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分类号：R725.1学号：2010210206重庆医科大学硕士学位论文（专业学位）2016年重庆地区儿童急性腹泻中轮状病毒分子流行病论文题目学特征研究作者姓名代秋菊指导教师姓名（职称、单位名称）许红梅教授重庆医科大学附属儿童医院专业学位类别名称临床医学专业学位领域名称儿科学论文答辩年月2018年5月 分类号：R725.1学号：2010210206重庆医科大学硕士学位论文（专业学位）2016年重庆地区儿童急性腹泻中轮状病毒分子流行病学特征研究论文题目作者姓名代秋菊指导教师姓名（职称、单位名称）许红梅教授重庆医科大学附属儿童医院专业学位类别名称临床医学专业学位领域名称儿科学论文答辩年月2018年5月 重庆医科大学研宄生学位论文独创性声明人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成本人申明所呈交的论文是我本果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经，据我所知发表或撰写过的研究成果，也乇包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料．与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均巳在论文中作了明确的说明丼表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处人承担一切相关贵任。，本学位论文作者签名？：日期？Ｍ‘辨学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学？本人保证毕业离校后■发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和谮阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），并编入有关数据库逬行检索，可以采用影印、结印或其鮮段歸论文，保絲文讀紅娜本授权书ａ论文作者签名指导教师签名：曰期： 目录英汉缩略语名词对照.......................................................................................................1中文摘要...........................................................................................................................2英文摘要...........................................................................................................................5论文正文：2016年重庆地区儿童急性腹泻中轮状病毒分子流行病学特征研究......9前言.........................................................................................................................91材料与方法.........................................................................................................111.1研究对象.................................................................................................111.2实验材料.................................................................................................111.3实验方法.................................................................................................131.4统计学分析.............................................................................................152结果.....................................................................................................................152.1轮状病毒感染的临床情况.....................................................................152.2轮状病毒基因型分型.............................................................................243讨论.....................................................................................................................31全文小结.........................................................................................................................35参考文献.........................................................................................................................36文献综述.........................................................................................................................40致谢...............................................................................................................................53攻读硕士学位期间论文发表情况.................................................................................54 重庆医科大学硕士研究生学位论文英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称RVRotavirus轮状病毒RT-PCRReversetranscriptionpolymerasechain逆转录聚合酶链式反应reactionWHOWorldHealthOrganization世界卫生组织LLRLanzhouLambRotavirusvaccine兰州羔羊轮状病毒疫苗DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯AMVAvianmyeloblastomavirus禽骨髓母细胞瘤病毒RNasinRNaseInhibitor核糖核酸酶抑制剂TaqThermusAquaticus耐热dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸cDNAComplementarydeoxyribonucleicacid互补脱氧核糖核酸RNARibonucleicAcid核糖核酸PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸1 重庆医科大学硕士研究生学位论文2016年重庆地区儿童急性腹泻中轮状病毒分子流行病学特征研究摘要目的：调查2016年重庆地区儿童急性腹泻中轮状病毒临床及分子流行病学特征，动态监测轮状病毒在重庆地区儿童的感染情况，为识别、预防、治疗轮状病毒感染及本地区最佳疫苗的选择提供依据。方法：采集了2016年1月至12月期间就诊于重庆医科大学附属儿童医院本部门诊患儿的符合纳入标准的急性腹泻大便标本505份，同时获取相应患儿的相关临床资料，所有标本经胶体金法检测轮状病毒抗原，被检测出轮状病毒阳性的标本进一步进行RT-PCR扩增，扩增成功的产物进行测序，测序成功后则进行VP7（G）、VP4（P）基因型分型。结果：1.在收集的505例标本中（男327例，女178例），经胶体法检测RV阳性有162例（男性97例，女性65例），阳性率为32.08%（162/505），男女患儿的RV阳性率分别为29.66%（97/327）、36.52%（65/178），男女患RV肠炎的概率无显著性差异（χ2=2.485，P=0.115）。162例中2岁以内婴幼儿占92.59%，0~6月龄、6~12月龄、12~24月龄、24~36月龄、36~48月龄、48~60月龄、大于60月龄各占19.75%（32/162）、38.89%（63/162）、33.95%（55/162）、2.47%（4/162）、2 重庆医科大学硕士研究生学位论文3.09%（5/162）、0.62%（1/162）、1.23%（2/162），各年龄组的RV阳性率分别是32.00%（32/100）、30.29%（63/208）、39.57%（55/139）、17.39%（4/23）、31.25%（5/16）、10.00%（1/10）、22.22%（2/9）。