替米沙坦对单纯性肥胖小鼠血清脂联素、尿微量白蛋白及肾脏病理的作用

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分类号：R692.9学校代码：10062密级：学号：2013602384硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：替米沙坦对单纯性肥胖小鼠血清脂联素、尿微量白蛋白及肾脏病理的作用TITLE：EffectsofTelmisartanonSerumAdiponectin,UrineMicroalbuminandRenalPathologyofObeseMices一级学科：临床医学二级学科：内科学肾病论文作者：赵菊兰导师：夏天天津医科大学研究生院二〇一六年五月 分类号：R692.9学校代码：10062密级：学号：2013602384学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：替米沙坦对单纯性肥胖小鼠血清脂联素、尿微量白蛋白及肾脏病理的作用TITLE：EffectsofTelmisartanonSerumAdiponectin,UrineMicroalbuminandRenalPathologyofObeseMices一级学科：临床医学二级学科：内科学肾病论文作者：赵菊兰导师：夏天天津医科大学研究生院二〇一六年五月 中文摘要研究目的肥胖目前是全球共存的一个严重的公共卫生问题。近年来肥胖的发病率大幅度增长，预测表明，2030年全球人口将有58%为超重或是肥胖。超重及肥胖可增加2型糖尿病、高血压、心血管疾病及肾脏疾病发生的风险。Weisinger早在1974年就已提出肥胖可导致蛋白尿的产生，即肥胖相关性肾病（obesity-relatedglomerulopathy，ORG）。已有多项研究证实，肥胖导致尿微量白蛋白（urinarymicroalbumin，mALB）排泄增多与血清脂联素（adiponectin，ADP）水平下降有关，给予过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisomeproliferatoractivatedreceptorgamma，PPARγ）激动剂吡格列酮干预后，血清ADP水平升高，尿mALB排泄减少。替米沙坦结构与吡格列酮类似，多项研究证实替米沙坦也具有PPARγ激活作用，可提高血清ADP水平。本研究针对替米沙坦的PPARγ激活作用对单纯性肥胖小鼠血清ADP、尿mALB排泄、肾脏PPARγmRNA表达水平、肾脏足细胞紧密连接蛋白-1（zonulaoccludens-1，ZO-1）表达水平及肾脏病理改变的影响，探讨替米沙坦作为PPARγ激动剂于ORG治疗的意义。研究方法8周龄雄性ob/ob小鼠24只和其同系C57BL/6J小鼠8只，适应性饲养1周，测量小鼠体质量。ob/ob肥胖小鼠按其体质量分层随机分为三组：模型组（M组，n=8）、替米沙坦治疗组（T1组，n=8）、氯沙坦治疗组（T2组，n=8）；C57BL/6J-1-1小鼠为对照组（C组，n=8）。T1组给予替米沙坦5mg·kg·d灌胃，T2组给予-1-1氯沙坦5mg·kg·d灌胃，C组、M组小鼠予以等量蒸馏水灌胃。每周一早上8:00测定各组小鼠体质量，根据小鼠体质量调整给药剂量，上述步骤连续12周。实验前后分别采集各组小鼠血液及24h尿液标本，测定小鼠血糖、血清ADP及24h尿mALB。实验结束12周末处死小鼠，摘取小鼠两侧肾脏并称重。一侧肾脏置于无菌冻存管于液氮中保存，实时荧光定量PCR（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，q-PCR）测定肾脏PPARγmRNA表达水平；另侧肾脏用10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后于光镜下观察肾组织病理改变，取10个正切的肾小球切面，测量肾小球直径并取平均值；免疫组化方法检测肾脏ZO-1表达水平。比较四组小鼠体质量、血清ADP、24h尿mALB、肾脏PPARγmRNA表达水平、肾脏湿重、肾小球直径及肾脏ZO-1表达水平的差异，并将血清ADP、I 24h尿mALB、肾脏PPARγmRNA表达水平、肾脏ZO-1表达水平与其他指标行相关性分析。使用SPSS20.0软件行数据处理及分析，P<0.05为有统计学意义。实验结果1.小鼠一般情况1.1实验前ob/ob小鼠及C57BL/6J小鼠体质量、24h尿mALB及血糖比较：实验开始前ob/ob小鼠平均体质量显著高于同系同周龄C57BL/6J小鼠（P<0.01），且ob/ob小鼠平均体质量超过C57BL/6J小鼠平均体质量的20%，达到小鼠肥胖标准。ob/ob小鼠24h尿mALB明显高于C57BL/6J小鼠（P<0.01）。ob/ob小鼠及C57BL/6J小鼠血糖水平存在差异（P<0.01），但实验前后ob/ob小鼠血糖均<16.7mmol/L，排除小鼠糖尿病诊断，故可排除糖尿病所致的肥胖小鼠尿mALB增多，明确肥胖小鼠尿mALB由肥胖所致。1.2实验前后各组小鼠体质量比较：实验前M组、T1组及T2组小鼠体质量均超过C组小鼠体质量（P<0.01）；M组、T1组及T2组小鼠体质量无显著性差异（P>0.05）。实验后M组、T1组及T2组小鼠体质量均明显超过C组小鼠体质量（P<0.01）；T1组小鼠体质量低于M组及T2组（P<0.01）。M组及T2组小鼠体质量无明显差异（P>0.05）。2.24小时尿微量白蛋白:2.1各组实验前后比较：实验后M组小鼠24h尿mALB较实验前增加（P<0.01）；实验后T1、T2组小鼠24h尿mALB较实验前减少（P<0.01）；C组小鼠24h尿mALB较实验前后无变化（P>0.05）。2.2各组小鼠之间比较：实验前后M组、T1组及T2组小鼠24h尿mALB均明显高于C组(P<0.01)；实验后T1组、T2组小鼠24h尿mALB明显低于M组小鼠(P<0.01，P=0.01)；T1组小鼠24h尿mALB明显低于T2组小鼠24h尿mALB(P=0.027)。3.血清脂联素3.1各组实验前后比较：实验后M组、T2组小鼠血清ADP水平较实验前明显降低（P<0.01）；实验后T1组小鼠血清ADP水平明显高于实验前（P<0.01）；C组小鼠血清ADP水平无明显变化（P>0.05）。3.2各组小鼠之间比较：实验前后M组、T1组及T2组小鼠血清ADP水平均明显低于C组(P<0.01)；实验前M组、T1组及T2组小鼠血清ADP水平无明显差异（P=0.174、P=0.183、P=0.973）；实验后T1组小鼠血清ADP水平高于M组II 小鼠及T2组小鼠（P=0.003、P=0.005）；实验后M组、T2组血清ADP水平差异无统计学意义（P=0.862）。4.肾脏PPARγmRNA表达水平：M组、T1组、T2组小鼠PPARγmRNA表达水平均低于C组（P<0.01）；T1组小鼠肾脏PPARγmRNA表达水平高于M组小鼠（P=0.026）；T1组小鼠肾脏PPARγmRNA表达水平高于T2组小鼠（P=0.035）；T2组小鼠肾脏PPARγmRNA表达水平与M组小鼠差异无统计学意义（P=0.886）。5.肾脏病理改变5.1肾脏湿重（右肾）：C组小鼠肾脏湿重低于M组小鼠、T2组小鼠肾脏（P<0.01）；M组小鼠肾脏湿重高于T1组小鼠肾脏（P=0.005），与T2组小鼠肾脏湿重无明显差异（P=0.377）。T1组小鼠肾脏湿重低于T2组小鼠肾脏（P=0.04）。5.2肾脏组织病理改变：光镜下C组小鼠肾脏病理结果提示其肾小球、肾小管、内皮细胞及系膜细胞均正常；M组、T2组小鼠肾脏病理提示肾小球细胞数目明显增加、肾小球肥大、体积增大，肾小球基底膜明显增厚；系膜区明显增宽，并可见系膜细胞及基质增生，部分伴有局灶节段性肾小球硬化及间质纤维化。T1组小鼠肾脏病理提示肾小球内皮细胞、系膜细胞基本正常，肾小球硬化程度较M组及T2组小鼠轻。5.3肾小球直径：M组、T2组小鼠肾小球直径明显大于C组、T1组小鼠肾小球直径（P<0.01）；T1组小鼠肾小球直径小于T2组小鼠肾小球直径（P<0.01）；T2组小鼠肾小与M组小鼠肾小球直径无明显差异（P=0.945）。6.肾脏ZO-1表达水平：M组及T2组小鼠肾脏ZO-1表达水平低于C组小鼠肾脏ZO-1表达水平（P<0.01）；T1组小鼠肾脏ZO-1表达水平低于C组小鼠肾脏ZO-1表达水平（P=0.079）；M组及T2组小鼠肾脏ZO-1表达水平低于T1组小鼠肾脏ZO-1表达水平（P<0.01）。7.相关性分析：7.1小鼠24h尿mALB与体质量、右侧肾脏湿重及肾小球直径呈正相（r1=0.853、r2=0.631、r3=0.830；P1<0.01、P2<0.01、P3<0.01），与血清ADP水平、肾脏PPARγmRNA表达水平及肾脏ZO-1表达水平呈负相关（r4=-0.773、r5=-0.469、r6=-0.731；P4<0.01、P5=0.007、P6<0.01）。7.2小鼠血清ADP水平与肾脏PPARγmRNA与ZO-1表达水平呈正相（r7=0.434、r8=0.811；P7=0.013、P8<0.01），与小鼠体质量、右侧肾脏湿重、24h尿mALB及肾小球直径呈负相关（r9=-0.743、r10=-0.523、r4=-0.773、r11=-0.722；P9<0.01、III P10=0.002、P4<0.01、P11<0.01）。7.3小鼠肾脏PPARγmRNA表达水平与血清ADP水平、肾脏ZO-1表达水平呈正相关（r7=0.434、r12=0.386；P7=0.013、P12=0.029），与小鼠体质量、右侧肾脏湿重、24h尿mALB及肾小球直径呈负相关（r13=-0.381、r14=-0.340、r5=-0.469、r15=-0.547；P13=0.034、P14=0.047、P5=0.007、P15=0.001）。7.4小鼠肾脏ZO-1表达水平与血清ADP水平、肾脏PPARγmRNA表达水平呈正相关（r8=0.811、r12=0.386；P8<0.01、P12=0.029），与小鼠体质量、右侧肾脏湿重、24h尿mALB及肾小球直径呈负相关（r16=-0.770、r17=-0.493、r6=-0.731、r18=-0.787；P16<0.01、P17=0.004、P6<0.01、P18<0.01）。