《帕金森病脑深部刺激治疗术前评估、术中场电位监测及术后管理的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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南京医科大学硕（博）士学位论文南京医科大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。▽ｆ作者签名：曰期年月曰Ｊ＜＜５导师签名：日期：姅Ｍ月日＾ｆ学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数。据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文“”本学位论文属于（请在以下相应方框内打Ｖ）：、保密□１，在年解密后适用本授权书。＿２、不保密＿令作者签名日期：年ｏ：〇＆月曰ｆ导师签名：日期：＞卩年月日 南京医科大学硕（博）士学位论文目录中文摘要……………………………………………………………………………1英文摘要……………………………………………………………………………5前言…………………………………………………………………………………11第一部分帕金森病患者血浆蛋白生物标志物的研究1引言…………………………………………………………………………162材料与方法…………………………………………………………………183结果…………………………………………………………………………304讨论…………………………………………………………………………405引用文献……………………………………………………………………40第二部分帕金森病患者运动症状定量评估----运动迟缓的分析1引言…………………………………………………………………………432材料与方法…………………………………………………………………443结果…………………………………………………………………………484讨论…………………………………………………………………………515引用文献……………………………………………………………………54第三部分帕金森病患者运动症状定量评估----语音分析1引言…………………………………………………………………………572材料与方法…………………………………………………………………583结果…………………………………………………………………………614讨论…………………………………………………………………………635引用文献……………………………………………………………………66第四部分帕金森病脑深部刺激术中场电位监测及定位研究1引言…………………………………………………………………………692材料与方法…………………………………………………………………693结果…………………………………………………………………………77 南京医科大学硕（博）士学位论文4讨论…………………………………………………………………………775引用文献……………………………………………………………………78第五部分帕金森病患者脑深部刺激术后管理1引言…………………………………………………………………………802材料与方法…………………………………………………………………803结果…………………………………………………………………………824讨论…………………………………………………………………………835引用文献……………………………………………………………………83综述…………………………………………………………………………………85在读期间主要研究成果的发表及获奖情况………………………………………93致谢…………………………………………………………………………………94 南京医科大学硕（博）士学位论文帕金森病脑深部刺激治疗术前评估、术中场电位监测和术后管理的研究中文摘要第一部分帕金森病患者血浆蛋白生物标志物的研究目的：探究中晚期帕金森病（PD）患者血浆蛋白生物标志物，以及手术、脑深部刺激对于血浆生物标志物的影响。方法：3例帕金森病患者分别在施行STN-DBS手术治疗前、手术治疗后一月未开机、手术治疗后三月（开机两个月）三个时间点分别采集外周血液，分离出血浆后进行质谱分析，同时亦对三名健康对照人员的外周血浆标本进行质谱分析。后进行生物信息学分析及比对，分别找出健康对照组（HC）和帕金森病组术前状态(PDpre)，帕金森病组术前状态（PDpre）与术后一月未开机状态（PDstimu-off）、术后一月未开机状态（PDstimu-off）与开机后后一月状态（PDstimu-on）的差异蛋白。分析差异蛋白的意义。结果：本项研究一共鉴定到739个蛋白质，其中644个蛋白质包含定量信息。如果以1.2倍为变化阈值，t-testp-value<0.05为标准，那么在定量到的蛋白质中，PD1/CK比较组中18个蛋白表达发生上调，21个蛋白表达发生下调；PD2/CK比较组中23个蛋白表达发生上调，25个蛋白表达发生下调；PD3/CK比较组中16个蛋白表达发生上调，19个蛋白表达发生下调；PD2/PD1比较组中12个蛋白表达发生上调，12个蛋白表达发生下调；PD3/PD1比较组中10个蛋白表达发生上调，5个蛋白表达发生下调；PD3/PD2比较组中16个蛋白表达发生上调，19个蛋白表达发生下调。结论：我们初步分析结果表明151种蛋白表达水平的变化可以提现正常人群和1 南京医科大学硕（博）士学位论文帕金森病患者的区别，而56种蛋白表达水平的变化可能与脑深部刺激治疗有关。关键词：帕金森病、丘脑底核脑深部电刺激治疗、蛋白质组学分析第二部分帕金森病患者运动症状定量评估----语音分析目的：探究帕金森病（PD）患者丘脑底核（STN）脑深部电刺激（DBS）手术治疗对于PD构音障碍症状的影响。方法：10例施行STN-DBS手术治疗的PD患者，在未服药的状态下，分别采集术后一个月未开机（OFF）、开机后一个月（ON1），开机后三个月（ON2）的朗读语音，对采集到的语音信号提取基频相关参数，并与健康对照组（HC）比较。结果：STN-DBS手术治疗对语音的基频有一定的改善作用。PD患者术后一个月未开机（OFF）的基频范围和基频变化显著小于术后三个月（ON2），而术后三个月（ON2）的基频范围、基频变化与HC组相比无显著差异，其他时间点的其他指标均无显著差异。结论：STN-DBS能改善患者的喉部肌肉及声带僵硬情况，尤其对震颤为主型患者和术前运动能力损伤较轻的患者改善明显。关键词：帕金森病、丘脑底核、脑深部刺激、声学分析第三部分帕金森病患者运动症状定量评估----运动迟缓的分析目的：运动迟缓作为帕金森病（PD）患者的核心特征之一，是临床诊断帕金森病的重要指标。对运动迟缓的定量评估将有助于疾病诊断、病情监测、以及药物等治疗的效果评价与优化。方法：被试者包括健康对照组和药物治疗组。健康对照组为15例与药物治疗组年龄、性别相匹配的健康老年人。药物治疗组按照中国帕金森病诊断标准（20162 南京医科大学硕（博）士学位论文版）选择11例原发性帕金森病患者，进行左旋多巴药物冲击实验，状态分为服药前和服药后。所有患者均采用统一帕金森病评分量表（UPDRS）进行评估。应用可穿戴定量评估系统记录两组翻腕、抬腿、10米往返范式动作的运动数据，提取幅度、频率等运动指标分别进行组间比较，并与UPDRSⅢ中子项及子项组合进行相关性分析。结果：健康对照组和药物治疗组服药前后状态的翻腕幅度、步幅、转身时间指标均有显著差异，且转身时间与UPDRS步态（Ⅲ29）、中轴症状（Ⅲ18、19、27-31）和迟缓+中轴症状（Ⅲ18、19、23-31）评分之间有良好的相关性。结论：利用可穿戴定量评估系统可对帕金森病运动迟缓症状进行定量测量，进而对药物治疗帕金森病患者运动迟缓症状效果进行有效评估，为帕金森病的精准管理提供新的方法。关键词：帕金森病，运动迟缓，运动功能定量评估，可穿戴定量评估系统，第四部分帕金森病脑深部电刺激术中场电位监测及定位研究目的：动态检测与帕金森病DBS手术靶点定位相关的丘脑底核场电位信号特征，依据场电位变化规律，寻找确定STN-DBS最佳手术靶点。方法：20例行STN-DBS手术治疗的PD患者，在手术过程中常规使用微电极记录（MER）确定手术靶点，同时收集距离靶点上6mm，4mm，2mm，以及0mm（即靶点处）的场电位信号进行功率谱密度分析，术后使用术前、术后影像资料进行融合重建，进行对比。结果：通过DBS术中植入电极进行场电位的动态检测，可以反应电极和STN核团的相对位置关系，与微电极记录（MER）、影像重建的结果有良好的符合性。结论：DBS术中场电位检测可以为手术靶点定位提供新的方法，并指导术后刺激位点、参数设置与调整。关键词：帕金森病，丘脑底核，脑深部刺激，场电位，靶点定位3 南京医科大学硕（博）士学位论文第五部分帕金森病患者脑深部电刺激术后管理目的：对帕金森病患者脑深部刺激术后3~36个月的治疗效果和残余症状进行回顾性的分析，探讨DBS术后的规范化和个性化管理。方法：本组资料选自2015年5月至2018年2月在南京脑科医院行STN-DBS治疗的帕金森病患者80例。术前、术后均由相同两位医师一起对其进行UPDRS量表、MMSE、MoCa、PNM、PQ39等量表进行评分，其中UPDRSⅢ运动部分的评分在med-on/med-off和刺激器stimu-on/stimu-off四种组合状态下完成。综合比较分析了震颤、强直、运动徐缓、平衡、吞咽、言语等帕金森病运动症状和和认知、情绪等非运动症状的改变、药物增减情况，观察刺激相关并发症的发生。总结以及术后刺激器程控的最佳设置参数及程控规律。结果：STN-DBS术后，所有患者的PQ39评分评分均得到显著改善（P<0.01）。运动评分显著改善（P<0.01），其中运动迟缓、震颤、僵直改善较好，言语能力初期有改善，姿势平衡改善不明显。认知、情绪改善不明显。术后药物种类减少50%（p<0.01），药物剂量减少43%（p<0.01）。术后主要不适主诉为异动、无力感、姿势步态异常、平衡障碍、睡眠异常、便秘。结论：STN-DBS是对中晚期帕金森病安全有效的治疗方法，其对运动症状改善良好，对非运动症状改善不足，需要进行术科学的个性化的管理关键词：帕金森病、丘脑底核脑深部刺激治疗、术后管理4 南京医科大学硕（博）士学位论文PreoperativeEvaluation,IntraoperativeLocalFieldPotentialMonitoringandPostoperativeManagementofDeepBrainStimulationinParkinson'sDiseaseAbstractPartoneTheStudyonPlasmaProteinBiomarkersinPatientswithParkinson'sDiseaseObjective:Toinvestigatealterationsinproteinexpressionassociatedwithdeepbrainstimulation(DBS)inanattempttoelucidatepossiblemechanismsofaction.Methods:Plasma,obtainedfromthreeParkinson’sdisease(PD)patients(pre-DBS,onemonthafteroperationbeforestim-on,onemonthafterstim-on)andfromthreenormalhealthycontrols,wasstudiedfordifferentiallyexpressedproteins.TMT/iTRAQLabeling,incombinationwithHPLCFractionationandLC-MS/MSAnalysis,wasusedtoidentifythechangedproteins(3PDpatientsindifferentstatementand3controls).739proteinswereidentifiedafterLC-MS/MSandproteindatabaseinterrogation.Result:Atotalof739proteinswereidentifiedinthisstudy,ofwhich644containedquantitativeinformation.Ifthechangethresholdis1.2timesashighast-testp-value<0.05,Then18proteinswereup-regulated,21proteinsweredown-regulated,23proteinswereup-regulated,and25proteinsweredown-regulatedinthePD3/CKcomparisongroup,inthepPD1/CKcomparisongroup,theexpressionof18proteinswasup-regulated,theexpressionof21proteinswasdown-regulated,andtheexpressionof25proteinswasdown-regulatedinthePD3/CKcomparisongroup.5 南京医科大学硕（博）士学位论文Theexpressionof12proteinswasup-regulated,theexpressionof12proteinswasdown-regulated,theexpressionof10proteinswasup-regulatedinthecomparisongroupofPD3/PD1,andtheexpressionof5proteinswasdown-regulatedinthecomparisongroupofPD3/PD2.Theexpressionof16proteinswasup-regulatedand19proteinsweredown-regulated.Conclusion:Ourpreliminaryanalysisshowedthatthechangesof151proteinexpressionlevelscouldrevealthedifferencebetweenthenormalpopulationandParkinson'sdiseasepatients,whilethechangesof56proteinexpressionlevelsmightberelatedtodeepbrainstimulationtherapy.Keywords:Parkinson'sdisease,deepbrainstimulation,proteomics,biomarker,plasmaParttwoQuantitativeEvaluationofMotorSymptomsinPatientswithParkinson'sDisease----AcousticAnalysisObjective:Theaimofthisstudyistoexploretheeffectofthesubthalamicnucleus(STN)deepbrainstimulation(DBS)ondysarthriaofpatientswithParkinson’sDisease(PD).Methods:TenPDpatientswithSTN-DBSsurgeryparticipatedinthisexperiment,andtheirreadingspeecheswerecollectedinthestateofstimulationoffonemonthafteroperation(OFF),stimulationonafterinternalpulsegenerator(IPG)onforonemonth(ON1)andstimulationonafterIPGonforthreemonths(ON2)respectively,andallthesestateswereunderthestateofmedicationoff.Fundamentalfrequency(F0)contourswereextractedfromthesespeechsignalsandthenwerecomparedwiththehealthycontrolgroup(HC).6 南京医科大学硕（博）士学位论文Results:F0wasimprovedinacertaindegreeinthepatientswithSTN-DBSsurgicaltreatment.TheF0rangeandF0variationofonemonthafteroperation(OFF)inthePDpatientsweresignificantlylowerthanthoseinthreemonths(ON2),andtherewasnosignificantdifferencebetweenonemonthafteroperation(OFF)andtheHCgroup.Besides,therewerenosignificantdifferencesinotherindicatorsamonganyothergroupsorstates.Conclusion:STN-DBSoperationcanalleviatethestiffnessoflaryngealmusclesandvocalcords,especiallyinthepatientswhosedominantsymptomistremorandthosewithlessmotorfunctionimpairmentbeforeoperation.Keywords:Parkinsondisease;Deepbrainstimulation;Subthalamicnucleus;AcousticAnalysisPartthreeQuantitativeEvaluationofMotorSymptomsinPatientswithParkinson'sDisease----BradykinesiaAnalysisObjective:BradykinesiaisoneofthecorefeaturesofParkinson'sdisease(PD)andalsoanimportantindexinclinicaldiagnosisofPD.ThequantitativeassessmentofmotorsymptomswillbehelpfultodiagnosePD,tomonitortheprogressofthedisease,andtoevaluateandoptimizetheeffectivenessofantiparkinsonismdrugsandothertherapies.Methods:Thesubjectsincludedahealthycontrolgroupandadrugtherapygroup.Thehealthycontrolgroupconsistedof15healthyelderlypeoplewhoseageandsexwerematchedtothedrugtherapygroup.Inthedrugtherapygroup,11patientswithParkinson'sdiseasewererecruitedaccordingtotheDiagnosticcriteriaforParkinson'sdiseaseinChina(2016).Thelevodopachallengetestswereperformed,andthedrug7 南京医科大学硕（博）士学位论文therapygroupwasintwostates:medication-onandmedication-offstate.AllPDpatientswereassessedwiththeUnifiedParkinson'sDiseaseRatingScale(UPDRS).Quantitativewearableassessmentsystemwasusedtorecordthemotiondataintwogroupsofthreeparadigmmaneuvers:wrist-turning,foot-tappingandwalkingbackandforthin10meters.Amplitude,frequencyandothermotionindicatorswereextractedandcomparedamonggroups.ThenthecorrelationanalysiswascarriedoutbetweenmotiondataandthesubitemsorcombinationofsubitemsofUPDRSⅢ.Results:Thereweresignificantdifferencesinwrist-turningamplitude,strideangleandturningtimeamongthehealthycontrolgroupandthedrugtherapygroupinmedication-onandmedication-offstate.Therewasagoodcorrelationbetweentheturningtimeandthescoresofgait(Ⅲ29),axialsymptom(Ⅲ18-19、27-31)andbradykinesiaplusaxialsymptom(Ⅲ18、19、23-31)ofUPDRSⅢ.Conclusion:ThequantitativewearableassessmentsystemcanbeusedtomeasurebradykinesiasymptominParkinson'sdisease,andthentoevaluatetheeffectofdrugtherapyonbradykinesiasymptominpatientswithParkinson'sdisease,whichprovidesanewmethodforaccuratemanagementofParkinson'sdisease.Keywords:Parkinson’sdisease;bradykinesia;Quantitativeassessmentofmotorfunction；quantitativewearableassessmentsystemPartfourMonitoringofFieldpotentialandTargetlocationduringDeepbrainstimulationinParkinson'sDiseaseObjective:ThesignalcharacteristicsofthesubthalamicnucleusfieldpotentialassociatedwiththelocationofthetargetsiteofDBSweredynamicallydetectedandtheoptimaltargetofSTN-DBSwasfoundaccordingtothelawofthechangeofthe8 