DB41-T 1590-2018 饲料中阪崎肠杆菌的检测 EMA-PCR法

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1、ICS65.120B46DB41河南省地方标准DB41/T1590—2018饲料中阪崎肠杆菌的检测EMA-PCR法2018-04-17发布2018-07-17实施河南省地方标准公共服务平台河南省质量技术监督局发布河南省地方标准公共服务平台DB41/T1590—2018前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、河南中标检测服务有限公司。本标准主要起草人：张发旺、董鹏、郑洪、狄元冉、方忠意、刘传辉、杜红鸽。本标准参加起草人

2、：高延玲、李金磊、李华岑、柴磊、巩丹、郑彬、朱雷、贾松涛、韩楠、臧合英、徐坤、杨希祥。河南省地方标准公共服务平台I河南省地方标准公共服务平台DB41/T1590—2018饲料中阪崎肠杆菌的检测EMA-PCR法1范围本标准规定了饲料中阪崎肠杆菌的EMA-PCR检测方法。本标准适用于饲料中阪崎肠杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.40食品安全国

3、家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3原理叠氮溴化乙锭（EMA）能够透过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合，使死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增，而活菌能进行PCR扩增。4试剂和材料4.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682一级水的要求。4.2缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A的A.1。4.3改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（mLST-Vm）：见附录

4、A的A.2。2+4.42×PremixTaq缓冲液：内含TaqDNA聚合酶1.25U/25μL，4mmolMg，dNTP各0.4mmol。4.5特异性引物(对)序列为：a）上游引物：5＇-CTGCTCTGCTGACGAGTGG-3＇；b）下游引物：5＇-CATCTCTGCAGGATTCTCTGGA-3＇。4.6琼脂糖：电泳级。4.7Marker2000。4.8阪崎肠杆菌ATCC25944。4.950×TAE缓冲液：见附录A的A.3。4.106×上样缓冲液：见附录A的A.4。4.11叠氮溴化乙锭（EM

5、A，0.2mg/mL）：见附录A的A.5。4.12溴化乙锭（10mg/mL）。4.13灭菌离心管：1.5mL，15mL。5仪器设备河南省地方标准公共服务平台1DB41/T1950—20185.1PCR仪。5.2天平：感量0.01g。5.3电热恒温培养箱。5.4离心机：转速≥12000r/min。5.5浊度仪。5.6卤素灯：照度≥25000勒克斯（Lux）。5.7核酸电泳仪。5.8凝胶成像系统。5.9微量移液器：0.5μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL，1mL～10mL。5

6、.10涡旋仪。6样品采集与制备按GB/T14699.1的规定采样，将样品充分混匀后密封低温保存，整个过程避