实验结论1、肥胖小鼠24h尿mALB排泄量增加、血清ADP水平下降、肾脏PPARγmRNA及肾脏ZO-1表达水平下降；肾脏病理提示肾小球体积增大部分伴有局灶节段硬化。2、替米沙坦及氯沙坦可通过改善肾脏血流动力学及非血流动力学效应减少单纯性肥胖小鼠24h尿mALB排泄量。3、替米沙坦通过其特殊的PPARγ激活作用，提高单纯性肥胖小鼠血清ADP水平、肾小球足细胞ZO-1表达增加并抑制肾小球肥大、减少24h尿mALB排泄，使其较其他ARB类药物于单纯性肥胖小鼠肾脏有更强的保护作用。关键词：替米沙坦肥胖相关性肾病过氧化物酶体增殖物受体γ脂联素尿微量白蛋白紧密连接蛋白-1IV AbstractObjectiveObesityisaglobalexistingseriouspublichealthproblem.Recently,theincidenceofobesityisgreatlyincreasing.Thepredictionshowsthattherewillbefiftyeightpercentpersonswhoareoverweightorobeseintheworldin2030.Theoverweightandobesityincreasetheriskoftheoccurrenceoftype2diabetes,mellitus,hypertension,cardiovasculardiseasesandrenaldiseases.Asearlyas1974,ithadbeenknownthatobesitycouldleadtoproteinuriaanditwasnamedobesity-associatedglomerulopathy(ORG).Afterbeingintervenedunderperoxisomeproliferatoractivatedreceptorgamma(PPARγ)agonistpioglitazone,thelevelofserumadiponcetin(ADP)increasedandtheurinarymicroalbumin(mALB)excretiondecreased.Thestructureoftelmisartanissimilartopioglitazone.TelmisartanisaPPARγagonisttoo.ThisstudyaimedattheinfluenceoftelmisartanasaPPARγagonisteffectonserumADP,urinemALBexcretion,theexpressionofrenalPPARγmRNAandthelevelofzonulaoccludens-1(ZO-1)andthechangesoftherenalpathologyofsimpleobesitymice,anddiscussedthesignificancetothetreatmentoftelmisartanasPPARγagonistforObesity-relatedglomerulopathy.MethodAtotalof248-week-oldmaleob/obmiceand88-week-oldmaleC57micewereselectedforthisstudy.Thegeneticbackgroundofob/obmousewasC57mouse,butthelepingenewasdeletedinob/obmouse.ob/obmicewererandomlydividedinto3groupsbybodyweightandfedwithhigh-fatdietfor12weeks:obesitygroup(Mgroup),telmisartaninterventiongroup(T1group)andlosartaninterventiongroup(T2group).C57miceactedascontrolgroup(Cgroup)andwerefedwithgeneraldietfor12weeks.SerumADPandbloodglucoseweremeasuredbeforeandaftertreatment.24hurinewascollectedtomeasureurinemAlb.Quantitativereal-timepolymerasechainreaction(qRT-PCR)wasusedtomeasuretheexpressionlevelofperoxisomeproliferators-activatedreceptorsgammamRNA(PPARγmRNA).HEstainwasusedtoobservethemorphologicalchangesofkidneyandmeasuretheglomerulardiameter.TheexpressionlevelofkidneyZO-1wasmeasuredwithimmunohistochemicalmethod.Bodyweight,serumadiponectinlevel,,urinemAlblevel,expressionlevelofkidneyPPARγmRNA,kidneywetweight,glomerulardiameterandtheexpressionV levelofkidneyzonulaoccludens-1(ZO-1)of4groupswerecomparedandacorrelationanalysiswascarriedoutbyPersoncorrelationcoefficient.TheSPSS20.0softwarewasusedtoprocessandanalysisdata.P<0.05wasconsideredtohavestatisticalsignificance.Results1.Thegeneralconditionofmice:1.1Thebodyweightandurinemicro-albuminofob/obmicehadbeenincomparisonwithC57BL/6Jmicebeforethetest:Themeanbodyweightof8-week-oldob/obmicewassignificantlyhigherthanC57BL/6Jmice(P<0.01).Moreover,thebodyweightofob/obmicewassignificantlymorethan20%ofC57BL/6J,whichreachedtheobesestandard.theurinemicroalbuminofob/obmicewassignificantlyhigherthanC57BL/6Jmice(P<0.01).Thelevelofserumglucoseofallthemicedidn’tmeetthestandardsofdiabetesalthoughthedifferenceofglucosewassignificantlybetweentwokindsofmice,thenwecanmakesurethattheapparentmALBofob/obmicewascausedbyobesebutnotdiabetes.1.2Thebodyweightofeverygroupmicebeforeandafterthetest:thebodyweightofM,T1andT2groupwasmorethanCgroupbeforethetest(P<0.01);T1grouplowerthanMandT2group(P<0.01).TherewasnodifferenceinthebodyweightofMandT2group(P>0.05).2.Urinemicro-albuminof24mice:2.1Thecomparisonamongfourgroups:Thelevelof24hurinemALBofMgroupwashigherthanbefore(P<0.01);Thelevelof24hurinemALBofT1andT2grouplessthanbefore(P<0.01);Thelevelof24hurinemALBofCgroupunchanged(P>0.05).2.2Thecomparisonamongfourgroups:Thelevelof24hurinemALBofM,T1andT2groupwassignificantlyhigherthanCgroupbeforeandafterthetest(P<0.01);ThelevelofurinemALBofT1andT2grouplowerthanMgroup(P<0.01,P=0.01).AndthelevelofurinemALBofT1grouplowerthanT2groupafterthetest(P=0.027).3.Theserumadiponectin3.1Thecomparisonamongfourgroupsbeforeandafterthetest:ThelevelofserumVI