南京医科大学硕（博）士学位论文fieldpotential.Materialsandmethods:TwentyPDpatientswhoweretreatedwithSTN-DBSwereroutinelyusedmicroelectroderecordingtodeterminethesurgicaltargetduringtheoperation,andthefieldpotentialsignalswerecollectedfrom6mmto4mmto2mmand0mmtothetargetforpowerspectraldensityanalysisbeforeandafteroperation.Theimagedatawerereconstructedandcompared.Results:ThedynamicdetectionoffieldpotentialbyimplantedelectrodeduringDBScanreflecttherelativepositionbetweentheelectrodeandtheSTNnucleus,andtheresultofimagereconstructionhasgoodconformancewiththemicroelectroderecording.Conclusions:DBSintraoperativefieldpotentialdetectioncanprovideanewmethodfortargetlocation,andguidepostoperativestimulationsite,parametersettingandadjustment.Keywords:Parkinson'sdisease,subthalamicnucleus,deepbrainstimulation,localfieldpotential,targetlocationPartfivePostoperativemanagementofdeepbrainstimulationinpatientswithParkinson'sdiseaseObjective:TheaimofthisstudywastoretrospectivelyanalyzethetherapeuticeffectsandresidualsymptomsofpatientswithParkinson'sdiseaseafter3~36monthsofdeepbrainstimulation,anddisscussthestandardizedandindividualizedmanagementafterDBS.Materialsandmethods:FromMay2015toFebruary2018,80patientswithParkinson'sdiseasewhoweretreatedwithSTN-DBSfromMay2015toFebruary9 南京医科大学硕（博）士学位论文2018wereincludedinthisstudy.TheUPDRS,MMSE,MoCa,PNM,PQ39scaleswerescoredbythesametwodoctorsrespectivelybeforeandafterDBSoperation.Espacially,UPDRSⅢwasgradedunderfourstatesofmed-on/med-offandstimulatorstimu-on/stimu-off.ThemainsymptomsofParkinson'sdisease,suchasbradykinesia,tremor,rigidity,balance,swallowing,speechandsoon,theincreaseanddecreaseofdrugs,theoccurrenceofcomplicationsassociatedwithstimulation,werecomparedandanalyzedbeforeandafterDBSoperation.Andtheoptimalsettingparametersandprogramcontrolrulesofthestimulatorafteroperation.Summarizethebestsettingparametersandprogramcontrolrulesofpostoperativestimulatorprogramcontrol.Results:AfterSTN-DBS,thePQ39scoresofallpatientsimprovedsignificantly(P<0.01).Motorscorewassignificantlyimproved(P<0.01),amongwhichmotorretardation,tremorandstiffnesswerebetter,speechabilitywasimprovedattheinitialstage,andposturalbalancewasnotimprovedsignificantly.Cognitive,emotionalimprovementisnotobvious.Afteroperation,thekindsofdrugsdecreasedby50%andthedosagedecreasedby43%(P<0.01).Themaincomplaintsofpostoperativediscomfortwereabnormalmovement,weakness,postureandgaitabnormality,disturbanceofbalance,abnormalsleepandconstipation.Conclusions:STN-DBSisasafeandeffectivemethodforthetreatmentofadvancedParkinson'sdisease.Itcanimprovemotorsymptomswell,butitisnotenoughtoimprovenon-motorsymptoms.Therefore,itisnecessarytocarryoutindividualizedmanagementofsurgery.Keywords:Parkinson’sdisease,Deepbrainstimulation,STN,Posteroperationmanagement10 南京医科大学硕（博）士学位论文前言PD（Parkinson’sDisease，帕金森病）又称震颤麻痹，是第二大中枢神经系统神经退行性疾病，其发病率仅次于AD（Alzheimer’sdisease，阿尔兹海默病）[1,2]。PD的病因目前尚不十分清楚，可能与遗传、环境和老龄化等因素相关。其特征是渐进性的发病和选择性的神经功能丧失，不同的临床亚型存在着病程和中枢神经系统受损部位的广泛变异性，因此其临床表现存在着明显的异质性。DBS（DeepBrainStimulation,脑深部刺激治疗）是一种基于立体定向技术，在脑内特定的神经核团内植入电极，释放一定脉宽、频率、电压（或电流）的电脉冲刺激序列，抑制过度兴奋的神经元的电冲动，调整神经元网络的过度同步化，从而缓解疾病症状的手术疗法。DBS目前广泛应用于帕金森病、特发性震颤、肌张力障碍等运动障碍疾病，并开始探索对于强迫症、抑郁症和认知障碍[3]等疾病的治疗。DBS对于iPD（idiopathicParkinsondisease,iPD）患者具有良好的治疗效果，但是对于其他帕金森综合症患者效果欠佳，因此科学的术前评估，把握适应症，选择合适的手术病人是保证疗效的前提。根据临床症状进行量表评估仍为iPD的主要诊断手段，这种评估方法具有很强的经验依赖性，容易随评估者的改变[4]而产生波动，早期正确诊断率还不能令人满意。PD的临床表现包括非运动症状和运动症状，非运动症状比运动症状出现更早，包括抑郁、睡眠障碍、嗅觉[5]障碍、便秘、自主神经功能紊乱等，对于PD的发病有一定的提示作用。运动[6]症状包括行动迟缓、静止性震颤、肌肉强直、姿势平衡障碍和运动减少等，PD目前归为运动障碍疾病，其运动症状是其突出特点，因此对运动症状的定量检测对于疾病的诊断、治疗效果观察和预后判断有重要意义。除了临床症状的诊断，大量的研究在病理学、分子生物学等领域展开探索。病理学研究提示在帕金森病发病早期即有特征性的淀粉样蛋白包涵体（Lewy小体）在外周自主神经系统、嗅球、延髓部分沉积。后逐渐在桥脑、中脑、基底前脑、边缘系统、丘脑、颞叶皮层、高级感觉联合区新皮层及前额叶、一级感11 南京医科大学硕（博）士学位论文[7]觉联合区新皮质及运动前区等脑区出现。Lewy小体为大量蛋白发生聚集而成，[8]其主要成分为α-突触核蛋白（α-synuclein）。产生这一病理结果的原因目前尚不明确，分子生物学研究提示可能与各种因素导致的线粒体功能障碍、氧化应[9]激、泛素蛋白酶体系统功能障碍、炎症、凋亡等机制相关。蛋白质是生命功能的执行者，因此，α-突触核蛋白及参与上述机制最终致使α-突触核蛋白沉积的相关蛋白质是帕金森病的发生发展中重要的生物标志物。有文献显示，帕金森病患者体内的α-突触核蛋白不仅沉积于中枢神经系统内，亦分布于包括外周血[10]在内的全身多处组织器官中。因此外周血中必然会有可以作为帕金森病生物标志物的蛋白存在。相比较组织活检、脑脊液检查，血浆蛋白质的检验具有采样方便，创伤小，可以反复定期检测，患者容易接受等优点，因此血浆蛋白生物标志物的研究具有重要的科研和临床应用价值。[11]PD的DBS治疗因其微创性、可调节性、双侧手术安全性等优点，基本[12]取代毁损手术成为帕金森病外科治疗的主要方法。目前主要的刺激靶点为：VIM核，Gpi核和STN核，相比较而言，STN不仅能够有效改善运动迟缓、震[13]颤和僵直症状，还能减少药量，因此成为目前最为常用的手术靶点。刺激靶点的准确定位是手术成功的关键，目前临床多采用术前影像融合、术中MER（Micro-ElectrodeRecording，微电极记录）电生理定位。近年来对PD患者STN的LFP（LocalFieldPotential，局部场电位）的研究表明STN的神经波动在β频[14,15,16]段存在过度同步化现象,而多巴胺类药物和DBS治疗均可以有效抑制这种[17]异常的β频段同步化,且治疗效果与β频段同步化抑制程度有关。因此对于场电位的研究可以进一步探讨帕金森病的电生理机制，同时进行STN-DBS手术靶点功能定位，指导术后程控。DBS治疗是中晚期帕金森病患者药物治疗外的一种重要补充，可以有效改善运动症状，减少药物用量，减少运动并发症的产生。但目前DBS和大多数的药物治疗为对症治疗，随着病情进展，患者因长期疾病所导致的肌力下降、关节变形、肌肉萎缩、执行功能下降等运动症状逐渐加重，同时便秘、抑郁、认12 南京医科大学硕（博）士学位论文知减退等非运动症状也会给患者的生活带来严重的困扰。因此，目前对PD的非[18,19]运动症状和运动症状采取全面综合的治疗，治疗方法包括：药物治疗、手术治疗、运动疗法、心理疏导及照料护理等。由于PD的异质性，对于行DBS手术治疗的患者来说，药物和DBS程控参数的配合，运动康复治疗和心理治疗的辅助，制定科学个性化的管理方案至关重要。总之，本研究基础部分通过液相色谱技术、质谱技术等手段分析研究了帕金森病患者外周血的生物标志物，为可能的发病机制提供蛋白质组学的试验基础。本研究临床部分采用多节点可穿戴运动监测设备、Praat语音分析软件、UPDRS量表等一系列量表对患者的运动症状和非运动症状进行评估，定量分析协助诊断、判定治疗的效果。使用Biopac电生理信号采集系统采集术中场电位电生理信号，使用Matlab软件进行数据分析，尝试通过局部场电位的特征分析寻找DBS手术的最佳靶点，指导术后程控。希望通过以上的基础与临床研究为帕金森病的精准诊疗提供新的参考。参考文献：[1]LauLM,BretelerMM.EpidemiologyofParkinson’sdisease[J].LancetNeurol.,2006.5(6),pp525–535.[2]JohnD.,GazewoodD.,RoxanneR.,KarlC.ParkinsonDisease:AnUpdate[J].AmericanFamilyPhysician,2013,87(4).[3]JoelS.Perlmutter,JonathanW.Mink.DeepBrainStimulation[J].Annu.Rev.Neurosci.2006,29:229–57[4]CharlesHA,ThomasGB.,JosephGH.,HollyAS.,JohnNC.,ErikaD.,MarwanNS.,LuciaIS.,SandraAJ.,ChristineMB.,BrittanyND.LowclinicaldiagnosticaccuracyofearlyvsadvancedParkinsondisease:clinicopathologicstudy[J].Neurology,2014,83(5):406-412.[5]SeanS.O’Sullivan,DavidR.Williams,DavidA.Gallagher,LukeA.Massey,LauraSilveira-Moriyama,AndrewJ.Lees.NonmotorSymptomsasPresenting13 南京医科大学硕（博）士学位论文ComplaintsinParkinson’sDisease:AClinicopathologicalStudy[J].MovementDisorders,2008,23(1):101–106.[6]MariaCRodriguez-Oroz,MarjanJahanshahi,PaulKrack,IreneLitvan,RaúlMacias,ErwanBezard,JoséAObeso.InitialclinicalmanifestationsofParkinson’sdisease:featuresandpathophysiologicalmechanisms[J].LancetNeurol,2009,8:1128–1139.[7]HeikoB.,KellyD.T.,UdoR.,RobA.I.deVos,ErnstN.H.,JansenS.,EvaB.StagingofbrainpathologyrelatedtosporadicParkinson’sdisease[J].NeurobiologyofAging,2003,,24,197–211.[8]NatáliaPR.,AlineSM.,AntônioLúcioTeixeira.InsightsintoNeuroinflammationinParkinson’sDisease:FromBiomarkerstoAnti-InflammatoryBasedTherapies[J].BiomedResInt,2015,2015:628192.[9]ToruY.,YasutoN.,HidekiM.α-SynucleinandNeuronalCellDeath[J].MolNeurobiol,2013,47:466–483.[10]AnzariAtik,TessandraStewart,JingZhang.Alpha-SynucleinasaBiomarkerforParkinson’sDisease[J].BrainPathology2016(26)410–418[11]李路明.脑起搏器与神经调控技术[J].生命科学仪器，2015，12（6）：7-11.[12]胡小吾,周晓平,王来兴,姜秀峰,曹依群,徐波涛,金爱国,曾浩.刺激术和毁损术在双侧立体定向手术治疗帕金森病中的比较[J].中华神经外科杂志，2004，20（4）：280-282.[13]KennethA.Follett,FrancesM.Weaver,MatthewStern,KwanHur,CrystalL.Harris,PingLuo.PallidalversusSubthalamicDeep-BrainStimulationforParkinson’sDisease[J].NEnglJMed,2010;362:2077-91[14]A.Kuhn,A.Kupsch,G.H.Schneider.Reductioninsubthalamic8-35HzoscillatoryactivitycorrelateswithclinicalimprovementinParkinson'sdisease[J].14 南京医科大学硕（博）士学位论文Neuroscience,2006,23(7):1956-1960.[15]A.Kuhn,A.Tsui,T.Aziz.PathologicalsynchronisationinthesubthalamicnucleusofpatientswithParkinson'sdiseaserelatestobothbradykinesiaandrigidity[J].ExpNeurol,2009,215(2):380-387.[16]A.Eusebio,W.Thevathasan,L.D.Gaynor.Deepbrainstimulationcansuppresspathologicalsynchronisationinparkinsonianpatients[J].NeurosurgPsychiatry,2011,82(5):569-573.[17]N.J.Ray,N.Jenkinson,S.Wang.LocalfieldpotentialbetaactivityinthesubthalamicnucleusofpatientswithParkinson'sdiseaseisassociatedwithimprovementsinbradykinesiaafterdopamineanddeepbrainstimulation[J].ExpNeurol,2008,213(1):108-113.[18]中华医学会神经病学分会帕金森病及运动障碍学组.中国帕金森病治疗指南（第三版）中华神经科杂志，2014，47（6）：428-433.[19]HuWH,ZhangK,MengFG,MaY,ZhangJG.DeepBrainStimulationinChina:PresentandFuture[J].Neuromodulation,2012,15(3):251-259.15 南京医科大学硕（博）士学位论文第一部分帕金森病患者血浆蛋白生物标志物的研究1引言朊蛋白（Prionprotein）是一种能够自我复制的蛋白质。普通蛋白质转化为朊蛋白通常伴随着β片层结构的增加和寡聚体的形成。一些朊蛋白是有益的，发挥正常的细胞功能，而另一些则是有害的，可导致神经退化。越来越多的证据表明，NDs（NeurodegenerativeDiseases，中枢神经系统退行性疾病）包括AD，PD和CJD（Creutzfeldt-Jacobdisease，克雅氏病）等均由其导致。大多数NDs是散发性的，只有10%到20%受遗传因素决定。但无论是散发的还是由遗传因[1]素决定的，神经功能障碍出现前，朊蛋白的积累均需要超过一定临界阈值。在朊蛋白逐渐积累的过程中，朊蛋白和与其产生及积累相关的蛋白，以及它们浓度水平的特征性变化，极有可能成为NDs特异性的生物标志物。PD作为NDs的一种，目前无法治愈。但神经保护疗法等新疗法的发展需要寻找PD早期诊断标志物，从而有能力早发现早诊断，以便能够在不可逆的细胞[2,3]损伤发生之前进行治疗。同时对PD病程进展标志物的研究则可以为PD病情[4]发展程度提供参考，为各种治疗效果的客观评价提供重要依据。PD的病理研究提示α-突触核蛋白为其特征性朊蛋白，以α-突触核蛋白为主体，同时和其它蛋白一起沉积，即形成特征性的淀粉样蛋白包涵体（Lewy小体）。Lewy小体在帕金森病发病早期即在外周自主神经系统、嗅球、延髓部分沉积。后逐渐在桥脑、中脑、基底前脑、边缘系统、丘脑、颞叶皮层、高级感觉联合[5]区新皮层及前额叶、一级感觉联合区新皮质及运动前区等脑区出现。后有研究发现α-突触核蛋白的沉积分布并不局限于中枢神经系统，同时也存在于周围组[6]织中。因此在未出现运动症状之前，在外周神经、皮肤、腺体、消化道、泌尿生殖道、脑脊液、脑脊液中单核细胞、唾液、血白细胞、血浆等检测发现α-突[7]触核蛋白亦可以作为PD早期诊断生物标志物。目前脑脊液α-突触核蛋白在科16 南京医科大学硕（博）士学位论文[8,9]研中已被广泛检测，其损伤较活检皮肤、腺体及外周神经小，但在临床上仍不能被病人所广泛接受。理想的生物标志物应具有容易获取，定量检测，重复性好，特异性高等特点，采血检测作为更容易接受的检查方式，血浆蛋白生物[10]标志物的研究具有重要的科研和临床意义。如有研究报道，外周血中与慢性炎症相关的CRP(C-reactiveprotein，C-反应蛋白)的基线浓度水平与PD的病情[11]发展与预后密切相关，即可以作为PD病情进展的生物标志物。蛋白质组学是以“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。因此蛋白质组学的研究通常是高通量的。目前，在蛋白质功能方面的研究非常缺乏的。大部分通过基因组测序而新发现的基因编码的蛋白质的功能都是未知的，而对那些已知功能的蛋白而言，它们的功能也大多是通过同源[12,13]基因功能类推等方法推测出来的。因此，使用蛋白质组学的方法可以寻找出更多、更全、更新的PD血浆蛋白质生物标志物，并且可以研究蛋白质之间的相互作用，绘制出PD发生、发展过程中的蛋白质互相作用的网络图谱。同时，分子生物学研究提示α-突触核蛋白沉积形成Lewy小体的过程可能与各种因素导致的线粒体功能障碍、氧化应激、[14]泛素蛋白酶体系统功能障碍、炎症、凋亡等机制相关。因此在蛋白质组学研究中与以上机制相关的上游蛋白成为着重考察的对象。在脑脊液中单个核细胞的蛋白质组学研究发现，PD与正常人差异蛋白包括细胞骨架蛋白(肌动蛋白、肌球蛋白)、信号转导蛋白(腺苷环化酶结合蛋白1、钙结合蛋白、距骨素)和抗氧化［15］因子(硫氧还蛋白过氧化物还原酶)等，说明通过患者与正常人的蛋白质组进行对比，即有在与氧化应激、信号转导、细胞凋亡机制相关的蛋白中发现PD的生物标志物的可能。