碱性磷酸酶染色(NAP)

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1、碱性磷酸酶染色（NAP）目的掌握卡氏偶氮偶联法测定中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。原理中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在pH9.6的碱性条件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种，常用的有坚牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等。新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s，流水轻轻冲洗30～60s，待干。把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10～15min。流水冲洗1～2min，加苏木素染色液中复染5～8min，流水冲洗，待干，镜检。结果判断　胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳

2、性。判断标准如下：0分：胞质中无阳性染色颗粒。1分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。2分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。3分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。4分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。5计算阳性率和积分值。方法步骤磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多，应根据基质选择相适应的重氮盐，坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是本法成败的关键。基质孵育液必须临用前新鲜配制，先应将血膜固定干燥后，才开始配制基质液。若无2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇，可用巴比妥缓冲液(pH9.2)或0.2mol/LTris缓冲液(pH9.2)代替。注意事项临床上主要用于鉴别：1.慢性粒细胞白血病与类白血病反应

3、：慢性粒细胞白血病(无继发性感染者)时，NAP积分一般明显下降，积分常＜13分，甚至为零分；类白血病反应时则显著增高，积分常＞200分。2.阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血：阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高，病情好转时，NAP积分则可逐渐下降。3.急性白血病的细胞类型：ALL增高，AML下降。临床意义铁染色（Ironstain）目的掌握骨髓铁染色的原理、方法、注意事项及临床意义。原理骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其所含的三价铁经稀盐酸处理后而游离，并能与酸性亚铁氰化钾溶液发生普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。细胞内铁也可

4、用此法显示，根据反应的强弱可了解骨髓中铁的含量。干燥涂片用甲醇固定10min，待干。玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，37℃染色30min。用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染10～15min。流水冲洗，待干，镜检。结果判断(1)幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。(2)细胞外铁用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。(3)细胞内铁用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞质中含有蓝色铁颗粒的细胞(铁粒幼细胞)的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒幼细胞分为四型。方法步骤细胞外铁的划分标准:(-)：无颗

5、粒。(+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者称为铁小珠)。(++)：有较多的铁颗粒或小珠。(+++)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。(++++)：有极多铁颗粒、小珠，并有很多的小块，密集成堆。铁粒幼细胞划分：Ⅰ型：幼红细胞内含1～2个小铁颗粒。Ⅱ型：幼红细胞内含3～5个小铁颗粒。Ⅲ型：幼红细胞内含6～10个小铁颗粒，或1-4个大铁颗粒。Ⅳ型：幼红细胞内含10个以上小铁颗粒，或5个以上大铁颗粒。环形铁粒幼细胞：是指幼红细胞含铁粒＞6个，绕核2/3以上者。玻片需经去铁处理将新玻片用清洁液浸泡24h，取出后反复水洗浸入95%酒精中24h，晾干，再浸泡

6、在5%盐酸中24h，用双蒸水反复浸洗玻片，取出烤干后备用。骨髓取材要满意，外铁一定要有骨髓碎块或颗粒，取材不佳时，往往影响结果。酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。注意事项鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血：IDA时骨髓细胞外铁显著减少或消失，铁粒幼红细胞明显减少，所见铁粒细小色浅，且以Ⅰ型为主，Ⅱ型极少见，Ⅲ型以上不见。经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多，此检查是诊断IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方法；非IDA，如HA、MA、AA等病人的细胞外铁通常增高，内铁亦增高，以Ⅰ型、Ⅱ型为主，可以见到Ⅲ型，罕见Ⅳ型。因此，有助于鉴别IDA与非IDA。用于诊断铁粒幼细胞性贫血：能找到数量不等

7、的环形铁粒幼细胞，多见粗颗粒的Ⅲ型与Ⅳ型铁粒幼细胞。用于诊断伴环形铁粒幼细胞增多的MDS：骨髓中环形铁粒幼细胞＞15%。临床意义