RV肠炎在全年各个月份均有发病，RV阳性率在冬季最高，尤其是在12月、1月为发病高峰期。2.该162例RV肠炎患儿中伴有呕吐、发热、呼吸道症状的病例分别为83例、56例、62例，各自的阳性率分别为51.23%（83/162）、38.27%（62/162）、34.57%（56/162）。64.2%患儿在腹泻病程3天内就诊，82.72%患儿在腹泻病程5天内就诊；每日腹泻4~6次患儿例数最多，占RV肠炎总例数的46.91%，10次以内占94.44%。大多数病例呕吐天数为1~2天（81.93%，68/83），每日呕吐6次以内的病例数占90.37%。RV肠炎伴发热以中低热为主（80.35%，45/56)）。3.经胶体金法检测RV阳性的162例标本中，经扩增、测序成功的有71例，按照VP7（G）、VP4（P）基因型分型，共检测出5种G基因型、2种P基因型和5种基因型组合。G基因型中有G9（77.46%，55/71）、G3（7.04%，5/71）、G1（2.82%，2/71）、G2（2.82%，2/71）、G4（1.41%，1/71），8.45%（6/71）未分出型别。P基因型中有P[8]（83.10%，59/71）、P[4]（1.41%，1/71），15.49%（11/71）未分出型别。G/P组合基因型中有G9P[8]（67.61%，48/71）、G3P[8]（4.22%，3/71）、G1P[8]（1.41%，1/71）、G2P[8]（1.41%，1/71）、G2P[4]（1.41%，1/71），23.94%（17/71）未分出型别。各种基因型主要在秋冬季节检出，而在夏季检出最少。3 重庆医科大学硕士研究生学位论文结论：2016年重庆地区儿童RV肠炎发病率仍较高，2岁以内婴幼儿为主要感染对象。RV肠炎的发生具有明显的季节性，发病高峰在冬季。呕吐与RV肠炎有密切相关性，而发热、呼吸道症状与RV肠炎无明显相关性。G基因型中，G9为优势流行株，其次是G3、G1、G2、G4。P基因型中，P[8]为优势流行株，其次是P[4]。G/P基因型组合中，G9P[8]为优势流行株，其次是G3P[8]、G1P[8]、G2P[8]、G2P[4]。不同年份RV的G/P基因型分型构成不同，但2014年至2016年3年的各基因型别的优势流行株均相同（G9、P[8]、G9P[8]），且该三年的P基因型相对稳定。关键词：腹泻，轮状病毒肠炎，临床特征，基因型4 重庆医科大学硕士研究生学位论文EPIDEMIOLOGICALCHARACTERISTICSOFROTAVIRUSINCHILDRENACUTEDIARRHEAINCHONGQINGIN2016ABSTRACTObjective:ToinvestigatetheclinicalandmolecularepidemiologicalcharacteristicsofrotavirusinchildrenacutediarrheainChongqingin2016,andmonitordynamicallytheinfectionofrotavirusamongchildreninChongqing,providingabasisfortherecognition,preventionandtreatmentofrotavirusinfectionandtheselectionofthebestvaccineinChongqing.Methods:FromJanuarytoDecemberin2016,atotalof505fecelsampleswerecollectedfromchildrenwithacutediarrheaconformingtotheinclusioncriteriaattheoutpatientdepartmentoftheAffiliatedChildren'sHospitalofMedicalUniversityOfChongqing,therelevantclinicaldataofthecorrespondingchildrenwasobtainedsimultaneously.AllsamplesweredetectedbyELISAforgroupArotavirus,andthentherotavirus-positivespecimensweretestedbyRT-PCRtoclassifythegenetypesofVP7(G)、VP4(P).Results:1.Atotalof505fecalsamples(male327,female178)werecollected,and162fecalsamplesincluding97maleand65femalewerediscoveredtorotavirus-positivebyELISA,thepositiverateofrota5 重庆医科大学硕士研究生学位论文virusin2016was32.08%(162/505),andthepositiverateofrotavirusinmaleandfemalerespectivelywere29.66%and36.52%,therewasnosignificantdifferenceinthegenderdistribution(χ2=2.485,P=0.115).In162cases,infantsandchildrenunder2yearsoldaccountsfor92.59%,and0~6、6~12、12~24、24~36、36~48、48~60、over60monthsofagesuccessivelyaccountsfor19.75%(32/162)、38.89%(63/162)、33.95%(55/162)、2.47%(4/162)、3.09%(5/162)、0.62%(1/162)、1.23%(2/162),thepositiverateofRVineachagegrouprespectivelyis32%(32/100),30.29%(63/208),39.57%(55/139),17.39%(4/23),31.25%(5/16),10%(1/10),22.22%(2/9).RVenteritisoccurredinallmonthsoftheyear,andThepositiverateofRVwasthehighestinwinter,especiallyinDecemberandJanuary.2.ThecountsofRVenteritischildrenin162caseswithvomiting,fever,respiratorysymptomswere83cases,56cases,62cases,thepositiverateswere51.23%(83/162)、38.27%(62/162)、34.57%(56/162),respectively.64.2%ofthechildrenhadadoctor’officevisiitingwithin3daysofthediarrheacourse,and82.72%ofthemsawadoctorwithin5daysofthediarrheacourse.It’smostcommonthatchildrensufferedfromdiarrhea4~6timesaday,accountingfor46.91%ofthetotalcasesofRVdiarrhea,and10timesadayaccoutingfor94.44%.Inmostcases,thenumberofdaysofvomitingwas1~2days(81.93%,68/83).Thenumberofcaseswithin6timesofdailyvomitingaccounte6 重庆医科大学硕士研究生学位论文dfor90.37%.ThedegreeoffeveraccompanyingRVenteritiswasdominatedbymiddleandlowheat(80.35%,45/56).3.In162fecalsamplesidentifiedrotavirus-positivebyELISA,therewere71caseswhichsucceededingeneamplificationandsequencing,andwerefoundthattherewerefivetypesofGgenotypes、twotypesofPgenotypesandfivetypesofG/Pgenotypescombination,accordingtoVP7(G)andVP4(P)genotypesclassification.InGgenotypes,therewasG9(77.46%,55/71)、G3(7.04%,5/71)、G1(2.82%,2/71)、G2(2.82%,2/71)、G4(1.41%,1/71)，ungenetypeaccountedfor8.45%(6/71).InPgenotypes,therewasP[8](83.10%,59/71)、P[4](1.41%,1/71)，ungenetypeaccountedfor15.49%(11/71).InG/Pgenotypes,therewasG9P[8](67.61%,48/71)、G3P[8](4.22%,3/71)、G1P[8](1.41%,1/71)、G2P[8](1.41%,1/71)、G2P[4](1.41%,1/71)，ungenetypeaccountedfor23.94%(17/71).Allgenotypesweredetectedmainlyintheautumnandwinterseason,butwerefoundatleastinsummer.Conclusion:TheincidenceofRVenteritisamongchildreninChongqingwasstillhighin2016,InfantsandyoungchildrenundertwoyearsofagewerethemaintargetofRVinfection.TheoccurrenceofRVenteritisisobviouslyseasonal,thepeakofonsetisinwinter.Accordingtotheresultsofstatisticalanalysis,it’sfoundthatVomitingiscloselyrelatedtoRVenteritis,butfeverandrespiratorysymptomshavenosignificantcorrelationwithRVenteritis.InGgenotypes,G9wasthedominant7 