17 南京医科大学硕（博）士学位论文DBS手术治疗对于帕金森病患者的症状可以有效改善，已知蛋白质是生命功能的执行者，目前公认在PD的发病过程中蛋白质起到重要作用，因此关于DBS治疗对PD患者蛋白质组水平变化影响的研究有利于揭示DBS治疗的机制，找寻评估DBS治疗效果的生物标志物。有研究对帕金森病患者DBS手术前后的脑脊液蛋白进行对比，定量鉴定了21个差异蛋白质，查阅文献分析，最终考虑tetranectin和细EC-SOD(extracellularsuperoxidedismutase，胞外超氧化物歧化酶)[16,17]与DBS刺激有关。本部分实验即是基于以上理论基础，采用高效液相色谱分级、液相色谱-质谱串联分析等方法测定PD患者和正常对照者血浆中蛋白质的差异，初步确定与PD及DBS治疗相关的蛋白，为进一步探索PD血浆蛋白生物标记物、DBS治疗效果标志物提供线索及研究基础。2材料和方法2.1标本的收集收集在南京脑科医院神经外科住院拟行DBS治疗的3位PD患者的外周血和3名健康对照者(CK)的外周血，基本情况如表1。两组被试的性别、年龄相仿，无统计学差异。CK与PD组标本的收集均征得本院伦理委员会的同意，并让每名参与者签署知情同意书。停药12小时以上，清晨空腹抽取外周血5ml，3500转/min离心十分钟，-80℃保存。6名受试者情况如下：表1标本信息受试者信息样品编号PD术后一PD开机编号性别年龄H-Y分期改善率R对照组PD术前月未开机一月后CK1女65//CK1///CK2男67//CK2///CK3女65//CK3///PD1女62Ⅱ63%/PD1-1PD1-2PD1-3PD2男63Ⅳ43%/PD2-1PD2-2PD2-3PD3女60Ⅲ47%/PD3-1PD3-2PD3-3*PDn-m:指的是第n个患者的第m种状态。18 南京医科大学硕（博）士学位论文*改善率R：为未服药状态下，开机一月后与术前相比UPDRSⅢ评分的改善率。R=（术前UPDRSⅢ评分-开机一月后UPDRSⅢ评分）/术前UPDRSⅢ评分。2.2仪器与试剂表2仪器仪器仪器名称供应商型号国别（城市）质谱仪ThermoFisherGermanyQ-ExactivePlusQ-ExactivePlusScientific（Bremen）液相色谱ThermoEASY-nLCThermoFisherEASY-nLC1000USA（Waltham）仪1000NanoHPLCScientific酶标仪Bio-RadMicroplateReaderIMARKUSA（Hercules）Laboratories通用真空Savant™UniversalThermoFisherGermany泵SpeedVac™VacuumSavantUVS400Scientific（Bremen）System超声波细HighintensityScientzJY92-ⅡNChina（Ningbo）胞破碎仪ultrasonicprocessor高速冷冻DynamicaUK（NewportCentrifugeVelocity18R离心机ScientificLtd.Pagnell）振荡器ShakerQilinbeierTS-200China（Haimen）移液器GermanyTransferpipetteeppendorfXplorerplus（Bremen）表3样品制备所需材料和试剂试剂名称供应商试剂名称供应商30%Acr-BisSigmaEDTASigmaSDSAmresco胰酶（trypsin）Promega甲酸（formicacid）Fluka尿素（urea）Sigma乙腈（acetonitrile）FisherChemical预染蛋白markerThermo超纯水（H2O）FisherChemical蛋白酶抑制剂Calbiochem三乙基碳酸氢铵SigmaBCA试剂盒碧云天二硫苏糖醇（dithiothreitol）Sigma标记试剂盒Thermo19 南京医科大学硕（博）士学位论文碘代乙酰胺（iodoacetamide）SigmaTMT标记试剂Thermo三氟乙酸（trifluoroaceticacid）Sigma-Aldrich2.3预试验及质控预试验主要包括蛋白提取、标记效率、定量准确性和平行性、修饰富集和质谱稳定性等方面。2.3.1蛋白提取本实验样品为血清类样本，含有高丰度蛋白，需要去除。去除高丰度蛋白步骤如下：①先将柱子的密封头掰断放在干净的无尘纸上备用，然后将柱子放到干净的收集套管中，离心除去保护液。②加200μlWashBuffer，旋转摇床上放置5mins，然后将柱子放到收集套管中，离心除去上清，重复1次。③加200μl血清样品，旋转摇床上放置2hours，然后将柱子放到收集套管中，离心除去上清。④加200μlWashBuffer，旋转摇床上放置5mins，然后将柱子放到收集套管中，离心除去上清，重复2次。⑤加200μl去离子水，旋转摇床上放置1min，然后将柱子放到收集套管中，离心除去上清。⑥加20μlElutionBuffer，旋转摇床上放置15mins，然后将柱子放到干净的离心管中，离心收集上清，重复2次。2.3.2蛋白浓度测定取5μL蛋白样品，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，方法如下：①将标准品按0µL、5µL、10µL、15µL、20µL加到酶标条的样品孔中，加样品稀释液补足到20µL，各检测3个复孔；②将5µL待测蛋白样品加到酶标条的样品孔中，加样品稀释液补足到20µL，各检测3个复孔；20 南京医科大学硕（博）士学位论文③各孔加入200µLBCA工作液，37°C静置反应30分钟；④用酶标仪测定A570（最佳吸收波长为562nm，540-595nm之间的其他波长也可应用）；⑤根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。图1蛋白浓度测定的标准曲线（标准蛋白为BSA）表4蛋白浓度测定结果样品编号蛋白浓度（ug/uL）样品总体积（uL）蛋白总量（ug）13.0150150.523.1150155.533.125015643.045015253.0150150.563.0350151.573.125015683.085015493.0750153.5103.0050150112.9950149.5123.10501552.3.3SDS-PAGE①样品准备：根据蛋白浓度测定结果，每个样品取30μg蛋白到离心管中，加入5μL4×Loadingbuffer，再加入2%SDS使体积为20μL，100°C热变性21 南京医科大学硕（博）士学位论文5分钟；②上样：依次上样1μL预染蛋白marker和20μL蛋白样品，样品相邻的空白孔上样20μL1×Loadingbuffer封闭；③电泳：浓缩胶80V电泳20分钟，分离胶120V电泳到溴酚蓝指示带到胶底端；④染色和脱色：胶取出后于考马斯亮蓝R250染液中室温染色2h，然后加入脱色液，脱色至背景无色、条带清晰。图2各样品蛋白SDS-PAGE图蛋白条带清晰、均一，蛋白无降解，各泳道平行性好，蛋白总量可以满足2次以上实验。2.3.4定量蛋白组学试验①胰酶酶解：各样品蛋白提取取等量蛋白溶液进行酶解，根据质量比1:1加入GST和MBP两个标准蛋白，加入DTT使其终浓度为5mmol/L，56°C还原30min。之后加入IAA使其终浓度为11mmol/L，室温避光孵育15min。22 南京医科大学硕（博）士学位论文最后将样品加TEAB使尿素浓度稀释至低于2M。以1:50的质量比例（蛋白酶：蛋白）加入胰蛋白酶，酶解过夜。再以1:100的质量比例（蛋白酶：蛋白）加入胰蛋白酶，继续酶解4h。②TMT标记胰酶酶解的肽段用StrataXC18（Phenomenex）除盐后真空冷冻干燥。以0.5MTEAB溶解肽段，用BCA试剂盒测定肽段浓度，每个样品取100μg肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段。简单的操作如下：TMT试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥，取1μg上质谱做预实验。③液相色谱-质谱联用分析：肽段用液相色谱流动相A相（0.1%(v/v)甲酸水溶液）溶解后使用EASY-nLC1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；缓冲液B为含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度设置：0~26min,6%-23%;26~34min,23%-35%;34~37min35%-80%;37~40min,80%,流速维持在400nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QExactiveTMPlus质谱进行分析。离子源电压设置为2.0kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800m/z，扫描分辨率设置为70,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，Orbitrap扫描分辨率设置为17,500。数据采集模式使用数据依赖型扫描（DDA）程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用30%的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，设置自动增益控制（AGC）设置为5E4，信号阈值设置为10000ions/s，最大注入时间设置为200ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒避免母离子的重复扫④数据库搜索：二级质谱数据使用Mascot2.3进行搜索，在Homosapiens数据库（标准蛋白搜GST和MBP库）中进行匹配，匹配同时使用了反库以排除随机匹配造成的假阳性率（FDR）。蛋白酶设置为Trypsin/P，肽段最小长度23 南京医科大学硕（博）士学位论文设置为7个氨基酸残基，最大漏切位点设置为2个，最大电荷数设置为5个。一级母离子的最大容忍质量误差设置为10ppm，二级子离子最大容忍质量误差设置为0.02Da。固定修饰设置为半胱氨酸烷基化，可变修饰设置为甲硫氨酸氧化。2.3.5标记效率评估标记效率质控标准：>97%标记效率检测结果：预试验标本1是97.57%，预试验标本2是98.25%，预试验标本3是97.88%，达到质控标准。2.3.6方法稳定性评估为了评估定量方法的准确性和平行性，我们在各个样品中加入相等量的标准蛋白（GST和MBP）。标准蛋白为微量添加，且来源于原核细胞，故不会对样品中的蛋白定量结果造成影响。质谱定量发现两个标准蛋白在各样品中的相对定量值均接近1（质控标准为0.8-1.2），说明定量方法的准确性和平行性良好，达到质控标准。标准蛋白质控结果见表5。表5蛋白质质控表预试验标本1standardCK-1PD1-1PD1-2PD1-3GST0.990.991.010.99MBP1.071.040.980.98预试验标本2standardCK-2PD2-1PD2-2PD2-3GST1.000.990.981.00MBP0.981.031.020.99预试验标本3standardCK-3PD3-1PD3-2PD3-3GST1.001.010.981.01MBP1.000.971.001.012.3.7质谱稳定性指控24 南京医科大学硕（博）士学位论文质量轴稳定性质控标准：中心轴在±3ppm以内，主体区间在±10ppm以内。本项目质量轴的中心轴在1ppm以内，且主体在5ppm以内，说明质谱的质量轴准确且稳定。图3肽段质量误差分布图2.4实验方法及过程本实验通过将TMT标记、高效液相色谱分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列前沿技术的有机结合，对帕金森病患者血浆蛋白生物标志物进行蛋白组学的研究。主要包括：蛋白提取、胰酶酶解、TMT标记、高效液相色谱分级、液相色谱-质谱串联分析、数据库搜索、生物信息学分析。2.4.1蛋白提取把分离好的血浆样品从－80°C取出，去除高丰度蛋白，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。2.4.2胰酶酶解蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mmol/L，56°C还原30min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mmol/L，室温避光孵育15min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2mol/L。以1:50的质量比例（胰酶：蛋白）加入胰酶，37°C酶解过夜。再以1:100的质量比例（胰酶：蛋白）加入胰酶，继续酶解4h。25 南京医科大学硕（博）士学位论文2.4.3TMT标记胰酶酶解的肽段用StrataXC18（Phenomenex）除盐后真空冷冻干燥。以0.5mol/LTEAB溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段。操作如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。2.4.4HPLC分级肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent300ExtendC18（5μm粒径，4.6mm内径，250mm长）。操作如下：肽段分级梯度为8%-32%乙腈、pH9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为18个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。2.4.5液相色谱-质谱联用分析肽段用液相色谱流动相A相（0.1%(v/v)甲酸水溶液）溶解后使用EASY-nLC1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流动相B为含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度设置：0~26min，7%-25%B；26~34min，25%-40%B；34~37min，40%-80%B；37~40min，80%B，流速维持在400nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QExactiveTMPlus质谱进行分析。离子源电压设置为2.0kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800m/z，扫描分辨率设置为70,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，Orbitrap扫描分辨率设置为17,500。数据采集模式使用数据依赖型扫描（DDA）程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用31%的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制（AGC）设置为5E4，信号阈值设置为10000ions/s，最大注入时间设置为200ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30s避免母离子的重复扫描。2.4.6数据库搜素26 南京医科大学硕（博）士学位论文二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索。检索参数设置：数据库为SwissProthuman（20130条序列），添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率（FDR），并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；Firstsearch和Mainsearch的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化。定量方法设置为TMT-6plex，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1%。2.5生物信息学分析方法2.5.1蛋白注释方法①GeneOntology分析：GeneOntology分析，或GO分析，是一种能够将基因与基因产物（如蛋白质）的各项信息有机的联系在一起进而提供统计学信息的生物信息学分析方法。在蛋白质组学项目中，GO主要有下列用途：1.作为蛋白及基因的各项信息的数据库；2.提供蛋白及基因的各种信息，并按照信息对蛋白及基因进行分类；3.作为一个工具，为项目中的所有蛋白提供最全面的信息注释和分类服务。GeneOntology分析主要包括三个方面：1.细胞组成：细胞组成是指细胞的特定成分，在GO系统中它应当是细胞中较大组分的组成元件。比如解剖学上的某些细胞结构（糙面内质网、细胞核等），或一系列基因产物，如一些复杂成分的基础结构（核糖体，蛋白二聚体等）。2.分子功能：分子功能主要描述分子的化学活性，比如能够在分子层面表现出来的催化活性或结合活性。3.生物进程：生物体内一系列分子有序的执行某项特定功能，被称为生理进程。GeneOntology(GO)对蛋白质组学层面的注释来源于UniProt-GOA数据库(www.http://www.ebi.ac.uk/GOA/)。首先，系统会将蛋白ID转换为UniProtID，之后用UniProtID去匹配GOID，并依据GOID从UniProt-GOA数据库中调取相应的信息。如果UniProt-GOA数据库中没有所查询的蛋白信息，那么会使用27 南京医科大学硕（博）士学位论文一款基于蛋白序列的算法软件，InterProScan，去预测该蛋白的GO功能。之后按照细胞成分、分子功能或生理进程对此蛋白进行分类。②蛋白结构域注释：蛋白的结构域是指蛋白质中在序列上具有保守性，且一般情况下可以独立行使功能的特定蛋白区域，是分子功能的结构元件，一般由25至500个氨基酸构成。这些区域在空间上相对紧凑、结构上相对稳定、能够独立的被折叠为功能性的结构。一个蛋白质可能拥有多个结构域，相对的，一个结构域也可能存在于多种蛋白质中。项目数据中，使用基于蛋白序列算法的软件InterProScan以及相应的InterPro结构域数据库对鉴定到的蛋白质进行蛋白结构域注释。InterPro结构域数据库(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)是一个整合了包括蛋白家族分类、蛋白结构域分类以及蛋白功能位点分类等信息的免费网络数据库。其核心是以数据库中结构域的模式或特征为标准，通过对所提交蛋白质的序列进行评估，利用相应算法来确定蛋白质所匹配到的结构域。③KEGG通路注释：KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）能够将当前已知的蛋白相互作用网络信息，比如通路及相关复合体（“Pathway”数据库）、基因及基因产物（“Gene”数据库）、生物内复合物及相关反应（“compoundandreaction”数据库）等信息进行整合。KEGG的通路主要包括：代谢、遗传信息处理、环境信息相关进程、细胞生理进程、药物研究等。我们使用KEGG通路数据库对蛋白通路进行注释：首先，使用KEGG在线服务工具KAAS对提交的蛋白进行注释，之后通过KEGGmapper将注释过的蛋白匹配入数据库中相应的通路中。④亚细胞定位：真核生物组织细胞中的蛋白，依据与其结合的膜结构的差异，被详尽的定位到细胞内各种元件上。真核细胞主要的亚细胞定位包括：胞外、细胞质、细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、过氧化物酶体、液泡、细胞骨架、核质、核基质以及核糖体等。基于此，我们使用预测亚细胞定位的软件wolfpsort对所提交的蛋白进行亚细胞定位注释。28 南京医科大学硕（博）士学位论文2.5.2蛋白质功能富集①GO富集分析：蛋白的GO注释被分为3个大类：生物进程、细胞组成、分子功能。费歇尔精确双端检验方法(Fisher'sexacttest)被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景。GO富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。②通路富集分析：KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）数据库被用于通路的富集分析。费歇尔精确双端检验方法被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景。通路富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。最后根据KEGG网站通路层级分类方法将这些通路进行分类。③蛋白结构域富集分析：InterPro（对蛋白序列的家族分类、结构域和特殊位点的预测等功能分析提供资源）数据库用于分析差异表达蛋白的功能结构域的富集情况。费歇尔精确双端检验方法被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景。结构域单元富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。2.5.3基于蛋白功能富集的聚类分析基于蛋白功能富集的聚类分析：基于不同分组的差异蛋白（或者不同差异倍数的差异蛋白）功能富集的聚类分析用于研究其在特定功能（GO，KEGG通路，蛋白结构域等）上存在的潜在联系和差异。我们首先收集所用蛋白分组富集到的功能分类信息和对应的富集P-value值，然后筛选出至少在一个蛋白分组中为显著富集（P-value<0.05）的功能分类。筛选得到的P-value数据矩阵首先经过以-log10的对数变换，然后将变换后的数据矩阵对各功能分类运用Z变换。最后将Z变换后得到的数据集使用分层聚类（欧式距离，平均连接聚类）方法做单边聚类分析。聚类关系使用R语言包gplots中的函数heatmap.2绘制出的热图进行可视化展示。2.5.4基于不同取样时刻蛋白定量动态变化的的聚类分析基于不同取样时刻的差异蛋白定量动态变化的聚类分析用于研究CK和PD术前、PD术后一月未开机、PD开机一月后三个状态下蛋白水平存在的动态变化趋势。