adiponectinofMandT2groupafterthetestwassignificantlylowerthanbefore(P<0.01);ThelevelofserumadiponectinofT2grouphigher(P<0.01);ThelevelofserumadiponectinofCgroupunchanged(P>0.05).3.2Thecomparisonamongfourgroups:ThelevelofserumadiponectinofM,T1andT2groupwassignificantlylowerthanCgroupbeforeandafterthetest(P<0.01);ThelevelofserumadiponectinofM,T1andT2groupwasnotsignificantlydifferentbeforethetest(P=0.174,P=0.183,P=0.973);ThelevelofserumadiponectinofT1grouphigherthanMandT2groupafterthetest(P=0.003,P=0.005).TherewasnostatisticalsignificantdifferencebetweenthelevelofserumadiponcetinofMandT2groupafterthetest(P=0.862).4.TheexpressionlevelofkidneyPPARγmRNA:TheexpressionlevelofkidneyPPARγmRNAofCgroupwashigherthanM,T1andT2group(P<0.01).TheexpressionlevelofkidneyPPARγmRNAofT1groupwashigherthanMgroup(P=0.026),TheexpressionlevelofkidneyPPARγmRNAofT1grouphigherthanT2group(P=0.035)andtherewasnostatisticalsignificantdifferencebetweenT2andMgroup(P=0.886).5.Changesofkidneypathology:5.1Therenalwetweight(rightkidney):ThekidneywetweightofCgroupwaslessthanMandT2group(P<0.01);ThekidneywetweightofMgrouphigherthanT1(P=0.005)andnosignificantdifferencewithT2group(P=0.377).ThekidneywetweightofT1grouplowerthanT2group(P=0.04).5.2Changesofkidneytissuepathology:Theglomerulus,Kidneytubule,endothelialcellandglomerularmesangialcellsofCandT1groupwerenormal.ThechangesincludeBowman'scapsulewidened,glomerularbasementmembranethickening,mesangialcellsandmesangialmatrixproliferation,glomerularvolumeincreased,someaccompaniedbyfocalsegmentalglomerulosclerosis,tubularatrophyandmildinterstitialfibrosiscouldbefoundinMandT2group.5.3Diameterofglomerular:ThediameterofglomerularofMandT2groupwasbiggerthanCandT1group(P<0.01).ThediameterofglomerularofT2groupwasbiggerthanT1group(P<0.01)andnotsignificantdifferentwithMgroup(P=0.945).6.TheexpressionlevelofZO-1ofkidneytissue:ZO-1wasmainlyexpressedintheVII cytoplasm.TheexpressionlevelofZO-1ofkidneytissueinMandT2groupwaslowerthanCgroup(P<0.01);TheexpressionlevelofZO-1ofkidneytissueofT1grouplowerthanCgroup(P=0.079);TheexpressionlevelofZO-1ofrenaltissueofMandT2grouplowerthanT1group(P<0.01).7.Correlationanalysis:7.1Therewaspositivecorrelationof24hurinemicro-albuminwithbodyweight,rightrenalwetweightandthediameterofglomerular(r1=0.853,r2=0.631,r3=0.830;P1<0.01,P2<0.01,P3<0.01)andanegativecorrelationwiththeserumADP,theexpressionlevelofkidneyPPARγmRNAandtheexpressionlevelofkidneyZO-1(r4=-0.773,r5=-0.469,r6=-0.731;P4<0.01,P5=0.007,P6<0.01).7.2TherewaspositivecorrelationoftheserumADPwiththeexpressionlevelofkidneyPPARγmRNAandtheexpressionlevelofkidneyZO-1(r7=0.434,r8=0.811;P7=0.013,P8<0.01)andanegativecorrelationwithbodyweight,rightrenalwetweight,urinemicro-albuminanddiameterofglomerular(r9=-0.743,r10=-0.523,r4=-0.773,r11=-0.722;P9<0.01,P10=0.002,P4<0.01,P11<0.01).7.3TherewaspositivecorrelationofkidneyPPARγmRNAwiththeexpressionleveloftheserumADPandZO-1(r7=0.434,r12=0.386;P7=0.013,P12=0.029)andnegativecorrelationwiththebodyweight,rightrenalwetweight,urinemicro-albuminanddiameterofglomeruli(r13=-0.381,r14=-0.340,r5=-0.469,r15=-0.547;P13=0.034,P14=0.047,P5=0.007,P15=0.001).7.4TherewaspositivecorrelationoftheexpressionlevelofkidneyZO-1withtheserumADP,theexpressionlevelofkidneyPPARγmRNA(r8=0.811,r12=0.386;P8<0.01,P12=0.029)andanegativecorrelationwithbodyweight,rightrenalwetweight,urinemicro-albuminanddiameterofglomeruli(r16=-0.770,r17=-0.493,r6=-0.731,r18=-0.787;P16<0.01,P17=0.004,P6<0.01,P18<0.01).Conclusion1.ThelevelofserumADPofobesemicedecreased,theurinemALBofthemincreased.Renalpathologyshowedglomerularhypertrophy,inpartassociatedwithfocalsegmentalglomerulosclerosis,theexpressionofZO-1inpodocytereduced.VIII 2.TheARBcandecreasedtheurinemALBexcretioninobesemicebyimprovingrenalhemodynamicsandnon-hemodynamics.3.Telmisartancomparedwithlosartanhadastrongerreducingurinemicro-albuminofobesitymice,whichmaybecorrelationwiththeeffectoftelmisartanactingthePPARγandpromotethelevelofserumADPandtheexpressionofZO-1inpodocyteandinhibittheglomerularhypertrophy.KeywordsTelmisartanObesity-relatedglomerulopathyperoxisomeproliferatoractivatedreceptorgammaSerumadiponectinUrinemicro-albuminzonulaoccludens-1IX 目录中文摘要…………………………………………………………………………….ⅠAbstract……………………………………………………………………………..Ⅴ缩略语/符号说明..…………………………………………………………………Ⅺ前言…………………………………………………………………………………..1研究现状、成果…………………………………………………………………..1研究目的、方法…………………………………………………………………..2对象和方法..