重庆医科大学硕士研究生学位论文epidemicstrain,followedbyG3,G1,G2,G4.InPgenotypes,P[8]wasthedominantepidemicstrain,followedbyP[4].IntheG/Pgenotypecombination,G9P[8]wasthedominantepidemicstrain,followedbyG3P[8],G1P[8],G2P[8]andG2P[4].TheG/PgenotypingofRVindifferentyearsisdiverse,butthedominantstrainofallthegenotypesinthe3yearsfrom2014to2015werethesame(G9,P[8],G9P[8]),thePgenotypeofthethreeyearswasrelativelystable.Keywords:Diarrhea,RotavirusEnteritis,Clinicalcharacteristics,Ge--notype8 重庆医科大学硕士研究生学位论文2016年重庆地区儿童急性腹泻中轮状病毒分子流行病学特征研究前言腹泻是肠道功能紊乱的一种表现，它会引起频繁的肠道分泌物排出增加，导致水、电解质和营养物质的流失[1]。腹泻是发展中国家婴幼儿发病率和死亡率的主要原因之一，它日益被认为是一种贫穷的疾病[2]。每年有超过10亿次腹泻发生在5岁以下的儿童中，造成约250万人死亡[2,3]。全球腹泻相关死亡超过40%发生在非洲[4,5]，与发达国家相比，发展中国家感染腹泻病的风险更高[6]。腹泻的感染原因很多，如病毒、细菌、原生动物或寄生虫的感染[7,8,9]。病毒是造成婴幼儿急性腹泻最常见的原因，而轮状病毒是世界范围内婴幼儿急性腹泻的主要病因[10]。几乎所有5岁以下儿童均至少感染过一次轮状病毒，严重感染病例往往发生在6月至2岁的婴幼儿，尤其是免疫缺陷儿童[11,12]。2008年全球范围内，RV感染导致的死亡人数达45.3万，占全年腹泻死亡人数的37%，其中5岁以下儿童占5%[13]。RV为呼肠病毒科，RV属，无包膜，为一个三层的二十面体蛋白质衣壳包绕由11个节段性双链RNA组成的病毒基因组，编码6种结构蛋白（VP1-VP4,VP6,VP7）和6种非结构蛋白（NSP1-NSP6），除第11基因编码NSP5、NSP6外，其他基因节段各均编码一种蛋白。内层蛋白（VP2）围绕病毒基因组、RNA相关RNA聚合酶（VP1）和冠状酶（VP3）组成病毒核心，核心被中间层蛋白（VP6）包围形成一个双层的粒子，外围再被VP7和VP4包围形成具有感染性的成熟颗粒[14]。轮状病毒可分为群、亚群、基因型，在内层衣壳VP6上存在群和亚群特异性，目前已发现了至少10个群（A-J）[15,16,17]，编码外衣壳VP7和VP4的基因将分别将RV分为G基因型和P基因型，现已发现了28种G基因型和39种P基因型[18]，其中全球范围内儿童最易感的基因型是5种G基因型（分别为G1、G2、G3、G4和G9）、2种P基因型（分别为P[4]和P[8]）[19]。RV感染主要发生在5岁以下儿童，尤其是6月至2岁婴幼儿，好发于秋冬季9 重庆医科大学硕士研究生学位论文节，主要经粪-口途径传播，潜伏期有1~2天[20]，急性起病，以腹泻、呕吐为主要临床症状，最新研究结果显示[21]，相比于未接种RV疫苗组，接种RV疫苗组中腹泻病程与频次、呕吐病程与频次、脱水的发生、住院时间等均较短，这说明RV疫苗的使用减轻了RV肠炎的病情程度。RV疫苗对严重RV肠炎具有很好的保护作用，但对RV感染的预防作用仍欠缺，因此，仍有部分患儿会因呕吐、腹泻严重出现脱水、酸中毒和电解质紊乱，严重时危及生命。对于RV肠炎，并无特效药物，主要治疗方法为纠正水电解质紊乱等对症支持治疗，而疫苗接种是控制感染的最有效措施。RV血清型具有多样化的特点，而且不同时间或不同地区其流行病毒株有所不同，这为RV疫苗的研发带来了巨大的挑战。RV肠炎给全球带来了巨大的社会经济负担，2009年WHO向全世界儿童推荐了Rotarix和Rotateq两种疫苗，随着RV疫苗的使用，RV腹泻的发病率和死亡率有所下降。但RV疫苗的保护作用在各个地区有所不同，其保护作用在发达国家明显高于发展中国家。目前投入使用的RV疫苗有WHO推荐的Rotarix和Rotateq、中国的LLR、越南的Rotavin-MI、印度的Rotavac和Rotasiil等等，它们各自包含了不同的血清型别。本研究中搜集了2016年全年就诊于重庆医科大学附属儿童医院本部门诊患儿的符合纳入标准的急性腹泻大便标本505份及相应患儿的相关临床资料，进行该年重庆地区儿童轮状病毒临床及分子流行病学的研究，为RV感染预防和治疗，及地区性最佳疫苗的研发和选择提供依据。10 重庆医科大学硕士研究生学位论文1材料与方法1.1研究对象采集了2016年1月-12月就诊于重庆医科大学附属儿童医院本部门诊患儿的符合纳入标准的急性腹泻大便标本505份（保存于-70℃冰箱），并获取相应患儿的相关临床资料（包括了患儿性别、年龄、发病日期、就诊前腹泻天数及最高腹泻次数/天、粪便性状、有无伴呕吐、发热、呼吸道症状相关伴随症状及其程度等等）。标本纳入标准：①新鲜大便；②腹泻病程须在2周内；③粪便性状有改变（排除脓血便），或粪便次数有改变；④粪便镜检白细胞或红细胞每高倍视野小于10个；⑤排除因其他系统感染长期使用抗生素者。本研究得到了重庆医科大学附属儿童医院医学伦理委员会批准同意。1.2实验材料1.2.1主要仪器表1.仪器名称及其生厂商Table1.InstrumentandIt’sManufacturer仪器名称生产商核酸提取仪中国天隆科技有限公司低温高速离心机美国Thermo公司小型台式低速离心机上海安亭离心机厂96孔板式PCR仪器美国BIO-RAD公司电泳仪美国BIO-RAD公司超低温冰箱（-80℃）美国Harris公司电子分析天平上海梅特勒-托利多公司移液器美国瑞宁公司11 重庆医科大学硕士研究生学位论文手掌型离心机中国海门其林贝尔电泳凝胶成像分析系统美国BIO-RAD公司微波炉中国格兰紫外线透射观测仪美国UVP公司干式恒温仪中国绍兴卫星医疗有限公司1.2.2主要试剂表2.试剂名称及其生厂商Table2.ReagentandIt’sManufacturer试剂名称生产商A群RV抗原检测试剂盒四川迈克生物科技股份有限公司琼脂糖西班牙Biowest公司DEPC中国上海生工生物有限公司AMV反转录酶美国Promega公司RNasin美国Promega公司rTaq聚合酶中国Takara公司dNTPmix中国Takara公司病毒DNA/RNA提取试剂盒中国金麦格有限公司1.2.3常用溶液的配置（1）PBS（PH7.45）溶液NaCl145mmol/L，KCl2.68mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO41.76mmol/L，混匀后分装备用。（2）DEPC水每1L水中加入1mLDEPC，配置成DEPC水，常温搅拌过夜后高温高压灭菌30min，即得DEPCTreatedWater。（3）琼脂糖凝胶电泳相关试剂①50×TAE缓冲液：称取Tris242g，Na2EDTA·2H2O37.2g于1L烧杯中，12 重庆医科大学硕士研究生学位论文向烧杯中加入约800mL去离子水，充分搅拌均匀；加入57.1mL的冰乙酸，充分溶解，用去离子水定容至1L后，室温保存。②10×DNA上样缓冲液（10×loadingbuffer）：称取蔗糖200g，溴酚蓝0.2g溶于去离子水中，加入SYBERGreen染料500µL，定容到500mL，充分摇匀，分装于避光管中，于4℃避光保存。1.3实验方法1.3.1A群RV抗原检测（1）检测方法按A群RV胶体金检测试剂盒操作说明进行，主要步骤如下，①用采便棒勺取3次样本于装有稀释液的样本管中，旋紧样本管后混匀。②将检测试纸放于平面上，缓慢滴加80µL（2至3滴）粪便标本悬液至加样孔中。③室温下，5至10分钟内观察结果（10分钟后判读则无效）。（2）结果判读试纸上有质控线和检测线两条线，根据它们的显色情况进行判读，如下：①质控线和检测线均显色，说明样本检出A群RV，则判定标本为RV阳性标本。②质控线显色，检测线未显色，说明样本未检出A群RV。③质控线未显色，则此次检测无效，应重新检测。1.3.2RV-RNA的提取将粪便标本加到1.5mLEP管中，加入PBS缓冲液稀释成10%悬液，并充分震荡混匀，然后静置10min，再以4000rpm离心5min，吸取上清液；再按照病毒DNA/RNA提取试剂盒操作说明提取RV-RNA。1.3.3RT-PCR检测RV（1）逆转录：采用AMV反转录酶进行反转录，体系配制如表3所示，42℃反应1h合成cDNA。13 重庆医科大学硕士研究生学位论文表3.逆转录体系Table3.ThereactionsystemofRT-PCR样品体积5×AMVbuffer4µLAMV酶0.1µL引物0.5µLdNTPmix1µLRNA5µLrRNAsin0.1µLDEPC水9.3µL（2）PCR扩增：利用半巢式PCR扩增轮状病毒的VP4或VP7片段，对所选标本进行G或P基因型分型。G血清型分析：第一轮PCR引物采用VP7-1F，VP7-Rc，第二轮PCR引物采用VP7-1F，VP7-Rb。P基因型分析：第一轮PCR引物采用VP4-F2，VP4-R3，第二轮PCR引物采用VP4-F4，VP4-R3。按表4所示配置扩增反应体系。