以1.2倍为变化阈值，t-testp-value<0.05为标准，在已定量的蛋白中，29 南京医科大学硕（博）士学位论文根据其在四种状态下的水平绘制变化趋势图，并根据其变化趋势进行富集作图。聚类关系使用R语言包进行可视化展示。3结果本项研究一共鉴定到739个蛋白质，其中644个蛋白质包含定量信息。如果以1.2倍为变化阈值，t-testp-value<0.05为标准，那么在定量到的蛋白质中，PD1/CK比较组中18个蛋白表达发生上调，21个蛋白表达发生下调；PD2/CK比较组中23个蛋白表达发生上调，25个蛋白表达发生下调；PD3/CK比较组中16个蛋白表达发生上调，19个蛋白表达发生下调；PD2/PD1比较组中12个蛋白表达发生上调，12个蛋白表达发生下调；PD3/PD1比较组中10个蛋白表达发生上调，5个蛋白表达发生下调；PD3/PD2比较组中16个蛋白表达发生上调，19个蛋白表达发生下调。基于上述数据，我们对包含定量信息的蛋白质进行了系统的生物信息学分析，包括蛋白注释、功能分类、功能富集及基于功能富集的聚类分析。并综合以上信息，对下游基于蛋白质组的深入研究提供了参考方向。以差异倍数值变化超过1.2倍作为显著上调、小于0.83作为显著下调的变化标准，本项目数据中所有差异表达（Differentiallyexpressed，以下简称DE）的蛋白汇总数据参见表6。表6差异表达蛋白统计信息比较组上调(>1.2)下调(<0.83)PD-1/CK1821PD-2/CK2325PD-3/CK1619PD-2/PD-11212PD-3/PD-1105PD-3/PD-21619#注:p值<0.05.30 南京医科大学硕（博）士学位论文3.1样品重复性检验考虑被试之间具有个体差异性，我们检验生物重复或技术重复样本的定量结果是否符合统计学上的一致性。利用所有样本两两之间计算皮尔森相关系数（Pearson'sCorrelationCoefficient）而绘制的热图。此系数是度量两组数据线性相关程度的值：当皮尔森系数越接近-1为负相关，越接近1为正相关，越接近0为不相关。Pearson'sCKPD-1PD-2PD-3correlationCK-1CK-2CK-3PD1-1PD2-1PD3-1PD1-2PD2-2PD3-2PD1-3PD2-3PD3-3CK-11.000.120.18-0.57-0.02-0.12-0.52-0.16-0.01-0.440.02-0.20CKCK-20.121.000.03-0.02-0.64-0.050.06-0.47-0.04-0.19-0.550.03CK-30.180.031.00-0.270.00-0.71-0.07-0.12-0.610.070.10-0.48PD1-1-0.57-0.02-0.271.00-0.130.270.000.090.09-0.220.020.14PD-1PD2-1-0.02-0.640.00-0.131.000.04-0.06-0.12-0.020.230.33-0.02PD3-1-0.12-0.05-0.710.270.041.00-0.080.020.31-0.020.030.06PD1-2-0.520.06-0.070.00-0.06-0.081.000.320.15-0.06-0.450.05PD-2PD2-2-0.16-0.47-0.120.09-0.120.020.321.000.30-0.15-0.29-0.10PD3-2-0.01-0.04-0.610.09-0.020.310.150.301.00-0.19-0.29-0.20PD1-3-0.44-0.190.07-0.220.23-0.02-0.06-0.15-0.191.000.330.09PD-3PD2-30.02-0.550.100.020.330.03-0.45-0.29-0.290.331.000.07PD3-3-0.200.03-0.480.14-0.020.060.05-0.10-0.200.090.071.0图4样品间重复性检验（红色表示相关性系数为1，绿色表示相关性系数为-1，白色表示相关性系数为0）3.2蛋白注释为了透彻了解数据中鉴定到和定量到的蛋白质，我们对这些蛋白的功能、特征等，从GO（GeneOntology，基因本论）、蛋白结构域（proteindomain）、KEGG通路以及亚细胞结构定位等方面进行了详细的注释。差异表达蛋白的功能分类（1）GO二级注释分类GO即基因本论,是一个重要的生物信息学分析方法和工具，用于表述基因和基因产物的各种属性。GO注释分为3个一级大类：生物进程（BiologicalProcess），细胞组成（CellularComponent）和分子功能（Molecular31 南京医科大学硕（博）士学位论文Function），从不同角度阐释蛋白的生物学作用。我们对定量到的蛋白质在GO二级注释中的分布进行了统计。表7:上调蛋白在GO二级注释中的分布情况(PD1/CK)GOTermsLevel1GOTermsLevel2No.ofProteinbiologicalregulation16metabolicprocess15single-organismprocess14responsetostimulus13cellularprocess12Signaling8multicellularorganismalprocess8Localization8BiologicalProcessimmunesystemprocess7Locomotion5developmentalprocess4multi-organismprocess3biologicaladhesion2cellularcomponentorganizationorbiogenesis2Other4extracellularregion17Organelle14Cell12CellularComponentMembrane8macromolecularcomplex5membrane-enclosedlumen3Binding16catalyticactivity8molecularfunctionregulator4MolecularFunctionsignaltransduceractivity1chemoattractantactivity1moleculartransduceractivity1transporteractivity132 南京医科大学硕（博）士学位论文表8:下调蛋白在GO二级注释中的分布情况(PD1/CK)GOTermsLevel1GOTermsLevel2No.ofProteinbiologicalregulation18single-organismprocess17responsetostimulus15cellularprocess15Localization13metabolicprocess11immunesystemprocess10developmentalprocess7BiologicalProcessSignaling7multicellularorganismalprocess7cellularcomponentorganizationorbiogenesis7multi-organismprocess5biologicaladhesion2Locomotion2Other2Cell17Organelle17extracellularregion16Membrane14macromolecularcomplex9CellularComponentcelljunction8membrane-enclosedlumen7supramolecularcomplex1Synapse1otherorganism1Binding17MolecularFunctioncatalyticactivity5molecularfunctionregulator333 南京医科大学硕（博）士学位论文（2）亚细胞结构定位分类：我们使用wolfpsort软件对于差异表达蛋白进行了亚细胞结构的预测和分类统计。表9:上调蛋白的亚细胞结构定位分布情况（PD1/CK）SubcellularLocationNo.ofProteinExtracellular15endoplasmicreticulum1plasmamembrane1Nucleus1表10:下调蛋白的亚细胞结构定位分布情况（PD1/CK）SubcellularLocationNo.ofProteinExtracellular10Nucleus4endoplasmicreticulum3mitochondria2Peroxisome1Cytoplasm13.3差异表达蛋白的功能富集分析根据鉴定到的全体蛋白的注释以及差异表达蛋白的筛选，我们进行了GO、KEGG、蛋白结构域（domain）等功能注释类型的富集分析，目的是检测差异表达的蛋白是否在某些功能类型有显著性的富集趋势。对于富集检验（此处运用Fisher'sexacttest即费希尔精确检验）得到的p值进行负对数（-log10）转换，即得到转换后的值越大则此功能类型的富集越显著。（1）GO富集我们将GO注释中除了一级三大类（BiologicalProcess，CellularComponent，MolecularFunction）之外的条目进行了富集分析。34 南京医科大学硕（博）士学位论文A-log10(Fisher'exacttestpvalue)00.511.522.533.5insulin-likegrowthfactorternarycomplex2.47ar2.47CellulComponentgrowthfactorcomplex2.472.28mannosebinding2.232.01endopeptidaseactivity1.661.65MolecularFunctionpeptidaseinhibitoractivity1.651.65peptidaseactivity,actingonL-aminoacid…1.553.26regulationofleukocytecell-celladhesion2.192.19negativeregulationofleukocytecell-cell…1.971.97responsetoheat1.751.67regulationofepithelialcellproliferation1.581.58positiveregulationofdevelopmentalgrowth1.57BiologicalProcess1.54negativeregulationofpeptidaseactivity1.511.5positiveregulationofimmunesystemprocess1.5B.-log10(Fisher'exacttestpvalue)00.511.522.533.54endoplasmicreticulumchaperonecomplex3.473.08adherensjunction2.422.27endocyticvesiclelumen2.27Cellular1.94Componentporecomplex1.861.86complementbinding3.052.5opsoninbinding2.282.11macromolecularcomplexbinding1.691.66MolecularFunctionlipoproteinparticlereceptorbinding1.581.51sequesteringofcalciumion3.162.75cellularresponsetounfoldedprotein2.752.69cellularresponsetolithiumion2.692.62responsetoendoplasmicreticulumstress2.612.53cellularresponsetoendogenousstimulus2.472.4responsetolithiumion2.4BiologicalProcess2.21positiveregulationofcellularprocess2.22.18图5上调蛋白（A）和下调蛋白(B)的GO富集结果（PD1/CK）。横轴数值为显著p值（p<0.05）的负对数转换。35 南京医科大学硕（博）士学位论文（2）KEGG通路富集KEGG是连接已知分子间相互作用的信息网络，如代谢通路、复合物、生化反应。KEGG途径主要包括：代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、人类疾病、药物开发等。富集分析得到的KEGG通路可以网页形式进行可视化展示。图6差异表达蛋白显著富集的某KEGG通路可视化展示（PD1/CK）。图中红色表示上调蛋白；亮绿色表示下调蛋白；黄色表示此节点中存在多个蛋白，其中包含上调及下调个体。A.-log10(Fisher'exacttestpvalue)1.21.251.31.351.41.451.5hsa05205Proteoglycansincancer1.451.3B.-log10(Fisher'exacttestpvalue)00.511.522.53hsa04141Proteinprocessinginendoplasmic…2.71.66图7上调蛋白（A）和下调蛋白（B）的KEGG通路富集图（PD1/CK）。横轴数值为显著p值（p<0.05）的负对数转换。36 南京医科大学硕（博）士学位论文（3）蛋白结构域富集蛋白质结构域是指在不同蛋白质分子中重复出现的某些组分，具有相似的序列、结构和功能，是蛋白质进化的单元。结构域的长度通常在25个氨基酸和500个氨基酸长度之间。A.-log10(Fisher'exacttestpvalue)00.511.522.53Collectin,C-typelectin-likedomain2.732.43VITdomain2.222.05C-typelectinfold1.691.69B.-log10(Fisher'exacttestpvalue)00.511.522.53FactorI/membraneattackcomplex2.58Membraneattackcomplexcomponent/perforin…2.08Netrinmodule,non-TIMPtype1.91Netrindomain1.77Tissueinhibitorofmetalloproteinases-like,…1.77图8上调蛋白（A）和下调蛋白（B）的蛋白结构域富集图（PD1/CK）。横轴数值为显著p值（p<0.05）的负对数转换。3.4聚类分析在将不同比较组中的差异蛋白进行GO分类、KEGG通路及蛋白结构域的富集后，我们对其进行聚类分析，旨在找到比较组中差异蛋白功能的相关性。聚类方法：根据富集分析得到的富集检验（Fisher'sexacttest）p值使用分层聚类的方法将不同组中的相关功能聚到一起，绘制为热图（heatmap）。热图的横向代表不同组的富集检验结果，纵向为差异表达富集相关功能（GO，KEGGpathway，proteindomain）的描述。不同组的差异表达蛋白与功能描述对应的色块表示富集程度强弱。红色代表富集程度强，蓝色代表富集程度弱。37 南京医科大学硕（博）士学位论文A.B.C.图9基于GO富集的聚类分析热图。包括生物过程（BiologicalProcess）（A）、细胞组成（CellularComponent）（B）和分子功能（MolecularFunction）（C）等GO的三大类别。A.B.图10基于KEGG通路（A）和蛋白结构域（B）富集的聚类分2.5.4基于不同取样时刻蛋白定量动态变化的的聚类分析分析CK和PD的术前、术后一月未开机、开机一月后三个状态下蛋白水平的动态变化趋势。以1.2倍为变化阈值，t-testp-value<0.05为标准，在已定量的蛋白中，根据其在四种状态下的水平绘制变化趋势图，并根据其变化趋势进行富集作图。其中①Cluster1、Cluster3中，CK、PD2水平大致相同，PD1、PD3水平大致相同，考虑PD2为手术后一月，患者仍有部分为毁损效应存在，提示可做为为毁损效应或手术效应相关的标志无可能；②Cluster2、Cluster4中PD1、PD2、PD3水平大致相同，而与CK区别明显，提示可做为PD的诊断标志物。③Cluster5中CK与PD3、PD1和PD2大致相同，而两组之间区别明显，可做为38 南京医科大学硕（博）士学位论文DBS治疗PD效果的标志物，图11基于不同取样时刻蛋白定量动态变化的的聚类分析图39 南京医科大学硕（博）士学位论文4讨论由于PD的病因目前仍不明确，而且发病较隐蔽，等出现临床症状时，病理分期基本进入Ⅲ期，病变进入中脑。因此，PD的发病机制和早期准确诊断一直是研究的热点。目前多数学者认为，PD的发生与蛋白的异常聚集有关。其神经元病理学检查中特征性的Lewy小体就是由大量的蛋白质异常聚集而成。随着蛋白分离技术和检测手段的进步，PD的蛋白质组学研究是近年来的热点。由于受大脑取材的限制，同时腰椎穿刺脑脊液的获取病人接受度低，而外周血的采取较为方便，因此有望成为可能的诊断手段。但是，由于外周血中少数含量丰富的蛋白质，如白蛋白和免疫球蛋白，使得低丰度蛋白测定很困难。因此，国内外有关PD患者外周血血浆的蛋白质组学研究十分罕见，而使用质谱分析研究PD患者和正常人之间的差异蛋白，则尚未见报道。本研究使用蛋白质质谱分析技术测定PD患者和正常外周血血浆中的差异蛋白，共鉴定到739个蛋白质，其中644个蛋白质包含定量信息。通过生物信息学分析，分别从功能注释和上下调关系来考虑综合考虑，首先如图12首先首先锁定cluster2、4、5的蛋白集群，cluster2、4的151种蛋白表达水平的变化可以提现正常人群和帕金森病患者的区别，cluster5的56种蛋白表达水平的变化可能与脑深部刺激治疗或手术有关。然后再从功能注释、以及蛋白浓度变化倍数的角度来思考这些具体蛋白的可能功能。查阅文献先发现以下蛋白具有可能的帕金森蛋白生物标志物的可能，比如C反应蛋白、Coronin-1A蛋白、Multimerin-1蛋白、Iggamma-4chainCregion蛋白、PRAMEfamilymember7蛋白等。5参考文献[1]StanleyB.,RusinerP.BiologyandGeneticsofPrionsCausingNeurodegeneration[J].Annu.Rev.Genet.,2013,47:601-623.[2]MinS.,MichaelW.,andZhangJ.BiomarkerDiscoveryinNeurodegenerative40 南京医科大学硕（博）士学位论文Diseases:AProteomicApproach[J].NeurobiolDis,2009,35(2):157–164.[3]MarionD.,DarylRJ.,PamelaJM.,RyanJU.BiomarkersinParkinson'sdisease:Advancesandstrategies[J].ParkinsonismandRelatedDisorders,2016,22:S106-S110.[4]MikeA.Nalls,MargauxF.Keller,DenaG.Hernandez,LanChen,DavidJ.Stone,etal.BaselineGeneticAssociationsintheParkinson’sProgressionMarkersInitiative(PPMI)[J].MovementDisorders,31(1):20.[5]HeikoB.,KellyD.T.,UdoR.,RobA.I.deVos,ErnstN.H.,JansenS.,EvaB.StagingofbrainpathologyrelatedtosporadicParkinson’sdisease[J].NeurobiologyofAging,2003,,24,197–211.[6]AnzariAtik,TessandraStewart,JingZhang.Alpha-SynucleinasaBiomarkerforParkinson’sDisease[J].BrainPathology2016(26)410–418[7]SchneideraSA.,BoettnerbM.,AlexoudiaA.,ZorenkovaD.,DeuschlaG.,WedelT.CanweuseperipheraltissuebiopsiestodiagnoseParkinson’sdisease?Areviewoftheliterature[J].EuropeanJournalofNeurology,2016,23:247–261.[8]陈莹.帕金森病患者脑脊液诊断生物标志物的研究:[硕士学位论文].重庆:重庆医科大学,2010.[9]徐芙蓉.帕金森病患者脑脊液中疾病特异性蛋白生物标志物的初步筛选:[硕士学位论文].重庆:重庆医科大学,2008.[10]AnzariAtik;TessandraStewart;JingZhang.Alpha-SynucleinasaBiomarkerforParkinson’sDisease[J].BrainPathology,2016,26:410–418.[11]HideyukiSawada,TomokoOeda,AtsushiUmemura,SatoshiTomita,MasayukiKohsaka,KwiyoungPark,KenjiYamamoto,HiroshiSugiyama.BaselineC-ReactiveProteinLevelsandLifePrognosisinParkinsonDisease[J].PLOSONE,2015.[12]RuediAebersold,MatthiasMann.Massspectrometry-basedproteomics[J].NATURE,2003,422(13):198-20741 南京医科大学硕（博）士学位论文[13]ThomasGasser.GenomicandproteomicbiomarkersforParkinsondisease[J].Neurology2009;72;S27[14]ToruY.,YasutoN.,HidekiM.α-SynucleinandNeuronalCellDeath[J].MolNeurobiol,2013,47:466–483.[15]LifeiXing,DongtaoWang,LihongWang,WenjieLan,SuyuePan.DifferentialproteomicsanalysisofmononuclearcellsincerebrospinalflidofParkinson’sdisease[J].IntJClinExpPathol,2015,8(11):15462-15466.