《苹果轮纹病菌对8种杀菌剂的敏感性测定及有效防治药剂筛选》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
类一．号，遲授予学位单位代码：丽－心？轉％一冷／．、Ｉ’’？一产…／、一、Ａ八一学号：１２０？：？２０１４１４０、；今？’■＊、＇．‘．，．．＇方＇？、Ｎ：、＇．．户Ｗ為复：．：．式．．，．’、’、一＂、、＇一．、？＾、、，？．、一一之、、＊户－巧＾／：．－｝心，＆．＿、’义一，？？，＊＇一一乂卢？一一一－‘Ｉ、一《■喀，一＇．？？’ｆ？＇．．‘．．‘’？，？？？．．，、＇－冷：六？，．＇＞．、，皆冷．與／：＇？．：＾＊２＾＾％苗．义累《义号．ｖ满滯中诚一Ｗ气■－…－．．二？：＇；微矿；、＇．、：＾二＇－—’－‘＇．；子－－＾＝＾扩一：一一＾全日制硕±专业筆化论黃苗立、一：户：．冬＇＇－＾於巧－掉：爷？牵果轮纹病菌对＾也兵８种杀菌剂的敏感性测定及有效防治药剂締选善皆＇作；／．：，护ｒ片；ＴｈｅＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ公０邸０５／７々＂ｃ（＇加／々，加＂化Ｅｉｇｈｔ、一、三！＿？ｉｃｉａｎ－二－Ｆｕｎｄｅｓｄ化ｅＥｆｆｅｃｔｉｖｅＦｕｎｉｃｉｄｅＳｃｒｅｅｎｉｎ声ｇｇｇ＇一：－一．＇．切‘，．：气病，，；ｒ一，冷：巾．＇－＾一…和－－，：？．－锻一，二一一气尸－？？＇？■＆－户，■．．＾－：＾．、产－．，矿沁谋．：巧．若户／／／／病才。‘＊－’．、‘、’今约．＇Ｚ＇一苗试矿；．冰ｒ＞知．ｖ．＇、＾、，＇．姓．顾班户—．名；乃图－今；若．Ｖ．，／挺秦然：－哈社ｉ、‘－心；＇．一裘＇：；？，巧一，锋餐汾Ｃ户兴＇‘冷Ａ＂业中心学位类别：农推拍Ｖ产：广ｒ；ｃ乂ｒ这：！＇＞／．：＇＞、－．ｙ进＇＼＼＼據占询振，：巧＇蛹；？、、＇；产．：‘专业；物护植保巧沪、、，、．，３．次：；＆、、；苗复＇－、‘■’－．，，公、六、：今气．、．，．今，々、是：二＞：理抗夺．研究方响农害生物性；＼药毒与有药；话、等；；‘？？＾、？—、，，．．＾■三立中，ｒ－、：Ｉ、尸＼ＶＣ、每＇‘‘＇：．．，．名：植．苗学晓物保院、＼政沁斬学訂為；Ｖ義ｙ舞？■－、＞＇＇’＊、？、？々，－义？ｒ－、．．ｌ、扣一广＊／ｉ’Ａ，异．：．晓授，：，指导教师夏明副教＾？、．巧ｙ，皆句＾方，■－＇＇－、．：妒．．．．．一、一，怒式ｆ聲兴怎，廢．尹巧々為＜＇＇ｒ＾－．－？？？本．足一：．孩、．扔难记，－：，，－、‘？１…《、、Ｖ＊＞以：、：＾．＊‘’．、．、，Ｖ．一一／义一户八、Ｊ？；；－－、－＇—．‘＇＇．＇’＾－：、＞＾公；－：？－：－－心＿：，记，＇，２＾巧；５尚：７，４近＾＾产．宁一－、、＇、、．＇－－．＇．＊＇￣＇心：．，点？？＇．＾？：伴义？．．沪？Ｃ－？－．．－、，＇？．－一？，．、？．户？Ｖ气心、＊－篇—？八冷＜；，－、户．？三心．．‘－：‘＇心八节兵芦２０１６目４Ｖ年月日爲；輿，皆心發；—之＂．－＾．：＾—；５．？六．沪Ｖ４省也為薪避…尸、與ＩＡ、＇’＂；，媒乃子：：．＾常．兰。；、：户．Ｈ巧，‘在Ｊ、境．－ｖ；／气爲，刮誇餐 论文提交日期：2016年5月论文答辩日期：2016年6月学位授予日期：2016年6月学科门类：农业推广答辩委员会主席：高兴文教授 符号说明h：Hour，小时D：Day，天μL：Microliter，微升Mg：Milligram，毫克mL：Milliliter，毫升L：Liter，升EC50：Medianlethalconcentration，抑制中浓度R：Relativecoefficient，相关系数CV：Cofficientofvariation，变异系数SD：StandardDeviation，标准差SE：StandardError，标准误ATI：Theactualtoxicityindexofmixture，实际混用毒力指数TTI：Thetheorytoxicityindexofmixture，理论混用毒力指数PDA：Potatodextroseagarmedium，马铃薯葡萄糖琼脂培养基CTC：Co-toxicitycoefficient，共毒系数LH-2010A：氟醚菌酰胺 目录中文摘要....................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................III1前言........................................................................................................................................11.1苹果轮纹病概述.................................................................................................................11.1.1苹果轮纹病菌..................................................................................................................11.1.2苹果轮纹病的症状..........................................................................................................11.2苹果轮纹病发生规律与原因.............................................................................................21.2.1轮纹病原菌发病规律.......................................................................................................21.2.2苹果轮纹病发病原因.......................................................................................................31.2.2.1品种抗病性...................................................................................................................31.2.2.2病原菌残留基数大.......................................................................................................31.2.2.3气候因素........................................................................................................................31.2.2.4栽培管理........................................................................................................................41.2.2.5其他...............................................................................................................................41.3苹果轮纹病的综合防治措施.............................................................................................41.3.1农业防治..........................................................................................................................41.3.1.1加强管理，增强树势...................................................................................................41.3.1.2健树防病，减少病菌侵染...........................................................................................51.3.2生态防治..........................................................................................................................51.3.3化学防治..........................................................................