扩增条件为：①95℃预变性5min，②95℃变性40s，③55℃退火40s，④72℃延伸1min，⑤上述步骤（②-④）重复35个循环；⑥72℃充分延伸10min。本实验所用引物序列见表5所示。表4.VP7、VP4扩增反应体系Table4.TheamplificationreactionsystemofRVinVP7andVP4gene样品体积10×buffer5µLF0.5µLR0.5µLdNTPmix0.5µLrTaq0.5µLcDNA5µLDEPC水38µL14 重庆医科大学硕士研究生学位论文表5.本实验所用引物序列Table5.Theprimerinthisstudy引物名称位置序列VP7-1F1-21GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCVP7-Rc931-914CTTGCCACCATTTTTTCCVP7-Rb673-562TGTGTATTGAGTGGACAAACTTVP4-F223-48TTTATAGACAGCTTCTCACTAATTCVP4-R3952-931TATGTGCAGTTACTTGTTCACCVP4-F4220-198AATTTTAGATGGTCCTTATCAAC注：F为上游引物，R为下游引物.1.3.4琼脂糖凝胶电泳鉴定配制2%浓度的琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物，对检测阳性的样品送测序。1.4统计学分析本研究采用描述性流行病学方法对所有病例临床资料进行分析，使用MicrosoftOfficeExcel2003对数据进行整理统计并制作相应图表，利用SPSS19.0软件行卡方检验比较率的差异，P＜0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1轮状病毒感染的临床情况2016年全年共采集了就诊于重庆医科大学附属儿童医院本部门诊的符合纳入条件的505份标本，经胶体金法检出RV阳性的例数为162例，阳性率为32.08%（162/505）。162例RV阳性标本的相关临床资料分析如下：2.1.1性别分布在收集的505例标本中，男性327例，女性178例，分别占总例数的64.75%（327/505）和35.25%（178/505），男:女≈1.84:1，男性明显多于女性。162例RV阳性标本中，男性97例，女性65例，构成比分别为59.88%（97/162）和40.12%（65/162），男:女≈1.49:1，男、女性RV阳性率分别为29.66%（97/327）、36.52%15 重庆医科大学硕士研究生学位论文（65/178）（见表6）。经分析，男女患RV肠炎的概率无显著性差异（χ2=2.485，P＞0.05）。表6.2016年重庆地区儿童轮状病毒肠炎的性别分布Table6.ThegenderdistributionofchildrenRotavirusenteritisinChongqingin2016性别RV阳性例数构成比（%）RV阳性率（%）χ2P男9759.8829.66女6540.1236.522.4850.115合计16210032.082.1.2年龄分布本研究中RV肠炎患儿的最小年龄为13天，最大年龄为10岁2月。162例RV肠炎患儿年龄分布情况见表7、图1。可见，2岁以下婴幼儿为主要感染对象，占RV肠炎患儿的92.59%。表7.2016年重庆地区儿童轮状病毒肠炎的年龄分布Table7.TheagedistributionofchildrenRotavirusenteritisinChongqingin2016年龄总例数RV阳性例数构成比（%）RV阳性率（%）＜6月1003219.7532.006月~2086338.8930.2912月~1395533.9539.5724月~2342.4717.3936月~1653.0931.2548月~1010.6210.0060月~921.2322.22合计50516210032.0816 重庆医科大学硕士研究生学位论文图1.2016年重庆地区儿童轮状病毒肠炎的年龄分布Figure1.TheagedistributionofchildrenRotavirusenteritisinChongqingin20162.1.3时间分布按季节分析，该研究中RV肠炎病例在春季（3月-5月）、夏季（6月-8月）、秋季（9月-11月）、冬季（12月、1月、2月）的分布情况见表8、图2。可见，RV阳性率在冬季最高，其中12月（63.33%，38/60）、1月（39.13%，9/23）为发病高峰时段，在春季最低。经统计分析，不同季节RV阳性率有显著差异（χ2=24.061，P＜0.01）。17 重庆医科大学硕士研究生学位论文表8.2016年重庆地区儿童轮状病毒肠炎的季节分布Table8.TheseasondistributionofchildrenRotavirusenteritisinChongqingin2016季节总例RV阳构成比RV阳性χ2P数性例数（%）率（%）春季801811.112.25（3-5月）夏季1354024.6929.63（6-8月）秋季1804829.6326.6724.061＜0.01（9-11月）冬季1105634.5750.91（12、1、2月）合计50516210032.08图2.2016年重庆地区儿童轮状病毒肠炎的季节分布Figure2.TheseasondistributionofchildrenRotavirusenteritisinChongqingin20162.1.4临床症状特征2.1.4.1症状表现情况RV肠炎常伴有呕吐、发热及流涕、轻咳等轻微呼吸道症状。该162例RV肠炎患儿中伴有呕吐、呼吸道症状、发热症状的病例分别为83例、62例、56例，18 重庆医科大学硕士研究生学位论文各自的阳性率分别为51.23%（83/162）、38.27%（62/162）、34.57%（56/162）（见表9），可见，呕吐是RV肠炎最常见的伴随症状。据统计分析，呕吐与RV肠炎有密切相关性（χ2=40.167，P＜0.01），而呼吸道症状（χ2=4.198，P=0.400）、发热（χ2=0.678，P=0.410）与RV肠炎无明显相关性。表9.2016年重庆地区儿童轮状病毒肠炎的常见伴随症状Table9.TheaccompanyingsymptomsofchildrenRotavirusenteritisinChongqingin2016症状例数阳性率（%）χ2P伴呕吐8351.2340.167＜0.01伴呼吸道症状6238.274.1980.400伴发热5634.570.6780.4102.1.4.2就诊前腹泻病程本研究中RV肠炎患儿就诊前腹泻病程最短的为0.5天，最长的为13天。64.2%患儿在病程3天内就诊，82.72%患儿在病程5天内就诊，93.22%患儿在病程10天内就诊，病程10天及其之后就诊的占6.78%（见表10、图3）。表10.2016年重庆地区轮状病毒肠炎患儿就诊前腹泻病程Table10.ThedurationofRotavirusenteritisbeforedoctors'officevisitinginChongqingin2016腹泻病程（天）病例数构成比（%）0~15232.102~35232.104~53018.526~7116.808~963.7010~1163.7012~1353.08合计16210019 重庆医科大学硕士研究生学位论文图3.2016年重庆地区轮状病毒肠炎患儿就诊前腹泻病程Figure3.ThedurationofRotavirusenteritisbeforedoctors'officevisitinginChongqingin20162.1.4.3就诊前每日腹泻次数本研究中162例RV肠炎病例，就诊前每日腹泻次数最少1次，最多13次，其中每日腹泻4~6次患儿例数最多，占RV肠炎总例数的46.91%，6次以内占76.54%，10次以内占94.44%，超过10次的仅占5.56%（见表11、图4）。表11.2016年重庆地区轮状病毒肠炎患儿就诊前每日腹泻次数Table11.ThefrequencyofRotavirusenteritisbeforedoctors'officevisitinginChongqingin2016腹泻次数/日病例数构成比（%）1~34829.634~67646.917~92917.90≥1095.56合计16210020 重庆医科大学硕士研究生学位论文图4.2016年重庆地区轮状病毒肠炎患儿就诊前每日腹泻次数Figure4.ThefrequencyofRotavirusenteritisbeforedoctors'officevisitinginChongqingin20162.1.4.4就诊前呕吐病程162例RV肠炎患儿中，伴及不伴呕吐症状的病例数分别为83例、79例，构成比分别是51.23%、48.77%。该研究中，RV肠炎患儿就诊前呕吐天数最少1天，最多5天，大多数病例呕吐天数为1~2天（81.93%，68/83）。本研究中RV肠炎患儿就诊前呕吐病程情况分析见表12及图5。表12.2016年重庆地区轮状病毒肠炎患儿就诊前呕吐天数情况Table12.ThedaysofvomitingduringRotavirusenteritisbeforedoctors'officevisitinginChongqingin2016呕吐天数（天）病例数构成比（%）1d4756.632d2125.303d89.644d44.825d33.61合计8310021 重庆医科大学硕士研究生学位论文图5.2016年重庆地区轮状病毒肠炎患儿就诊前呕吐天数情况Figure5.ThedaysofvomitingduringRotavirusenteritisbeforedoctors'officevisitinginChongqingin20162.1.4.5就诊前每日呕吐次数本次162例RV肠炎病例中，有83例伴有呕吐症状，每日呕吐次数最少为1次，最多为10次。每日呕吐1~3次的病例数最多（61.45%），每日呕吐6次以内的病例数占90.37%，个别病例有呕吐10次/日（见表13、图6）。