[16]WangES,YaoHB,ChenYH,WangG,GaoWW,SunYR,GuoJG,HuJW,JiangCC,HuJ.ProteomicanalysisofthecerebrospinalfluidofParkinson'sdiseasepatientspre-andpost-deepbrainstimulation[J].CellPhysiolBiochem,2013,31(4-5):625-637.[17]王尔松.帕金森病的脑深部电刺激治疗与脑脊液蛋白变化的相关性研究[硕士学位论文].中国上海.复旦大学.2008.42 南京医科大学硕（博）士学位论文第二部分帕金森病患者运动症状定量评估----运动迟缓1引言脑深部刺激（DBS）治疗对于原发性帕金森病（iPD）具有良好的治疗效果，但是对于其他PD综合症（PDs）效果欠理想，因此科学的术前评估、把握适应症、选择合适的手术病人是保证疗效的基础[]。根据临床症状进行量表评估仍为原发性帕金森病（iPD）的主要诊断手段，诊断标准要求患者药物治疗后UPDRSⅢ评分改善超过30%[]。统一帕金森病评分量表的第Ⅲ部分（UPDRSⅢ）主要是对于帕金森病运动症状进行评估，主要包括语音（Ⅲ18）、面容（Ⅲ19）、震颤（Ⅲ20-21）、僵直（Ⅲ22）、四肢运动迟缓（Ⅲ23-26）、起立（Ⅲ27）、姿势（Ⅲ28）、步态（Ⅲ29）姿势的稳定性（Ⅲ30）、躯体少动（Ⅲ31），专门评估人员可以根据患者运动症状进行0分到4分的打分（0正常，1稍有，2轻微，3中等，[4]4严重），其各项相加总分体现了患者运动障碍的严重程度。然而这种评估方法具有很强的经验依赖性，容易随评估者的改变而产生波动。因此，可供临床和科研使用的客观定量评估系统越来越受到大家的关注。对于帕金森病运动功能定量评估，目前多通过加速度、角速度、压力传感器，以及移动通讯或电脑外接设备来采集数据，进而计算出可描述帕金森病特征性运动障碍的指标，这些设备具有穿戴携带方便，所获得的指标客观统一等优点，并且可持续实时收[5]集分析数据，为治疗方案的改善提供依据。[1]帕金森病是以运动症状为主的神经退行性疾病，其主要运动症状为运动迟缓、震颤、僵直和姿势平衡不稳等，严重影响了患者的正常生活。其中运动迟缓几乎见于所有帕金森病患者中，该症状的出现已成为帕金森病临床诊断最主[2]要的标准之一。运动迟缓包括运动行为的三个方面，即行动缓慢（bradykinesia）、运动不能（akinesia）和运动功能减退（hypokinesia）。行动缓慢指患者运动执行动作缓慢，运动不能指自发运动缺乏、协同运动困难、43 南京医科大学硕（博）士学位论文冻结步态和起始困难等，运动功能减退指在运动速度减慢的同时伴有运动幅度的减低，比如帕金森病患者的写字过小征，这三个方面相互区别又相互联系，为帕金森病运动迟缓症状评估提供了完整的描述。目前认为运动迟缓主要是由于患者难以计划、执行运动，难以完成序列和同时任务所致，并受肌力减退、[3]震颤、僵硬强直、运动变异性增大、认知功能异常等因素的影响。[6,7]本研究旨在利用多节点可穿戴定量评估系统，通过采集受试者完成翻腕、抬腿、十米往返范式动作的运动数据，提取与运动迟缓相关的运动指标，衡量多节点可穿戴定量评估系统在临床评估帕金森患者运动迟缓症状的可行性及有效性。2材料与方法2.1研究对象药物治疗组被试者为11名原发性帕金森病患者，根据中国帕金森病诊断标准（2016版）诊断确诊，其中男7人，女4人，年龄（64.5±4.7）岁，身高（169.4±7.4）cm，体重（67.2±6.4）kg，患者亨-雅（Hoehn-Yahr,H-Y）分期为Ⅱ~Ⅳ期，UPDRSⅢ评分为6~28分。各项实验室、影像学检查排除其他严重疾病，病史5年以上，诊断为原发性帕金森病，美多芭治疗有效，术前简短精神状态量表（MMSE）得分均大于24分，排除认知功能障碍；汉密尔顿焦虑量表（HAMA）得分均小于14，汉密尔顿抑郁量表（HAMD）得分均小于20分，排除严重的情绪障碍。帕金森病患者的信息如表1所示。被试者行美多芭药物冲击试验，药物剂量为患者各自每顿所服用药物有效剂量换算成美多芭等效剂量的1.5倍，一般在200-400mg之间。所有被试者药物冲击前后均使用多节点可穿戴设备监测肢体与躯体运动。健康对照组（HC）15名，与药物治疗组年龄、性别相匹配，其中男性受试者10名，女性受试者5名，年龄（61.1±5.8）岁，身高（168.1±6.5）cm，体重（65.2±8.7）kg，无运动障碍类相关疾病。该实验在南京脑科医院神经外科进行，均获得受试者和家属的知情同意。44 南京医科大学硕（博）士学位论文表1帕金森病患者信息表UPDRSUPDRSH_Y分性年龄体重身高病程总分H_Y分期编号总分（服期(服药别(Year)(KG)(CM)(Year)（服药(服药前)药后）前)前）PD1女6764.515511354172PD2女647016516514131PD3男6462.517210202.5111PD4男76661731236471PD5男59791787443252PD6男636116813282.591PD7女6163.5164938381PD8男6567.51728333152PD9女6859163522210PD10男6077.5181626291PD11男63691728252162平均值±64.5±4.67.2±6.169.4±7.9.5±3.32.5±9.NA2.9±0.811.9±6.31.3±0.6标准差744352.2实验设备与方法[6，7]本文采用5个可穿戴定量评估系统分别佩戴在受试者的双侧上肢、双侧下肢和腰部，在特定的运动范式下监测被试双手、双腿以及腰部的运动情况，如图1所示。设备内置9轴传感芯片MPU9250（InvenSenseInc.,美国），其采样频率为100Hz，可同时记录三轴加速度、三轴角速度及三轴磁场信号。其中加速度量程为±16g，分辨率为0.48mg/LSB；陀螺仪量程为±1000°/s，分辨率为0.06°/s/LSB；磁力计量程为±4800µT，分辨率为0.63µT/LSB。所有记录信号均通过无线WiFi同步传输至电脑端。每个运动设备大小为52mm×37mm×13mm，重量为26.3g，可持续工作13小时，被试的活动范围是40米。试验中使用弹性绑带将设备分别固定在相应位置其捆绑松紧适中，同时确保节点在记录过程中不会发生相对位移又不会影响患者正常运动。45 南京医科大学硕（博）士学位论文图1.多节点可穿戴定量评估系统佩戴位置示意图（左）及运动数据分析软件界面（右）。实验根据UPDRSIII中第25、26和29项分别设计相应的范式动作包括：①翻腕运动：受试者静坐在椅子上平举双臂，然后左、右手同时以最快速度，最大幅度完成30s的连续旋前旋后动作；②静坐抬腿：受试者静坐在椅子上，先用左脚连续快速踩上踏板的标记位置（高度固定为11.5cm），30s后停止，完成后休息1~2min，换右脚完成相同的动作流程。③10m往返：受试者静止端坐在椅子上，起立以正常速度向前行走10m后绕标记点转身返回，坐回椅子保持静止；每完成一个范式动作休息1~2分钟，整个实验过程进行录像，作为后期数据截取的参考。2.3数据分析2.3.1数据预处理对采集到的原始数据进行预处理，以去除噪声的干扰。具体方法为首先利用5点中值滤波器对X,Y,Z三轴加速度和角速度信号进行滤波去除孤立噪声点，然后采用带通滤波器（0.1-12Hz）去除低频自主运动和高频噪声的影响。计算预处理后三轴角速度信号方差，选取方差最大的一轴提取某一范式的运动特征。2.3.2双手翻腕动作在此范式中，仅对双侧上肢运动节点的数据进行分析，提取每次翻腕频率、幅度这两个运动指标。首先，对双侧数据预处理后信号A(t)进行阈值T0估计，其计算公式如下：46 南京医科大学硕（博）士学位论文TE2（1）02其中，E和σ分别是A(t)的均值和标准差。将A(t)与T0做比较，若A(t)的一段数据有连续多个点大于阈值T0，则这段数据被定义为单次翻腕运动数据Ai(t),对应时间段为ti(m),i=1,2,…N,其中N为该次范式实验中翻腕运动数据的总个数，m=1,2,…M，其中M为Ai(t)中数据的点数。对Ai(t)做积分得到该段时间内的角速度Pi(t),则该次在此方向上翻腕的幅度为：sPt(_maxt_min)（2）iiii其中ti_max和ti_min分别为该次翻腕数据Ai(t)的最大值和最小值对应的时刻。翻腕的总幅值由三个方向的幅值共同决定，其计算公式为：222S(_X)s(_Y)s(_Z)s（3）iiii该次范式实验最终的翻腕幅度为每次翻腕幅度的平均值。而该次范式实验的翻腕频率计算公式如下：F1(t_maxt_max)（4）N1N12.3.3静坐抬腿在此范式动作中，仅利用放置于双下肢的运动检测设备采集到的Y轴加速度信号进行运动特征提取。由于踏板的高度是固定的，静坐抬腿的运动指标主要为抬腿频率，其计算方法与翻腕范式中翻腕频率计算方法相同。2.3.4十米往返运动对于十米往返运动，提取步幅、步频和转身时间作为运动指标。其中步幅和步频的计算主要利用双侧下肢运动节点三个轴的运动数据进行分析，计算方法与前述翻腕运动的翻腕幅度和翻腕频率相同。在计算步频时，行走的步数并不包括转身时步数。转身时间定义为患者身体转动从30°转至150°的时间。转身时间使用放置于腰部的运动检测设备采集到的角加速度信号进行计算。利用1.4.2中的阈值计算方法计算腰部运动监测节点运动数据的阈值并得到连续大于阈值的一段信号Ai(t)，然后对Ai(t)进行积分得到角速度Pi(t)。当患者转47 南京医科大学硕（博）士学位论文身时Pi(t)将从0增长至180.因此转身时间可以定义为：Tt||t（5）turnP(t)150iP(t)30i2.4统计学分析本研究采用SPSS20.0统计分析软件进行统计检验分析。在检验前分别对每组数据进行正态检验，如果符合正态分布，用t检验，如果不符合，使用非参数秩和检验。为了检验多节点可穿戴定量评估系统采集的信号能否有效地描述帕金森患者运动迟缓症状，除十米往返转身时间数据外（该数据呈非正态分布，使用秩和检验），对健康对照（HC）组、帕金森病患者服药前（PDmed-off）组、帕金森病患者服药后（PDmed-on）组各数据进行组间t检验，对PDmed-off组和PDmed-on组之间做配对t检验。运动指标与UPDRS评分之间的关系采用Spearman法进行相关性分析。十米往返运动中转身时间体现了帕金森病人运动迟缓的整体症状，因此选择其作为评估运动迟缓的综合指标。然后计算UPDRSⅢ中僵硬、震颤、迟缓、中轴各亚项组合与转身时间的相关性，以衡量运动指标与UPDRS评分的一致性。3结果3.1UPDRS量表的组间检验由图2可知，美多芭药物治疗能有效改善患者UPDRS运动评分，帕金森病患者服药前后，除了语音（Ⅲ18）、震颤（Ⅲ20-21）中部分子项目外，UPDRS总分及其余子项目均有显著性差异。48 南京医科大学硕（博）士学位论文2.5服药前45**服药后***2********40******35**********1.530***25得分***1*20150.510500181920a20b20c20d20e21a21b22a22b22c22d22e23a23b24a24b25a25b26a26b2728293031总分UPDRS评估项图2.帕金森病患者服药前后UPDRSⅢ总分及子项目评分对比。（其中*P<0.05，**P<0.01，下同。）3.2运动指标分析从图3可知，在翻腕范式动作中，PDoff组被试的左右翻腕频率、翻腕幅度均低于正常人，且左右翻腕幅度与正常人差异显著。而在抬腿范式中，PDoff组被试的左右平均抬腿频率也低于HC组。十米往返范式中，PDoff组与HC组相比，虽然双侧步频没有显著差异，但双侧步幅均显著小于HC组，体现了帕金森患者的步幅的缩小。与此同时，PDoff组被试转身时间明显大于HC组，体现了帕金森患者转身困难的现象。冲击实验后，被试组的整体运动迟缓症状有所缓解。PDon组较PDoff组各项运动指标均更接近HC组，其中十米往返范式中转身时间显著改善，并且与HC组无显著差异，而双侧步幅虽然显著改善，但PDon组左腿步幅仍然显著小于HC组。49 南京医科大学硕（博）士学位论文2.5160正常人3****服药前21202.5服药后/分钟）1.52分钟）/801.51翻腕幅度（度）140翻腕频率（次0.50.5抬腿频率（次000左手右手左手右手左腿右腿（a）翻腕（b）抬腿5480*20正常人*****18服药前7052服药后16605014**5012484010468步频（次）步幅（米）3044转身时间（秒）6204421024000左腿右腿左腿右腿全身（c）十米往返图3.在翻腕、抬腿和十米往返范式动作下各定量运动指标的组间比较结果3.3运动指标与UPDRS评分的一致性将冲击实验前转身时间指标和UPDRSⅢ29项以及震颤（Ⅲ20-21）、僵直（Ⅲ22）、运动缓慢（Ⅲ23-26）和中轴症状（Ⅲ18、19、27-31）评分作相关，结果如表2所示。结果说明转身时间与UPDRSⅢ中步态（Ⅲ29）、中轴症状（Ⅲ18、19、27-31）和迟缓+中轴（Ⅲ18、19、23-31）之间有良好的相关性。相关系数的显著性均小于0.05。表2转身时间与UPDRS评分相关分析定量测量指标相关性UPDRSⅢ29项震颤总分僵直总分迟缓总分中轴总分迟缓+中轴总分转身时间R值0.824**-0.148-0.0140.4520.779**0.673*（冲击前）P值0.0020.6640.9680.1630.0050.02350 南京医科大学硕（博）士学位论文808080606060404040202020转身时间（秒）0转身时间（秒）0转身时间（秒）00102002402040UPDRSⅢ29项得分UPDRS中轴得分UPDRS迟缓+中轴总分图4转身时间与UPDRSⅢ29、UPDRS中轴、UPDRS迟缓+中轴相关关系图4讨论运动迟缓是帕金森病最核心运动症状之一，本研究针对运动迟缓的运动缓慢、运动不能和运动功能减退等多种特征，设计了翻腕、抬腿、十米往返三组运动范式，对翻腕频率、翻腕幅度、抬腿频率、行走步频、行走步幅、转身时间等六个指标进行了分析。由于运动功能受到损伤，与正常人相比，帕金森病患者翻腕幅度、步幅等运动幅度减低，差异显著（p<0.05），体现了运动迟缓中运动功能减退的特点。同时步频、翻腕频率虽然降低，但差异不显著，体现出帕金森病患者行动迟缓主要的原因为运动幅度的变小而非运动频率的降低，在临床中即体现出写字过[8]小征、行走小碎步等。另外，帕金森病患者组的转身时间比健康对照组延长，且差异显著（p<0.05），考虑为运动缓慢和、运动不能和运动功能减退共同作用的结果。服用左旋多巴制剂可以有效改善帕金森病患者的运动症状，对UPDRSⅢ量表评分进行统计分析可以有效的区分帕金森病患者的服药和不服药状态（图2）。同时使用可穿戴定量评估系统进行测量，服用左旋多巴制剂后，帕金森病患者上、下肢运动能力均有所改善，上肢轮替动作翻腕幅度最为明显，服药前后双侧翻腕幅度差异显著（p<0.05），趋近于正常人水平（图3a），而十米往返运动中虽然左右步幅均有所改善，且差异明显（p<0.05），但左步幅仍低于正常对照组(图3c)，说明下肢运动功能仍然没有完全达到正常水平，此结果提示帕金森[9]病对于下肢运动的损伤更为严重。而服药后十米往返转身时间较服药前明显改51 南京医科大学硕（博）士学位论文善，差异显著（p<0.05），且与健康对照组水平接近无显著差异，说明服用左旋多巴补充剂不仅能改善四肢的运动迟缓症状，还能改善包含步态在内的中轴症状。可穿戴定量评估系统在做范式动作的过程中采集数据进行分析，与UPDRSⅢ评分一样可以有效的区分正常人和帕金森病患者，患者的服药及不服药状态，检测结果与临床观察结果一致，与患者的临床特征相匹配。目前临床对帕金森病运动症状评估主要使用UPDRSⅢ，文献中多把其分为震颤（Ⅲ20-21）、僵直（Ⅲ22）、四肢运动迟缓（Ⅲ23-26）和中轴症状（Ⅲ18、[10，11]19、27-31）四部分。而从运动迟缓的角度具体分析，其中Ⅲ23-26项是对四肢运动缓慢的直接评估，中轴症状中的起立（Ⅲ27）、步态（Ⅲ29）、少动（Ⅲ31）体现了躯干及肢体的运动不能和运动功能减退，Ⅲ18、19与面部、声带的运动功能减退有关，震颤（Ⅲ20-21）、僵直（Ⅲ22）、姿势（Ⅲ28）及平衡稳定性（Ⅲ30）则是影响运动迟缓的重要因素。在本研究中，左右侧翻腕幅度、翻腕频率、抬腿频率、步幅、步频只能反应单侧肢体的运动情况，而转身时间不仅和运动缓慢有关，还和运动不能和运动功能减退有关，不仅和下肢的运动迟缓有关，还可以反映患者整体的运动迟缓，因此选择转身时间与UPDRSⅢ评分进行相关分析。相关分析发现转身时间和UPDRSⅢ29项显著相关（R=0.824,P=0.002,<0.01），说明了转身时间能良好的反映患者步态情况。然后对转身时间和震颤、僵直、四肢运动迟缓、中轴症状等子项组合进行相关分析发现：转身时间与震颤（R=-0.148,P=0.664）和僵直（R=-0.014,P=0.968）相关欠佳，提示震颤和僵直虽然是运动迟缓的影响因素，但可能是更为独立的运动特征因子，不是运动迟缓最重要的影响因素；转身时间与UPDRSⅢ中肢体运动缓慢（23-26项）相关欠佳（R=0.824,P=0.002），考虑和23-26项只能反映四肢的运动迟缓，但是不能反映整体的运动迟缓有关；而转身时间和中轴症状相关显著（R=0.779,P=0.005,<0.01），考虑与中轴症状诸项综合反映运动不能、运动功能减退有关；最后转身时间与四肢运动迟缓（23-26）+中轴症状（18、19、27-31）相关显著（R=0.673,P=0.023,<0.01），说明转身时间和患者整体的52 南京医科大学硕（博）士学位论文运动迟缓相关，结合前述相关分析，提示中轴症状对患者整体运动迟缓的影响更大（表2，图4）。[12,13]中晚期帕金森病患者会伴有情绪、认知障碍，而被试的运动功能情况受认知、情绪等因素影响大，因此在入组病人时排除了情绪、认知障碍的患者（表1），在实验前进行实验范式规范化，同时向患者详细介绍了实验范式和流程，排除认知、情绪对运功功能评价的影响。本研究所使用多节点可穿戴定量评估系统，通过内置的传感器可采集到肢体或躯干运动的加速度和角速度，计算出描述患者运动功能的各项指标，除运动迟缓外，还可以监测震颤、步态姿势平衡障碍在内的各种运动症状。[14]Martinez-Mendez等使用手指部位的传感器进行手指运动功能的评估，是对本套系统的补充，另外他们结合可穿戴传感器和铺于地面的压力感受器设计了预期姿势调整测量系统，对帕金森病患者的起步和姿势调整进行测量。而Shyamal[15]Patel等使用多节点传感技术组建家庭长程监测系统，对帕金森病患者的症状波动进行监测,实现24小时连续监测。另外，亦有不可穿戴型的定量评估设备，多为离体的压力传感器、移动终端或电脑外接设备，可以评估肢体远端功能及[16,17]步态障碍等。目前我们对于翻腕幅度、翻腕频率、抬腿频率、行走步幅、步频、转身时间这六个指标进行研究，但是仍不能全面评估患者的运动迟缓症状。国外文献[17，18]中有在时域和频域两个方面的更为全面的分析,并在时域分析方面提出峰-峰速度值,均方根速度值等指标，在频域分析方面提出相位相关速度剖面和傅里叶幅度谱、陀螺仪信号功率谱密度等指标,更多特异敏感指标的测量会对运动迟缓症状的描述更加精确。总之，多节点可穿戴定量评估系统是评估帕金森病患者运动迟缓症状的一种简便易行、低消耗、无创的检测方法。它在帕金森病患者的早期筛查工作有着巨大的应用潜力。它能够区分正常人与帕金森病患者，能区分帕金森病患者在不同治疗状态的运动迟缓水平，随着研究的深入，必会显示出比量表评估更53 南京医科大学硕（博）士学位论文大的优越性。5参考文献：[1]LMLDeLau,MMBBreteler.EpidemiologyofParkinson’sdisease.TheLancetNeurology,2006-Elsevier[2]JankovicJ.Parkinson’sdisease--clinicalfeaturesanddiagnosis.JournalofNeurology,Neurosurgery&Psychiatry,2008.[3]BerardelliA.,RothwellJC.,ThompsonPD.,HallettM.PathophysiologyofbradykinesiainParkinson'sdisease.Brain,2001,124:2131-2146.[4]MovementDisorderSocietyTaskForceonRatingScalesforParkinson’sDisease.TheUnifiedParkinson'sDiseaseRatingScale(UPDRS):statusandrecommendations.MovDisord,2003,18(7):738-750.[5]WalterMetal.AsystematicreviewofthecharacteristicsandvalidityofmonitoringtechnologiestoassessParkinson’sdisease.MovementDisorders,2013,28(12).[6]Bai,Q.,Shen,T.,Xu,B.,Yu,Q.,Zhang,H.,Mao,C...&Wang,S.QuantificationofthemotorsymptomsofParkinson'sdisease.NeuralEngineering(NER),20178thInternationalIEEE/EMBSConference,2017,82-85,IEEE.[7]Li,L.,Yu,Q.,Xu,B.,Bai,Q.,Zhang,Y.,Zhang,H...&Wang,S.(2017,May).Multi-sensorwearabledevicesformovementmonitoringinParkinson'sdisease.NeuralEngineering,2017,70-73.[8]EstherJ.Smits,AnttiJ.Tolonen,LucCluitmans,etc.StandardizedHandwritingtoAssessBradykinesia,MicrographiaandTremorinParkinson'sDisease.PLOSONE,2014,9(5):e97614.[9]AhmedA.Moustafa,SrinivasaChakravarthy,JosephR.Phillips,etc.MotorsymptomsinParkinson’sdisease:Aunifiedframework.Neuroscience&54 南京医科大学硕（博）士学位论文BiobehavioralReviews,2016.