................................................51.3.3.1苯并咪唑类杀菌剂.......................................................................................................51.3.3.2三唑类杀菌剂...............................................................................................................61.4苹果轮纹病对杀菌剂的敏感性现状..................................................................................61.5试验药剂介绍.....................................................................................................................71.5.1苯醚甲环唑......................................................................................................................71.5.2丙环唑...............................................................................................................................71.5.3氟环唑..............................................................................................................................81.5.4甲基硫菌灵.......................................................................................................................8 1.5.5腐霉利...............................................................................................................................81.5.6氟醚菌酰胺.......................................................................................................................91.5.7克菌丹..............................................................................................................................91.5.8代森联..............................................................................................................................91.6农药复配研究.....................................................................................................................91.6.1农药复配的目的和意义...................................................................................................91.6.1.1扩大防治对象普，减少用工用时..............................................................................101.6.1.2延缓抗药性产生..........................................................................................................101.6.1.3降低用量，减少环境污染..........................................................................................101.6.1.4治理抗药性.................................................................................................................101.6.2农药复配混用的原则....................................................................................................101.6.3农药复配的机理.............................................................................................................111.7研究目的和意义................................................................................................................112材料与方法...........................................................................................................................122.1实验药剂...........................................................................................................................122.2供试菌株...........................................................................................................................122.3供试培养基.......................................................................................................................122.4供试仪器...........................................................................................................................122.5供试试剂...........................................................................................................................132.6毒力测定方法...................................................................................................................132.6.1药剂配置和剂量设置....................................................................................................132.6.2含药PDA培养基的制备.................................................................................................142.6.3苹果轮纹病菌对八种试验药剂的敏感性测定...........................................................142.6.4数据统计与分析...........................................................................................................142.7联合毒力测定...................................................................................................................142.7.1供试菌株...........................................................142.7.2混配组合设计和药剂配置...........................................................................................142.7.3联合毒力测定.......................................................152.7.4数据统计与分析...........................................................................................................153.