…………………………………………………………………...........3结果…………………………………………………………………………………16讨论…………………………………………………………………………………29结论…………………………………………………………………………………34参考文献……………………………………………………………………………35发表论文和参加科研情况说明……………………………………………………40综述…………………………………………………………………………………41ARB在慢性肾脏病中应用……………………………………………………41综述参考文献……………………………………………………………………47致谢…………………………………………………………………………………51个人简历……………………………………………………………………………52X 缩略语/符号说明缩写英文名称中文名称ACEIangiotensincovertingenzymeinhibitor血管紧张素转换酶抑制剂ACEangiotensinenzyme血管紧张素转换酶ADPadiponectin脂联素AdipoRadiponectinrecepter1脂联素受体11AdipoRadiponectinrecepter2脂联素受体22，，AMPK5-AMP-activatedproteinkinase5-AMP激活性蛋白激酶AngⅠangiotensinⅠ血管紧张素ⅠAngⅡangiotensinⅡ血管紧张素ⅡARBangiotensinⅡreceptorblocker血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂BMIbodymassindex体质指数CKDchronickidneydisease慢性肾脏病CRPC-reactiveproteinC反应蛋白CVDcardiovasculardiease心血管疾病ECMextracellularmatrix细胞外基质ESRDendstagerenaldiease终末期肾病FSGSfocalandsegmentalglomerulosclerosis局灶节段性肾小球硬化症GBMglomerularbasementmembrane肾小球基底膜GFRglomerularfiltrationrate肾小球率过滤Hcyhomocysteinaemia同型半胱氨酸IFN-γinterferongamma-γ干扰素γIL-1interleukin-1白细胞介素-1KDIGOkidneydiease:improvingglobal改善全球肾脏病预后组织outcomesm-ALBmicroalbumin微量白蛋白MCP-1monocytechemotacticprotein-1单核细胞趋化因子-1NADPHnicotinamideadeninedinucleotide还原型辅酶XI phosphateNSAIDsnonsteroidalantiinflammatorydrugs非甾体抗炎药NOXNADPHoxidaseNADPH氧化酶蛋白家族OBobesity肥胖OB-FSGobesity-associatedfocalandsegmental肥胖相关性局灶节段性肾Sglomerulosclerosis小球硬化症OB-GMobesity-associatedglomerulomegaly肥胖相关性肾小球肥大症ORGobesity-associatedglomerulopathy肥胖相关性肾病PPARγperoxisomeproliferatoractivated过氧化物酶体增殖物活化receptorgamma受体γqRT-PCquantitativereal-timepolymerasechain实时荧光定量PCRRreactionRAASreninangiotensinaldosteronesystem肾素-血管紧张素-醛固酮系统SDslitdiaphragm裂孔隔膜TLR4tolllikereceptor4Toll样受体4TNF-αtunlornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子αTNF-β1tunlornecrosisfactor-β1肿瘤坏死因子β1WT-1wilmstumor1足细胞特异性标志蛋白ZO-1zonulaoccludens-1紧密连接蛋白-1XII 前言研究现状、成果肥胖目前是全球共存的一个严重的公共卫生问题。近年来肥胖的发病率大[1]幅度增长，预测2030年全球人口将有58%为超重或是肥胖。超重及肥胖可增[2]加2型糖尿病、高血压、心血管疾病及肾脏疾病发生的风险。1974年Weisinger[3]等提出肥胖可导致蛋白尿产生，即ORG。目前ORG的发病机制尚未完全明确，现认为ORG发生的机制包括有：脂肪因子及炎性因子分泌异常、高胰岛素血症及胰岛素抵抗、血脂水平异常、氧化应激作用、肾脏血流动力学异常及肾素-血[4]管紧张素-醛固酮系统（reninangiotensinaldosteronesystem，RAAS）亢进等。脂肪组织有内分泌功能，其分泌的具有生物活性激素的总称为脂肪因子，包括[5]有ADP、瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子等。肥胖及超重时脂肪组织体积增大，脂肪组织分泌的各种细胞因子异常，通常表现为ADP减少，瘦素、肿瘤坏死因子等增多。ADP是由脂肪细胞生成并分泌的存在于血浆中的一种蛋白质，有增[6,7][8]加胰岛素敏感性、改善胰岛素抵抗、抗炎及抑制氧化应激等生物效应。研究证实，肥胖导致尿mALB排泄增多与血清ADP下降有关，给予PPARγ激动剂吡格列酮干预后，血清ADP水平升高，肾脏组织ZO-1表达增多，尿mALB[9]排泄减少。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（angiotensinⅡreceptorblocker，ARB）可通过改善肾脏血流动力学异常及非血流动力学效应发挥肾脏保护作用，减少尿蛋白排泄。其血流动力学效应通过对肾小球血流动力学的特殊调节作用，降低肾小球内高压力、高灌注、高滤过从而减少尿蛋白排泄；其非血流动力学效应则主要表现为抗氧化、减轻肾小球基底膜损害、保护肾小球滤过屏障及减少系膜基质沉积等，减少尿蛋白排泄量，延缓肾小球硬化进展。研究证实替米沙坦通过激活PPARγ提高血清ADP水平。心梗大鼠经替米沙坦治疗后，心肌细胞PPARγmRNA及蛋白表达增加，心梗后的心脏衰竭发生率明显下降，证实替米沙[10]坦的激活PPARγ作用，且为于转录及蛋白修饰水平发挥激活作用。替米沙坦因其独特的PPARγ激活作用由此我们认为替米沙坦较其他ARB对肥胖患者肾脏可能有更强的保护作用，但目前基于替米沙坦的PPARγ激活作用于ORG的治疗缺乏相关的基础研究。1 研究目的、方法本研究以替米沙坦独特的的PPARγ激动剂样作用，肥胖小鼠血清ADP的变化水平及ADP对肾脏保护作用为理论基础，探讨替米沙坦与其他ARB类药物相比，是否可以通过提高血清ADP水平、减少尿mALB排泄而有更强的肾脏保护的作用。实验采用8周龄雄性ob/ob小鼠24只和其同系同周龄C57BL/6J小鼠8只，适应性饲养1周，测量小鼠体质量，ob/ob小鼠按体质量分层随机分为三组：肥胖组（M组，n=8）、替米沙坦治疗组（T1组，n=8）、氯沙坦治疗组（T2组，n=8）；-1-1C57BL/6J小鼠为对照组（C组，n=8）。T1组给予替米沙坦5mg·kg·d灌胃，-1-1T2组给予氯沙坦5mg·kg·d灌胃，C组、M组小鼠予以等量蒸馏水灌胃。每周一早上8:00测定小鼠体质量一次，根据小鼠体质量调整给药剂量，上述步骤连续12周。于实验前后分别采集各组小鼠血液及24h尿液标本分别测定血糖、血清ADP及24h尿mALB。实验结束12周末处死小鼠，摘取小鼠两侧肾脏并称重。一侧肾脏置于无菌冻存管于液氮中保存，q-PCR测定肾脏PPARγmRNA表达水平；另侧肾脏10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后于光镜下观察肾脏组织病理改变；取10个正切的肾小球切面，测量肾小球直径并取平均值；免疫组化方法检测肾脏ZO-1表达水平。比较四组小鼠体质量、血清ADP水平、24h尿mALB、肾脏PPARγmRNA表达水平、肾脏湿重、肾小球直径及肾脏ZO-1表达水平的差异，并将血清ADP水平、24h尿mALB、肾脏PPARγmRNA、肾脏ZO-1与其他指标行相关性分析。使用SPSS20.0软件行数据处理及分析，P<0.05为有统计学意义。2 对象和方法1对象1.1实验动物24只8周龄健康雄性ob/ob小鼠及8只同周龄C57BL/6J小鼠，其中ob/ob小鼠为瘦素自发突变小鼠，其背景品系为C57BL/6J小鼠。实验前ob/ob小鼠平均体质量为30-37g，C57BL/6J小鼠平均体质量为13-18g，上述实验动物均于北京华阜康生物科技股份有限公司购入，许可证号：SCXK（京）2009-0008。上述实验动物于中科院生物医学工程研究所动物实验室屏障环境单笼饲养，实验期间室内温度20-24℃，相对湿度45-50％，12/12h光照黑暗循环（光照时间07:00am-07:00pm）。ob/ob小鼠高脂饲料喂养，饲料于北京华阜康生物科技股份有限公司购入；C57BL/6J小鼠普通饲料，饲料于北京华阜康生物科技股份有限公司购入。实验期间实验动物为自由摄取水分及饲料。1.2主要实验仪器1)光学显微镜：日本奥林巴斯公司2)多功能彩色细胞图像分析管理系统：美国Cybernetics影视公司Image-ProPlus3)CMOS：日本奥林巴斯公司4)石蜡切片机：德国莱卡5)电子天平PL203：瑞士METAE105型6)血糖仪：美国强生公司oneTouchⅡ型7)TDL-16-C飞鸽台式低速细胞离心机（上海安亭科学仪器厂）8)微量移液器：德国EPPENDORF9)4℃/-20℃冰箱（中国三星电子集团）10)医用干燥箱：日本三洋公司11)恒温水浴箱：江苏太仓医学用仪器厂302型12)医学用微波炉：浙江临爱迪仪器厂882B型13)紫外分光光度计：日本岛岛津公司14)核酸定量分析仪（英国Eppendorf公司）3 15)电泳仪及电泳槽DYY-10C（北京市六三仪器厂）16)-70℃低温冰箱（THERMOELETRON公司）17)凝胶成像系统（法国VILBERLOURMAT公司）18)台式高速冷冻离心机（英国Eppendorf公司）19)PCR扩增仪（英国Eppendorf公司）20)超净工作台（HealForceDevelopment）21)全自动快速立式洗板机（天津安亭科学仪器厂）1.3主要实验试剂及试剂盒微量血糖试纸（美国强生公司）小鼠尿蛋白（UP）酶联免疫分析试剂盒（天津易生源生物技术有限公司）小鼠ADP酶联免疫检测试剂盒（天津易生源生物技术有限公司）ZO-1-抗第二抗体试剂SP-9001试剂盒DBA显色试剂HPTotalRNAKit(50)R6812-01（上海研拓生物科技有限公司）RevertAidFirstStandcDNASynthesisKit#k1622（上海研拓生物科技有限公司）FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)（上海研拓生物科技有限公司）替米沙坦（德国勃林格殷格翰）氯沙坦（杭州默沙东制药）1.4干预药物制备分别取替米沙坦、氯沙坦40mg、50mg碾碎并溶于50ml蒸馏水中，制成浓度分别为0.8mg/ml及1.0mg/ml的溶液，于4℃冰箱中保存备用。