[10]AnaLisaTaylorTavares,GregoryS.X.E.Jefferis,MandyKoop,etc.QuantitativeMeasurementsofAlternatingFingerTappinginParkinson’sDiseaseCorrelateWithUPDRSMotorDisabilityandRevealtheImprovementinFineMotorControlFromMedicationandDeepBrainStimulation.MovementDisorders,2005,20(10):1286–1298.[11]AlexanderM.Goberman.Correlationbetweenacousticspeechcharacteristicsandnon-speechmotorperformanceinParkinsonDisease.MedSciMonit,2005;11(3):CR109-116.[12]MichelePoletti,DanielaFrosini,CristinaPagni,etc.Mildcognitiveimpairmentandcognitive-motorrelationshipsinnewlydiagnoseddrug-naivepatientswithParkinson’sdisease.JNeurolNeurosurgPsychiatry,2012;83:601e606.[13]D.Aarsland,K.Bronnick,C.Williams-Gray,etc.MildcognitiveimpairmentinParkinsondisease.Neurology,2010,75.[14]Martinez-MendezR,etal.AnalysisofSubtleMovementsRelatedtoNeurodegenerativeDiseasesUsingWearableInertialSensors:AStudyinHealthySubjects.35thAnnualInternationalConferenceoftheIEEEEMBS.[15]ShyamalP,etal.HomeMonitoringofPatientswithParkinson’sDiseaseviaWearableTechnologyandaWeb-basedApplication.32ndAnnualInternationalConferenceoftheIEEEEMBS,201.[16]ChaeYoungLee,etal.AValidationStudyofaSmartphone-BasedFingerTappingApplicationforQuantitativeAssessmentofBradykinesiainParkinson’sDisease.PLOSONE,2016.[17]SummaS.etal.AssessingbradykinesiainParkinson’sdiseaseusinggyroscopesignals.2017InternationalConferenceonRehabilitationRobotics(ICORR).[18]HoudeDai,etal.Quantitativeassessmentofparkinsonianbradykinesiabasedon55 南京医科大学硕（博）士学位论文aninertialmeasurementunit.BioMedEngOnLine,2015,14:68.56 南京医科大学硕（博）士学位论文第三部分帕金森病患者运动症状定量评估----语音分析1前言帕金森病患者除了具有运动迟缓、静止性震颤、肌强直等典型运动症状外，[1]70%-90%的患者还有构音障碍。PD患者的构音障碍一般表现为语调单一（monotone）、响度单一（monoloudness）、语速变化大、停顿异常、发音不[2]准确等。UPDRSⅢ中对于语音的评估为第18项，针对以上特点，对音量、音调、语义能否被理解做了评估。和左旋多巴等药物治疗一样，STN-DBS手术能较好地减轻PD患者的运动障[4,5]碍。然而使用量表进行评估，STN-DBS对PD语音的疗效却尚未达成一致意见[6,7][8]。Bejjani分析10例帕金森症患者手术前后帕金森统一量表（UPDRS）第18项打分，认为STN-DBS对PD语音具有积极的疗效，结果显示，PD患者术前第[9]18项平均得分高于术后平均得分，改善明显。与之相反的是Kloster对STN-DBS术后的病人进行UPDRS第5项和第18项打分，结果显示术后的评分比术前高一分，语言状况恶化。虽然STN-DBS对PD语音的疗效与手术的靶点、程控的参数、患者病情的进展程度有关，但作为评价系统UPDRSⅢ18暴露出评估内容过于简单，仅限于定性评估，主观打分，缺乏客观指标的弱点，不能充分反映患者的病情变化情况，满足临床精确客观评估的要求。随后对PD患者语音变化情况进行定量研究的声学分析开始出现。有研究表明，STN-DBS术后PD患者的语速更快、停顿时间更短、基频抖动和振幅抖动更[10-12]小、以及基频范围和基频变化更大。另有研究表明，单侧植入DBS电极的病[13,14]人中，左侧植入者的语言能力恶化程度大于右侧植入者；接受高电压（≥[15,16]3.5V）、高频率（≥130Hz）刺激的PD患者语言可懂度低、发音更不准确。然而，以往关于STN-DBS对PD语音治疗效果的研究大都基于西方语言，国内尚鲜有该方面的研究。因此，本研究主要考察汉语PD患者在STN-DBS手术后早期57 南京医科大学硕（博）士学位论文的语音变化特征，时间纵向上采集和分析汉语PD患者的朗读语音，并与汉语健康对照组进行比较。2对象与方法2.1研究对象收集2017年5月至11月在南京医科大学附属脑科医院神经外科进行丘脑底核脑深部电刺激（STN-DBS）手术治疗的患者，相关语音研究采集资料完善者。按照中国帕金森病诊断标准（2016版）诊断的10例原发性帕金森病患者，其中男2例，女8例。入组标准：术前诊断为原发性帕金森病，美多芭治疗有效，冲击试验改善30%以上；帕金森病统一量表第三部分（UPIII）第18项言语（表达）均大于或等于1分；术前简短精神状态量表（MMSE）得分均大于24分，排除认知功能障碍；汉密尔顿焦虑量表（HAMA）得分均小于14，汉密尔顿抑郁量表（HAMD）得分均小于20分，排除严重的情绪障碍；术前各项实验室、影像学检查排除其他严重疾病，无声带咽喉部位病变，没有接受过语言矫治；所有被试都是双侧刺激电极植入者，手术靶点准确，术后程控选取最优刺激点。该组被试的信息如表1所示。另一组是与PD组年龄、性别相匹配的健康对照组（HC），年龄62.905.54岁，男2例，女8例，没有发音障碍。表1患者信息表UPⅢ编号年龄病程H-YMMSEHAMAHAMDUPⅢ分型（18）PD168532642422混合型PD269732667342僵硬为主型PD351103271116421震颤为主型PD477102.52601271震颤为主型PD5568430512321震颤为主型PD65282.52834302混合型PD7661042825351僵硬为主型PD861732673571震颤为主型PD963102.52944201混合型PD10556330129291僵硬为主型平均值61.808.103.0527.65.406.3034.801.30N/A58 南京医科大学硕（博）士学位论文2.2手术方法2.2.1靶点定位患者入院后行3.0TMRI薄层扫描，手术当日在局麻下安装立体定向头架，头架固定后行头颅CT检查。使用LEKSELLSURGILPAN计划系统对3.0TMRI和带框架CT图像进行融合。选取磁共振T2像中红核直径最大的层面，这一帧图像所显示的STN核的下极中心就定为理论靶点，根据靶点和AC-PC连线的空间关系计算相对于立体定向头架的靶点坐标值。2.2.2微电极记录（MER）在局麻下取双侧冠状缝前偏开中线40mm为中心作长度30~35mm弧形头皮切口，冠状缝前行颅骨钻孔，后切开硬膜及蛛网膜。按照计算所得靶点，分别进行双侧微电极记录。微电极进入STN核团后，背景噪音会突然增加，伴有20~50Hz簇状或不规则放电，同时亦会采集到放电频率20-90Hz，略高于其他放电频率的震颤细胞的放电，震颤细胞的发现是术中STN定位的特征性标志。当微电极探测的电信号背景噪声突然降低，或出现规则的紧张性细胞放电时，则考虑微电极已经穿出了丘脑底核的下界。微电极测试所选针道在STN核内长度至少大于4.5mm才可为满意针道。2.2.3植入刺激电极微电极测试针道满意后，退出微电极，沿选定针道置入刺激电极。用体外临时刺激器给予刺激，对每一电极触点逐个检测，刺激参数设置脉宽90ms，频率130-150HZ，电压从1.0V逐渐增加至3.6V，以观察不同触点的刺激效果同时排除刺激可能发生的副作用。术后患者常规进行头颅CT或1.5TMRI检查，确认电极位置同时排除出血等外科并发症。2.2.4植入脉冲发生器全麻下于左侧锁骨下3cm处作横切口约5cm，切开后向下方分离皮下组织，形成约5×5cm口袋状电池囊袋，置入刺激器。两根延长导线通过皮下隧道分别连接左右两侧额部切口下深部电极，另一端再与锁骨下刺激器连接，临时测试显示电极连接良好，测试各触点电阻正常，缝合左耳上皮下组织及皮肤，缝合锁骨上皮下组织及皮肤。2.2.5脉冲发生器参数调整术后一月开启植入患者胸部的脉冲发生器，对每一电极触点均进行测试，选择刺激效果良好且无副作用的刺激点，从电压1.0V，59 南京医科大学硕（博）士学位论文频率130Hz，脉宽60us开始，根据患者症状的改善程度选择最优刺激参数，同时在后期随访中不断调整参数，使患者症状得到尽可能大的改善。10例患者的电压1.5-2.5V、频率130-150Hz、脉宽60-90ms。2.3语音采集本文采用的汉语语料是国际上语言研究常用的寓言故事《北风与太阳》，共185个音节。语音采集使用ZoomH4n便携式数字录音机，采样率44.1kHz，量化精度16bit，录音前发音人充分熟悉文本语料，病人语音在相对安静的房间录制。录音均在病人未服药状态下进行，包括三个时间点：术后一个月未开机（OFF）、开机后一个月（ON1），开机后三个月（ON2），每个时间点的录音材料完全一致。2.4数据分析2.4.1声学分析应用Praat软件标注并分析采集到的语音信号。我们对语音文件做了以下三层标注：（1）汉字层（HZ）：标注每个汉字。（2）音节层（PY）：标注每个音节的拼音。（3）声韵层（SY）：标注实际发音的声母、韵母以及声调。阴平、阳平、上声、去声分别标为1、2、3、4，轻化的音节，声调标为轻声5。标注如图1示例所示。图1语音分析标注示例60 南京医科大学硕（博）士学位论文根据语音文件和标注文件，首先用Praat自动提取基频值，然后手工检查并做必要的修正。其后，对基频曲线做轻微平滑以消除局部扰动、做线性内插以连接断点，最终得到连续的基频曲线。最后提取5个基频参数，分别是基频最小值（F0min）、基频最大值（F0max）、基频均值（F0mean）、基频范围（F0rng）、基频标准差（F0std）。由于听感上的音高与以Hz为单位的物理基频值之间呈现近似于对数的关系，所以本文采用半音（St）作为基频单位，以50Hz为参考值（Fr），将Hz值转换为半音值的公式如下：𝐹0St=12×log2()𝐹r2.4.2统计分析数据分析使用SPSS20.0统计软件，三种状态OFF、ON1、ON2的数据采用重复测量的方差分析，ON2与HC组比较采用独立样本T检验，p2<0.05为差异有统计学意义，同时报告效应量（Eta）。3.结果3.1三种状态下的基频参数比较术后一个月未开机（OFF）、开机后一个月（ON1），开机后三个月（ON2）三种状态下基频相关参数的比较如图2所示。表2重复测量的方差分析结果显示，基频范围和基频标准差组间差异显著。Bonferroni事后检验显示OFF和ON2在基频范围（p<0.05）和基频标准差（p<0.01）上有显著差异，并且ON2的基频范围和基频标准差显著高于OFF；其他均无显著差异。OFFON1ON2353025*201510**50F0minF0maxF0meanF0rngF0std图2三种状态下的基频参数比较（注：图中*p<0.05,**p<0.01。）61 南京医科大学硕（博）士学位论文表2重复测量的方差分析结果2dfFPEtaF0min21.140.3410.11F0max22.430.1160.21F0mean20.690.5130.07F0rng25.120.0180.36F0std29.910.0020.523.2开机后三个月与健康对照组的基频参数比较为考察开机后三个月（ON2）的基频范围和标准差是否达到健康对照组（HC）的正常水平，我们对ON2和HC组的两个基频参数（基频范围和基频标准差）进行统计分析。T检验结果表明两组的基频指标差异不显著（p>0.05），图3显示了两组基频范围和基频标准差比较。25HCON220）15St10基频（50F0rngF0std图3ON2和HC组基频范围和标准差的比较3.3个案比较为进一步了解每名PD患者对STN-DBS的反应，我们对每位患者的基频范围和标准差进行了比较。图4显示，PD3、PD5、PD6、PD8、PD9基频范围和基频标准差改善明显。而PD1、PD2、PD4、PD7、PD10的基频特征改善较小。62 南京医科大学硕（博）士学位论文OFFON1ON23025）20St（1510基频范围50PD1PD2PD3PD4PD5PD6PD7PD8PD9PD10（a）10例PD患者三种状态下基频范围的比较OFFON1ON254.54）3.5St（32.521.5基频标准差10.50PD1PD2PD3PD4PD5PD6PD7PD8PD9PD10（b）10例PD患者三种状态下基频标准差的比较图410例PD患者三种状态下基频范围和标准差的比较4.讨论4.1STN-DBS对PD语音的治疗由图2和表2得知，丘脑底核脑深部电刺激治疗帕金森症语音的基频有一定疗效，主要表现为开机三个月后PD语音的基频范围和基频标准差提高，而且[12]接近健康组水平，这一结果与Karlsson的研究结论一致。基频范围反映声带振动能达到的动态范围，基频标准差反映基频变化。基频范围小和变化小导致PD患者语音的语调听起来缺乏高低起伏的变化，显示出语调63 南京医科大学硕（博）士学位论文单一的特征（monotone）。声带是喉头的一部分，声带的振动涉及喉部多种肌肉。声带的开合频率决定了语音基频的高低，开合频率的变化决定了基频变化。由于PD患者的肌强直症状，喉部肌肉僵硬，病人无法根据音高的需要而灵活地调整声带开合频率，导致基频范围小、基频变化小。而STN-DBS术后PD语音的基频范围和基频变化增大，说明手术在一定程度上缓解了PD病人喉部肌肉和声带的僵硬状态。术后一个月未开机的基频范围和标准差与开机后三个月有显著差别，而开机后一个月的基频范围和标准差与术后一个月未开机、开机后三个月均没有显著差别，这说明STN-DBS术后病人的语音能力在连续不断地、小幅度地提高，直到三个月才有较明显的改善。语音小幅度缓慢地好转不同于运动能力迅速而明显地提高，提示STN-DBS对PD语音的治疗是一个长期而缓慢的过程，而非短期易见的。然而，相关长期跟踪STN-DBS术后病人的研究报告，长期的持续刺激对于[17,18]PD病人的语音是有害而无利的。但是这些研究却忽略了这样的事实：PD患者在接受长期刺激的同时，其病情在逐渐加重、年龄也逐渐增大，而这些可能都是语音恶化的因素。因此，要了解STN-DBS术后病人的语音是否随着时间而恶化还需要排除病情和年龄因素。[19,20]此外，STN-DBS对PD语音的疗效是有限的可能与脉冲发生器的参数有关。[15,16]高电压、高频率的刺激有损语音，而低频刺激利于语音改善。临床实践中为了更好的解决震颤、肢体僵直等运动症状，往往选择较高的频率，从而错失了改善发音的机会。近期研究结果表明，丘脑底核（STN）变频刺激（variable[21]frequencystimulation）可以改善患者的步态障碍，同属于中轴症状的构音障碍也可能有望改善。本实验给予患者的刺激参数频率选择在高频段（130-180Hz）的较低部分，采集的PD患者语音最长时间是术后三个月，此时病人可能还处于术后恢复期，[22]电极刺激的效果也许没有达到稳定状态。因此，此时得到的结论还需更多被64 南京医科大学硕（博）士学位论文试在不同刺激频率参与更长期的跟踪研究来进一步验证。4.2个体差异术后个体语音的差异可能与病人分属不同的亚型以及术前运动能力有关。[23]Lewisetal.（2005）依据帕金森统一量表震颤评分项（16、20-26）的平均值与非震颤评分项（5、7、12-15、18、19、27-44）平均值的比值，把患者分[2]为震颤型、僵直迟缓型和混合型。Chenausky（2011）研究发现主要症状为震颤的病人接受STN-DBS手术后的语言治疗效果优于主要症状是僵直和运动迟缓[7]的患者。Tripolitietal.（2011）研究表明PD病人术前运动检查分数（UPIII）与语言反应显著负相关。语音改善情况较好的五名病人中，PD3、PD5、PD8是震颤为主型患者（见表1），语音改善较好。PD6和PD9虽然是混合型患者，但术前UPIII得分较低（分别为30分和20分），因此语音改善明显好于同样是混合型但UPIII分数较高（42分）的PD1。因此，PD患者不同亚型以及术前运动检查可以在一定程度上预测STN-DBS手术后的语音改善情况，这将有利于提出进一步的治疗方法和手段。总之，相关研究表明，早在PD患者出现运动障碍之前，患者语音的某些声[24]学特征就会发生变化，因此丘脑底核脑深部电刺激手术在治疗PD病人运动障碍的同时也应考虑电刺激对语音的影响，以更大程度地提高患者的生活质量。本研究采集并分析了10例施行STN-DBS手术病人未服药状态下三个时间点的语音，并与健康对照组比较。结果表明，开机三个月后的病人语音在基频范围和基频变化上有一定程度的改善，说明病人喉部肌肉和声带的僵硬状态得以缓解。但是不同症状的PD患者的疗效并不一致，导致病人个体间的差异。STN-DBS手术对语音的治疗是一个缓慢、复杂且困难的过程，对临床医生和言语治疗师都是一个具有挑战性的任务，因此值得全面细致地探索PD语音的状况。在今后的工作中，我们将采集更大的样本量、纵向分析更长治疗时间的PD患者，以获得更加可靠的结论，从而推动在临床实践上的应用。65 南京医科大学硕（博）士学位论文5参考文献[1]RuszJ,CmejlaR,RuzickovaH,etal.QuantitativeacousticmeasurementsforcharacterizationofspeechandvoicedisordersinearlyuntreatedParkinson’sdisease[J].JAcoustSocAm,2011,129(1):350-67.[2]ChenauskyK,MacauslanJ,GoldhorR.AcousticAnalysisofPDSpeech[J].ParkinsonsDis,2011:435232.[3]PandeyS,SarmaN.Deepbrainstimulation:currentstatus.[J].NeurolIndia,2015,63(1):9-18.[4]DeuschlG,SchüpbachM,KnudsenK,etal.StimulationofthesubthalamicnucleusatanearlierdiseasestageofParkinson'sdisease:conceptandstandardsoftheearlystim-study[J].ParkinsonismRelatDisord,2013,19(1):56-61.[5]Perestelo-PérezL,Rivero-SantanaA,Pérez-RamosJ,etal.DeepbrainstimulationinParkinson’sdisease:meta-analysisofrandomizedcontrolledtrials[J].JNeurol,2014,261(11):2051-60.[6]PintoS,GentilM,KrackP,etal.Changesinducedbylevodopaandsubthalamicnucleusstimulationonparkinsonianspeech[J].MovDisord,2005,20(11):1507-1515.[7]TripolitiE,ZrinzoL,Martinez-TorresI,etal.EffectsofsubthalamicstimulationonspeechofconsecutivepatientswithParkinsondisease[J].Neurology,2011,76(1):80-86.[8]BejjaniBP,GervaisD,ArnulfI,etal.Axialparkinsoniansymptomscanbeimproved:theroleoflevodopaandbilateralsubthalamicstimulation[J].JNeurolNeurosurgPsychiatry,2000,68(5):595-600.[9]KlostermannF,EhlenF,VesperJ,etal.EffectsofsubthalamicdeepbrainstimulationondysarthrophoniainParkinson’sdisease[J].JNeurolNeurosurgPsychiatry,2008,79(5):522-529.[10]GentilM,ChauvinP,PintoS,etal.Effectofbilateralstimulationofthesubthalamicnucleusonparkinsonianvoice[J].BrainLang,2001,78(2):233-240.[11]GentilM,PintoS,PollakP,etal.Effectofbilateralstimulationofthe66 南京医科大学硕（博）士学位论文subthalamicnucleusonparkinsoniandysarthria[J].BrainLang,2003,85(2):190-196.[12]KarlssonF,OlofssonK,BlomstedtP,etal.PitchvariabilityinpatientswithParkinson'sdisease:effectsofdeepbrainstimulationofcaudalzonaincertaandsubthalamicnucleus[J].JSpeechLangHearRes,2013,56(1):150-158.