结果与分析.........................................................................................................................16 3.1苹果轮纹病菌对8种化学杀菌剂的敏感性...................................................................163.1.1苹果轮纹病对苯醚甲环唑的敏感性.............................................................................163.1.2苹果轮纹病对丙环唑的敏感性....................................................................................203.1.3苹果轮纹病对氟环唑的敏感性....................................................................................243.1.4苹果轮纹病对腐霉利的敏感性....................................................................................273.1.5苹果轮纹病对甲基硫菌灵的敏感性............................................................................313.1.6苹果轮纹病氟醚菌酰胺的敏感性.................................................................................343.1.7苹果轮纹病对克菌丹的敏感性....................................................................................383.1.8苹果轮纹病对代森联的敏感性....................................................................................413.2苯醚甲环唑与其他7种杀菌剂的联合毒力...................................................................453.2.1苯醚甲环唑与丙环唑的联合毒力................................................................................453.2.2苯醚甲环唑与氟环唑的联合毒力................................................................................453.2.3苯醚甲环唑与腐霉利的联合毒力.................................................................................463.2.4苯醚甲环唑与甲基硫菌灵的联合毒力........................................................................473.2.5苯醚甲环唑与氟醚菌酰胺的联合毒力.........................................................................483.2.6苯醚甲环唑与克菌丹的联合毒力.................................................................................493.2.7苯醚甲环唑与代森联的联合毒力.................................................................................504讨论......................................................................................................................................515结论......................................................................................................................................53参考文献............................................................................................................................55致谢..........................................................................................................................................62 山东农业大学硕士学位论文中文摘要苹果轮纹病菌（Botryosphaeriadothidea）引起的苹果轮纹病（Appleringrot）是我国苹果生产中的主要病害之一，该病害在我国各大苹果主产区发生普遍，且在果实储藏期仍可持续发病，严重影响了苹果产业的健康发展。当前生产上，使用化学杀菌剂仍是防治苹果轮纹病的主要手段。但由于长期使用化学杀菌剂导致该病菌对杀菌剂的抗性发展非常迅速，给苹果轮纹病的有效控制带来较大困难。本研究采用菌丝生长速率法，测定了田间106株苹果轮纹病菌对8种杀菌剂的敏感性，并建立敏感基线；并以苯醚甲环唑为主，采用菌丝生长速率法，测定了苯醚甲环唑与其他7种杀菌剂不同配比对苹果轮纹病菌的联合室内毒力，并筛选出了最佳配比。以期为田间苹果轮纹病菌的抗药性检测、治理以及病害防控提供依据。采用菌丝生长速率法，测定了采自山东、辽宁、河北、河南、山西和陕西等地的106个苹果轮纹病菌对苯醚甲环唑、丙环唑、氟环唑、腐霉利、甲基硫菌灵、氟醚菌酰胺、克菌丹和代森联8种杀菌剂的敏感性，建立了敏感基线。毒力测定结果表明：同一种杀菌剂对供试的106个田间苹果轮纹病菌菌株的EC50值差别不大；不同杀菌剂之间对苹果轮纹病菌的平均EC50差异明显。同属三唑类杀菌剂的苯醚甲环唑、丙环唑和氟环唑之间的平均EC-150值相对较低，均小于0.25mg·L，且差异不明显。苯醚甲环唑的EC-1-150值在0.0063-0.6782mg·L之间，平均EC50为0.1346±0.0139mg·L；丙环唑的EC50值在0.0160-0.9310mg·L-1之间，平均EC-150为0.1880±0.0184mg·L；氟环唑的EC50值在0.0241-0.7828mg·L-1之间，平均EC-150为0.2134±0.0165mg·L。其次为二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利和取代苯类杀菌剂甲基硫菌灵，腐霉利的EC-150值在0.3270-3.3228mg·L之间，平均EC-1-150为1.2891±0.0600mg·L，甲基硫菌灵的EC50在0.8145-10.7008mg·L之间，平均EC-150为3.3579±0.1607mg·L。新型酰胺类杀菌剂氟醚菌酰胺对苹果轮纹病菌的毒力相对较低，EC-150值在0.9913-16.9868mg·L之间，平均EC50为5.9254±0.2881mg·L-1。传统的邻苯二酰亚胺类杀菌剂克菌丹和二硫代氨基甲酸盐类杀菌剂代森联对苹果轮纹病菌的毒力最低，克菌丹的EC-150值在1.6722-27.0095mg·L之间，平均EC50为10.2681±4.6002mg·L-1；代森联的EC-150在1.2763-32.1324mg·L之间，平均EC50为15.5119±0.7107mg·L-1。