表13.2016年重庆地区轮状病毒肠炎患儿就诊前每日呕吐次数Table13.ThefrequencyofvomitingduringRotavirusenteritisbeforedoctors'officevisitinginChongqingin2016呕吐次数病例数构成比（%）1~35161.454~62428.927~978.43≥1011.20合计8310022 重庆医科大学硕士研究生学位论文图6.2016年重庆地区轮状病毒肠炎患儿就诊前每日呕吐次数Figure6.ThefrequencyofvomitingduringRotavirusenteritisbeforedoctors'officevisitinginChongqingin20162.1.4.6就诊前发热程度在此162例RV肠炎病例中，有56例伴有发热，其中以中低热为主（80.35%，45/56）。56例RV肠炎伴发热患儿的发热程度情况见表14及图7。表14.2016年重庆地区轮状病毒肠炎患儿就诊前发热程度Table14.ThedegreeoffeverRotavirusenteritisbeforedoctors'officevisitinginChongqingin2016发热程度（T）病例数构成比（%）低热（37.3℃≤T≤38.0℃）2035.71中热（38.1℃≤T≤39.0℃）2544.64高热（39.1℃≤T≤41.0℃）1017.86T不详11.79合计5610023 重庆医科大学硕士研究生学位论文图7.2016年重庆地区轮状病毒肠炎患儿就诊前发热程度Figure7.ThedegreeoffeverRotavirusenteritisbeforedoctors'officevisitinginChongqingin20162.2轮状病毒基因型分型162例胶体法检测阳性的标本经RT-PCR扩增、测序成功的有71例（43.83%，71/162），按照VP7（G基因型）和VP4（P基因型）进行基因型分型，检测出5种G基因型（分别为G1、G2、G3、G4和G9）、2种P基因型（分别为P[4]和P[8]），及5种G/P组合基因型（分别为G1P[8]、G2P[4]、G2P[8]、G3P[8]和G9P[8]）。VP7分型流行分布见表15、图8，月份分布见表16、图9，季节性分布见表17，可见，2016年G基因型流行以G9为主，其次为G3、G1、G2、G4，未分出型别占8.45%。VP4分型流行分布见表18、图10，月份分布见表19、图11，季节性分布见表20，可见，2016年P基因型流行以P[8]为主，其次为P[4]，未分出型别的占15.49%。2016年G/P组合基因型流行分布见表21、图12，月份分布见表22、图13，季节性分布见表23，可见，2016年G/P组合基因型流行以G9P[8]为主，其次为G3P[8]、G1P[8]、G2P[8]、G2P[4]，23.94%未分出型别。可见，各种基因型主要在秋冬季节检出，而在夏季检出最少，G9、P[8]、G9P[8]基因型在各个季节均有检出。24 重庆医科大学硕士研究生学位论文表15.2016年重庆地区儿童轮状病毒G基因型分型分布Table15.ThetypesdistributionofRotavirusGgenotypeinChongqingin2016G基因型病例数构成比（%）G122.82G222.82G357.04G411.41G95577.46ungenetype68.45合计71100图8.2016年重庆地区儿童轮状病毒G基因型分型分布Figure9.ThetypesdistributionofRotavirusGgenotypeinChongqingin201625 重庆医科大学硕士研究生学位论文表16.2016年重庆地区儿童轮状病毒G基因型月份分布Table16.ThedistributionmonthlyofRotavirusGgenotypeinChongqingin2016月份123456789101112合G基因型计G10001000000012G22000000000002G31111010000005G40000000001001G9554110111362755ungenetype0000010000056合计865312111463371图9.2016年重庆地区儿童轮状病毒G基因型月份分布Figrue9.ThedistributionmonthlyofRotavirusGgenotypeinChongqingin201626 重庆医科大学硕士研究生学位论文表17.2016年重庆地区儿童轮状病毒G基因型季节分布Table17.TheseasondistributionofRotavirusGgenotypeinChongqingin2016季节春季夏季秋季冬季合计G基因型G110012G200022G321025G400101G962103755ungenetype01056合计94114771表18.2016年重庆地区儿童轮状病毒P基因型分型分布Table18.ThetypesdistributionofRotavirusPgenotypeinChongqingin2016P基因型病例数构成比（%）P[4]11.41P[8]5983.10ungenetype1115.49合计7110027 重庆医科大学硕士研究生学位论文图10.2016年重庆地区儿童轮状病毒P基因型分型分布Figure10.ThetypesdistributionofRotavirusPgenotypeinChongqingin2016表19.2016年重庆地区儿童轮状病毒P基因型月份分布Table19.ThedistributionmonthlyofRotavirusPgenotypeinChongqingin2016月份123456789101112合P基因型计P[4]1000000000001P[8]664211100163159ungenetype10110101130211合计86531211146337128 重庆医科大学硕士研究生学位论文图11.2016年重庆地区儿童轮状病毒P基因型月份分布Figure11.ThedistributionmonthlyofRotavirusPgenotypeinChongqingin2016表20.2016年重庆地区儿童轮状病毒P基因型季节分布Table20.TheseasondistributionofRotavirusPgenotypeinChongqingin2016季节春季夏季秋季冬季合计P基因型P[4]00011P[8]7274359ungenetype224311合计94114771表21.2016年重庆地区儿童轮状病毒G/P混合基因型分型分布Table21.ThetypesdistributionofRotavirusG/PgenotypeinChongqingin2016G/P基因型病例数构成比（%）G1P[8]11.41G2P[4]11.41G2P[8]11.41G3P[8]34.22G9P[8]4867.6129 重庆医科大学硕士研究生学位论文ungenetype1723.94合计71100图12.2016年重庆地区儿童轮状病毒G/P基因型分型分布Figure12.ThetypesdistributionofRotavirusG/PgenotypeinChongqingin2016表22.2016年重庆地区儿童轮状病毒G/P基因型月份分布Table22.ThedistributionmonthlyofRotavirusG/PgenotypeinChongqingin2016月份123456789101112合G/P基因型计G1P[8]0000000000011G2P[4]1000000000001G2P[8]1000000000001G3P[8]1101000000003G9P[8]454110100162548ungenetype10110201130717合计86531211146337130 重庆医科大学硕士研究生学位论文图13.2016年重庆地区儿童轮状病毒G/P基因型月份分布Figure13.ThedistributionmonthlyofRotavirusG/PgenotypeinChongqingin2016表23.2016年重庆地区儿童轮状病毒G/P基因型季节分布Table23.TheseasondistributionofRotavirusG/PgenotypeinChongqingin2016季节春季夏季秋季冬季合计G/P基因型G1P[8]00011G2P[4]00011G2P[8]00011G3P[8]10023G9P[8]6173448ungenetype234817合计941147713讨论腹泻是世界范围内仅次于肺炎的儿童死亡率的第二大原因，而RV是引起5岁以下儿童急性腹泻的最常见原因，RV在发展中国家和发达国家均有较高的发病率和死亡率[22]。为减少RV肠炎造成的社会经济负担，已研发出多种RV疫苗，RV31 重庆医科大学硕士研究生学位论文疫苗的推广使用有效地降低了RV感染所致的发病率及死亡率，但仍不能很好地预防RV感染，这对研发更有效的新型RV疫苗提出了挑战，因此动态监测RV感染的流行病学情况对预防、治疗RV感染及RV疫苗的研发具有重要意义。2016年重庆地区急性腹泻患儿中RV阳性率是32.08%，高于同年的杭州市拱野区6.5%[23]、温州21.45%[24]及济宁市2015年~2016年22.33%[25]、广东江门市2012年~2016年11.9%[26]、广东东莞市2010~2016年15.96%[27]、深圳2015年13.03%[28]，低于河南郑州2014年~2016年62.4%[29]，与青海省2012年~2015年31.1%基本一致[30]，不同地区RV阳性率报道的差异，可能与地理位置、卫生及经济条件等相关。本研究中RV阳性率与重庆地区往年相关报道比较，2016年RV阳性率较2015年42.72%[31]明显降低，略低于2009年34.06%[32]及2014年37.98%[33]，但高于2010年26.08%[34]，表明同一地区不同年份RV阳性率不同，这与严春等[35]研究结果一致，可能与疫苗接种、RV感染流行变迁等相关。