[13]WangE,VerhagenML,BakayR,etal.Theeffectofunilateralelectrostimulationofthesubthalamicnucleusonrespiratory/phonatorysubsystemsofspeechproductioninParkinson’sdisease—apreliminaryreport[J].ClinLinguistPhon,2003,17(4-5):283-289.[14]WangEQ,MetmanLV,BakayRA,etal.Hemisphere-specificeffectsofsubthalamicnucleusdeepbrainstimulationonspeakingrateandarticulatoryaccuracyofsyllablerepetitionsinParkinson’sdisease[J].JMedSpeechLangPathol,2006,14(4):323-334.[15]TornqvistAL,Schal_enL,RehncronaS.EffectsofdifferentelectricalparametersettingsontheintelligibilityofspeechinpatientswithParkinson'sdiseasetreatedwithsubthalamicdeepbrainstimulation[J].MovDisord,2005,20(4):416-423.[16]TripolitiE,ZrinzoL,Martinez-TorresI,etal.Effectsofcontactlocationandvoltageamplitudeonspeechandmovementinbilateralsubthalamicnucleusdeepbrainstimulation[J].MovDisord,2008,23(16):2377-2383.[17]KrackP,PoeppingM,WeinertD,etal.Thalamic,pallidal,orsubthalamicsurgeryforParkinson’sdisease?[J].JNeurol,2000,247Suppl2:II122-134.[18]ØstergaardK,SundeNA.EvolutionofParkinson’sdiseaseduring4yearsofbilateraldeepbrainstimulationofthesubthalamicnucleus[J].MovDisord,2006,21(5):624-631.[19]TörnqvistAL,SchalénL,RehncronaS.EffectsofdifferentelectricalparametersettingsontheintelligibilityofspeechinpatientswithParkinson’sdiseasetreatedwithsubthalamicdeepbrainstimulation[J].MovDisord,2005,20(4):416-423.[20]MontgomeryEB.Deepbrainstimulationandspeech:AnewmodelofspeechfunctionanddysfunctioninParkinson’sdisease[J].JMedSpeechLangPathol,2007,15(3):9-25.67 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南京医科大学硕（博）士学位论文第四部分帕金森病脑深部刺激术中场电位监测及定位研究1引言帕金森病是一种神经系统运动障碍疾病，其症状的产生与患者丘脑底核神经活动异常密切相关。脑深部刺激（DeepBrainStimulation，DBS）治疗是目前比较成熟、快速发展的一种治疗方式。通过手术中植入的脑深部刺激电极可[1]以直接记录到人脑深部的局部场电位神经点活动，具有高的时间和空间分辨率，反应神经核团的集群同步化或去同步化神经波动，蕴含丰富的生理、病理功能相关信息。目前对帕金森患者丘脑底核局部场电位的研究表明，其神经波动在Beta(12~30Hz)频段存在过度同步化现象,而使用脑深部电刺激治疗可抑制帕金[2]森病患者的病理同步性。术中靶点定位的准确性和最佳治疗靶点的选择是良好疗效的前提。以脑深部神经信号的频率成分作为定位的特征，不但可以增加定位的准确性，而且可以将定位与预后相结合，提高治疗的效果。场电位定位是一种理想的定位方式，因为与微电极记录（MER）的电极相比，术中植入电极是钝端，引起出血的可能小，而且可以省去一次微电极穿刺的操作，节省手术时间，此外还具有实时监测功能，为闭环DBS、术后程控提供依据。从科学研究角度来看，我们希望通过分析脑深部神经信号，探索神经系统功能机制，以及功能性神经系统疾病的发病机理。从临床应用角度，我们希望建立完善的DBS植入电极定位导航系统，并指导术后刺激参数设置与调整。2材料与方法2.1研究对象系2017年4月至2017年12月南京医科大学附属脑科医院的原发性帕金森病患者20例。根据中国帕金森病诊断标准（2016版）诊断确诊，其中男14例，女16例，平均年龄（65.5±8.74）岁，平均病程7.75±3.41年。患者亨-雅（Hoehn-Yahr,H-Y）分期为Ⅱ~Ⅳ期，UPDRSⅢ评分为6~28分。各项实验室、影像学检查排除其他严重疾病，病史5年以上，诊断为原发性帕金森病，69 南京医科大学硕（博）士学位论文美多芭治疗有效，术前简短精神状态量表（MMSE）得分均大于24分，排除认知功能障碍；汉密尔顿焦虑量表（HAMA）得分均小于14，汉密尔顿抑郁量表（HAMD）得分均小于20分，排除严重的情绪障碍。患者或患者家属均知情同意并签署知情同意书，并经过医院伦理委员会同意。2.2实验器材表1实验器材实验器材图示数量备注说明笔记本电脑（含A1CPUIntel(R)Core(TM)i5-4210,2.39GHz，硬盘500G，电源线）内存4G，Windows7系统，装有Acqknowledge4.2软件BIOPAC主机（含B、C1正面（B）有开关指示灯，背面（C）有电源接口，开关电源线）键，网线接口。模块正面（图D），用于选择模式：（Gain：10000）/（MODE：BIOPAC-EEG100CB、D、3NORM）/（35Hz）/（LPN：OFF）/（HP：0.1Hz）。模块E模块上面（图E），用于设置通道：BIOPAC自左向右将通道分别选择为：3、4、5。为信号放大器单元。网线A、C1用于连接BIOPAC主机和笔记本电脑，传输采集到的信号电极外接信号线F21用于连接颅内植入电极和信号记录导线连接导线及街头F11传输外接导线输送的信号，进入BIOPAC-EEG100C模块，第一根标号为0，单头，接通道3的正极，第二根标号信号记录导线B、E4为1，双头，接通道3的负极和通道4的正极，第三根标号为2，双头，接通道4的负极和通道5的正极，第四跟标号为3，单头，接通道5的负极接地导线G1用于接地电极片H1连接接地导线，粘于患者小腿上小推车A、B1装载设备，便于搬运70 南京医科大学硕（博）士学位论文铺巾A、B2绝缘，用于隔离试验器材和小推车，保证信号质量(A)(B)(C)(D)(E)(F)(G)(H)（I）图1试验器材71 南京医科大学硕（博）士学位论文2.3信号采集20例患者均行双侧丘脑底核（STN）DBS手术，手术方法如前所述。术前、术中常规行影像融合及微电极记录（MER）进行靶点定位。行MER电生理检测时，微电极进入STN后，背景噪音会突然增加，伴有20~50Hz簇状或不规则放电，同时亦会采集到放电频率20-90Hz，略高于其他放电频率的震颤细胞的放电，震颤细胞的发现是使用MER进行术中STN定位的特征性标志。当微电极探测的电信号背景噪声突然降低，或出现规则的紧张性细胞放电时，则考虑微电极已经穿出了丘脑底核的下界，此时即为实际靶点的位置。以实际靶点作为0点，在植入颅内刺激电极时，分别在靶点上6mm，4mm，2mm，以及0mm（即靶点处）使用Acqknowledge4.2软件进行颅内场电位信号的收集，一般待信号基本稳定后每个位置持续记录120秒。颅内植入电极有四个铂-铱圆柱表面触点，直径1.3mm，长度1.5mm，触点之间的距离为0.5mm。3个通道的神经信号分别从四个触点（触点0-1，1-2，2-3）记录。通道3（最左边的放大器单元）记录的信号为触点0+/1-双极LFP信号，通道4（中间放大器单元）记录的信号为触点1+/2-双极LFP信号，通道5（最右边的放大器单元）记录的信号为触点2+/3-双极LFP信号。信号依次沿颅内电极、电极外接信号线、连接导线、信号记录导线、BIOPAC-EEG100C模块、BIOPAC主机、网线向电脑传输。实验过程中，患者处于睁眼清醒静息状态，不讲话、不动肢体，尽量让周围的工作人员不要走动，以免影响信号的记录质量。两侧信号记录的流程相同。信号记录文件的命名方式为：采集时间+患者名字缩写+植入大脑半球测别（L左侧，R右侧），如：20170401hcz_L.acq，表示2017年4月1日，姓字缩写为hcz的患者的左侧STN的场电位信号。软件界面及信号记录图像如下：72 南京医科大学硕（博）士学位论文图2Acqknowledge软件数据采集界面2.4数据分析：首先在Acqknowledge4.2软件中，对于每个被试的每一侧STN核从每个位置（靶点上6mm，4mm，2mm，以及0mm）采集的120S时间的原始信号中截取50S时长的平稳连续信号段，原始信号采样率为2000Hz。图3.原始信号对原始信号做预处理，包括去50Hz工频干扰，2Hz高通滤波去基线漂移，90Hz低通滤波，然后降采样到500Hz得到预处理后信号。73 南京医科大学硕（博）士学位论文图4.预处理后信号对预处理信号进行功率谱分析。与帕金森病症状密切相关的神经活动主要集中在12~38Hz，可以划分为lowβ(12~20Hz)及hightβ（20~38Hz）频段。使用功率谱分析法（welch算法，选用1s的汉宁窗、0.7s重叠，1024个快速傅里叶变换点数）研究LFPs。为减少个体阻抗、记录环境等因素的干扰，将功率谱密度进行归一化处理：将功率谱密度进行积分得到总能量，再将功率谱密度除以总能量得到归一化后的功率谱密度，用以分析各频率成分的幅值分布、度量信号的同步化特征。图5.信号功率谱密度74 南京医科大学硕（博）士学位论文每个植入电极的电极触点长度是1.5mm，触点与触点之间的距离是0.5mm，以实际靶点为0点，植入电极最低端触点分别在距离靶点+0mm，+2mm，+4mm，+6mm的位置采集信号，则可以分别可以采集到距离靶点+0mm，+2mm，+4mm，+6mm，+8mm，+10mm，+12mm场电位的信息，除+0mm，+12mm仅一个信号值，其余位置的信号值取该位置所有信号值的平均值。其功率谱图如图6。可以估算刺激电极在STN中的长度，寻找距离靶点不同距离的场电位功率谱最大值，为术后程控提供参考。图6距离靶点不同深度场电位的功率谱变化2.5根据MER估算植入电极在STN中长度微电极进入STN核团后，背景噪音会突然增加，伴有20~50Hz簇状或不规则放电，同时亦会采集到放电频率20-90Hz，略高于其他放电频率的震颤细胞的放电，震颤细胞的发现是术中STN定位的特征性标志。当微电极探测的电信号背景噪声突然降低，或出现规则的紧张性细胞放电时，则考虑微电极已经穿出了丘脑底核的下界。在MER信号图（图7）中可以根据震颤细胞放电的变化估算出电极在STN中的长度。75 南京医科大学硕（博）士学位论文图7STN中MER信号图2.6根据影像融合估算植入电极在STN中长度在Matlab环境下使用leadDBS工具箱对术前术后脑影像学检查进行融合，如图8，已知每个植入电极的电极触点长度是1.5mm，触点与触点之间的距离是0.5mm，可以估算出刺激电极在STN中的长度。76 南京医科大学硕（博）士学位论文图8DBS术前术后影像融合图2.7定量计算根据场电位出现β频率峰值的个数计算LFP功能定位的长度；分别取LFPβ频率峰值最大的刺激点、MER信号最强的位置、影像融合提示距离STN最核心的位置为程控最佳刺激点，与临床实际程控最佳刺激点相比较，计算其符合率，计算公式为：两者符合的侧数/总侧数*100%。3结果3.1LFP功能定位平均长度值为6.3+-1.7mm。3.2使用场电位（LFP）、微电极记录（MER）、以及术后图像融合之间寻找最佳刺激靶点的符合率。LFPMER影像融合符合率80%75%65%4讨论帕金森病的DBS治疗目前已经取代毁损术，成为帕金森病手术治疗的主要方式。决定帕金森病DBS手术治疗成败的关键是靶点的定位。目前使用较多的是使用立体定向系统结合影像融合技术，以及微电极记录（MER）技术，实际临床工作中多是使用两种技术互作参考，结合患者的临床症状改善程度来定位。局部场电位（LFP）是电极旁边集团神经元共同的神经点活动的总和，反应神经核团的集群同步化或去同步化神经波动，研究表明，其神经波动在77 南京医科大学硕（博）士学位论文Beta(12~30Hz)频段的过度同步化导致了帕金森病一系列症状的发生,而使用脑深部电刺激治疗可抑制帕金森病患者STN核团神经元活动的病理同步性，因此用LFP来进行定位更符合从功能上寻找刺激靶点。本实验所得的LFP功能定位的长度要比MER的长度要长，提示场电位的分布比震颤细胞分布的范围更广，这也可以解释临床中影像融合提示电极靶点不十分准确时，给予电刺激仍然可以改善症状。分别通过LFP、MER、影像融合寻找最优刺激靶点，结果显示，LFP与实际程控刺激有更大的符合率。本实验根据距离靶点不同深度场电位的功率谱变化，可以看出主要的治病电生理活动β震荡存在着一定的规律，并能很好的体现与STN核团的位置关系，因此有希望成为一种新的功能定位方法，而且与微电极记录（MER）和影像融合定位技术的符合率高，提示功能定位和解剖定位具有明显的重合性，也证明β震荡的产生和STN核团的异常神经活动关系明显。5引用文献[1]JoshuaA.Goldberg,UriRokni,ThomasBoraud,EilonVaadiaandHagaiBergman.SpikeSynchronizationintheCortex-BasalGangliaNetworksofParkinsonianPrimatesReflectsGlobalDynamicsoftheLocalFieldPotentials[J].JournalofNeuroscience,2004,24(26):6003-6010.[2]EusebioA.,ThevathasanW.,DoyleGaynorL.PogosyanA.,ByeE.,TFoltynie,LZrinzo,KAshkan,TAziz,PBrown.Deepbrainstimulationcansuppresspathologicalsynchronisationinparkinsonianpatients[J].JNeurolNeurosurgPsychiatry,2011,82:569-573.[3]王守岩，王学廉，何江弘,脑深部刺激未来发展的机遇与挑战[J].中国生物医学工程学报，2015，34（4）：455-462.[4]PeterBrown,DavidWilliams.Basalganglialocalfieldpotentialactivity:Characterandfunctionalsignificanceinthehuman[J].ClinicalNeurophysiology,2005,116:2510–2519.78 南京医科大学硕（博）士学位论文[5]WonSeokChang,HaeYuKim,JooPyungKim,YoungSeokPark,SangSupChung,JinWooChang.Bilateralsubthalamicdeepbrainstimulationusingsingletrackmicroelectroderecording[J].ActaNeurochir,2011,153:1087–1095.[6]ChiungChuChe,AlekPogosyan,LudvicU.Zrinzo,StephenTisch,PatriciaLimousin,KeyoumarsAshkan,TarekYousry,MarwanI.Hariz,PeterBrown.Intra-operativerecordingsoflocalfieldpotentialscanhelplocalizethesubthalamicnucleusinParkinson'sdiseasesurgery[J].ExperimentalNeurology,2006,198:214–221.[7]JohnA.ThompsonaDavidLanctinbNuriFiratIncecAvivaAboscha.ClinicalImplicationsofLocalFieldPotentialsforUnderstandingandTreatingMovementDisorders[J].StereotactFunctNeurosurg,2014,92:251–263.[8]Jilll.ostrem,NathanZiman,NicholasB.Galifinakis,philipa.starr,Martasanluciano,mayaKatz,carolinea.racine,AlastairJ.martin,LeslieC.Markun,pauls.larson.ClinicaloutcomesusingClearPointinterventionalMRIfordeepbrainstimulationleadplacementinParkinson’sdisease[J].JNeurosurg,2016,124:908–916.[9]LukeA.Johnson,ShaneD.Nebeck,AbiramiMuralidharan,MatthewD.Johnson,KennethB.Baker,JerroldL.Vitek.Closed-LoopDeepBrainStimulationEffectsonParkinsonianMotorSymptomsinaNon-HumanPrimate–IsBetaEnough?[J].BrainStimul,2016,9(6):892-896.79 南京医科大学硕（博）士学位论文第五部分帕金森病患者脑深部刺激术后管理1前言[1]中国帕金森病治疗指南（第三版）指出：对帕金森病的运动症状和非运动症状采取全面综合的治疗。治疗方法和手段包括：药物治疗、手术治疗、运动疗法、心理疏导及照料护理等。药物治疗为首选，但随着病情的进展，对于中晚期帕金森病患者来说，手术治疗是药物治疗的一种重要有效补充。DBS治疗有一系类的优点，与药物相比它具有稳定性，无有效剂量的波动，无药物众多的副作用，与既往的毁损手术先比，具有微创性、可逆性、可调控性。众多临床研究发现，STN-DBS手术治疗帕金森病可以有效的解决原有的震颤、僵直、行动迟缓等运动症状。但同时随着病情进展，患者因长期疾病所导致的肌力下降、关节变形、肌肉萎缩、执行功能下降、非运动症状加重，DBS不能完全解决，另外长期的脑深部刺激还可能会出现构音障碍、步态障碍等新的运动问题，因此希望通过量表调查和定量检测设备的检测明确帕金森病患者术后病情症状发展情况，为制定科学个性化的术后管理策略奠定事实基础。2材料与方法2.1研究对象本研究纳入2016年2月至2017年2月在南京脑科医院行STN-DBS治疗的[2]帕金森病患者。手术患者选择标准,明确诊断为原发性帕金森病，对左旋多巴类药物治疗有效，美多巴冲击试验改善30%以上，经过系统的药物治疗,疗效逐渐减退,或出现运动并发症。无严重认知和精神情感障碍。术前、术后资料齐全。入组患者53例，所有患者均知情同意。其中男25例，女28例。平均年龄62.37.5岁，病程5-15程年,平均8.2+-3.2年，随访时间为术后15-27个月,均大于1年。术前未服药状态Hoehn-Yahr分期平均3.0+-1.05期。术后1年，未服80 南京医科大学硕（博）士学位论文药刺激器使用状态下，Hoehn-Yahr分期平均2.0+-0.9期。2.2术后程控原则术后一个月后开启刺激器。包括首次开机在内，每次来院程控均停服药12小时以上，避免受药物影响。首次程控原则如下：触点选择脉宽频率电压出现问题解决办法C+/1-/2-/3-/4-四个触点逐渐适当增加测试参数，一般初次开选择效果最佳的601301.0V刺激无明机在2.5以下一个触点显改善四个触点常规刺激参数如果没有改善，可以增单极刺激60-901302.5V刺激无明高脉宽，如果仍然没效果建议扫描头显改善颅核磁，根据头颅片子程控130-震颤较重，小幅增加电压，如果改善不明显可以单极刺激150控制不佳适当增加频率，观察3-7天美多巴服用超过4年，患者首次开机易出现异动或原有异动加重，在药物开期减少电压直至异动消失，给予患单极刺激60130≤2.0V开机异动者控制器可程控参数，高值为药物关期症状改善的值，低值为药物开期异动消失的值。减少电经过减少电压如果不能改善，减少脉单极刺激30-60130刺激出现压宽疼痛、肢体2.0-3.经上述调整仍不能改善，换成双极刺双极刺激60-90130抽搐0激模式开机之后随访患者的程控原则如下：出现触点选择脉宽频率电压解决办法问题如果电压超过3.0仍不能改善症单极刺激60-901303状，可以调高电压81 南京医科大学硕（博）士学位论文电极电极刺激，电极位置在未出现副作用的情况下，适当增位置浅可以用双60-90浅，非加电压，效果仍不佳增加脉宽负最佳位置电刺≥60≤激超电刺激时间较长可以适当增加脉单极刺激90过1宽年平衡刺激触点已为最佳时，观察是否原障碍，单极刺激刺激脉宽过高，小幅降低脉宽，长言语期观察含糊2.3临床评估由同一位医师对所有患者在术前和术后一年，分别进行UPDRS、MMSE、MoCa、HAMA、HAMD、PNM、PQ39等量表进行评分。评估时患者术前术后均处于未服药状态，术后处于开机状态。2.4统计学分析先对所得结果进行正态性检验，对符合正态分布的数据进行t检验。