最新DNA甲基化实验课件教学讲义ppt.ppt

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1、DNA甲基化实验课件Content1、2、3、4、ExperimentsDNA甲基化简介DNA甲基化的生物学意义DNA甲基化的检测方法1.DNA甲基化简介DNA甲基化：在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMTs)的作用下，以SAM为供体，将一个甲基添加到胞嘧啶的5’-碳分子上，形成5-甲基化胞嘧啶，主要发生在CpG位点。哺乳动物基因组中约有5%-10%是CpG位点，其中约有70%为mCpG。CpG位点不是均匀分布，而是呈现局部聚集倾向，形成一些GC含量较高、CpG双核苷酸相对聚集的区域，即CpG

2、岛，CpG岛通常呈现低甲基化状态。基因启动区域内CpG位点的甲基化通过三种方式影响基因转录活性：DNA序列甲基化直接阻碍转录因子的结合；甲基CpG结合蛋白结合到甲基化CpG位点与其他转录抑制因子相互作用；染色质结构的凝集阻碍转录因子与其调控序列的结合；2.DNA甲基化的生物学意义DNA甲基化与基因表达调控2.DNA甲基化的生物学意义DNA甲基化与表观遗传学基因组印迹是指在配子或合子发生期间，来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性的加工修饰，导致后代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性的现象。其分子机理与甲

3、基化密切相关，DNA甲基化模式的维持对基因印迹在亲子代之间的遗传是必须的。X染色体失活，生长发育过程中，雌性哺乳类动物细胞中的两条X染色体其中一条失去活性的现象。X染色体上存在一个与X染色体失活有密切联系的核心部位。核心区命名位X染色体失活中心。失活的染色体上DNA序列都呈高度甲基化，导致绝大多数基因转录处于关闭状态。2.DNA甲基化的生物学意义DNA甲基化与胚胎发育在胚胎发育的不同时期，基因组范围内的DNA甲基化水平会发生剧烈的改变，改变最剧烈的阶段为配子形成期与早期胚胎发育阶段。DNA甲基化对胚胎正常发育和等位基因的选择

4、表达至关重要，错误甲基化模式的建立将引起人类的疾病，如脆性X染色体综合症。肿瘤细胞的特征：癌基因低甲基化——被激活；抑癌基因高甲基化——被沉默肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化，基因印迹缺失以及染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤在整体低甲基化的水平下，某些抑癌基因发生高甲基化，导致基因沉默，对肿瘤抑制能力低下甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，DNA甲基化水平越低，染色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力就越高，临床分期也愈晚2.DN

5、A甲基化的生物学意义DNA甲基化与肿瘤A．基因组甲基化水平(MethylationContent)的分析:高效液相色谱(High-performanceLiquidChromatography,HPLC)高效毛细管电泳法(High-performanceCapillaryElectrophoresis,HPCE)适用于基因组整体的甲基化水平研究，无法定位甲基化位点。B.甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法(methylation-sensitiverestrictionEndonuclease-PCR/Sou

6、thern,MSRE-PCR/Southern)，常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HpaⅡ-MspⅠ(CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。C.甲基化DNA免疫沉淀法(MethylatedDNAimmunoprecipitation,MeDIP)，特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白。D.重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion)--pyrosequencing，RRBS,BS-seq3.DNA甲基化的检测-----重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion)实验原理3.DNA甲

7、基化的检测CUBisulfite重亚硫酸盐将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。3.DNA甲基化的检测-----重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion)实验步骤细胞培养基因组提取重亚硫酸盐转化PCR扩增琼脂糖凝胶电泳焦磷酸测序细胞培养3.DNA甲基化的检测-----重亚硫酸盐转化法(Bisulfiteconversion)Hela细胞系DMEM高糖培养基3.DNA甲基化的检测-----重亚硫酸盐转化法(Bisulfit

8、econversion)2.基因组提取血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒在200μl离心管中配制重亚硫酸盐反应体系，具体配制体系如下：DNA样品Xµl(最佳DNA处理量为500-1000ng）ddH2O30-Xµl(DNA与ddH2O的最大体积为30μl)BisulfiteMix90μl