用Shapiro-wilk正态检验结果表明，以上8种杀菌剂对供试的田间苹果轮纹病菌的毒力（EC50值）除代森联外均呈连续的偏正态分布，代森联的毒力（EC50值）呈连续的正态分布，可以作为田间苹果轮纹病菌对以上8种杀菌剂的敏感基V 苹果轮纹病菌对8种杀菌剂的敏感性测定及有效防治药剂筛选线。采用菌丝生长速率法，以苯醚甲环唑为主要成分，分别测定了其余7种杀菌剂与苯醚甲环唑按照不同配比复配后对苹果轮纹病菌的联合毒力。联合毒力测定结果表明，苯醚甲环唑与丙环唑按1:1-1:3混配时，苯醚甲环唑与氟环唑按1:4混配时，苯醚甲环唑与腐霉利按1:7混配时，苯醚甲环唑与甲基硫菌灵按照1:9-1:10混配时，苯醚甲环唑与氟醚菌酰胺按1:5-1:6和1:9-1:10混配时，苯醚甲环唑与克菌丹按1:2-1:7混配时，苯醚甲环唑与代森联按1:1-1:3、1:5、1:7混配时，对苹果轮纹病菌均有明显的增效作用。室内的联合毒力测定结果，为下一步田间苹果轮纹病的防治药剂混剂研究和开发提供了基础和依据。关键词：苹果轮纹病菌；杀菌剂；毒力；敏感基线；复配VI 山东农业大学硕士学位论文ThesensitivitydetectionofBotryosphaeriadothideatoeightfungicidesandtheeffectivefungicidescreeningAbstractAppleringrotdisease,causedbyBotryosphaeriadothidea,iswidelydistributedinmostappleplantingareas,andhasbecomeoneofthemostseriousdiseasesintheappleproductioninChina.Thisdiseasecanoccuratthegrowingstagebeforeharvestoranytimeduringthestorage.Currently,themostpopularandeffectivemanagementstrategyforcontrollingringrotdiseaseinChinaistheapplicationofsyntheticfungicides.However,wideapplicationofchemicalfungicidesinevitablyleadstoseriousfungicide-resistanceproblems,andresultinmoredifficultiestocontrolappleringrot.TheobjectiveofthepresentstudywastoevaluatethesensitivitylevelandbaselineofB.dothideatoeightfungicidesusing106fieldisolatescollectedfromShandong,Hebei,Henan,Liaoning,ShanxiandShaanxi,respectively.Toselectthesynergisticmixtureofdifenoconazolewithothersevenfungicidesagainstappleringrotdisease,thetoxicityofthesemixtureswithdifferentratiosagainsttheB.dothideawerealsotestedinthelaboratorybyusingmycelialgrowthassays,andtheoptimalcombinationandmixtureratioofdifenoconazolewithothersevenfungicidesweredeterminedbytheco-toxicitycofficientmethod.TheresultsofourstudymayprovideabasisforthedetectionandmanagementoffungicideresistancetoB.dothidea,alsoforusingfungicidesefficientlytopreventandcontroltheappleringrotdiseaseinthefield.ThesensitivitylevelofeachfieldisolateofB.dothideatodifenoconazole,propiconazole,epoxiconazole,procymidone,thiophanate-methyl,LH-2010e,captanandmetiram,respectively,wasdeterminedbyusingmycelialgrowthassayonPDAcontainingserialconcentrationsofeachfungicide.ThesensitivitybaselineofB.dothideatoeachfungicidealsowasestablishedbasedonthemeanEC50valuesof106filedisolates.Thesensitivityresultsshowedthat,theEC50valuesinthesamefungicideweresimilarforall106fieldisolatesforB.dothidea.However,thereweresignificantdifferencesofmeanEC50valuesof106fieldisolatesintheeighttestedfungicides.ThemeanEC50valuesofthreetriazolefungicides(difenoconazole,propiconazoleandepoxiconazole)wasthelowestandnomorethan0.25mg·L-1.TheEC50valuesfordifenoconazole,propiconazoleandepoxiconazoleVII 苹果轮纹病菌对8种杀菌剂的敏感性测定及有效防治药剂筛选rangedfrom0.0063-0.6782,from0.0160-0.9310andfrom0.0241-0.7828mg·L-1,withthemeanEC50valueandstandarddeviationof0.1346±0.0139,0.1880±0.0184and0.2134±0.0165mg·L-1,respectively.TheEC50valuesforprocymidone(dicarboximidesfungicide)andthiophanate-methyl(substitutivebenzenefungicide)rangedfrom0.3270-3.3228andfrom0.8145-10.7008mg·L-1,withthemeanEC50valueandstandarddeviationof1.2891±0.0600and3.3579±0.1607mg·L-1,respectively.TheLH-2010e(phenylamidefungicides)hadtherelativelylowertoxicitytoB.dothidea,theEC-150valuesrangedfrom0.9913-16.9868mg·L,withthemeanEC-150valueandstandarddeviationof5.9254±0.2881mg·L.Thetraditionalfungicides,captan(dicarboximidesfungicide)andmetiram(dithiocarbamatesfungicide)hadthelowesttoxicitytoB.dothideawiththehighestmeanmeanEC50valuecomparedwithothersixtestedfungicides.TheEC50valuesforaptanandmetiramrangedfrom1.6722-27.0095andfrom1.2763-32.1324mg·L-1,andthemeanEC50valueandstandarddeviationwas10.2681±4.6002and15.5119±0.7107mg·L-1,respectively.SincethefrequencydistributionofEC50valuesforeachfungicidein106isolateswascontinuous,unimodalandpositivelyskewed,exceptmetiramwithanormaldistribution,themeanEC50valuesofeachfungicidecouldbeusedasthesensitivitybaselines.Theco-toxicityofdifenoconazolemixturewitheachofothersevenfungicidesatdifferentratiosagainstB.dothideaalsowasdeterminedbyusingmycelialgrowthassayonPDAcontainingserialconcentrationsofeachfungicidemixtureatdifferentratios.Theresultsshowedthat,thesignificantsynergismwasobservedinalltestedmixturescombineddifenoconazolewithpropiconazole,epoxiconazole,procymidone,thiophanate-methyl,LH-2010e,captanandmetiram,respectively.Themixtureofdifenoconazoleandpropiconazoleshowedthesynergismintheratiosrangedfrom1:1to1:3.Themixtureofdifenoconazoleandepoxiconazoleshowedthesynergismintheratiosof1:4.Themixtureofdifenoconazoleandprocymidoneshowedthesynergismintheratiosof1:7.Themixtureofdifenoconazoleandthiophanate-methylshowedthesynergismintheratiosrangedfrom1:9to1:10.ThemixtureofdifenoconazoleandLH-2010eshowedthesynergismintheratiosrangedfrom1:5to1:6and1:9-1:10,respectively.Themixtureofdifenoconazoleandcaptanshowedthesynergismintheratiosrangedfrom1:2to1:7.Themixtureofdifenoconazoleandmetiramshowedthesynergismintheratiosrangedfrom1:1to1:3orof1:5and1:7,respectively.TheVIII 山东农业大学硕士学位论文co-toxicityresultsofourstudymayprovideabasisforthenextresearchanddevelopmentofmixturefungicidetopreventandcontroltheappleringrotdiseaseinthefield.KeyWords:Botryosphaeriadothidea;Fungicides;Toxicity;Sensitivitybaseline;MixturesIX 山东农业大学硕士学位论文1前言苹果（Apple）属于蔷薇科（Rosaceae）仁果亚科（Pomideae）苹果属（MalusMill）又名奈、苹婆、天然子等，原产于欧洲中部，中亚细亚至我国新疆（张玉星等，2003），落叶乔木，叶椭圆形，有锯齿。苹果在我国已有2200多年的栽培历史，相传夏禹所吃的“紫柰”，就是红苹果。苹果是世界上食用最广泛的水果品种之一，全球有80多个国家和地区栽培着35种苹果。根据联合国粮农组织统计，2013年全世界的苹果产量为8082万吨，超过葡萄的7718万吨，排世界第二位（第一位是香蕉：1.067亿吨）。中国是世界上最大的苹果生产国和消费国，苹果种植面积和产量均占世界总量的40%以上，在世界苹果产业中占有重要地位（张怀西，2013；陆秋农，1983）。根据国家苹果产业技术体系的统计数据，2012年全国苹果总产量3800万吨，产量已占世界的63.3%，为世界第一。我国许多地区，苹果产业已成为当地国民经济收入的主要经济支柱，同时也是农民致富的主要门路（王宇霖等，2001），但是由于病虫的危害，我国苹果生产每年遭受较大的经济损失，严重影响了我国苹果产业的健康和可持续发展（修建冰等，2013）。苹果轮纹病与苹果树腐烂病、苹果早期落叶病是我国苹果的三大主要病害，其中苹果采后贮藏期损失主要由苹果轮纹病造成，因此苹果轮纹病是我国苹果生产上的主要病害（纪兆林等，2008）。1.1苹果轮纹病概述1.1.1苹果轮纹病菌1907年，日本学者首次报道苹果轮纹病病原菌为贝格伦葡萄座腔菌（BotryosphaeriaberengerianadeNotf.sp.piricola（Nose）KoganezawaetSakuma）（陈策等，1999）。最初苹果轮纹病菌被命名为MacrohonakawtsukaiHara，后又被命名为PhysalosporapiricolaNose，直至1980年才被认为属于葡萄座腔菌（Botryosphaeria）属，但其命名一直存在争议，我国和日本学者常用B.berengeriana，而欧美学者认为是B.dothidea。Alves和Slippers利用rDNA-RFLP和多基因序列分析证实B.berengeriana和B.dothidea两者是同物异名（AlvesA.等，2005；SlippersB.等，2004）。葡萄座腔菌属种类繁多，寄主范围广，危害严重。在我国，该属真菌所引发的病害是非常常见的，如林木和果树中的杨树溃疡病，开心果枯萎病，苹果轮纹病，苹果干腐病，桃流胶病等（吴小芹等，2001；余仲东等，2004；修建冰，2013；张星耀等，2008；MaZhonghua等，2002）。1.1.2苹果轮纹病的症状1 苹果轮纹病菌对8种杀菌剂的敏感性测定及有效防治药剂筛选苹果轮纹病（Appleringrot）又名粗皮病、轮纹烂果病，是一种发生在苹果枝干部和果实上的重要病害，能够引起苹果枝干树皮的粗糙，并造成苹果枝干的局部性坏死和苹果果实的腐烂，只有极少情况下会在叶片上引发症状。根据其在苹果树上的发病部位和症状，可把苹果轮纹病划分为苹果树轮纹病和苹果果实轮纹病两种。苹果树轮纹病的发病部位为枝干，其中：主干、主枝、侧枝和小枝均是苹果轮纹病菌的侵害部位。苹果树轮纹病发病初期的症状是以枝干的表皮皮孔为中心形成一种水渍状圆形或椭圆形的溃疡斑，主要呈红褐色或暗褐色凸起的小斑点，随后病斑慢慢的扩大，最后会形成直径0.5-3cm(平均为1cm)、椭圆形或不规则形、红褐色或者是暗褐色的较大病斑。病斑中心会隆起圆形疣状突起，质地坚硬，病斑的边缘多数情况下会开裂形成一个环形的沟。第二年，病害程度进一步加深，发病部位病组织与周围健康组织进一步裂开，形成一种特殊的马鞍形态。病斑中间表面产生的黑色小粒点就是病害的子实体(分生孢子器或子囊壳)。刮去患病组织后，在树皮内侧会有黑色坏死点，病情严重时可深达木质部，造成苹果叶片叶脉间严重褪绿，枝条前端枯死，节间变短。随着病害在枝干上越来严重，病斑就会慢慢的连成一个整体，造成苹果树表皮十分粗糙，所以苹果树轮纹病也被叫做苹果树粗皮病(李美娜等，1997)。苹果果实轮纹病在发病初期，以果实皮孔为中心，生成淡褐或褐色的一种圆形或近圆形水渍状小斑点。病斑周围常会出现明显红晕，红晕一般在发病早期及扩展速度慢时出现，随着发病斑的扩展，红晕随之消失，病果果肉慢慢的呈软腐的淡褐色或红褐色，同心轮纹状也会逐渐在表面明显呈现出来，一周后可导致整个苹果果实腐烂。病斑一般不会出现凹陷，烂果大部分也不会出现明显的变形，发病组织表现为软腐状，常常发出酸臭气味，并有茶褐色汁液不断地流出。黑色点（分生孢子器）散生在发病部位表面，但是不突破果皮，病果失水后呈现黑褐色僵果(张愈学等，1995)。叶片受害后通常有轮纹出现，病斑多为褐色圆形或不规则轮纹，病斑直径一般在0.5-1.5cm。后期病斑多呈灰白色。条件适宜时，病部也能产生黑色点状病斑。严重时导致叶片早衰，提前落叶。但苹果轮纹病在叶片上很少发病，主要危害苹果的枝干和果实（陈策等，1999)。1.2苹果轮纹病发生规律与原因1.2.1苹果轮纹病发病规律苹果轮纹病病原菌可侵染苹果果实，侵染可从谢花后的幼果期直至采收前的成熟期，并在苹果果实迅速膨大的成熟期，也就是每年的6-7月份，苹果果实被侵染的概率2 山东农业大学硕士学位论文最高，病害侵染高峰期也会在一些多雨年份适当提前发生。秋季苹果轮纹病显现症状，8月下旬到9月中旬为苹果果实发病最高峰，直到苹果采收期，一直保持很高的果实发病率（董桂枝等，1982）。苹果枝干轮纹病从3-4月老病斑开始侵染、扩展，到9月基本停至扩展。苹果轮纹病的发生和流行，年度之间差异较大，且受众多因素影响，侵染期间的降雨等气候条件起到关键作用。在苹果树生长期，如果降雨期提前，降雨次数多、雨量大，病原菌容易侵染，病害重。果实成熟期高温干旱，病害重。1.2.2苹果轮纹病发病原因苹果轮纹病的发生流行与品种、病原菌残留基数、气候条件和栽培管理等因素密切相关。1.2.2.1品种抗病性不同苹果品种间抗病性差异的主要与苹果皮孔的数量、大小有关，其中细胞结构疏松、皮孔密度大、皮孔先期表现为开口且皮孔下无木栓组织的富士、金帅和红帅等品种，对苹果轮纹病抗病性都很差，为易感品种（张宏霞等，2011；阎振立等，2005）；绿帅、国光等品种为中感品种；岳帅、珊夏等品种为轻度感病品种；细胞结构严密、皮孔少且小、先期皮孔不开口且皮孔下有木栓组织的鸡冠为抗病品种（高艳敏等，2007；李广旭等，2004）。1.2.2.2病原菌残留基数大苹果轮纹病菌能够循环侵染，苹果树上的病斑，枝干上的枯死枝和修剪后形成的枯桩等都可以释放病原孢子，造成二次侵染，所以果园中残存的发病枝干是苹果轮纹病的重要侵染来源（侯保林等，1998；SitterlyWR等，1960)。苹果果实轮纹病普遍发病较晚，基本上不产生成熟的子实体，无法发生再侵染。在自然条件下，苹果果实轮纹病菌很少会出现像干腐病一样的有性世代(薛莲等，2004)。因此，苹果轮纹病的初侵染与连年侵染的菌源主要来自于田间发病苹果树（岳兰菊等，2001)。病菌是以分生孢子器及子囊壳、菌丝体在苹果枝干上越冬，为此病下年初次侵染和连续侵染的主要菌源。苹果树轮纹病会在苹果枝干上反复的循环侵染，且病菌的生存年限最高可达到50年以上，因此在苹果树上会积累丰厚的病源基数（刘先琴等，2006）。