本次研究结果显示RV肠炎患儿中男性明显多于女性，而女性RV阳性率较男性高，但男女患RV肠炎的概率无统计学意义，这与国内[28,31,32,33,34]及Al-BadaniA等[36]、PursemVN等[37]国外研究结果一致。在162例RV肠炎患儿中各年龄段均有发病，而2岁以下婴幼儿为RV肠炎的高发年龄，与GheorghitaS等[38]、SahakyanG等[39]、AgutuMT等[21]研究结果一致；本研究中6月龄婴儿的RV阳性率较高（32.00%），这与SelvarajanS等[40]研究显示6月以下婴儿RV阳性率最低的结果不一致，但其与GasparinhoC等[41]报道结果一致，考虑与相关患儿母乳喂养不足相关，因此建议在该课题以后的研究中增加患儿喂养方式的采集以探讨喂养方式对小婴儿感染RV的影响，但需警惕重庆地区RV感染有向小婴儿流行的趋势，故需动态监测本地区RV感染流行情况以证实这一考虑因素。本研究表明RV肠炎具有明显季节性，RV阳性率在冬季最高，尤其是在12月、1月份，这与ChernyshovaLI等[42]研究一致。有研究表明[43,44]腹泻和呕吐是RV感染的标志性症状。本研究中162例RV肠炎患儿有51.23%（83/162）伴呕吐，呕吐是RV肠炎最常见的伴随症状，经统计分析发现呕吐与RV肠炎存在显著相关性（χ2=40.167，P=0.000），与NnukwuSE等[45]研究结果一致。本次研究中RV肠炎患儿就诊前呕吐天数最少1天，最多5天，大多数患儿为1~2天（81.93%，68/83），与鄢小琼[31]研究结果一致。本研究32 重庆医科大学硕士研究生学位论文中64.2%RV肠炎患儿在病程3天内就诊，RV肠炎所伴发热以中低热为主，这与余凤[33]研究结果一致。本研究结果显示发热、呼吸道症状与RV肠炎无明显相关性，与GasparinhoC等[46]研究结果一致。本研究对RV肠炎患儿就诊前的临床症状（包括伴随症状、腹泻病程及次数、呕吐病程及次数等）进行了统计分析，这对RV肠炎早期疾病状态的认识提供了很好的参考依据，但从整体性出发，建议在该课题后续的研究中，可增加病例随访，以了解RV感染所致的整个临床症状表现过程。此外，建议在研究设计的临床信息调查资料中增加有无RV疫苗接种及类型，可进一步探讨接种RV疫苗对RV肠炎临床表现的影响及评价RV疫苗的保护效果等。SantosN等[47]曾研究了RV血清型/基因型在全球的分布情况，发现最常见G基因型是G1、G2、G3、G4、G9，最常见的P基因型是P[4]、P[8]，最常见的G/P基因型组合是G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]，而最新研究表明G9P[8]亦是人类最易感的RV株[19,48]。2016年重庆地区儿童RV肠炎的基因型分型检出5种G基因型（分别为G1、G2、G3、G4和G9）、2种P基因型（分别为P[4]和P[8]），及5种基因型组合（分别为G1P[8]、G2P[4]、G2P[8]、G3P[8]和G9P[8]），可见，RV基因型在重庆地区的流行情况与全球基本相符。本研究结果显示2016年重庆地区RV各基因型的优势流行株分别为G9、P[8]、G9P[8]，与2014年余风[33]、2015年鄢小琼[31]的研究结果一致，余风[33]的研究显示2014年在重庆地区5岁以下RV腹泻患儿中检测出4种G基因型（G1、G2、G3、G9）、2种P基因型（P[4]、P[8]）和6种G/P基因型组合（G1P[8]、G2P[4]、G2P[8]、G3P[8]、G9P[4]、G9P[8]），鄢小琼[31]的研究结果表明2015年在重庆地区RV肠炎患儿中检测出的基因型为4种G基因型（G1、G2、G3、G9）、2种P基因型（P[4]、P[8]）和6种G/P基因型组合（G1P[8]、G2P[4]、G3P[4]、G3P[8]、G9P[4]、G9P[8]），可见，2014年至2016年重庆地区RV各基因型流行相对稳定，但G/P基因型组合仍有差异。田登等[30]研究结果显示2012年至2015年从青海省RV肠炎婴幼儿中检测出2种G基因型（G3、G9）、3种P基因型（P[4]、P[6]、P[8]）和2种G/P基因型组合（G3P[8]、G9P[8]）。因此，在相同地区不同年份以及同年不同地区，RV基因型的分布情况会有所差异。RV是世界范围内造成儿童严重腹泻的最常见原因，为减少RV感染所致负担，2009年WHO向全世界儿童推荐了Rotarix（包括G1P8血清型）和Rotateq（包括33 重庆医科大学硕士研究生学位论文G1、G2、G3、G4和P8血清型）两种RV疫苗，疫苗的使用对RV肠炎起到了一定的保护作用，但对于预防RV感染效果仍欠佳，因此各国正大力研制更有效的RV疫苗中，目前是投入使用的疫苗除Rotarix和Rotateq外，还有中国的LLR、越南的Rotavin-MI、印度的Rotavac和Rotasiil，等等。鉴于RV基因型及其优势流行株分布的地区性及时间性差异，动态监测RV基因型的分子病学流行情况及研发适宜各地区的疫苗对减轻RV感染带来的危害有重要意义。34 重庆医科大学硕士研究生学位论文全文小结1.2016年重庆地区儿童急性腹泻病例中，RV阳性率达32.08%，说明RV仍是重庆地区引起儿童急性腹泻的重要病原体。2.RV肠炎具有明显的季节性，好发于冬季，尤12月、1月为发病高峰时段。3.呕吐与RV肠炎有密切相关性，而且是RV肠炎最常见的伴随症状。4.2014年至2016年3年中的各基因型优势流行株均相同（G9、P[8]、G9P[8]），且该三年的P基因型相对稳定。5.研发及选择适宜各地区的最佳RV疫苗对减轻RV感染带来的危害十分必要。35 重庆医科大学硕士研究生学位论文参考文献[1]SchillerLR,PardiDS,SellinJH,etal.ChronicDiarrhea:DiagnosisandManage--ment[J].ClinGastroenterolHepatol.2017,15(2):182-193.e3.[2]KotloffKL.TheBurdenandEtiologyofDiarrhealIllnessinDevelopingCountries[J].PediatrClinNorthAm.2017,64(4):799-814.[3]GBDDiarrhoealDiseasesCollaborators.Estimatesofglobal,regional,andnationalmorbidity,mortality,andaetiologiesofdiarrhoealdiseases:asystematicanalysisfortheGlobalBurdenofDiseaseStudy2015[J].LancetInfectDis.2017,17(9):909-948.[4]Boschi-PintoC,VelebitL,ShibuyaK.Estimatingchildmortalityduetodiarrhoeaindevelopingcountries[J].BullWorldHealthOrgan.2008,86(9):710-7.[5]BryceJ,Boschi-PintoC,ShibuyaK,etal.WHOestimatesofthecausesofdeathinchildren[J].Lancet.2005,365(9465):1147-52.[6]NasrinD,WuY,BlackwelderWC,etal.Healthcareseekingforchildhooddiarrheaindevelopingcountries:evidencefromsevensitesinAfricaandAsia[J].AmJTropMedHyg.2013,89(1Suppl):3-12.[7]DuPontHL.PersistentDiarrhea:AClinicalReview[J].JAMA.2016,315(24):2712-23.[8]KeuschGT,WalkerCF,DasJK,HortonS,HabteD.DiarrhealDiseases.In:BlackRE,LaxminarayanR,TemmermanM,WalkerN,editors.Reproductive,Maternal,Newborn,andChildHealth:DiseaseControlPriorities,ThirdEdition(Volume2).Washington(DC):TheInternationalBankforReconstructionandDevelopment/TheWorldBank;2016Apr.Chapter9.PMID:27227225.[9]ZhuXH,TianL,ChengZJ,etal.ViralandBacterialEtiologyofAcuteDiarrheaamongChildrenunder5YearsofAgeinWuhan[J],China.ChinMedJ(Engl).2016,129(16):1939-44.[10]ParasharUD,GibsonCJ,BreseeJS,GlassRI.Rotavirusandseverechildhooddiarrhea[J].EmergInfectDis.2006,12(2):304-6.[11]GosselinV,GénéreuxM,GagneurA,PetitG.Effectivenessofrotavirusvaccineinpreventingseveregastroenteritisinyoungchildrenaccordingtosocioeconomicstatus[J].HumVaccinImmunother.2016,12(10):2572-2579.