DNA甲基化

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1、DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。近15年来，人们越来越认识到DNA甲基化研究的重要性，开发出一系列检测DNA的方法。根据研究目的这些方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PC

2、R的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。DNA甲基化的分析方法很多，可分为总基因组甲基化的检测和单基因序列特异性甲基化分析的研究。总基因组甲基化的检测又分为全基因组序列特异性甲基化分析和基因组非特异性甲基化水平的研究。前者包括甲基化差异性杂交显示(differentialmethylationhybridization，DMH)、寡核苷酸微阵列法和基因组限制性酶切扫描法(restrictionlandmarkgenomescanning，RLGS)；后者包括3H—SAM掺人后液闪检测法和高压液相色谱法。对单基

3、因序列特异性甲基化分析包括传统的甲基化敏感的限制性内切酶(methylationsensitiverestrictionendonucleases，MSREs)分析、比较简洁的甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR，MSP)、全面反映甲基化情况的亚硫酸氢钠变性后测序(bisulfitegenomicsequencing)、甲基化敏感性单核苷酸引物扩增(methylationsensitivesinglenucleotideprimerextension，Ms—SnuPE)、较新颖的甲基化荧光检测(methylight)、结合亚硫酸氢钠变性

4、的限制性酶分析(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)、酶的区域性甲基化特异性分析(enzymaticregionalmethylationassay，ERMA)和变性高压液相色谱法(denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)。甲基化敏感的单核苷酸的扩增(Ms—SnuPE)Ms—SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶

5、全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms—SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms—SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。这样，如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端；若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C／T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况。甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)法methylatio

6、nsensitiverestrictionendonuclease，MSRE是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶，目前至少已发现320种。此类酶如在其切割位点中含有一个甲基化碱基，则它们中的绝大多数就不能切割DNA。MSRE法是基于甲基化敏感Ⅱ型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理。用甲基敏感Ⅱ型内切酶及其同工酶(对甲基化不敏感)切割含有一个或多个甲基化CpG序列的片段，然后用DNA印迹法分析。此法的最大优点就是无须知道靶DNA一级结构的详细信息，并可提供CpG岛甲基化状态的直接评价，包括取得一些对被检基因甲基化的定量分析信息。

7、但该法除了需要大量的高相对分子质量DNA(≥5ug)外，还只能检测到拷贝数比例大于百分之几的甲基化等位基因，并且仅能提供MSRE识别序列中那些CpG岛甲基化状态的信息。甲基化荧光PCR检测甲基化荧光检测(methylight)是利用荧光定量性PCR检测亚硫酸氢钠处理后的序列改变。在TaqManR技术中，可以使用3种不同的单核苷酸(正义引物、反义引物和荧光杂交探针)，进行不同序列的检测。与已存在的技术相比，甲基化荧光检测最明显的优点就是能同时对几百甚至几千例样品迅速检测。高敏感、快速是本方法最显著的特点，它可以在非甲基化等位基因超出10000倍的情况下精确地检测到甲

8、基化的等位