2方法2.1实验动物饲养分组ob/ob小鼠高脂饲料喂养，适应性喂养一周后测量ob/ob小鼠体质量，按照体质量分层随机分为三组：肥胖组（M组，n=8）、替米沙坦治疗组（T1组，n=8）、氯沙坦治疗组（T2组，n=8）；C57BL/6J小鼠普通饲料喂养，并设置为对照组（C组，n=8）。4 2.2实验动物给药-1-1四组小鼠每天早上8:00给药。T1组小鼠给予替米沙坦5mg·kg·d灌胃，T2-1-1组小鼠给予氯沙坦5mg·kg·d灌胃，C组、M组小鼠予以等量蒸馏水灌胃。每周一早上8:00测定四组小鼠体质量，根据小鼠体质量调整给药剂量，上述步骤连续12周。2.3实验观察指标体质量：每周一早上8:00使用微量电子体重仪称量四组小鼠体质量并记录。24h尿mALB：实验前后分别将四组小鼠置于小鼠代谢笼中留取24h尿量，记录尿量，取5ml尿液低速离心1分钟后取上清尿液于-20℃保存，待成批测定小鼠24h尿mALB。血糖：四组小鼠实验前后分别禁食水1夜，第二天剪尾取血，血糖仪测定各组小鼠血糖。血清ADP：实验前后四组小鼠内眦取血0.5ml，低速离心10分钟后取上清液-20℃保存，待成批测定小鼠血清ADP。2.4取材实验12周末，四组小鼠禁食水12小时，称重后断头处死小鼠，摘除双侧肾脏并称重，一侧肾脏置于无菌冻存管中用于肾脏组织PPARγmRNA测定，另侧肾脏10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，光镜下HE染色观察肾脏病变情况、测量肾小球直径及免疫组化染色。2.5小鼠尿微量白蛋白及血清脂联素测定方法2.5.1小鼠尿微量白蛋白酶联免疫分析1）标准品的稀释：于酶标包被板上设置5个标准孔并编号：5号标准孔内依次加入150μl的原倍标准品及同体积标准品稀释液，充分混匀；4号标准孔内分别依次150μl的5号标准孔内混合液体及同体积标准品稀释液，充分混匀；3号标准孔内依次加入150μl的4号标准孔内混合液体及同体积标准品稀释液，充分混匀；2号标准孔内依次加入150μl的3号标准孔内混合液体及同体积标准品稀释液，充分混匀；1号标准孔内依次加入150μl的2号标准孔内混合液体及同体积标准品稀释液，充分混匀；稀释后1-5号标准孔内浓度分别为：5μg/l、10μg/l、5 20μg/l、40μg/l、80μg/l。具体操作参考下表：浓度名称方法80μg/l5号标准品150μl的原倍标准品与同体积标准品稀释液混合液40μg/l4号标准品150μl的5号标准品与同体积标准品稀释液混合液20μg/l3号标准品150μl的4号标准品与同体积标准品稀释液混合液10μg/l2号标准品150μl的3号标准品与同体积标准品稀释液混合液5μg/l1号标准品150μl的2号标准品与同体积标准品稀释液混合液2）加样：于酶标包被板上分别设立空白对照孔（空白对照孔内除不加样品及酶标试剂外，余下各步骤与以下各孔均相同）、标准孔、待测样品孔。标准孔内加样50μl；待测样品孔依次加入40μl样品稀释液及10μl待测样品（最终样品稀释倍数为5倍）。加样过程中应确保将样品均加于酶标板板孔底部，未触及孔壁，加样完毕后轻晃酶标包被板使其混匀。3）温浴：封板膜封酶标包被板后于37℃温浴30分钟。4）配液：30倍浓缩洗涤液经蒸馏水稀释30倍后备用。5）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去各孔内液体，甩干酶标包被板，后于各孔内加满洗涤液，静置30秒后弃去洗涤液，重复上述步骤5次，拍干酶标包被板。6）加酶：除空白对照孔外各孔均加入酶标试剂50μl。7）温浴：同步骤38）洗涤：同步骤5.9）显色：空白对照孔、标准孔及待测样品孔内依次加入50μl显色剂A及50μl显色剂B，轻轻震荡酶标包被板使液体充分混匀，37℃避光显色10分钟。10)终止：空白对照孔、标准孔及待测样品孔内加终止液50μl，停止反应（此时各孔内混合液体应由蓝色立马转为黄色）。11）测定：以空白对照孔调零，450nm波长下依次序测量各孔的吸光度（OD值）。12）计算：以标准物的浓度与其OD值计算出浓度标准曲线的直线回归方程式，将各孔内样品的OD值代入方程式，计算出各孔内待测样品浓度，最后再乘以稀释倍数（*5），即为各孔内待测样品的实际浓度。2.5.2小鼠血清脂联素酶联免疫分析1）标准品的稀释：于酶标包被板上分别设5个标准孔并编号：5号标准孔内依次加入120μl的原倍标准品及同体积标准品稀释液，充分混匀；4号标准孔内依6 次加入120μl的5号标准孔内混合液体及同体积标准品稀释液，充分混匀；3号标准孔内依次加入120μl的4号标准孔内混合液体及同体积标准品稀释液，充分混匀；2号标准孔内依次加入120μl的3号标准孔内混合液体及同体积标准品稀释液，充分混匀；1号标准孔内依次加入120μl的2号标准孔内混合液体及同体积标准品稀释液，充分混匀；稀释后1-5标准孔内浓度分别为：12.5μg/l、25μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l。具体操作参考下表：浓度名称方法200ug/l5号标准品120μl的原倍标准品与同体积的标准品稀释液混合液100ug/l4号标准品120μl的5号标准品与同体积的标准品稀释液混合液50ug/l3号标准品120μl的4号标准品与同体积的标准品稀释液混合液25ug/l2号标准品120μl的3号标准品与同体积的标准品稀释液混合液12.5ug/l1号标准品120μl的2号标准品与同体积的标准品稀释液混合液2）加样：于酶标包被板上分别设立空白对照孔（空白对照孔内除不加样品及酶标试剂外，余下各步骤与以下各孔均相同）、标准孔、待测样品孔。标准品孔内加入50μl的标准品及链霉素-HRP；待测样品孔内依次加入40μl的待测样品、10μl抗ADP抗体及50μl链酶亲和素-HRP。加样过程中应确保将样品均加于酶标板板孔底部，未触及孔壁，加样完毕后轻晃酶标包被板使其混匀，37℃温育1小时。3)配液：30倍浓缩洗涤液经蒸馏水30倍稀释后备用。4)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去各孔内液体，甩干酶标包被板，后于各孔内加满洗涤液，静置30秒后弃去洗涤液，重复上述步骤5次，拍干酶标包被板。5)显色：空白对照孔、标准孔及待测样品孔内依次加入50μl显色剂A及50μl显色剂B，轻轻震荡酶标包被板使液体充分混匀，37℃避光显色10分钟。6）终止：空白对照孔、标准孔及待测样品孔内加终止液50μl，停止反应（此时各孔内混合液体应由蓝色立马转为黄色）。7 7)测定：以空白对照孔调零，450nm波长下依次序测量各孔的吸光度（OD值）。8)计算：以标准物的浓度与其OD值计算出浓度标准曲线的直线回归方程式，将各孔内样品的OD值代入方程式，计算出各孔内待测样品浓度，即为各孔内待测样品的实际浓度。2.6小鼠肾脏PPARγmRNA测定方法2.6.1RNA的提取1）该试剂盒提示500ul的裂解缓冲液约可裂解约≤30mg组织；注意裂解缓冲液使用前每1ml裂解缓冲液中加入20ul的2-羟基乙醇，充分混匀。取约30mg组织于研磨试管中，加入500ul的裂解缓冲液充分研磨，直至液体均匀无组织块状残留。2）将上述混合液体转移至1.5m离心管中，常温下14,000*g离心5min。3）离心后将上清液转移至gDNA柱中，常温下14,000*g离心2min。离心后将收集到的流出液转移至一个新的离心管中。4）于裂解产物中加入50％体积（250ul－350ul）的无水乙醇（96％－100％）充分混匀，漩涡振荡20s。5）样品转移到RNA柱上，常温下10,000*g离心30-60s。弃去流出液。6）将RNA柱子置于一个新的2ml收集管中，后加入300ulRNAwashbufferI，常温下10,000*g离心30-60s，弃去流出液。7）将RNA柱子置于一个新的2ml收集管中，后加入400ulRNAwashbufferI,常温下10,000*g离心30-60s，弃去流出液。8）将RNA柱子置于一新的2ml收集管中，后加入500ulRNAwashbufferII（以经乙醇稀释过），室温10,000*g,离心30s，弃去流出液。注意：RNAwashbufferII使用前必须要用无水乙醇稀释，加入48ml96-100%的无水乙醇充分混匀。9）于RNA柱子内加入500ulRNAwashbufferII洗涤，室温10,000*g离心30s，弃去流出液。将RNA柱子置于新收集管中，室温下≥13,000*g离心2min，使其完全干燥。10）转移RNA柱子于一个新的1.5ml的离心管中，RNA柱子中加入50－100ul的无酶水洗脱，室温下13,000*g离心1min。11）用核酸定量仪测OD260/280和OD260/230值及RNA样品浓度，-70℃冰箱内保存用于逆转录；8 2.6.2总RNA浓度及完整性的检测1）取3μlRNA溶液、30μl无酶水于离心管中，充分混匀，使用核酸-蛋白检测仪测定待测RNA的OD260/280。OD260/280为RNA的纯度，以1.7-2.0为宜。2）制备0.8%的琼脂糖凝胶：取50mlTAE于漏斗烧杯中，加入1g的2%的DNA胶，充分混匀，置于微波炉里加热至沸腾（每半分钟观察烧杯内混合液情况）。混合液沸腾后室温下放置，待混合液温度降至60-70℃后于混合液中加入3μlEB，充分混匀。将上述混合液于电泳槽一侧缓缓倒入（避免出现气泡），后插入梳子，20-30分钟后，待凝胶凝固，取出凝胶。3）取1μlRNA浓液、2.5μl6×loading缓冲液、11.5μl去RNA酶水充分混合，混合液加入加样槽中，开始电泳。电泳结束后凝胶成像系统观察电泳结果。