1.2.2.3气候因素苹果轮纹病发生轻重与降雨量、温度以及空气的相对湿度等气候因素都有非常重要的联系。其中，温度是影响病害发生的重要因素，在适宜的温度范围内，该病菌有利于传播、繁殖与侵染危害。苹果轮纹病菌菌丝在小于5℃的环境中不能生长，大于35℃时3 苹果轮纹病菌对8种杀菌剂的敏感性测定及有效防治药剂筛选生长受到严重的抑制（吴桂本等，2001）。此外，由于病菌分生孢子越冬后的传播途径主要靠雨水传播，故苹果轮纹病的发生与降雨有着密切关系（尾形正等，1991；王顺建等，2004）。降雨量大的苹果种植区，或者生长期间降雨量大、持续时间长、次数多的地区，苹果轮纹病发病重。1.2.2.4栽培管理苹果轮纹病菌属于弱寄生菌，树势强则会使苹果轮纹病发病较轻。但如果栽培管理粗放，如：冬季不清园、不翻耕、不施肥、不修剪，夏季不清除病源和树下杂草；雨季时因排水不及时而导致果园积水；苹果树结果太多，不及时进行疏花疏果，这些均会造成苹果树长势衰弱，加重病害发生。此外，施肥无合理规划，偏施氮肥，磷肥、钾肥和硼肥偏少甚至根本不施，导致土壤肥力下降、黏重板结；不合理的种植密度，导致通风透光差；在病虫害发生初期没有及时防治。这些原因均可造成苹果树生长的逆境，为苹果轮纹病的发生及蔓延提供了有利的条件。1.2.2.5其他苹果象鼻虫、小食心虫、黄粉蚜等危害苹果后，都会在苹果上留下大量的伤口，这些危害发生后的伤口更有利苹果轮纹病菌的快速侵染（尹颖等，2008）。虫害如果发生重且防治不及时，可提高轮纹病菌的侵染机率，加重病害的发生。果树的树龄对苹果轮纹病的发生流行也有着很大影响作用，一般随着树龄的增大，发病率和病情指数也会有所提高（国立耕，2009）。老园内新移栽的小树及衰弱植株、枝干也易感病。苹果轮纹病的防治，一般药剂效果很差，而且，长期单一使用多菌灵等苯并咪唑类药剂，使病原菌产生了抗药性从而导致药剂防治效果降低甚至丧失（李晓军等，2009），这也是导致病害严重发生的原因之一。1.3苹果轮纹病的综合防治措施1.3.1农业防治1.3.1.1加强管理，增强树势对于新建果园，要选择栽种无病树苗，定植后要经常检查，及时铲除病株，防止病害扩大蔓延。对幼树在进行修剪整形时所用支柱，不使用发病的枝干，而且也不能在果园周围堆放修剪下来的发病枝干。进行科学合理的肥水管理，平衡施肥，防止氮肥过量入，平衡微量元素，并增施有机肥，不断增强树势，提高果树抗病能力。此外，进行合理的周年修剪整形，环剥刻芽，适度拉枝，适量疏花疏果，使果树的负载量达到适量水4 山东农业大学硕士学位论文平，均有助于减轻病害发生（张秋菊等，2008）。1.3.1.2健树防病，减少病菌侵染冬季及时清除果园内苹果树上残留的病果、病叶以及枝干上的苹果轮纹病病瘤，收集以后进行深埋或焚烧。使用硫磺粉+石灰+水+食盐制成的涂刷剂对树干进行涂刷保护，并用石硫合剂喷雾（刘先琴等，2006）。及时防治苹果象鼻虫、小食心虫、黄粉蚜等害虫，降低病原菌侵染，减轻病害发生。1.3.2生物防治生物防治是使用天然或改造的生物、基因或基因产物来降低有害生物的防治方法（ChalutzE等，1988）。目前化学防治虽然仍是控制采后病害的主要手段，但随着“农药公害”，“抗药性”等问题的日趋严重，以及生物防治技术的推广应用，使人们将生物防治深入扩展到采后病害防治的研究领域。我国采后生物防治的研究工作开始于80年代，经过二十多年的研究从实验室向生产应用的商品化发展，发现了许多具有拮抗作用的细菌，小型丝状真菌和酵母菌，这些微生物对引起果实采后腐烂的许多病原真菌都具有明显的抑制作用（WilsonL等，1988）。苹果轮纹病病果发病初使用0.4%低聚糖素800倍液每隔10d左右喷施1次，共5次，并与波尔多液交替使用，可将苹果轮纹病病果率控制到2%以下，较常规药物的防治效果高出约4-9倍（王顺建等，2004）。通过张丽萍等在田间试验表明，由荧光假单孢菌、枯草芽孢杆菌、木霉组成的复合生物制剂对苹果轮纹病菌的生长有非常好的抑制效果，该制剂防治苹果轮纹病，相对防效为84.2%（张丽萍等，2006）；该制剂与波尔多液交替喷施，防效与化学农药无显著差异，且可增加苹果鲜重；用其浸果还可以减少贮存期因苹果轮纹病的发生（张丽萍等，2006）。2008年纪兆林等对轮纹病菌和炭疽病菌的抑制进行的防治试验指出了地衣芽孢杆菌W10和其抗菌蛋白对于苹果储藏期等重要病害均有较好的防治作用（纪兆林等，2008）。赵百鸽，孔建等用枯草芽孢杆菌B-903防治苹果轮纹菌，取得了较好的防效（赵白鸽等，1997）。1.3.3化学防治由于我国苹果树种植以易感品种红富士居多，而且化学防治具有效果稳定、见效快、易于操作、成本低的特点，所以防治苹果轮纹病最主流最不可或缺的防治方法仍然是化学防治。就目前而言，防治苹果轮纹病的药剂主要有一下几类。1.3.3.1苯并咪唑类杀菌剂苯并咪唑类杀菌剂自20世纪70年代以来就成为我国控制苹果轮纹病的主要药剂，5 苹果轮纹病菌对8种杀菌剂的敏感性测定及有效防治药剂筛选该类药剂的问世使苹果轮纹病防治进入了一个新的历史阶段。苯并咪唑类杀菌剂主要品种有多菌灵(carbendaziin),甲基硫菌灵(thiophanate-ethyl)等。苯并咪挫类杀菌剂具有高效低毒、无残留药剂，但因长时期盲目使用农药，导致该病原菌抗药性较为严重。目前仍有大量果园在使用多菌灵，但其使用年代较长，用量较大，防治效果在逐年下降（张小风等，2000）。杨炜华等在山东烟台等地发现了抗多菌灵菌株（杨炜华等，2000）。许文耀等认为多菌灵在有些地区由于连续使用,病菌已产生抗药性（李晓军等，2009）。长期使用单一多菌灵防治苹果轮纹病导致的轮纹病产生抗药性,这一问题已经引起国内外有关专家的高度重视。1.3.3.2三唑类杀菌剂三唑类杀菌剂是进入21世纪才开始大量应用于苹果轮纹病防治的一类通过病菌抑制麦角甾醇生物合成来抑制或者干扰菌体附着胞及吸器的发育、孢子的形成及破坏菌丝细胞结构，以此用来降低病原菌的致病力（王彦荣，2013）。三唑类杀菌剂是一类广谱、高效、内吸输导性强的杀菌剂，对丝核菌属的病原真菌具有很高的生物活性（范昆等，2012；祁之秋等，2003）。其主要品种包括苯醚甲环唑(difenoconazole)、戊唑醇(tebuconazole)、丙环唑(propiconazole)和氟环唑（epoxiconazole）等,可防治苹果轮纹病、苹果树斑点落叶病和干腐病等苹果树病害。在植物病害的防治中，新型的三唑类杀菌剂的地位日益受到人们的瞩目，被广泛用于多种病害的防治。近年来，苯醚甲环唑、戊唑醇等三唑类杀菌剂已经在防治苹果轮纹病及储藏期病害上推广使用（范昆等，2013；刘保友等，2013；陈再廖等，2010），并获得良好的防治效果。戊唑醇作为三唑类杀菌剂中的重要品种，抗菌活性极高，具有内吸保护作用和治疗作用，防病谱广（徐汉虹等，2007），对多种病原菌都有很好的防治效果。另外也有关于其防治苹果轮纹病的研究报道，显示出很好的防治效果（范昆等，2013）。同时,人们发现该类化合物还有极强的调节植物生长、提高植物抵抗不良环境伤害的生理效应。三唑类化合物作为生长调节剂已倍受人们的关注。1.4苹果轮纹病对杀菌剂的敏感性现状目前，已有田间苹果轮纹病菌对生产中常用药剂多菌灵、代森锰锌、戊唑醇、苯醚甲环唑和氟硅唑等杀菌剂敏感性研究的报道，如李晓军等通过研究建立了苹果轮纹病对多菌灵的敏感基线为0.0428mg·L-1，苹果轮纹病对异菌脲的敏感基线为0.4511mg·L-1（李晓军等，2000；李晓军等2009）；范昆等通过研究建立了苹果轮纹病对代森锰锌的6 山东农业大学硕士学位论文敏感基线为3.0963mg·L-1，苹果轮纹病对戊唑醇的敏感基线为0.2541mg·L-1（范昆等，2012；范昆等，2013）；苏平等通过研究建立了苹果轮纹病对戊唑醇的敏感基线为0.4359mg·L-1（苏平等，2010）。由于长期使用化学杀菌剂导致该病菌对杀菌剂的抗性发展非常迅速，给苹果轮纹病的有效控制带来较大困难（范昆等，2012；范昆等，2013）。研究发现，田间苹果轮纹病菌已对多菌灵、戊唑醇和代森锰锌等常用杀菌剂产生了不同程度的耐药性和抗药性：如张小风和杨伟华等人报道了苹果轮纹病菌对多菌灵的抗性情况（张小风等，2000；杨伟华等，2002）；苏平等报道了苹果轮纹病菌对戊唑醇抗性的情况（苏平等，2010），刘保友等报道了苹果轮纹病菌对苯醚甲环唑与氟硅唑的抗药性情况（刘保友等，2013）；李娜等报道了苹果轮纹病菌对代森锰锌的抗药性情况（李娜等，2010）。刘保友等还发现，田间苹果轮纹病菌已经出现了对三唑类杀菌剂氟硅唑敏感性降低的亚群体，且这些菌株与戊唑醇之间具有交互抗性（刘保友等，2013）。1.5试验药剂简介1.5.1苯醚甲环唑苯醚甲环唑（Difenoconazole）属三唑类内吸性杀菌剂，是甾醇脱甲基化抑制剂，抑制细胞壁甾醇的生物合成，阻止真菌的生长，对子囊菌纲、担子菌纲、部分半知菌门有较好抑制效果。广谱、高效、持效期长，具有良好的内吸性，同时具有很强的预防治疗保护作用。由先正达作物保护有限公司研制开发，其中文的商品名叫“世高”。因内吸性强、低毒、用量少、不会污染环境等优点，被广泛应用于谷物、水稻、蔬菜和果树等多种病害的防治，叶面和种子处理均可保证作物品质和提高产量（王行军，2005），且对作物具有很高的安全性。1.5.2丙环唑丙环唑（propiconazole）是醇脱甲基抑制剂类杀菌剂中的代表药剂，是一种兼具治疗和保护双重作用的内吸性三唑类杀菌剂，为经济作物类专用杀菌剂，其中文的商品名叫“敌力脱”。