[12]ThomasPD,PollokRC,GazzardBG.Entericviralinfectionsasacauseofdiarrhoea36 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重庆医科大学硕士研究生学位论文文献综述轮状病毒疫苗保护效果及其影响因素的研究进展摘要：轮状病毒（Rotavirus，RV）是全球范围内引起婴幼儿急性腹泻的主要病原体，造成了巨大的社会负担和经济损失。疫苗预防接种是控制RV感染最有效的方式，RV疫苗的使用显著降低了RV感染所致的发病率及死亡率，但其保护效果在发达地区及非发达地区存在很大的差异，而这种差异性的产生受到众多因素的影响。本文主要就几种RV疫苗的概况及其保护效果，RV疫苗保护效果的影响因素进行了综述。关键词：轮状病毒，病原，疫苗，保护效果，影响因素Abstract:Rotavirus(RV)isthemainpathogencausingacutediarrheaininfantsandyoungchildrenworld-widely,andresultsingreatsocialburdenandeconomicloss.Vaccinationisthemosteffectivewaytocontrolinfection.TheuseofRVvaccinesignificantlyreducesthemorbidityandmortalitycausedbyRVinfection,However,Itsprotectiveeffectdiffersgreatlyindevelopedandnon-non-developedregions,andthatoveralldiversityisinfluencedbyawiderangeoffactors.Thispaperreviewstheprofileandprotectiveeffectofseveraltypesofrotavirusvaccineandtheinfluencefactorsofrotavirusvaccineprotection.Keywords:Rotavirus,Pathogeny,Vaccine,Effectiveness,InfluencingF-actors急性腹泻病是世界范围内造成儿童疾病和死亡的主要原因之一，特别是在欠发达地区，而轮状病毒（Rotavirus，RV）是引起婴幼儿急性腹泻的主要病原体[1]。在RV疫苗接种计划未普及之前，全球每年因RV感染导致的死亡病例高达40万~60万[2]。现已有90多个国家将RV疫苗纳入免疫计划，目前得到批准使用的RV疫苗包括了在全球推广使用的Rotarix和Rotateq、中国的LLR（LanzhouLambRotavirusvaccine，LLR）、越南的Rotavin-MI、印度的Rotavac和Rotasiil[3]。随40 重庆医科大学硕士研究生学位论文着RV疫苗的推广接种，RV导致的年死亡病例下降到20万左右[4]，由此可见，RV疫苗的使用对RV引起的腹泻具有良好的保护作用。较多研究表明不同疫苗的保护效果具有一定的差异性。本文主要就目前投入使用的几种RV疫苗的概况及其保护效果，以及影响RV疫苗保护效果的因素作一综述。1RV的概况1.1RV的发现RV是一种人兽共患病病原，目前该病毒在人类、哺乳类和鸟类[4]中均有发现。1969年MebusCA等[5]通过电子显微镜在腹泻犊牛的粪便中发现了RV颗粒，1973年澳大利亚科学家BishopRF等[6]在急性胃肠炎婴幼儿的十二指肠粘膜活检标本中通过电子显微镜观察到了RV颗粒，并首次报道该病毒与婴幼儿腹泻相关。1.2RV的形态结构RV属呼肠病毒科，RV属，无囊膜，为由3个同心蛋白层构成的二十面体球形颗粒，其在电镜下是带有短纤突且外缘光滑近似轮状的粒子。颗粒中心包绕着病毒基因组11个分节段的dsRNA片段，这些基因片段分别编码病毒的6个结构蛋白（VP1～VP4,VP6和VP7）和6个非结构蛋白（NSP1～NSP6）。VP7和VP4构成外层衣壳、VP6构成中间衣壳、VP2构成内层衣壳，其中，VP4镶嵌在病毒颗粒表面，锚定于由VP6蛋白所构成的中间衣壳层，在病毒黏附细胞的过程中，VP4易被胰酶裂解成2个肽段（即带羧基末端的VP5和带氨基末端的VP8），同时可增强病毒的感染力，而内层衣壳中每12个VP2蛋白分子包含1个病毒转录酶（VP1）和鸟苷酸转移酶（VP3）蛋白[7]。1.3RV的分群与血清型RV的VP6具有高度保守性，为群特异性抗原，根据VP6抗原性的不同，RV分为8个群（A～H）[8]，其中A～C三个群感染人类，而A群对婴幼儿危害最大。RV的VP7和VP4为型特异性抗原，VP7为中和抗原，VP4为血凝素抗原；根据VP7和VP4抗原性的不同，可将RV进一步分为G血清型、P血清型，G-P组合血清型由RV病毒的VP4和VP7共同决定，目前已发现27种G血清型和37种P血清型，而G1P8、G2P4、G3P8、G4P8及G9P8这5种血清型RV是人类最易感41 重庆医科大学硕士研究生学位论文的RV株[9]。2几种RV疫苗研究概况2.1Rotarix和Rotateq2.1.1Rotarix和Rotateq简介Rotarix是由比利时GlaxoSmithKline公司研制的人源RV单价疫苗，源于母疫苗株89-12，为全世界最广泛流行的人RV株G1P8，疫苗接种计划为两剂[10]。Rotateq是由美国Merck公司研制的人-牛RV重配疫苗，是通过基因重配技术将来自人RV株中编码VP4和VP7的基因导入WC3株而得，为五价疫苗，包括了G1、G2、G3、G4和P8血清型，疫苗接种计划为3剂[11]。世界卫生组织（WorldHealthOrganization,WHO）推荐，Rotarix和Rotateq的免疫接种年龄分别为2月龄、4月龄和2月龄、4月龄、6月龄左右，但此两种疫苗在有些地区的免疫接种年龄与WHO推荐接种年龄略有差异，如英国推荐Rotarix和Rotateq的免疫接种年龄分别为2月龄、3月龄和2月龄、3月龄、5月龄[13]。2009年WHO向全世界儿童推荐了Rotarix和Rotateq两种RV疫苗，如今在全世界已得到较为广泛的使用。2.1.2Rotarix和Rotateq的保护效果LiRC等[12]在中国广西对3333名婴儿进行了关于Rotarix在中国2岁以下婴幼儿RV胃肠炎保护率的前瞻性随机对照试验，研究表明该疫苗在不同病情程度胃肠炎的保护率不同，对严重RV胃肠炎的保护率（72%）较一般病情RV胃肠炎保护率（67.1%）高，且其对不同血清型的保护率亦有所不同，对G1、非G1血清型RV胃肠炎的保护率分别为64%、77.8%。在一项关于Rotarix在欧洲保护率的回顾性研究中，KarafillakisE等[13]检索了2006年1月至2014年7月期间发表的关于RV疫苗在欧洲保护率的研究成果，最终符合研究纳入标准的有9篇研究报道，经统计分析得出Rotarix在欧洲的保护率为80%～98.3%。Rotarix在非洲保护率的多国研究[14,15,16,17,18]显示该疫苗在非洲的保护率为56%～64%。JonestellerCL等[19]就RV疫苗保护率进行一项系统性回顾研究，搜索了2006-2016年全球关于RV疫苗保护率的研究报道，最后获得了来自24个国家符合研究纳入标准的48篇相关文章，对这48篇报道数据进行统计分析，结果显示Rotarix在低、中、高儿童死亡42 重庆医科大学硕士研究生学位论文率国家的保护率分别为84%、75%和57%。BreimanRF等[20]针对Rotateq的保护率在非洲的加纳、肯尼亚、马里及亚洲的孟加拉国、越南五个地区对6674名婴儿进行了一项双盲对照的前瞻性研究，结果显示该疫苗对RV胃肠炎、严重胃肠炎的保护率分别为33.9%、42.5%。PatelM等[21]在尼加拉瓜不同城市的四个医院对4927名婴儿进行了关于Rotateq在尼加拉瓜保护率的回顾性试验，结果表明该疫苗的保护率为45%。JonestellerCL等[19]对RV疫苗保护效果分析的系统回顾研究结果显示Rotateq在低、高儿童死亡率国家的保护率分别为90%、45%。YeungKHT等[22]对香港六所公立医院2014年10月份至2015年4月间、5岁以下儿童急性胃肠炎住院病例进行RV保护率的病例对照试验，结果显示Rotarix和Rotateq疫苗可避免89%～96%的RV胃肠炎者住院治疗。2.2LLR2.2.1LLR简介LLR是由中国兰州生物制品研究所生产的一种单价RV疫苗，该RV疫苗病毒株源自青海绵羊感染的RV，初期认为其血清型为G10P12，而最新研究表明该疫苗血清型为G10P15[23]。该疫苗首剂接种对象为2月龄至3岁以下婴幼儿，其后推荐每年接种1次[24]，接种至5岁[3]。该疫苗于2001年在中国上市，目前仅使用于中国。2.2.2LLR的保护效果黎明强等[25]检索了2001-2014年公开发表的有关LLR对RV胃肠炎保护效果的中文文献，经分析后结果显示，该疫苗对RV胃肠炎、严重RV胃肠炎的保护率分别为68%、69%，与Rotarix和Rotateq的保护效果相当，但该疫苗对RV胃肠炎住院率的保护率（约61%）低于Rotarix和Rotateq的住院保护率；本研究结果还显示疫苗组中少数婴儿感染RV后仍患病，但其平均患病时间比对照组缩短了1.31天。ZhenSS等[26]关于LLR的保护率在中国河北正定县对6441名5岁以下儿童进行了一项病例对照回顾性研究，结果显示该疫苗对RV胃肠炎和严重RV胃肠炎保护率分别为35%和53%，本研究中LLR保护率较低作者推测可能与该研究中的实验对象首次接种LLR的年龄偏大（超过6月龄）的人数过多相关。2.3Rotavin-MI43 重庆医科大学硕士研究生学位论文该疫苗由越南卫生部疫苗与生物制品研究中心研制，其病毒株与Rotarix类似，为G1P8血清型的人类减毒活疫苗。推荐免疫接种方案为2剂，第1剂接种时间不低于6周龄，两剂间至少间隔30天。于2012年在越南得到批准使用。Ⅰ期和Ⅱ期临床试验[27]显示，该疫苗的免疫原性和安全性与Rotarix相似。目前尚无该疫苗的保护率数据公布。2.4RotavacRotavac是由印度Bharat生物技术国际有限公司研制的一种人-牛RV单价减毒活疫苗，为自然重组菌株G9P11（即116E-RV株）[28]。