若总RNA样品完整则会出现5S、18S、28S三条条带，其中5S条带隐约可见，而28S条带最明显且其亮度为18S条带的两倍。若18S、28S条带亮度对调，说明总RNA样品有降解；若不显示清晰条带，说明RNA严重降解。2.6.3引物：根据GenBank公布的小鼠PPARγ基因和β-action基因序列设计引物，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。目标基因及引物的基因序列名称引物序列产物长度PPARγ上游5’-GATGGAAGACCACTCGCATT-3’20下游5’-AACCATTGGGTCAGCTCTTG-3’20β-action上游5’-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’21下游5’-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3’232.6.4q-PCR反应（1）逆转录（RT）使用上海研拓生物科技的RevertAidFirstStandcDNASynthesisKit#k1622试剂盒，以肾脏组织中提取的总RNA为模板进行逆转录，具体步骤如下：1）总RNA于冰上解冻，将oligo(dT)18primer,water,nuclease-free,5×ReactionBuffer,RibolockRnaseInhibitor,10mMdNTPMix,RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase等试剂于室温下解冻，解冻后置于冰上。取1.5mL离心管分别加入以下试剂，该步骤于冰上进行：9 试剂使用量oligo(dT)18primer1μlwater,nuclease-freeto12μlTotalvolume12μl2）将上述混合液充分混匀，65℃条件下变形5分钟。3）向上述混合液中加入以下试剂（冰上操作）：试剂使用量5×ReactionBuffer4μlRibolockRnaseInhibitor1μl10mMdNTPMix2μlRevertAidM-MuLVReverse1μlTranscriptaseTotalvolume20μl4）上述混合液充分混匀后，于42℃孵育60分钟。5）上述混合液于70℃孵育5分钟后置于冰上，得到混合液即为cDNA，-20℃保存。（2）退火温度的确定普通PCR机用于确定最佳退火温度，设置50℃-62℃温度梯度，反应取10μl体系；具体反应体系见下表：试剂使用量water,nuclease-free3.8μl上游引物0.1μl下游引物0.1lSYB5μlcDNA模板1μl10 PCR反应条件见下表：步骤温度时间循环数预变性94℃3min1变形94℃30s退火50-62℃30s｝40延伸72℃1min后延伸72℃5min1制备制备0.8%的琼脂糖凝胶，PCR完成后的混合液于电泳仪上开始电泳。电泳完毕后使用凝胶成像系统观察电泳结果。最亮条带对应的温度即为最佳退火温度。（3）qRT-PCR反应使用上海研拓生物科技的FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)试剂盒，以上述逆转录合成cDNA为模板进行qRT-PCR检测PPARγmRNA的表达，以β-action基因作为内参。使用FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)试剂盒，将上述逆转录得到的cDNA为模板扩增，反应体系为10μl。反应体系见表：试剂使用量water,nuclease-free3.8μl上游引物0.1μl下游引物0.1μlSYB5μlcDNA模板1μlqRT-PCR反应条件见表：步骤温度时间循环数预变性94℃3min1变形94℃30s退火57℃30s｝40延伸72℃1min后延伸72℃5min111 2.7肾脏HE染色及免疫组化染色方法2.7.1小鼠肾脏病理切片的制备1）取材：四组实验小鼠肾脏组织尽可能新鲜，经磷酸盐缓冲液冲洗后取小于0.5cm×0.5cm×0.1cm组织块用于制片。2）固定和包埋：上述肾脏组织经10%多聚甲醛固定。固定后依次经70%及80%乙醇30分钟1次；90%、95%及100%乙醇30分钟两次；二甲苯透明30分钟两次；55℃石蜡中30分钟两次，最后使用铜制模具包埋组织块。3）切片：将厚度3um的肾脏组织切片置于经多聚赖氨酸附膜后的载玻片上，60℃烘烤过夜；2.7.2小鼠肾脏组织HE染色1)脱蜡、入水：将肾脏组织切片浸于二甲苯中15分钟两次；100%、95%及80%乙醇5分钟两次；后经自来水充分冲洗5分钟，最后蒸馏水浸一下。2)于苏木紫中充分浸泡组织切片5分钟。3)经自来水充分冲洗组织切片5分钟直至水清澈为止。4)将组织切片置于盐酸酒精中充分分色5秒钟。5)经自来水充分冲洗组织切片10分钟直至水清澈为止。6)将组织切片经淡氨水充分洗5秒，以确保胞核充分蓝化。7)将组织切片经自来水充分冲洗10分钟，后再经蒸馏水浸一下。8)将组织切片于伊红染液中充分染色30秒。9)将组织切片经自来水充分冲洗，后再经蒸馏水浸一下。10)将组织切片依次经80%、95%、100%乙醇及二甲苯各5分钟两次，后脱水透明，最后经中性树胶封片。2.7.3小鼠肾脏组织免疫组化染色1）脱蜡、入水：将组织切片依次浸于二甲苯、100%、95%、90%、85%及75%乙醇中，均为5分钟两次，最后经自来水及PBS充分冲洗两次。2）室温下将组织切片置于1%甲醇双氧水中充分浸泡10分钟,后组织切片经蒸馏水充分洗1次，再经0.1MPBS5分钟内充分洗3次。3）将组织切片置于0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）中，后置于微波炉内低温加热10分钟；待混合液降至室温后，组织切片经0.1MPBS5分钟内充分洗3次。4）将正常山羊血清封闭液加样至组织切片上，室温下充分反应20分钟。反应完毕后甩去多余液体，组织切片不给予清洗。5）将第一抗体加样置组织切片上，4℃充分反应12小时，反应完毕后经0.1MPBS512 分钟内充分洗3次。6）将生物素化第二抗体（IgG）加样置组织切片上，37℃充分反应20分钟，反应完毕后经0.1MPBS5分钟内充分洗3次。7）组织切片上加样辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃反应20分钟，反应完毕后经0.1MPBS5分钟内充分洗3次。8）DAB显色：1ml蒸馏水内依次分别加显色剂A、B、C各一滴，充分混匀，后将上述混合液加至组织切片上，充分显色6分钟后经自来水充分水洗。9）组织切片经苏木素充分复染细胞核1分钟，复染完毕后经自来水充分水洗，后依次经1%盐酸酒精分化、1%胺水反蓝，再次经自来水充分水洗，再依次经70%及80%乙醇5分钟，90%、95%、100%乙醇及二甲苯透明5分钟两次，脱水后经中性树脂封片。10）显微镜观察：选择四组的阳性和阴性组织切片、进行100×和400×的显微照相。11）图象分析：选择有实验结果意义的组织切片相，登录系统、编号组织相、采集图片、分析及读取数据、存盘。2.7.4小鼠肾脏组织HE染色及免疫组化染色结果的判定1）光镜下观察各组小鼠肾脏组织HE染色切片形态变化，后取10个包含肾小球血管极、尿极的最大切面的肾小球切面，测量上述10个肾小球的直径并取其平均值。2）肾脏ZO-1表达水平结果的判定：小鼠肾脏组织经免疫组化染色后于光镜下观察ZO-1的表达部位。其相关分析软件行半定量评分：于×400高倍镜视野下，于每张切片中随机选取10个肾小球，其中染色为棕褐色的为阳性。肾脏组织内ZO-1的表达水平以阳性染色面积（a）评分与阳性染色强度（b）评分的乘积表示。阳性染色面积（a）的具体分级为：<1%=0、1～10%=1、11～50%=2、51～80%=3、81～100%=4；阳性染色强度（b）的具体分级：0（阴性）、1（弱阳性）、2（阳性）、3（强阳性）。于每张切片中随机选取的10个肾小球的a、b均值为该张切片的a、b值，每张切片的a、b相乘即为最后积分。2.8质量控制1）各组小鼠所处实验条件基本保持一致，且各实验观察指标均为同批留取及检测。13 2）实验设置对照组；免疫组化中对照组使用PBS作为一抗，以减少假阳性。四组切片所处实验条件基本一致。3）实验切片读取条件一致，机器随机挑选观察视野，尽量减少人为误差。2.9统计学方法应用SPSS20.0统计软件行相关数据处理及分析。实验数据以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析：Levene法先进行方差齐性检验，若方差齐，采用LSD法比较差异；若方差不齐，采用Games-Howell法比较差异。两组间比较采用两独立样本t检验。相关性分析采用Pearson法。P<0.05为差异有统计学意义。14 3实验方法流程图8周龄ob/ob小鼠24只及C57BL/6J小鼠8只，适应性喂养1周小鼠称重并记录，ob/ob小鼠按体质量分层随机分为三组，C57BL/6J小鼠为对照组尾静脉采血测定小鼠血糖；经内眦静脉采血0.5ml，离心后取上清液冻存待测血清ADP各组分别给予药物及蒸馏水灌胃，连续12周12周末，各组小鼠内眦取血及留取24h尿液，标本冻存待测处死小鼠摘除两侧肾脏，侧重后一侧肾脏置于甲醛中，另一侧肾脏置于无菌冻存管中血标本测定ADP，尿液标本观察肾脏病理变化，q-PCR测测定24h尿mALB定肾脏PPARγmRNA表达，免疫组化测定肾脏ZO-1表达整理数据行统计学分析15 结果1小鼠一般情况1.1实验前各组小鼠体质量及血糖情况：实验前8周龄的ob/ob小鼠平均体质量明显高于同周龄的C57BL/6J小鼠（P<0.01），且ob/ob小鼠平均体质量明显超过C57BL/6J小鼠平均体质量的20%，ob/ob小鼠达到小鼠肥胖标准。ob/ob小鼠及C57BL/6J小鼠血糖水平存在差异（P<0.01），但实验前后各组小鼠血糖均<16.7mmol/L，未达小鼠糖尿病诊断，故排除糖尿病所致的尿mALB增多，明确肥胖小鼠尿mALB由肥胖所致。1.2各组小鼠实验前后体质量比较：实验前M组、T1组及T2组小鼠体质量均高于C组小鼠体质量（P<0.01），M组、T1组及T2组小鼠体质量无明显差异（P>0.05）。