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1、成熟石榴叶片DNA提取方法研究安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2009,37(31):15141-15143,15156-赵丽华,王先磊2011/8/19MDF修改整理1.1主要试剂。①CTAB缓冲液:200mmol/LTris2HCl(pH值8.0),50mmol/LEDTA(pH值8.0),0.14mol/LNaCl,4%PVP,2%BME使用时加入;②CTAB-裂解液:100mmol/LTris2HCl(pH8.0),1.4mol/LNaCl,50mmol/LEDTA(pH8.0),3%C
2、TAB,4%PVP,1%BME使用时加入;③TE缓冲液:10mmol/LTris2HCl(pH值8.0),1mmol/LEDTA(pH值8.0);④酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1;⑤氯仿∶异戊醇=24∶1;⑥3mol/LNaAc(pH值5.0);⑦KAc(pH值8.0);⑧5mol/LNaCl;⑨RNaseA10ng/μl;⑩75%乙醇;无水乙醇;抗坏血酸粉末(Vc);PVP粉末;琼脂糖凝胶;TAE电泳液:0.04mol/LTris2HAc、0.002mol/LEDTA;Marker:λDNA/HindⅢ;GoldVie
3、w核酸染料;TaKaRa6×loadingbuffer;液氮。1.2 粗提方法1.2.1 石榴基因组DNA粗提方法。---改良CTAB法。①加入0.02gVc和0.03gPVP以及少量石英砂于研钵中，(用液氮将研钵预冷后)取除去叶脉的鲜叶0.50g快速置于研钵中；②研钵中多次加入液氮将叶片快速研磨至粉末状,迅速转至的10ml离心管中(内含预冷的CTAB缓冲液4ml),混匀,冰浴10min后,在4℃、5000r/min下离心10min,弃掉上清液，保留沉淀;③在沉淀中加入65℃预热CTAB裂解液4ml,混匀,65℃水浴30～
4、60min,中间轻柔振荡3次,放气1次;④在溶液中加入5mol/LKac(或NaCl)1ml,混匀,冰浴10～20min;⑤加入4ml氯仿∶异戊醇=24∶1,轻柔颠倒混匀,乳化10min,于18℃以上、12000r/min下离心10min,吸取上清液,转入新离心管中;⑥重复⑤1次,吸取上清液,转入新离心管中。⑦上清液溶液加入等体积的-20℃预冷的无水乙醇(或预冷的异戊醇),混匀,冰上沉淀30min;⑧于室温、12000r/min下离心10min,弃去上清液,将沉淀转入1.5ml离心管中;⑨用75%乙醇漂洗5min,重复1次
5、,再用无水乙醇漂洗5min,(吸掉乙醇后)沉淀置于室温下干燥至无酒精味;⑩加入100μl的TE液溶解沉淀(勿用移液枪吸打),进行DNA纯化或放入-20℃冰箱备用。1.2.2 石榴基因组DNA纯化。①在粗提DNA溶液中分别加入5μlRNaseA,37℃水浴30min,电泳查看RNA是否除净;②向除净RNA的DNA溶液中补加400μl的TE,加入500μl酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1(酚250μl和氯仿:异戊醇250μl),颠倒混匀5min,静置10min;③18℃以上、12000r/min下离心10min,吸取上清液,转
6、入新离心管中;④补加TE至总体积500μl,加入500μl氯仿∶异戊醇=24∶1,轻柔颠倒混匀,乳化10min,于18℃以上、12000r/min下离心10min,吸取上清液,转入新离心管中;⑤重复④1次,吸取上清液,转入新离心管中;⑥向上清液加入1.0～1.5倍体积-20℃预冷无水乙醇(或预冷的异戊醇),混匀,冰上沉淀30min;⑦于室温、8000～10000r/min下离心10min,弃去上清液,将沉淀转入1.5ml离心管中;⑧用75%乙醇漂洗5min,重复1次,再用无水乙醇漂洗5min,沉淀置于室温下干燥至无酒精味;
7、⑨加入100μl的TE液,溶解沉淀,放入-20℃冰箱备用。1.3 石榴基因组DNA质量检测1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测。在锥形瓶中配制0.6-0.7%琼脂糖凝胶17ml,在微波炉中加热沸腾,冷却至50℃,加入1.7μl核酸染料,将凝胶倒入电泳槽,使其充分凝固,将胶板放入电泳槽中;用移液枪取5μlDNA原液和1μlloadingbuffer,混匀,加入点样孔;以5μlλDNA/HindⅢ为标准,在1×TAE(或0.5×TBE)缓冲液中以5V/cm电泳,在凝胶成像系统上观察并拍照。1.3.2 紫外光检测。向纯化后的DNA溶液
8、中加入无菌水稀释20-100倍后,用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm值、OD260nm/OD230nm值、并计算DNA产量。CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一