丙环唑具有优良渗透力及附着力，其特殊的“汽相活性”，即使喷药不均匀，药液也会在作物的叶片组织中均匀分布，起到理想的防治效果（冯雪雯等，2013）。丙环唑可以被根、茎、叶部吸收，并且能很快地在植物株体内向上传输，能够防治担子菌，半知菌和子囊菌所引起的病害，其药效残留期为一个月左右（沙家骏等，1992；周学良等，2000）。丙环唑具有杀菌速度快、杀菌谱广泛、持效期长、活性高、内吸传导性强等特点，而且其具有毒性低，没有腐烛性，对光稳定，乳化能力好，能与7 苹果轮纹病菌对8种杀菌剂的敏感性测定及有效防治药剂筛选很多农药混用(Jones等，1987)，因此其已经成为世界上大吨位的三唑类新兴广谱性杀菌剂代表品种。1.5.3氟环唑氟环唑（epoxiconazole）通过阻碍真菌麦角甾醇的生物合成而影响真菌细胞壁的形成，对危害作物生长的多种真菌病害均有良好效果，氟环唑可以提高作物的几丁质酶活性，从而导致真菌吸器的收缩，最终抑制病菌侵入，这是氟环唑在所有的三唑类产品中其独一无二的特性，氟环唑对真菌尤其是担子菌和子囊菌引起的病害有广谱性的保护和治疗作用，其中文的商品名叫“欧博”（刘良柱等，2008）。氟环唑内吸性强，可以迅速被植株吸收并传导到感病的部位，使病害的侵染立即停止，能起到局部施药防治彻底。其持效期极佳，比如在谷物上其抑菌作用可达到40天以上，可以有效的降低用药次数及劳力成本。氟环唑既可以有效的控制病害，又可以通过调节酶活性来提高作物自身的抗病性，使果树本身的抗病性能大大增强。可以使叶色更绿，以保证作物光合作用最大化，增强果树树势，起到了提高产量及改善品质的作用。1.5.4甲基硫菌灵甲基硫菌灵（thiophanate-methy）是一种苯并咪唑类杀菌剂，通过与病原菌β微管蛋白结合，抑制微管蛋白聚合，从而抑制微管的形成，导致其不能形成纺锤体和其他网络结构，破坏病原菌的有丝分裂，抑制核酸的合成。由日本曹达株式会社研制开生产，又名“甲基托布津”。甲基硫菌灵是一种广谱性的内吸性低毒杀菌剂，具有预防、内吸和治疗的作用。其能够有效的防治多种作物的病害。对蔬菜类、禾谷类、果树的多种病害均具有非常好的防治作用。其特点是广谱杀菌剂，具有向顶性传导功能，对多种病害有预防和治疗作用。对叶螨和病原线虫有抑制作用。对禾谷类、蔬菜类、果树上的多种病害有较好的防治作用（裴欣等，2012）。1.5.5腐霉利腐霉利（procymidone）是一种二甲酰亚胺类杀菌剂，其主要作用为抑制菌体内的甘油三脂的合成，兼具保护与治疗双重作用，对核盘菌属真菌和葡萄孢属有特效（宋晰等，2013）。施用腐霉利后保护效果好、持效期长，且阻止病斑发展与蔓延，且在土壤中的半衰期较短，对环境及生态无不良的影响。特别是在作物的发病前期或者发病初期施用，可以取得非常满意的效果，对旋孢腔菌属、葡萄孢属核、盘菌属、长蠕孢属有较高的防效，并且能够防治对甲基硫菌灵、苯菌灵、多菌灵等已经产生抗性的植物病原菌（韩君等，2011；张春容等，2012）。目前，腐霉利不仅在田间果园被广泛应用于包括8 山东农业大学硕士学位论文苹果轮纹病在内的多种苹果病害的防治；作为一种水果保鲜剂，还被广泛应用于苹果等多种水果的储藏期病害的防治（徐国锋等，2009）。1.5.6氟醚菌酰胺氟醚菌酰胺是由山东省联合农药工业有限公司和山东农业大学合作，在2010年创新合成的一种新型的含氟苯甲酰胺类的杀菌剂，编号：LH-2010A，已经申请了国家发明专利。氟醚菌酰胺是一种新型广谱型的含有氟苯甲酰胺类的杀菌剂，对卵菌病害有特效，其可以直接作用于真菌线粒体的呼吸链，抑制琥珀酸脱氢酶的活性，从而阻断电子传递，抑制真菌孢子萌发，芽管伸长，菌丝生长和孢子母细胞形成真菌生长和繁殖的主要阶段，杀菌作用由母体活性物质直接引起，没有相应代谢活性。对于多种病害都具有良好的防治效果，如对辣椒疫霉、葡萄霜霉病、马铃薯晚疫病、棉花立枯病等多种真菌引起的病害都具有很好的防效效果（张化霜，2013；张秀焕，2015）。1.5.7克菌丹克菌丹（captan），是一种传统的有机硫类多位点杀菌剂，为广谱性低毒杀菌剂，以保护作用为主，兼有一定的治疗作用，而且还具有刺激植物生长的作用，其中文名字叫“开普敦”。主要用于防治苹果轮纹病，也可作为种子处理剂或灌根防治茎枯病、立枯病、黑斑病（李智文等，2003）。因其不含有金属离子，所以对多种敏感性得作物如桃树、芝麻等安全，但对苹果和梨的某些品种有药害，对葛芭、芹菜、番茄种子有影响，对人皮肤有一定刺激性。克菌丹对于多种蔬菜的霜霉病和炭疽有很好的防治效果（张恒敏等，1999）。1.5.8代森联代森联（metiram）是一种传统的有机硫类对卵菌纲类真菌所引起的各种植物病害都有很好预防作用的保护性杀菌剂。代森联杀菌范围广，且不易产生抗性。代森联的主要防治对象梨黑星病、柑橘疮痴病、苹果斑点落叶病等（张舒亚等，2002）。能有效防止病菌侵入、病菌扩散和清除体内病菌三重作用，而且代森联不用其他任何杀菌剂完全可有效控制病害发生，质量稳定、可靠（罗敏等，2010）。1.6农药复配研究1.6.1农药复配的目的和意义增加具有一定增效作用的复配药剂的施用，能够减少单一药剂的施用，以达到提高杀菌剂的活性，大大降低药剂使用成本的目的（韩丽娟等，1994）。某些杀菌剂因其具9 苹果轮纹病菌对8种杀菌剂的敏感性测定及有效防治药剂筛选有极强的选择性，所以严重的抗药性会在药剂使用几年以后就可能明显的产生，选择与其作用机理不同的杀菌剂进行复配对于降低病害对新药剂产生抗性风险有非常大的作用，可以很大程度上增长新药剂的使用周期。为了延长新的农药品种的使用寿命、降低防治成本、扩大防治谱、提高药效和环境安全性、缓解靶标生物的抗性，农药复配剂的研究在世界各国受到了越来越高的重视。1.6.1.1扩大防治对象谱，减少用工用时植物的生长周期是一个长时间多阶段的过程，植物病害也会随着作物不同的生长阶段发生改变，而且往往会出现多种病害在同一时期综合发生，但是对于杀菌剂来说其作用方式和作用对象是有范围限制的，仅仅对某一种或者某几种病害是有效果的，所以根据生产要求就要求我们生产出能同时防治多种病害的复配农药，达到一次施药而防治多病的目的（Keplinger等，1967）。作物的病害和虫害往往是同时发生的，为了能在防治病害的同时治疗虫害，可以把杀菌剂和杀虫剂进行混配成剂，混剂在提高药效的同时还会使药剂毒性降低，随之就会使施药次数的减少和时间的缩短，还能起到扩大防治对象范围，降低成本等优点。1.6.1.2延缓抗药性产生对有增效作用的农药进行复配可以减缓病原菌群体对某一单剂的抗性发生和发展，同时对多作用位点的农药产生抗药性的频率为单剂频率之积，农药复配可以杀死这种多抗性的个体，其产生并存活的几率非常小，所以复配药剂就能进一步的降低抗性基因的频率值。为了达到上述的增效目的，我们就可以把具有增效作用的不同作用机制的农药进行复配（叶正荷等，1996）。两类作用机制不同的农药进行混配使用，能够非常明显降低杀菌剂的使用量，减少病原菌与农药接触的机会，从而降低了病原菌的突变几率，延缓了病原菌的抗性发生和发展。1.6.2农药复配混用的原则为了保证各种农药理化性质的稳定（如乳脂性、悬浮率等），有各种不良的化学反应（如水解、氧化还原酸解或碱解等反应）的各种杀菌剂之间不能复配，这样可以有效的保证正常的药效或者增效作用。不同品种药剂混用后，不能致使作物发生药害，不能增加毒性，保证对人畜安全。作物品种和农药种类间的搭配合理，成本的合理，是药剂之间的混合合理使用的两大原则。我们不需要那种农药的混用后不能省工省时，且耗费材料，减弱防治效果，缩小防治范围，没有实用价值的混用复配农药。为了确保复配药剂能够起到很好的增效作用，各农药品种间的拮抗作用也是我们还应该高度关注的10 山东农业大学硕士学位论文（毕秋艳等，2010）。1.6.3农药复配的机理孙云佩和Johnson提出的共毒系数法（SunYP等，1960）是我国农药混剂登记得到认可有效算法，利用共毒系数法得到的增效复配药剂可以得到世界各地的公认。就农药复配的增效而言，共毒系数法是在Bliss提出农药的联合毒力的概念和统计分析方法后（BlissCI等,1939）认知度比较高的一种。虽然关于复配增效的报道有非常的多但是因为不同药剂有不同的作用位点，不同作用位点的联系是非常复杂的，因此关于农药复配机制的研究很少有报道。PietroA.Di等人认为两种混配可能会引起增效，一是两种药剂之间可以直接的相互影响，另外一种情况是混剂中一种药剂可以影响病原菌体内的能量产生或者能够阻碍细胞膜甾醇类物质的产生而影响细胞膜的通透性，这样就可以为混剂中另外一种或者几种药剂提供进入菌体内的机会，作物靶标能够与其更好的结合，实现药剂之间的互作与增效作用（PietroA.Di等，1993；闫晓静等，2006）。1.7研究目的和意义苹果轮纹病（Botryosphaeriadothidea）是我国苹果生产中的主要病害之一，在中国大部分产区普遍发生，且呈逐年加重趋势（李鑫垚等，2010）。该病不仅可危害果实和枝干，还可在果实储藏期发病，给苹果生产造成巨大损失，也是造成我国苹果单产水平不高的重要原因之一，严重影响了苹果产业的健康发展（李娜等，2010）。当前生产上，使用化学杀菌剂仍是防治苹果轮纹病的主要手段。但由于长期使用化学杀菌剂导致该病菌对杀菌剂的抗性发展非常迅速，给苹果轮纹病的有效控制带来较大困难。杀菌剂对田间植物病原菌的敏感性检测及敏感性基线的建立，对于作物病害防治药剂的选择和抗药性治理具有重要的参考价值。尽管针对不同省份（山东、河南等）苹果产区，目前已建立了苹果轮纹病菌对多菌灵、异菌脲、代森锰锌和戊唑醇的敏感基线，但针对全国范围内的苹果轮纹病菌对其余常见杀菌剂的敏感基线均未见研究和报道。