基因的克隆、表达载体构建及功能验证

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1、.-基因的克隆、表达载体构建及功能验证〔一般性方法〕一、基因克隆★事前三问a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？b.这个基因在哪种材料中扩增？c.材料需要怎么处理？◎实验前准备工作a.设计引物，准备材料，b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+、Kan+等抗生素准备※根本流程提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成1.1叶片、根

2、总RNA的提取Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。1）实验前准备预先配制0.1%的DEPC水〔ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37℃过夜处理12h〕，高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购置)。-.word.zl.-2)Trizol法〔小麦〕叶片或根的总RNA实验步骤如下：〔1〕提前在1.5ml离心管中参加1mlTrizol，然后

3、将200mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15s，在15-30℃温育5min，使核酸蛋白复合物完全别离。〔2〕4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。〔3〕吸取上清液加0.2ml氯仿，盖好盖，用力摇15s，15～30℃温育2～3min。〔4〕在≤12000g，4℃离心10min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。〔5〕将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加2倍体积的无水

4、乙醇沉淀RNA，室温静止30min。〔6〕在≤12000g，4℃离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。〔7〕用≥1ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5min，弃上清。（8）室温放置枯燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10min使RNA溶解。〔9〕配制以下体系：10×DNasebuffer5μlDNaseI〔RNase-free〕〔40μg/μl〕1μlRNasinInhibitor〔40μg/μl〕1μlTota

5、lRNA70μg加去RNase水至总体积为50μl〔10〕37℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100μl，参加等体积氯仿抽提一次。〔11〕取上清，参加10μl的3mol/LNaAC溶液，200μl的无水乙醇，-80℃沉淀30min。〔12〕2～8℃，12000g离心10min，弃清液，枯燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3〕RNA的质量及纯度检测〔1〕电泳检测取2ulRNA与1ul10×Loadingbuffer上样缓冲液混合均匀在1%的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA条带并记录实验结果。〔2〕分光光度计RNA纯度检测取

6、1ulRNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/A280比值，估测RNA质量。4〕cDNA第一条链的合成按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA：-.word.zl.-1）在Eppendorf管中配制以下混合液：试剂名称使用量模板RNA1µgOligodTprimer(50µM)1µldNTPMixture(10mM)1µlRNasefreedH2Oupto10µl2〕65℃保温15min后迅速在冰上急冷2min。3〕离心数秒使模板RNA/引物等的混合液聚集Eppendorf管底部。4〕在上述Eppendorf管中配制以下反转

7、录反响液:试剂名称使用量上述模板RNA/引物等的混合液10µl5×Frist-StandBuffer4µlRNaseInhibitor(40U/µl)0.5µlMTVRTase(10U/μl)0.5µlRNasefreedH2Oupto20µl5〕37℃保温60min。6〕95℃,5min后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。1.2小麦胚及胚乳总RNA的提取〔1〕配制RNA抽提buffer，50ml中含有：1MTris-HCl〔PH9.0〕2.5ml4MNaCl1.5ml10%SDS5mlDEPC-H2O41.25ml〔2〕取以上RN

8、A提取液650ul，加350ul水饱和酚，放入1.5ml离心管中，65℃水浴预热。〔3〕研磨0.3g材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚挥发，迅速参加到上述预热的提取液中