鸡胚原代细胞培养

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1、.-鸡胚原代细胞培养[实验材料]9～10日龄鸡胚，Hank"s液50mL，0．5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL(含犊牛血清1mL，双抗0．2mL，pH7．2)，O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL三角瓶，滴管假设干，链霉素小空瓶假设干(参加细胞悬液培养用)，高压灭菌塞子假设干，培养盘，蛋座，95％酒精，水浴锅。[实验容及操作程序]1．配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，用7％NaHC03调整pH至7．2～7．4，将胰蛋白酶调

2、整pH7．6(玫瑰红色)。置37℃水浴锅中预热备用。2.取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及脏，用Hank"s液(简称H液)洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加5mLH液轻摇，静止1～2min，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H液留组织。3．消化自水浴锅取出预热的胰酶，按组织块量约3～5倍参加三角瓶中，1个鸡胚约需5mL胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2挥发

3、及污染。37℃-.word.zl.-水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体而不易下沉时，那么需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，那么细胞不易分散。4．洗涤取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10mLHank"s液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。

4、静置1min，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出1mL于20mL营养液中，此液细胞数约50万～70万/mL。如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做100mL细胞悬液。6．细胞计数取上述细胞悬液0．5mL参加0．1％结晶紫一柠檬酸(0.1mol/L)溶液2mL，置室温或37℃温箱中5～10min，充分振动混合后，用毛细管吸取滴人血细胞计数板，在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法，计算四角大格完整细胞的总数。如3～5个聚集在一起，那么按1个计算，然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。细胞数/mL=4大格细胞总数/4×1000

5、0×稀释倍数例如：4大格的细胞总数为284个，而稀释倍数为5(0．5mL染色液)，那么每毫升细胞悬液的细胞数为284/4×10000×5=3．5×104个。7．稀释按照每毫升50万～70万个细胞密度的标准，将细胞悬液用营养液稀释之。-.word.zl.-(计数时，可见到大局部细胞完整分散，3～5个细胞成堆，且细胞碎片很少，说明消化适度；如分散细胞少，那么消化不够；如细胞碎片多，那么消化过度。)活细胞计数法取2％台盼蓝溶液1滴，细胞悬液1滴，混合计数，活细胞不着色，死细胞呈蓝色。8．分装培养分装于链霉素瓶中，每瓶约1mL，瓶口橡皮塞要塞紧。不适宜者弃

6、去，以免漏气造成污染或C02跑掉而营养液变碱。将细胞瓶横卧于培养盘中，于瓶上面划一直线，以表示直线的对侧面为细胞在瓶的生长位置。瓶上注明组别、日期，置37℃温箱培养，4h后细胞即可贴附于瓶壁，24～36h生长成单层细胞，此时可吸去培养液，更换维持液，并接种病毒。附：细胞培养所需的常用培养基与试剂1．Hank’s液配制原液甲NaCl8gKCl2gMgSO4·7H202gMgCl2·6H202g2．8％CaCl2100mL双蒸水加至1000mL-.word.zl.-先将固体成分加于800mL双蒸水中，加温到50～60℃加速溶解，再参加CaCl2溶液，最

7、后加双蒸水补足到1000mL。加氯仿2mL，摇匀后于4℃贮存。原液乙Na2HPO4·2H201.2gKH2PO4·2H201.2g葡萄糖20g0．4％酚红lOOmL双蒸水加：1000mL将上列各物混合后使其溶解，加氯仿2mL，摇匀后于4℃贮存。Hank"s工作液原液甲1份原液乙1份双蒸水18份工作液分装100mL，或500mL盐水瓶中，115~C灭菌10min，使用前以7％NaHCO3调节pH至07．2～7．6。2．0．4％酚红溶液配制酚红0.4g-.word.zl.-0．1％NaOH溶液11.28mL将酚红置于研钵中，加磨边缓缓加NaOH溶液，直

8、到所有颗粒完全溶解，置于至lOOmL量杯中，最后加双蒸水至lOOmL，摇匀后，保存于4℃冰箱备用。3.0.5％乳蛋白水解物