ELISA双抗体夹心法.docx

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1、ELISA双抗体夹心法点击次数：320?作者：百奥迈科发表于：2009-03-1316:18转较请注明來自丁香园1、原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相我体表面的抗原或抗体仍保持其九疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受

2、检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进疔定性或定量分析。聲的低化效率很高,问接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很离的緘感度。2、特点某些分泌型蛋白，用siRNA干扰后可以用ELISA进行栓測。3、ELISA实验流程示图（以双抗体央心法为例）AntibodyLabelingReagentsSeeondAntibodyorEniywe■SubMnte“ProductTugetAnilyte、BindJLLabelReadWash4、试剂与耗材（1）包械统冲液（pHM碳酸盐绽冲液）:Na2CO3L59gN

3、aHCO.J2.93gddH2O至1000mL(2)洗涤缓冲液(pH,MPBS):kh2po40.20gNa2HPOrl2H2O2.90gNaCl8.00gKC10.20gTween-200.50niLddH2O至1000mL(3)稀絳液:牛血清白蛋白(BSA)0.10o洗涤液至100111L羊血清、兔血清等血清10niL洗涤液至lOOniL(4)终止液(2M:ddH2O178.3niL浓硫酸至200mL在水中逐滴沿壁加入浓硫酸，边加边搅拌(5)底物缓冲液(pH):0.2MNa2HPO4(28.4g/L

4、)25.7niL0.1M柠檬酸(19.2gL)24.3niLddH2O至50niL(6)四甲基联苯胺(TMB)使用液:TMB(10mg/5nil无水乙醇)0.5niL底物缓冲液10.0niL0.75%H2O232.0liL1(7)2,r-连氮基-双-3-乙基-荣丙瞠咬啄硕按(ABTS)使用液:ABTS0.5mg底物缓冲液1.0inL3%H2O22.0pL(8)抗原.抗体和酶标记抗体：扶说明书处理。(9)标准品：用稀释液稀释成梯度浓度溶液。(8)96孔聚苯乙烯塑料板(聲标板)。2、实验步骤(双抗体央心法)

5、:(1)包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10yg/mLo在晦标板反应孔中加mL・4；C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤绽冲液洗板3次.每次3mine(2)加样：加一定浓度稀释的待检样品(同时做空白对照，阴性对照孔及阳性对照〉mL于上述已包筱的反应孔中，置湿盒中，37°C,1hr。用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。(3)加酶标抗体：千各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)。37°C,-1hr,用洗涤绽冲液洗板3次，每次3min。(4)拉底物液显邑：于各反应孔中加入现配的TM

6、B底物溶液mL.37°C.10-30min^(5)终止反应：于各反应孔中加入终止液mLo(6)结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450nm(若ABTS显色，读410n(n).读数，输出到Excel中。(7)以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，生成标准曲线和直线回归方程式，根据公式计算未知样品的浓度，并记录。