实验后M组、T1组及T2组小鼠体质量均明显高于C组小鼠体质量（P<0.01）；T1组小鼠体质量低于M组及T2组小鼠体质量（P<0.01）。M组及T2组间小鼠体质量无差异（P>0.05）。表1：各组小鼠体质量及血糖比较（x±s）组别体质量（g）血糖（mmol/L）实验前实验后实验前实验后C组16.180±0.69427.400±1.8087.434±0.1277.456±0.143aaaaM组36.010±.58065.630±4.68911.480±0.38611.510±0.135aabaaT1组34.650±2.83455.750±1.66911.490±0.20710.320±0.739aacaaT2组36.450±1.60762.750±3.41211.420±0.17611.490±0.170ab注：与同时间C组比较，P﹤0.01；与同时间M组比较，P﹤0.01；与同时间cT1组比较，P﹤0.0116 图1：实验前后各组小鼠体质量（g）变化（1）图2：各组小鼠实验前后体质量（g）变化（2）2小鼠尿微量白蛋白2.1四组小鼠实验前后尿微量白蛋白比较：实验后M组小鼠24h尿mALB较实验前增加（P<0.01）；实验后T1、T2组小鼠24h尿mALB较实验前减少（P<0.01）；C组小鼠24h尿mALB实验前后无变化（P>0.05）。17 2.2各组小鼠尿微量白蛋白之间比较：实验前后M组、T1组及T2组小鼠24h尿mALB均明显高于C组(P<0.01)；实验后T1、T2组小鼠24h尿mALB较M组明显降低(P<0.01，P=0.01)，且T1组明显低于T2组(P=0.027)。表2：各组小鼠尿mALB比较（x±s）组别n尿mALB（μg/L）实验前实验后C组830.28±5.76433.30±5.365aaM组8128.9±5.073130.5±0.831aabT1组8128.7±4.406123.1±1.450aacdT2组8128.8±1.895125.5±1.487abc注：与同时间C组比较，P<0.01；与同时间M组比较，P<0.01，P=0.01；与d同时间T1组比较，P=0.027图3：实验前后各组小鼠尿mALB（μg/L）变化（1）18 图4：各组小鼠实验前后尿mALB（μg/L）变化（2）3小鼠血清脂联素3.1各组小鼠实验前后血清ADP比较：实验后M组、T2组小鼠血清ADP明显低于实验前（P<0.01）；实验后T1组小鼠血清血清ADP明显高于实验前（P<0.01）；C组小鼠血清ADP无明显变化（P>0.05）。3.2各组小鼠血清ADP之间比较：实验前后M组、T1组及T2组小鼠血清ADP均明显低于C组(P<0.01)；实验前M组、T1组及T2组小鼠血清ADP无明显差异（P=0.174、P=0.183、P=0.973）；实验后T1组小鼠血清ADP高于M组及T2组（P=0.003、P=0.005）；实验后M组、T2组血清ADP差异无统计学意义（P=0.862）。表3：各组小鼠血清ADP比较（x±s）组别n血清ADP（μg/L）实验前实验后C组851.00±1.52151.10±1.562aaM组842.84±1.70240.77±1.146aabT1组841.89±1.19342.90±1.428aacT2组841.91±0.951440.89±1.041ab注：与同时间C组比较，P<0.01；与同时间M组比较，P=0.003；与同时间T1c组比较，P=0.00519 图5：实验前后各组小鼠血清ADP变化（1）图6：各组小鼠实验前后血清ADP变化（2）4小鼠肾脏组织PPARγmRNA表达水平：T1组PPARγmRNA表达水平高于M组（P=0.026），T1组PPARγmRNA高于T2组（P=0.035）,T2组PPARγmRNA与M组差异无统计学意义（P=0.886）。20 表4：各组小鼠肾脏PPARγmRNA表达水平比较（x±s）组别nPPARγmRNAC组80.623±0.049M组80.552±0.022aabT1组80.587±0.019acT2组80.555±0.014ab注：与同时间C组比较，P<0.01；与同时间M组比较，P=0.026；与同时间T1c比较，P=0.035图7：各组小鼠肾脏PPARγmRNA表达水平比较CMT1T2PPARγmRNACMT1T2β-action图8：各组小鼠肾脏PPARγmRNA凝胶电泳图21 5小鼠肾脏病理改变5.1肾脏湿重（右肾）：C组小鼠双肾湿重低于M组、T2组（P<0.01）；M组小鼠双肾湿重高于T1组（P=0.005），与T2组小鼠肾脏湿重无明显差异（P=0.377）。T1组小鼠肾脏湿重低于T2组（P=0.04）。5.2肾脏组织病理改变：光镜下C组小鼠肾脏病理结果提示其肾小球、肾小管、内皮细胞及系膜细胞均正常；M组、T2组小鼠肾脏病理提示肾小球细胞数目明显增加、肾小球肥大、体积增大，肾小球基底膜明显增厚；系膜区明显增宽，并可见系膜细胞及基质增生，部分伴有局灶节段性肾小球硬化及间质纤维化。T1组小鼠肾脏病理提示肾小球内皮细胞、系膜细胞基本正常，肾小球硬化程度较M组及T2组小鼠轻。5.3肾小球直径：M组、T2小鼠肾小球直径显著大于C组、T1组小鼠（P<0.01）。T2组小鼠肾小球直径大于T1组小鼠（P<0.01），与M组小鼠肾小球直径无明显差异（P=0.945）。表5：四组小鼠肾脏湿重及肾小球直径比较（x±s）组别n肾脏湿重（g）肾小球直径（μm）C组80.168±0.010132.5±1.148aaM组80.203±0.023159.8±2.470bcT1组80.184±0.014139.8±0.739adaeT2组80.193±0.639159.9±0.639abc注：与同时间C组比较，P<0.01；与同时间M组比较，P=0.005，P<0.01；与de同时间T1比较，P=0.04，P<0.01图9：各组小鼠右肾湿重（g）及肾小球直径（μm）比较22 图10：400倍光镜下四组小鼠肾脏HE染色切片图6肾脏ZO-1表达水平：ZO-1主要在细胞浆液中表达。M组及T2组小鼠肾脏ZO-1表达水平低于C组小鼠（P<0.01）；T1组小鼠肾脏ZO-1表达水平低于C组小鼠（P=0.079）；M组及T2组小鼠肾脏ZO-1表达水平低于T1组小鼠（P<0.01）。表6：四组小鼠肾脏ZO-1表达水平比较（x±s）组别nZO-1表达C组82.826±0.065aM组80.888±0.196bcT1组82.664±0.183adT2组80.823±0.225abc注:与同时间C组比较，P<0.01，P=0.079；与同时间M组比较，P<0.01；与d同时间T1比较，P<0.0123 图11：400倍光镜下四组小鼠肾脏ZO-1表达7各实验观察指标间相关性分析7.1小鼠24小时尿mALB与各指标相关性分析：小鼠24h尿mALB与体质量、右肾湿重、及肾小球直径呈正相关（r1=0.853、r2=0.631、r3=0.830；P1<0.01、P2<0.01、P3<0.01），与血清ADP、肾脏PPARγmRNA表达水平及Z0-1表达水平呈负相关（r4=-0.773、r5=-0.469、r6=-0.731；P4<0.01、P5=0.007、P6<0.01）。表7：小鼠24h尿mALB与各检测指标的相关系数（r）指体质量肾脏湿重血清ADPPPARγmRNA肾小球直ZO-1表达标径r0.8530.631-0.773-0.4690.830-0.731P<0.01<0.01<0.010.007<0.01<0.0124 图12：小鼠24h尿mALB与体质量、右肾湿重、血清ADP、肾脏PPARγmRNA、肾小球直径及肾脏ZO-1表达相关性散点图及拟合线7.2小鼠血清ADP与各指标相关性分析：小鼠血清ADP与肾脏PPARγmRNA与ZO-1表达水平呈正相关（r7=0.434、r8=0.811；P7=0.013、P8<0.01），与小鼠体质量、右肾湿重、24h尿mALB及肾小球直径呈负相关（r9=-0.743、r10=-0.523、r4=-0.773、r11=-0.722；P9<0.01、P10=0.002、P4<0.01、P11<0.01）。25 表8：小鼠血清ADP与各检测指标的相关系数（r）指体质量肾脏湿重24h尿PPARγmR肾小球直径ZO-1表达标mALBNAr-0.743-0.523-0.7730.434-0.7220.811P<0.010.002<0.010.013<0.01<0.01图13：小鼠血清ADP与体质量、右肾湿重、肾脏PPARγmRNA、肾小球直径及肾脏ZO-1表达相关性散点图及拟合线26 7.3小鼠肾脏PPARγmRNA表达水平与各指标相关性分析：小鼠肾脏PPARγmRNA表达水平与血清ADP、ZO-1表达水平呈正相关（r7=0.434、r12=0.386；P7=0.013、P12=0.029），与小鼠体质量、右肾湿重、24h尿mALB及肾小球直径呈负相关（r13=-0.381、r14=-0.340、r5=-0.469、r15=-0.547；P13=0.034、P14=0.047、P5=0.007、P15=0.001）。表9：小鼠肾脏PPARγmRNA与各检测指标的相关系数（r）指标体质量肾脏湿重血清ADP24h尿肾小球直ZO-1表达mALB径r-0.381-0.3400.434-0.469-0.5470.386P0.0340.0470.0130.0070.0010.029图14：小鼠肾脏PPARγmRNA表达水平与体质量、右肾湿重、肾小球直径及肾脏ZO-1表达水平相关性散点图及拟合线7.4小鼠肾脏ZO-1表达水平与各指标相关性分析：小鼠肾脏ZO-1表达水平与血清ADP、肾脏PPARγmRNA表达水平呈正相关（r8=0.811、r12=0.386；P8<0.01、P12=0.029），与小鼠体质量、右肾湿重、24h尿mALB及肾小球直径呈27 负相关（r16=-0.770、r17=-0.493、r6=-0.731、r18=-0.787；P16<0.01、P17=0.004、P6<0.01、P18<0.01）。