免疫接种方案推荐3剂，接种时间分别为6周龄、10周龄和14周龄[29]。在印度的一项对6799名婴儿进行关于Rotavac保护率的随机双盲安慰剂对照试验（即Ⅲ期临床试验）[3]表明，该疫苗对严重RV胃肠炎的保护率为56%。于2014年上市，目前仅在印度使用。2.5RotasiilRotasiil是由印度血清研究所有限公司与美国国家过敏和传染病研究所合作开发的一种人-牛重组RV五价减毒活疫苗，其中包括血清型G1、G2、G3、G4和G9。该疫苗的剂型与前述几种疫苗不同，前述疫苗的剂型为液体，而该疫苗为冻干粉剂，需加入配比的柠檬酸碳酸氢盐缓冲液后口服[28]。该疫苗在储存期间可耐受较高的温度，如在37℃～40℃下可稳定保存18个月[30]。其免疫接种计划与Rotavac相同。在尼日尔的一项随机双盲安慰剂对照试验（Ⅲ期临床试验）[31]显示Rotasiil对严重RV胃肠炎的保护率为67%。该疫苗最近获得了印度药物管制局批准，正在接受世界卫生组织资格预审的评估。3RV疫苗保护效果的影响因素3.1口服脊髓灰质炎疫苗脊髓灰质炎疫苗已在全球儿童中广泛使用，欠发达国家多应用口服脊髓灰质炎疫苗（OPV），发达国家已使用灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）。RV疫苗的保护率在发达国家高于欠发达国家，有研究[32]表明该现象可能与OPV相关，因为OPV与RV均为减毒活疫苗，同时接种时两者在肠道内的复制会相互干扰，从而OPV可降低RV疫苗株的有效滴度，造成RV疫苗株诱导免疫反应所需的滴度下降。Patel44 重庆医科大学硕士研究生学位论文M等[33]关于OPV对Rotarix和Rotateq的免疫原性及保护率影响的研究发现当与OPV联合使用时，机体对RV疫苗表现出低免疫反应，在第1剂RV疫苗后，联合OPV接种组中血清抗RV-IgA抗体的几何平均浓度及血清转换率均较未联合OPV接种组高，但是在RV接种计划完成后（即Rotarix接种第2剂后或Rotateq接种第3剂后）这种免疫反应差异将不存在；本研究发现，尽管两组在免疫反应方面存在一些差异，但两组中疫苗保护率却是相似的（82–85%）。关于Rotarix与WHO常规扩大免疫规划（ExpandedProgrammeonImmunization，EPI）疫苗同时接种对Rotarix保护率是否有影响，TregnaghiMW等在拉丁美洲六个国家（包括阿根廷、巴西、哥伦比亚、多米尼加共和国、洪都拉斯和巴拿马）对6568名婴儿进行了一项随机双盲安慰剂对照前瞻性试验[34]，研究表明Rotarix疫苗与常规EPI疫苗（本研究中包括百白破、HBV、B型流感嗜血杆菌的疫苗及OPV）联合接种不会降低Rotarix保护率。TaniuchiM等[35]最新研究表明RV疫苗的免疫应答及保护率下降与OPV没有显著联系。目前尚不知OPV对RV疫苗免疫应答的影响是否转化为降低其保护率，因为免疫应答反应并不一定与保护率有必然联系。所以，OPV对RV疫苗保护效果的影响尚不确定。3.2肠道环境肠道环境可影响口服疫苗的免疫应答。环境性肠病（Environmentalenteropathy，EE）是低收入国家的一种常见的亚临床疾病，其特征为小肠炎症、肠绒毛缩短、肠屏障功能障碍和营养吸收减少，其与贫穷和不卫生的生活环境有关，也可能为肠道致病菌的重复或长期感染、营养不良所致[36]。NaylorC等[36]在孟加拉国达卡的一个城市贫民窟对700例婴儿进行了有关EE对RV疫苗免疫原性影响的研究，结果显示环境性肠病与Rotarix免疫原性成负相关，而对注射型疫苗（EPI推荐的破伤风、百日咳、白喉、B型流感嗜血杆菌和麻疹疫苗）的免疫原性无影响；该研究还表明减少肠道的病毒感染可能会改善RV疫苗的免疫效果。在发展中国家，小肠细菌过度生长的发生率很高，而小肠细菌过度生长有助于环境性肠病的发生，这也可以部分解释发达地区RV疫苗保护率比在落后地区高[37]。在卫生条件差的地区，经粪-口途径传播细菌的暴露增加可引起肠道菌群改变，继而影响RV疫苗的免疫应答[38]。45 重庆医科大学硕士研究生学位论文3.3微量元素微量营养素锌在宿主免疫防御和肠道健康中起着广泛作用，在肠道上皮修复及免疫反应机制中对粘膜保护至关重要，锌的缺乏与腹泻的发病率和死亡率密切相关。一项在赞比亚卢萨卡实施的腹泻综合性预防和治疗方案（包括补充锌剂）的结果[39]显示该方案明显降低了5岁以下儿童腹泻死亡率（下降了34%）。ColgateER等[40]研究了血清锌与RV腹泻的关系，结果显示血清锌降低会增加患RV腹泻的风险，而且血清锌可作为一个影响RV腹泻的独立因素。LazarusRP等[41]在印度韦洛尔对620名婴儿进行了一项关于补充锌对RV疫苗免疫原性的影响随机双盲安慰剂对照试验，研究结果表明，补充锌并不能提高RV疫苗的免疫原性。目前尚未发现关于锌对RV疫苗免疫原性及保护效果影响的更多证据。3.4母乳喂养关于RV疫苗免疫原性降低可能与母乳中抗体中和作用干扰有关已得到了广大的探讨。TrangNV等[42]在越南对292名母乳喂养者（145名来自农村，147名来自城市）展开了一项关于母乳中RV抗体的流行情况及其对RV疫苗抑制作用的研究，检测了母乳中总的抗RV-IgA水平，研究发现农村母乳中总的抗RV-IgA浓度范围为29~1395mg/dL（中位数为165mg/dL），城市母乳中总的抗RV-IgA浓度范围27~432mg/dL（中位数为72mg/dL），经统计分析，农村母乳中总的抗RV-IgA浓度比城市母乳高得多（P＜0.001），这预示着农村（经济落后及卫生条件差的地区）较城市（经济发展及卫生条件好的地区）更易暴露于RV；鉴于不同地区母乳中抗RV抗体水平不同及其对RV疫苗免疫原性的干扰作用，因此，这可部分解释RV疫苗的保护效果在发达国家高于发展中国家。母乳中的非抗体成分亦可干扰疫苗的免疫原性，Mwila-KazimbayaK等[43]在赞比亚卢萨卡对128名婴幼儿进行了关于母乳中天然抗病毒糖蛋对RV疫苗血清转换影响的研究，该研究评估了乳铁蛋白、乳凝集素及韧黏素-C对Rotarix血清转换的影响，研究发现乳铁蛋白和韧黏素-C对Rotarix血清转换无影响，而乳凝集素可能在Rotarix血清转换失败中发挥重要作用，但需要进一步研究证实这一结果。鉴于母乳对RV疫苗免疫原性的影响，TrangNV等[42]提出为增强机体对RV疫苗的免疫反应可疫苗接种1小时后再进行母乳喂养，而GroomeMJ等[44]一项在南非索韦托对250名婴儿进行的关于母乳喂46 重庆医科大学硕士研究生学位论文养对RV疫苗免疫原性影响的研究发现，在每次接种疫苗前后1小时避免母乳喂养，对于机体对RV疫苗的免疫应答反应没有显著影响；所以关于延长RV疫苗接种前后母乳喂养时间是否能提高疫苗的免疫反应和保护效果尚待进一步研究。GroomeMJ等[45]与Bar-ZeevN等[46]分别在马拉维和南非进行了Rotarix保护效果的研究，尽管这两项研究的实验对象中母乳喂养婴儿的比例不同，但Rotarix疫苗在马拉维地区（母乳喂养率超过90%）和南非其他地区（母乳喂养率不到70%）的保护效果却是相似的，这说明疫苗保护效果的差异性不能单独由母乳喂养这一单因素解释。3.5疫苗的接种时机O’RyanM等[32]研究显示，RV疫苗在发达和不发达国家保护效果的差异与首次RV感染年龄不同相关。通常认为在自然感染之前接种RV疫苗是最有效的，因此首次RV感染年龄是疫苗接种时间安排的重要考虑因素。低收入国家的RV感染比中高收入国家年龄早，例如在马拉维，1岁以下儿童RV感染率达77%，而在欧洲国家RV感染的年龄高峰为6-23月龄[32]。因此，在婴儿期RV自然感染高水平国家，应在RV自然感染发生前接种RV疫苗，提高首剂疫苗接种的依从性，对于提高疫苗接种的保护率至关重要。3.6其他除上述因素外，RV疫苗的保护效果还受到其他因素如社会经济地位[38]、IgA的血清转化[40]、各地区RV株分布及传播速率的不同[47]、疫苗接种次数[48]、婴儿免疫系统的不成熟[49]、组织血型抗原[50]及机体对疾病的遗传易感性[51]等的影响。4结语综上所述，RV仍然是全球范围内引起婴幼儿腹泻的重要病原，多个国家已将RV疫苗纳入免疫计划。随着RV疫苗广泛接种，RV感染的发病率及死亡率均有显著下降，但其在发展中国家及经济落后地区的保护效果仍有待进一步提高。疫苗的保护效果受到众多因素的影响，仍需进一步探讨研究，以便为提高RV疫苗保护效果提供相关有效措施。47 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重庆医科大学硕士研究生学位论文致谢时光荏苒，岁月如梭，三年研究生生涯即将结束，回首这段时光，心中感慨颇多。三年的时光，无论是临床工作学习还是工作以外的生活，自己都成长、收获了很多。现在，向亲爱的你们送上我最诚挚的感谢！首先，我要感谢我的导师许红梅教授，在这三年里，无论是在学习中还是在生活中，她都给了我很多的关心与耐心的指导，在论文撰写期间，许老师也在百忙之中抽出宝贵的时间耐心指导我修改论文。其实，从她这里，我收获最大的是作为一名医生应有的态度--仁心，医者仁心。能师从许老师，我深感庆幸与荣幸。心之所想，无以言表，在此，谨向我的恩师许红梅教授致以最诚挚的谢意和深深的敬意。衷心感谢研究生院每位老师默默地付出。衷心感谢感染科化验室张爱华老师和任巧丽师姐在实验标本采集过程中给我的帮助，在生活中给予我的指导。衷心感谢李娅莎老师、陈婉冰师姐、李方师姐、唐香师姐在论文写作过程中给予的指导。衷心感谢师姐、师弟、师妹在生活中与实验中给予我的支持与帮助。衷心感谢这三年临床工作中遇到的各位老师、各位师兄师姐、一起并肩工作的小组成员（江雪、刘珍敏、孙舒韵、徐恩会、杨丽燕、王维、杨雪、欧江燕），以及遇到的每个患儿及其家属，谢谢你们的信任与鼓励，谢谢你们对我临床工作的支持与肯定。衷心感谢我的家人、朋友，你们是我一直向前的原动力，谢谢你们的关爱、支持、体谅。感谢，感恩，一切！53 重庆医科大学硕士研究生学位论文攻读硕士学位期间论文发表情况代秋菊,许红梅.轮状病毒疫苗保护效果及其影响因素的研究进展（约稿于中华实用临床儿科杂志）54