本研究拟采用菌丝生长速率法，检测了氟醚菌酰胺、苯醚甲环唑、丙环唑、氟环唑、甲基硫菌灵、腐霉利、克菌丹和代森联8种杀菌剂对采自山东、辽宁、河北、河南、山西和陕西六个省份主要苹果产区106株苹果轮纹病菌的毒力，明确目前我国苹果主要产区苹果轮纹病菌对这8种杀菌剂的敏感性现状，并分别建立敏感基线。并以苯醚甲环唑为主，采用菌丝生长速率法，测定了苯醚甲环唑与其他7种杀菌剂不同配比对苹果轮纹病菌的联合室内毒力，筛选出了最佳配比。以期为田间苹果轮纹病菌的抗药性检测、治11 苹果轮纹病菌对8种杀菌剂的敏感性测定及有效防治药剂筛选理以及田间苹果轮纹病防治药剂的合理选择和病害科学防治提供依据。2材料与方法2.1供试药剂95.0%苯醚甲环唑原药（difenoconazole），由山东东泰农化有限公司生产；95.0%丙环唑原药（propiconazole），由湖北康宝泰精细化工有限公司生产；97.0%氟环唑原药（epoxiconazole），由湖北康宝泰精细化工有限公司生产；98.3%腐霉利原药（procymidone），由青岛海利尔药业有限公司生产；85.0%代森联原药（metiram），由青岛海利尔药业有限公司生产；97.0%甲基硫菌灵原药(thiophanate-methyl)，由山东荣邦化工有限公司生产；95.0%克菌丹原药(captan)，由山东荣邦化工有限公司生产；95.8氟醚菌酰胺原药（LH-2010A），由山东省联合农药工业有限公司生产。2.2供试菌株供试的106株苹果轮纹病菌（Botryosphaeriadothidea）菌株均由山东省果树研究所分离，纯化，鉴定，保存，提供。2007年~2009年，分别于山东（栖霞、沂源、泰安、阳信）、山西（临猗、万荣、平陆）、河南（灵宝、渑池、陕县）、辽宁（葫芦岛、瓦房店）、陕西（大荔、汉中）、河北（昌黎、保定）等地相距10千米以上果园内，随机采集轮纹病果，装入干净的小塑料袋中（每个袋子只装一个标本），带回实验室分离纯化获得。其中包括陕西省4株、辽宁省11株、河南省7株、山西省5株、河北省20株和山东省59株。2.3供试培养基马铃薯琼脂葡萄糖（PDA）培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，水1L。用于苹果轮纹病菌的培养、常规保存以及对药剂毒力测定等。2.4供试仪器主要仪器：DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），LDZX-40BI型立式自动电热压力灭菌锅（上海申安医疗器械厂），高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），A200S型万分之一电子天平（德国产），HD-920型净化操作台12 山东农业大学硕士学位论文（哈尔滨东联电子技术开发有限公司），SPX型智能生化培养箱（宁波江南仪器厂），PHSJ-4A实验室pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司），具塞刻度试管、烧杯、研钵、量筒和容量瓶等玻璃仪器（江苏海门市玻塑试剂厂），WMS卧式砂磨机（秦皇岛北航机械有限公司），90mm培养皿（上海五一玻璃仪器厂），BX51Olympus研究显微镜（奥林巴斯株式会社），HZQ-F160全恒温振荡培养箱（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）。2.5供试试剂试剂（Reagents）纯度（purity）生产厂商（company）95%乙醇(C2H5OH)分析纯天津市凯通化学试剂有限公司丙酮(C3H6O)分析纯天津市大茂化学试剂厂吐温-80（Tween80）分析纯索宝来生物技术有限公司盐酸（HCl）分析纯济南试剂总厂农乳1602分析纯索宝来生物技术有限公司农乳500分析纯索宝来生物技术有限公司2.6毒力测定方法2.6.1药剂配置和剂量设置用万分之一电子天平分别准确称取苯醚甲环唑、丙环唑、氟环唑、腐霉利、氟醚菌酰胺、甲基硫菌灵和克菌丹各1.0526、1.0526、1.0309、1.0173、1.0309、1.0526和1.0438g，用丙酮溶解定溶至100ml容量瓶，分别配制成1×104mg/L的苯醚甲环唑、丙环唑、氟环唑、腐霉利、氟醚菌酰胺、甲基硫菌灵和克菌丹母液，备用；用万分之一电子天平准确称取代森联1.1765g，黄原胶0.2000g，农乳1602#2.0000g，农乳500#1.0000g，用去离子水补足至100g，然后用小型悬浮剂砂磨机湿法研磨1h，配制成1×104mg/L代森联水悬浮剂母液，备用。在预试试验的基础上，按有效成分含量分别设苯醚甲环唑：1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125mg·L-1；丙环唑和氟环唑：1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05和0.125mg·L-1；腐霉利：8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.25mg·L-1；甲基硫菌灵24、12、6.0、3.0、1.5和0.75mg·L-1；氟醚菌酰胺、克菌丹和克菌丹：64、32、16、8.0、4.0和2.0mg·L-1系列质量浓度处理；并用含有0.1%的吐温80的水溶液将以上八种试验药剂母液稀释至上述设计浓度的10倍浓度。13 苹果轮纹病菌对8种杀菌剂的敏感性测定及有效防治药剂筛选2.6.2含药PDA培养基的制备在无菌操作条件下，将预先融化、灭菌的63mL马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基加入无菌锥形瓶中，并冷却至45℃，然后用移液器从低浓度到高浓度依次定量吸取配好的浓度为设计浓度10倍的各处理药液7mL，分别加入上述锥形瓶中，充分摇匀，然后等量倒入直径为9cm的培养皿中，制成最终浓度为相应设计浓度的含药PDA平板。参照菌丝生长速率法（慕立义，1994；范昆等，2013），2.6.3苹果轮纹病菌对八种试验药剂的敏感性测定采用杀菌剂的菌丝生长速率法进行测定（慕立义等，等1994；李晓军，2009；范昆等，2013）。将在PDA培养基上转接活化4d后的苹果轮纹病菌，在无菌条件下用内径为7.0mm的灭菌打孔器从菌落边缘切取菌柄，用接种器将菌饼接种于含药平板中央，菌丝面朝下，盖上皿盖，放入26℃恒温培养箱内，连续培养4d后用直尺测量各处理菌落直径。以不含药剂的0.1%的吐温80水溶液处理作空白对照，每处理4个重复。采用十字交叉法垂直测量各处理菌落直径各1次，求其平均值，减去7.0mm菌病直径，即为菌落生长直径。根据4次重复的试验结果，求出各处理浓度梯度的平均菌落生长直径，并计算不同处理浓度对苹果轮纹病菌的菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率%=[（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径]×100。2.6.4数据统计与分析采用SPSS16.0统计分析软件，用各浓度梯度值及其相应的菌丝生长抑制率几率值进行回归分析，分别计算8种杀菌剂对不同苹果轮纹病菌菌株的EC50、相关系数、回归方程以及95%置信限。以EC50值为横坐标，菌株分布频数为纵坐标，绘制频数分布柱状图，EC50值的分类间隔值(柱形图中单根柱的宽度)按Scott(1979)的公式（DavidW，1979）:H=3.49SN-1/3，其中H：分类间隔值(binwidth)；S：EC50值的标准偏差(standarddeviation)；N：测定的菌株数量。求取分类间隔值后，依据EC50值的分布范围确定柱形图的柱体数量（符雨诗等，2015,）。2.7联合毒力测定2.7.1供试菌株选取菌株TS7CK为试验菌株，此菌株采自泰山南天门海棠植株。2.7.2混配组合设计和药剂配置将苯醚甲环唑与其他7种供试杀菌剂根据质量浓度分别按下列配比混配，苯醚甲环14 山东农业大学硕士学位论文唑:丙环唑按照3:1、2:1、1:1、1:2和1:3五个配比；苯醚甲环唑:氟环唑按照5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5九个配比；苯醚甲环唑:腐霉利、苯醚甲环唑:氟醚菌酰胺、苯醚甲环唑:克菌丹和苯醚甲环唑:代森联分别按照1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9和1:10十个配比；醚甲环唑:甲基硫菌灵按照1:8、1:9、1:10、1:11和1:12五个配比；用2.6.1中配好的单剂母液，每个配比也分别配制成1×104mg/L的混合母液，备用。在预试试验的基础上，将上述不同配比组合设定5-7个系列梯度浓度，然后用含有0.1%的吐温80的水溶液将各种配比组合母液稀释至设计浓度的10倍浓度。2.7.3联合毒力测定含药PDA培养基的制备参照2.6.2部分内容。联合毒力测定参照2.6.3部分内容。2.7.4数据统计与分析参照2.6.4部分的数据统计分析方法，分别计算出苯醚甲环唑与其他7种供试杀菌剂按照不同质量浓度配比混配后的组合以及各单剂对供试苹果轮纹病菌的EC50、相关系数、回归方程以及95%置信限。根据孙云沛法计算共毒系数（CTC），根据共毒系数（CTC）来评价药剂混用的增效作用，即CTC≤80为拮抗作用，80
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