别特殊抗原表位等优点。目前已有针对多种人类病毒纳米抗体的研究报道,结果显示具有良好的抗病毒活性和临床应用前景,然而在动物病毒上相关的研究报道还比较少。基于以上背景,本研究利用噬菌体展示技术筛选针对PRRSVNsp9的特异性

3、纳米抗体,探索其抗病毒活性和机制,为开发新型抗PRRSV的纳米抗体药物提供必要的实验依据和物质基础。本研究的主要内容和结果如下:1.利用OverlapPCR扩增Nsp9全长基因片段,将其克隆入pET-28a载体,构建了pET-28a-Nsp9重组表达载体。将其转化Transetta(DE3)感受态细胞,IPTG诱导后,经SDS-PAGE和westernblot分析表明Nsp9重组蛋白得到可溶性表达。经过Ni-NTA亲和层析柱和凝胶过滤层析柱两步纯化,得到具有较高纯度的Nsp9重组蛋白。将其免疫BALB/c小鼠制备抗血清,血清ELISA效价可以达到1:1,000,00

4、0表明本实验制备的Nsp9重组蛋白具有较好的免疫原性。2.利用Nsp9重组蛋白结合弗氏佐剂免疫成年雄性阿拉善双峰驼,经过6次免疫后,骆驼血清中Nsp9特异性抗体的效价可以达到1:128,000。分离外周血淋巴细胞,提取总RNA并反转录cDNA,利用巢式PCR扩增VHH基因,将其连入pCANTAB5E载体并转化TG1感受态细胞,得到了库容量为4×108的双峰驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过3轮淘选,共筛选到8株Nsp9特异性纳米抗体,其中Nb6和Nb7具有较强的结合力。3.将纳米抗体和Nsp9真核表达载体共转染HEK293T细胞,进行免疫共沉淀实验,结果表明,细胞

5、质内表达的Nb6和Nb7具有结合Nsp9的活性。随后将纳米抗体真核表达载体转染MARC-145细胞,利用加压筛选和有限稀释法,获得了稳定表达纳米抗体的MARC-145细胞系。细胞增殖实验表明,胞内纳米抗体没有细胞毒性。4.通过病毒感染实验研究了纳米抗体的抗病毒功能。研究结果表明,胞内表达的Nb6可以抑制多株PRRSV毒株(SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332)在MARC-145细胞中的增殖,并且在0.01MOI或更低接毒量条件下,可以完全阻断PRRSVSD16毒株的增殖。进一步的研究发现,胞内表达的Nb6可以结合PRRSV编码的Nsp9蛋白,并抑制病毒基

6、因的复制和转录。综上所述,本研究首次筛选到了PRRSVNsp9蛋白特异性纳米抗体,为Nsp9结构和功能的研究提供有用的研究工具,其中纳米抗体Nb6可以强烈地抑制多株PRRSV毒株在MARC-145中的复制,有望开发成为新型的抗PRRSV药物。