改善程度用百分数表示，计算公式为改善程度（%）=100×（术后值-术前值）/术前值3结果表1量表评分量表PQ39UPDRSMMSEMoCaPDNMHAMHAMPD睡眠量ⅢDA表改善率32.2%35.7%5.3%2.8%18.4%7.1%6.8%21%P值P<0.01P<0.01p>0.05p>0.05P<0.05p>0.05p>0.05P<0.0582 南京医科大学硕（博）士学位论文表2UPDRSⅢ各子项的改善情况项目运动迟缓震颤僵直中轴症状改善率43.5%58.3%33.6%9.2%P值P<0.05P<0.01P<0.05P>0.05表3残余症状加重发生率项目乏力腰背部平衡障步态障发音障认知障情绪障碍异动疼痛碍碍碍碍发生率23.5%11.3%7.6%9.2%5.8%3.5%11%6.6%4讨论DBS术后患者的UPDRSⅢ评分均有降低，降低的项目包括：震颤、僵直、行动迟缓、少动等，提高了患者的生活质量，恢复患者的运动功能。但是患者DBS术后仍有乏力、腰背部疼痛、平衡障碍、步态障碍、发音障碍、认知障碍、情绪障碍、异动等症状存在，因此术后管理不仅仅是减少药物和不断的增加参数，应该制定更科学更个性化的综合管理办法。科学的综合管理办法包括：合理的药物治疗方案，定期随访调整程控参数，持续的康复治疗，促进运动功能和社会功能的改善，积极的心理疏导，降低患者的不切合实际的期望，积极面对疾病，对抗疾病，患者家属的疾病教育，是家庭成员理解帕金森患者，帮助帕金森病患者更好的融入家庭，融入社会。总之，STN-DBS是对中晚期帕金森病安全有效的治疗方法，其对运动症状改善良好，对非运动症状改善不足，需要进行术科学的个性化的管理。5引用文献[1]中华医学会神经病学分会帕金森病及运动障碍学组，中国帕金森病治疗指南（第三版）[J].中华神经科杂志，2014,47(6):428-433.[2]中国帕金森病脑深部电刺激疗法专家组，中国帕金森病脑深部电刺激疗法专家共识[J].中华神经科杂志，2012,45(7):541-542.83 南京医科大学硕（博）士学位论文[3]中华医学会神经病学分会帕金森病及运动障碍学组,中国医师协会神经内科医师分会帕金森病及运动障碍专业委员会，中国帕金森病的诊断标准（2016版）[J].中华神经科杂志，2016,49(4):268-271.[4]王刚，刘小坤，陆建春，陈生第.帕金森病步态障碍的诊断与治疗[J].中国现代神经疾病杂志，2009，9（5）：504-506.[5]沈伟，杨坤，何升学，钱中润，孙振国，徐俊，章文斌.丘脑底核脑深部电刺激术后程控分析[J].中华神经医学杂志，2013，12（3）：293-295[6]相媛媛，张杨，吴林，李雷，邹永彪，刘艺鸣.帕金森病脑深部电刺激治疗的程控体会[J]中国神经精神疾病杂志，2009，35（4）：216-219.[7]雷小光.住院患者帕金森病运动并发症及相关因素的调查与分析[硕士学位论文].中国重庆.重庆医科大学.2011.[8]马羽.脑深部电刺激术治疗帕金森病的疗效及机制研究[博士学位论文].中国沈阳.中国医科大学.2007.84 南京医科大学硕（博）士学位论文文献综述丘脑底核脑深部电刺激对帕金森症患者语音疗效的研究丘脑底核脑深部电刺激（STN-DBS）作为一种运动能力的有效治疗手段，已经广泛应用于治疗帕金森症患者的震颤、肌强直、运动迟缓以及其他运动障碍。除此之外，术后病人的中轴症状如步态障碍、姿势不稳等也得到相应的研究，作为中轴症状之一的语音情况同样受到关注。本文将从分析方法（主观评分与声学分析）和研究方法（对照研究与随访研究）两个方面对STN-DBS对帕金森症病人语音疗效的研究进行梳理。1.分析方法针对不同研究目的和研究方式，出现了两种研究方法，分别是以临床量表评估为手段的主观评分方法和以数字信号分析为手段的声学分析方法。1.1量表评分临床上主要采用量表的形式对PD病人的语言进行DBS术后评估，评估内容一般是语言整体状况和语音质量方面。最常用的评分量表是UPDRSIII量表的第18项（语言）的得分。Bejjani等[1]（2000）对10位STN-DBS术后6个月的PD病人进行UPDRSIII量表的打分评估。结果表明除了运动能力改善，包括语言在内的中轴症状也得以改善。而同样是用UPDRSIII量表的第18项（语言）对STN-DBS术后的PD病人进行语[2][3]言评估的研究，Guehl等（2006）和Ostergaard（2006）却发现与Bejjani等研究相反的结果。由于UPDRSIII量表的第18项（语言）项目过少且分数等级粗略导致评分不足以反映病人的语言症状，因此临床上采用更为详细评估语音障碍程度的量[4]表VoiceHandicapIndex（VHI）。Wertheimer等（2014）设计了横断面研究，将VHI量表和相关问卷分发给231个STN-DBS术后的PD病人和758个没有接受手术的PD病人，两组病人分别按照量表和问卷对自己的语言情况进行评价。VHI量表包含三个方面的问题，分别是功能（functional）、身体（physical）和情85 南京医科大学硕（博）士学位论文绪（emotional）方面。问卷反馈结果显示，不管年龄大小和病程长短，手术组病人的言语障碍显著高于没有手术组，且在言语障碍的三个方面皆有严重的症[5]状表现。Tanaka等（2015）同样用VHI量表评估STN-DBS术后6个月及以上的PD病人，得到了相同的结论。除了使用VHI量表，研究者还用GRBAS量表对病人术后的嗓音音质情况进行了感知评估。其中G，R，B，A，S分别表示gradeofhoarseness，roughness，breathiness，asthenia，strained。两种评估量表的结果大致相同：与只用药物治疗的病人相比，STN-DBS术后的PD病人嗓音受损更加严重，紧嗓音和无声度更高。此后他们对PD术后病人的随访研究也再次证实STN-DBS术后的PD病人嗓音受损更加严重。[6]此外还有很多针对PD语音可懂度的研究。Tsuboi等（2017）、[7][8]Tripoliti(2011)、Tripoliti等（2014）指出STN-DBS术后一年的PD病人语音[9][10]的可懂度与自然度显著降低，Törnqvist等（2005）、Tripoliti等（2008）则报告PD病人术后6个月后的语音可懂度降低是由高频率、高电压导致的。以上无论是用UPDRSIII量表的第18项（语言）、VHI量表、GRBAS量表还是可懂度都是对PD语言（语音）的整体判断，包括语言的各个方面，如发音、呼吸、共鸣等，同时也是基于病人自评或医护人员基于对病人语音状况的主观感受进行的评分。由于个人经验以及打分标准不同，分数就会出现某种程度的差异。第二，以上对PD病人语言的评分处于术后的不同时间段，如3个月、6个月、1年或者4年，甚至有些研究没有统一的评估时间，这也是导致研究结果不一致的可能原因之一。再者，语言评估的对象虽然都是无认知和情绪障碍的PD病人，但病人术前言语障碍情况不明确，因此手术对于这些病人的语言治疗效果可能会千差万别。因此，为了保证主观评分的可靠性和准确性，在选择病人时应考虑病人的言语障碍情况以及术后时间，同时选用多种检测量表，并且采用三级评分方法，即自评、照看者评分以及医护人员评分三者结合，以期客观且真实有效地反映患者语言能力状况。86 南京医科大学硕（博）士学位论文1.2声学分析PD语音的声学分析包括音段、超音段和嗓音分析。音段分析就是分析PD病人语音中的元音和辅音是否准确，元音采用的声学指标是共振峰相关参数，而辅音的研究采用强度、浊音起始时间等参数；超音段分析是指韵律、节奏等方面，分析指标一般包括频域和时域相关参数；嗓音分析是基于持续元音/a/的分析，指标包括基频、基频抖动、振幅抖动、谐噪比以及谐波差等。1.2.1音段分析音节由元音和辅音组成。音段分析就是分析音节的元音及辅音。元音分析基于元音的第一共振峰（F1）和第二共振峰（F2）的多种指标，如单元音/a,i,u/的元音声学空间面积（VSA），双元音的FI、F2斜率等。Dromey[11]和Bjarnason（2011）认为术后PD语言恶化的原因在于单元音声学空间面积减小和双元音共振峰斜率下降。由于共振峰与人的生理结构（共鸣腔、舌头等）密切相关，现在研究者为了减小因个体差异导致的元音计算不准确，采用了多种计算方法研究元音发音质量，如元音发音指数（VAI）和元音距离等。辅音分析主要针对塞音和鼻音。对塞音的分析主要采用持阻段（闭塞段）最小音强和除阻段最大音强、闭塞段时长，擦音的分析采用摩擦段时长，以及[12]辅音VOT等指标。Kaelsson等（2014）发现STN-DBS术后一年的PD病人[13]塞音除阻时最大音强增大，说明能更好地完成闭塞动作。Putzer等（2008）采用口腔轮换率任务发现术后病人的发音准确性因人而异，有些患者好转，有些患者却恶化。对鼻音的研究多集中于术前PD病人，术后病人的鼻音有待进一步考察。1.2.2韵律分析韵律分析是指除音段外的超音段成分分析，包括频域和时域两方面。多数研究表明STN-DBS术后基频（F0）参数得到有效改善，如持续元音的[14][15]F0更稳定、F0变化更小（Gentil等（2001），Gentil等（2003）），句子[14][16]F0变化更大（Gentil等（2001），Dromey等（2000），Karlsson（2013）87 南京医科大学硕（博）士学位论文[17][18]，Xie等（2011））。考察时域参数的研究不胜枚举，但是结果也不尽相同。如重复无意义音节/pataka/是测量口腔轮换率（DDK）的有效指标，但这一指标的结果并不相同。[15][19]Gentil等（2003）和Karlsson（2011）研究显示STN-DBS术后PD病人DDK[18][20]速度增快，Xie等（2011）和Lundgren（2011）研究表明PD病人DDK速[14]度没有因STN-DBS手术而产生变化。除了DDK的变化，Gentil等（2001）还发现术后病人单元音持续发音时间延长、句子和词语之间的停顿时长也比术前缩短。口腔轮换率不一致的研究结果可能是由于病人不同的说话语速导致的，因此有关时域参数的研究要考虑病人自身的说话风格，用相对指标而不应该选择绝对指标来测量相关语言能力。1.2.3嗓音分析嗓音分析常以持续单元音/a/为语音样本，从持续性周期波中提取基频抖动、振幅抖动、谐波噪声比、谐波差等参数。[18][5]Xie等（2011）和Tanaka等（2015）STN-DBS术后1个月和6个月后的PD嗓音与术前或药物治疗组相比没有显著的系统差异。嗓音分析易受环境影响，尤其对于振幅抖动参数，周围噪声显著改变声学分析的结果。2.研究方法2.1对照研究对照研究是指将STN-DBS的PD病人组与其他条件下另一组做对照的横向研究，考察术后病人的语音情况。根据现有研究，对照组有两种形式，分别是[5]药物治疗的PD病人组和健康老年人组。Tanaka等（2015）和Tsuboi等（2017）[6]的对照组是药物治疗的PD病人组，目的在于比较手术治疗与药物治疗的效果。[7][14]Tripoliti等（2011）和Gentil等（2001）采用了健康老年人作为对照组。2.2随访研究随访研究是同一组病人术前及术后各个不同的时间点参与研究全过程的纵88 南京医科大学硕（博）士学位论文向研究方法。大多数PD语音术后变化的研究采用此研究方法。然而语音采集时间点的选择因研究目的的不同而产生差别。[18]Xie等（2011）术后2周到一个月的F0，DDK和嗓音指标均没有显著性差异；术后6个月的PD语音F0变化增大（Dromey等（2000）），PD病人术后12个月的语音F0范围增大，F0变化增大（Karlsson等（2013））；随访PD病人术后3个月、6个月和12个月，发现术后12个月后病人语言可懂度和言语障碍[7]程度加重（Tsuboi等（2017））；Tripoliti等（2011）对32PD病人进行了术后1个月、6个月、1年和3年跟踪研究，结果提示术后1年病人的语音可行度损伤严重。术后4年随访PD病人的运动能力的研究（Østergaard等（2006）），发现4年后的病人运动能力改善，而中轴症状和语言能力损伤严重。以上对PD病人术后的随访研究大多采用了3个月、6个月、1年、3年甚至是4年的研究，研究结果有同有异。这些结果的差异可能跟病人选择（是否有构音障碍）、实验方法（主观评分或声学分析）、时间点选择、刺激调整参数[9]以及电极植入偏侧化有密切的关系。如Törnqvist等（2005）、Tripoliti等（2008）[10]研究发现高电压、高频率刺激有损于语言能力，而低频则有利于语言的改善；左侧植入电极患者的语言能力差于右侧植入者。病人术前的异质性以及术后对电刺激反应出的明显差异对PD病人术后语音的研究提出挑战，因此要系统研究STN-DBS手术对PD病人语音的疗效，要注意以下几个问题：1、病人选择要考虑是否有构音障碍以及构音障碍的表现及程度；2、实验方法要把客观的声学分析和主观的打分相结合，并考察二者的相关性；3、控制好语音采集的时间点，进行长期的跟踪研究，寻找语音状况变化的关键时间点；4、控制刺激频率和电压在同一水平，将高或低电压和频率的病人分开考察；或考察同一组病人在低电压、低频率下以及高电压、高频率条件下的语音情况。89 南京医科大学硕（博）士学位论文对STN-DBS术后PD病人的语音研究是一个复杂且困难的问题。在现在已有的研究基础上，我们将采集更长随访时间以及更大样本的STN-DBS术后病人，对病人的语音进行细致地进一步的研究以更好地服务于术后神经调控和病人的言语康复。参考文献[1]BejjaniBP,GervaisD,ArnulfI,etal.Axialparkinsoniansymptomscanbeimproved:theroleoflevodopaandbilateralsubthalamicstimulation[J].JournalofNeurologyNeurosurgery&Psychiatry,2000,68(5):595-600.[2]GuehlD,CunyE,BenazzouzA,etal.Side-effectsofsubthalamicstimulationinParkinson'sdisease:clinicalevolutionandpredictivefactors[J].EuropeanJournalofNeurology,2006,13(9):963–971.[3]ØstergaardK;AaSundeN.EvolutionofParkinson'sdiseaseduring4yearsofbilateraldeepbrainstimulationofthesubthalamicnucleus[J].MovementDisorders,2006,21(5):624-631.[4]WertheimerJ,GottusoAY,NunoM,etal.TheimpactofSTNdeepbrainstimulationonspeechinindividualswithParkinson'sdisease:thepatient'sperspective[J].Parkinsonism&RelatedDisorders,2014,20(10):1065-1070.[5]TanakaY,TsuboiT,WatanabeH,etal.VoicefeaturesofParkinson'sdiseasepatientswithsubthalamicnucleusdeepbrainstimulation[J].JournalofNeurology,2015,262(5):1173-1181.[6]TsuboiT,WatanabeH,TanakaY,etal.EarlydetectionofspeechandvoicedisordersinParkinson’sdiseasepatientstreatedwithsubthalamicnucleusdeepbrainstimulation:a1-yearfollow-upstudy[J].JournalofNeuralTransmission,2017,124(12):1547-1556.[7]TripolitiE,ZrinzoL,Martinez-TorresI,etal.Effectsofsubthalamic90 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南京医科大学硕（博）士学位论文[15]GentilM,PintoS,PollakP,etal.Effectofbilateralstimulationofthesubthalamicnucleusonparkinsoniandysarthria[J].Brain&Language,2003,85(2):190-196.[16]DromeyC,KumarR,LangAE,etal.Aninvestigationoftheeffectsofsubthalamicnucleusstimulationonacousticmeasuresofvoice[J].MovementDisorders,2000,15(6):1132-1138.[17]KarlssonF,OlofssonK,BlomstedtP,etal.PitchvariabilityinpatientswithParkinson'sdisease:effectsofdeepbrainstimulationofcaudalzonaincertaandsubthalamicnucleus[J].JournalofSpeechLanguage&HearingResearch,2013,56(1):150-158.[18]XieY,ZhangY,ZhengZ,etal.ChangesinSpeechCharactersofPatientswithParkinson’sDiseaseAfterBilateralSubthalamicNucleusStimulation[J].JournalofVoice,2011,25(6):751-758.[19]KarlssonF,UngerE,WahlgrenS,BlomstedtP.ResearchArticleDeepBrainStimulationofCaudalZonaIncertaandSubthalamicNucleusinPatientswithParkinson’sDisease:EffectsonDiadochokineticRate[J].Parkinson’sDisease,2011:e605607.[20]LundgrenS,SaeysT,KarlssonF,etal.DeepBrainStimulationofCaudalZonaIncertaandSubthalamicNucleusinPatientswithParkinson'sDisease:EffectsonVoiceIntensity[J].ParkinsonsDisease,2011:e605607.92 南京医科大学硕（博）士学位论文攻读学位期间成果发表文章：1.中华神经外科杂志：《丘脑底核脑深部电刺激术治疗帕金森病早期语音声学研究》（2018年-第4期），第一作者2.临床神经外科杂志：《帕金森病患者运动迟缓症状的定量检测》（2018年-第4期），第二作者3.临床神经外科杂志：《一种基于惯性传感器的帕金森病冻结步态识别方法》（2018年-第4期）4.2018SpeechProsody会议文章.FundamentalFrequencyCharacteristicsofParkinsonianspeechafterSubthalamicNucleusDeepBrainStimulation，第三作者5.IEEE2018EMBC会议文章.DetectingchangesofbradykinesiaofpatientswithParkinson'sdiseasebywearablesensors，第二作者6.PlasmaProteomicsAnalysisinpatientswithParkinson'sDiseasebeforeandafterDeepbrainstimulation（文稿写作中）第一作者7.LocalizationofthesubthalamicnucleusinParkinson‘sdiseasesurgerybasedonIntra-operativerecordingsoflocalfieldpotentials（文稿写作中）第一作者93 南京医科大学硕（博）士学位论文致谢很幸运本科毕业六年后能再次回到母校学习，时光如水，逝者如斯夫，三年的研究生生活即将结束。此时，首先要感谢我的导师章文斌教授，他治学严谨、技术精湛、医德高尚，是他带我进入了神经外科领域。在这三年里，他在学业上给予我无私帮助，在生活上给予我温暖的关怀，他手把手的教会我手术技能，循循善诱的帮我厘清科研思路，给予我各种外出学习培训的机会，让我在这三年中快速成长。在最后的论文写作阶段，章老师对于论文整体框架以及细节问题均进行针对性的指导，给予我莫大的帮助。同时，我要感谢脑科医院311病区的邹元杰主任、杨坤主任、胡新华主任、刘翔主任、何升学主任、阎华师姐、刘永老师、赵金兵医生、耿良元医生和罗正祥医生在我临床实习期间给予的指导。感谢复旦大学类脑智能科学与技术研究院王守岩教授在术中场电位、运动功能定量检测方面给予的指导。感谢南京师范大学语言科技研究所顾文涛教授在语音声学分析中给予的指导。除此之外，我还要感谢在实验过程中给予我帮助的的各位师兄师姐师弟师妹们。首先要感谢中国科学院苏州生物医学工程技术研究所的罗回春师姐，是她教会了我电生理试验和运动功能监测设备的使用，同时还教会了我对于收集到信号的处理，在数据分析中给予了极大的帮助；感谢南京师范大学语言科技研究所的范萍师姐，她在我论文的写作过程中给了诸多的建议，并帮助我把文字修改练达，很佩服她的文字功底，是我所不及项背的；感谢杨锡斌师兄在帕金森病，生物标志物蛋白质组学研究中给予的一切帮助，在每一次讨论中我都能吸收到新的知识，堪称字字珠玑，句句金贵；交谈都能学到好多，感谢东南大学生物科学与医学工程学院的王琰和杨越同学，在运动功能定量监测的实验中我们互相帮助，顺利完成试验，结下深厚的革命友谊。感谢神经外科的刘禹池师弟，在血液样本分离保存方面给予的帮助，邱畅、阚文武、王瀚轩、董文文师弟在临床实践和科研中点点滴滴的帮助。感谢脑科医院老年神经科的沈柏师兄和蒋旭师妹，在临床量表评估的过程中能愉快的合作。感谢护理学院的刘94 南京医科大学硕（博）士学位论文静一师妹，在量表数据录入中花费了大量休息的时间，真诚感谢。当然还有我的同学们：肖勇、凌晓阳和孙文博，虽然我们的研究领域不同，仍感谢你们同窗陪伴，唯愿前途光明，工作生活顺遂。特别感谢答辩委员会的各位教授老师以及论文评审专家在百忙之中能对我的论文给予评判指导，助我走完成硕士阶段的最后一段里程。最后，我要衷心的感谢我的父母，他们的支持和鼓励是我能顺利完成学业的支柱和强大后盾。谁言寸草心，报得三春晖，谨以此文献给我可爱的家人和所有支持关心我的良师益友们。95
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