表10：小鼠肾脏ZO-1表达水平与各检测指标的相关系数（r）指标体质量肾脏湿重血清ADPPPARγmRN24h尿肾小球直AmALB径r-0.770-0.4930.8110.386-0.731-0.787P<0.010.004<0.010.029<0.01<0.01图15：小鼠肾脏ZO-1表达水平与体质量、右肾湿重、肾小球直径相关性散点图及拟合线28 讨论随着人们饮食结构、生活方式改变及生活节奏加快，目前肥胖已成为全球共存的一个严重的公共卫生问题。近年来肥胖的发病率大幅度增长，预测2030[1]年全球人口将有58%为超重或是肥胖。超重及肥胖可显著增加2型糖尿病、高[2]血压、心血管疾病及肾脏疾病发生的风险。1974年Weisinger等已提出肥胖患者[3][11]尿检提示有蛋白尿，即ORG。近期国内外ORG的发病率呈持续上升趋势。1、ORG的概述2,ORG的定义为体质量指数（bodymassindex,BMI）≥30.0kg/m，尿检蛋白阳[12-15]性，并排除其他肾脏疾病。ORG的典型临床特征为中度或大量蛋白尿，但[16]并不伴有血清白蛋白的下降。ORG患者光镜下肾脏形态学改变主要表现为两类：单纯肥胖相关的肾小球肥大（obesity-associatedglomerulomegalyalone,O-GM）及肥胖相关的局灶节段性肾小球硬化（FSGS）伴肾小球肥大[13]（obesity-associatedFSGSwithglomerulomegaly，O-FSGS）。电镜下观察ORG患者肾脏组织可发现，其足细胞明显肿胀及足突融合，并存在足细胞的相对密[17]度及绝对数目的减少，提示ORG患者肾脏病变主要表现为足细胞的损伤。本研究所选取的ob/ob小鼠为瘦素突变小鼠，其背景为C57BL/6J小鼠，其体重大于C57BL/6J小鼠体重20%以上，符合小鼠肥胖标准。本研究中，肥胖组小鼠体质量、肾脏湿重及24h尿mALB排泄量明显高于对照组小鼠，肾脏HE染色提示肥胖组小鼠肾小球肥大且部分伴有局灶阶段硬化，且24h尿mALB与小鼠体质量、肾脏湿重及肾小球直径均呈正相关，表明肥胖组小鼠临床及病理符合ORG。另免疫组化染色结果提示肥胖组小鼠肾脏ZO-1（主要在肾小球足细胞胞浆中表达）表达水平明显低于对照组，且肾脏ZO-1表达水平与24h尿mALB负相关，证实足细胞损伤及数目减少为ORG患者出现蛋白尿的主要原因。实验前后监测各组小鼠血糖变化，结果提示实验前后ob/ob小鼠血糖均高于C57BL/6J小鼠血糖，且差异有[18]统计学意义，但实验前后各组小鼠血糖水平均低于16.7mmol/l，未达小鼠糖尿病诊断标准，故排除糖尿病诊断，故考虑ob/ob小鼠24h尿mALB排泄增加由肥胖所致。目前认为ORG的发病机制主要包括有：脂肪因子及炎性因子分泌异常、高胰岛素血症及胰岛素抵抗、血脂异常、氧化应激、肾脏血流动力学异常、肾素-29 [4]血管紧张素-醛固酮系统亢进等。现在人们对脂肪组织的认识有所改变，过去对脂肪组织的认识仅局限为能量储备器官，现在发现脂肪组织同时具有内分泌功能。脂肪因子为脂肪组织分泌的具有生物活性激素的总称，其中包括有ADP、[5]瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子等。超重及肥胖时脂肪组织增大，且其分泌的各种细胞因子异常，包括有ADP减少，瘦素、肿瘤坏死因子等增多。ADP为目前发现的唯一一种与肥胖负相关的脂肪因子成为目前的研究热点。ADP为脂肪细胞生成并分泌的大量存在于血浆中的一种蛋白质，具有增加胰岛素敏感性、改[6,7][8]善胰岛素抵抗、抗炎及抑制氧化应激等生物效应。PPARγ激活剂吡格列酮[19]等通过上调ADP受体，增强ADP表达，提高ADP水平已成为目前ORG治疗的研究热点。2、ADP与ORGADP是由脂肪细胞生成并分泌的大量存在于血浆中的一种蛋白质，含量约[20]介于3~30μg/ml，分子量约为30KDa。ADP有两种受体：脂联素受体1（AdipoR1）、脂联素受体2（AdipoR2）。AdipoR1在肾脏及足细胞中多有表达。[21]ADP与其受体结合后可发挥减轻体重、调节糖代谢、脂肪代谢及抗炎、抑制[5,22,23]氧化应激等生物活性作用。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分之一，而足细胞裂孔隔膜（slitdiaphram,SD）则是维持肾小球滤过屏障功能的主要因素之一。研究发现ZO-1与维持及调节屏障功能有关，故常作为用以观察组织[24]紧密连接屏障功能及通透性的指标。肾脏内ZO-1位于SD插入足突处的胞质侧，可将SD的相关蛋白连接到细胞骨架上，故对于维持足细胞及肾小球滤过屏障的完整性有至关重要的作用。JalovaaraK等发现肥胖患者血清ADP水平与体重[25]呈负相关，肥胖时血清ADP水平降低。YanoY研究提示，肥胖患者，尿蛋白排泄量多者血清ADP水平也低，且上述结果不受性别、血糖、血压等的影响，[26]提示肥胖患者尿蛋白排泄量增加与血清ADP水平下降有关。研究证实ADP敲除小鼠模型尿蛋白排泄明显增加，肾脏病理提示足细胞足突融合及ZO-1表达减少。足细胞培养实验提示，ADP可诱导ZO-1向细胞膜移位，减弱足细胞对白蛋白的渗透作用及改善足细胞功能，ADP水平下降导致足细胞对白蛋白渗透性增[27]强，出现蛋白尿，表明ADP主要通过对足细胞的保护减少尿蛋白排泄，发挥肾脏保护作用。POD-ATTAC小鼠，低ADP水平小鼠较高ADP水平小鼠，尿蛋白排泄量多、肾功能恶化更明显，且高ADP水平小鼠肾脏病理提示原有损伤有所30 修复且间质纤维形成少，表明ADP在足细胞出现损伤后也对足细胞有保护作用[27]。炎症及氧化应激为ORG发生发展的重要机制，ADP可以激活AMPK及抑制NF-kB信号以减少炎症及氧化应激作用。ADP低表达导致上述作用减弱，活性氧[28]及炎性因子如IFN-γ、NOX4、TLR4和TNF-α的表达增多。本研究中肥胖组小鼠血清ADP明显低于对照组小鼠，血清ADP与体质量负相关，证实肥胖致使血清ADP水平下降。肥胖组小鼠24h尿mALB排泄量明显高于对照组小鼠，肾脏ZO-1表达水平低于对照组小鼠，且血清ADP与24h尿mALB、肾脏湿重、肾小球直径及肾脏ZO-1表达水平负相关，考虑肥胖组小鼠24h尿mALB排泄增加及出现肾脏结构及功能异常可能与血清ADP水平下降有关，滤过屏障-足细胞受损及滤过屏障通透性增加、炎症反应及氧化应激作用增强有关。PPARγ激动剂为胰岛素增敏剂，最初多应用于2型糖尿病患者的降糖治疗。但有多项临床研究证实，糖尿病肾病患者使用吡格列酮治疗后尿蛋白排泄量明[29]显减少，且血清ADP水平明显升高。我们早期实验将吡格列酮应用于ob/ob小鼠，证实肥胖小鼠尿蛋白排泄量减少，血清ADP水平升高，肾小球足细胞ZO-1[9]表达及WT1标记的足细胞数目增加。另给予吡格列酮干预治疗后，肾组织AMPK表达明显增多。吡格列酮可明显减少肥胖小鼠尿蛋白排泄量，其机制考虑为吡格列酮通过激活PPARγ，上调ADP受体，ADP表达增加，增强肾组织AMPK表达，减轻氧化应激反应，修复足细胞损伤，保持足细胞相对数量，从而发挥[30,31]保护肾脏作用。3、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对ob/ob小鼠肾脏的保护作用ORG患者肾脏病理光镜下为肾小球肥大或伴有局灶节段性硬化，电镜下[32]ORG患者肾小球足细胞表现为肿胀、足突融合等。研究显示ORG患者足细胞[17]损伤主要为足细胞相对密度下降及绝对数目减少两种形式。ORG患者肾脏早期表现为肾脏血浆流量增加、肾小球高灌注、高滤过，其原因包括有：RAAS活[4]化、交感神经系统兴奋、胰岛素抵抗等。肾小球的高灌注、高滤过、高压力导致足细胞代偿性发生形态学改变，其细胞体变窄、足突宽度增加，代偿性维持肾小球率过滤稳定，而变形的足细胞不能完全覆盖基膜，故会导致基膜裸露。裸露的基膜与包蔓囊发生粘连，使肾小球局部硬化。故ORG患者早期使用ARB可改善肾脏血流动力学异常，发挥肾脏保护作用。Benigni等研究发现，ARB不仅可通过阻断RAAS系统缓解肾小球“三高”状态，还可使肾脏nephrin蛋白表达增31 [33]加、减少足细胞脱落及抑制肾小球肥大等作用。ARB可明显改善ORG患者肾脏血流动力学，其效应具体表现如下：1）通过对肾小球入球、出球小动脉的扩张作用（ARB对出球小动脉的扩张作用强于入球小动脉）改善肾小球内“三高”（高压力、高灌注、高滤过）；2）ARB可以重调肾小管-肾小球反馈系统，并减[34]少入球小动脉扩血管性前列腺素分泌减少，防治肾小球“三高”；3）CKD患者肾小球入球小动脉常处于扩张状态，若CKD患者血压增高，系统高血压较易通过扩张的入球小动脉传人肾小球，导致肾小球内出现“三高”状态。ARB可以降低系统血压，改善肾小球内“三高”状态。另近年有研究提示ARB可增强ACE2的活性，从而增加血管紧张素1-7（Ang1-7）的合成而降低系统血压。ARB除上述通过改善肾脏血流动力学异常发挥肾脏保护作用外，还可通过非血流动力学效应[35,36]保护肾脏，其非血流动力学效应主要表现为：稳定滤过膜、改善滤过膜屏[37,38][39,40]障功能、抑制肾脏纤维化等。本研究中替米沙坦组肥胖小鼠及氯沙坦组肥胖小鼠分别经干预治疗后，实验后两组小鼠24h尿mALB明显低于实验前，提示经替米沙坦及氯沙坦治疗后，肥胖小鼠尿蛋白水平明显下降，其原因考虑与ARB通过改善肾脏血流动力学及其非血流动力学效应改善肾脏“三高”状态及保护滤过屏障等作用有关。4、替米沙坦对ob/ob小鼠肾脏的特殊保护作用替米沙坦结构与氯沙坦、缬沙坦、坎地沙坦等不同，而与吡格列酮结构相[35]似，替米沙坦为非四唑衍生物，并具有单羧酸基团，故其具有高度的脂溶性。[41,42]替米沙坦作为一种ARB广泛用于高血压、糖尿病肾病等的治疗，近期多项研究表明，替米沙坦同时具有PPARγ激活作用。替米沙坦通过激活PPARγ明显减轻炎症及氧化应激作用，代谢综合征大鼠模型给予替米沙坦及缬沙坦干预治疗，实验结果提示替米沙坦可明显减轻大鼠体重、降低血清甘油三酯水平；替米沙坦较缬沙坦有更强的减少尿微量白蛋白排泄作用，且替米沙坦干预后大鼠肾脏损伤评分明显低于缬沙坦组，提示替米沙坦对于代谢综合征大鼠肾脏的保护作[43]用强于缬沙坦。替米沙坦因具有ARB及PPARγ激活的双重作用，对心肌梗死[44]后心肌的重构发挥有益作用，可调节糖及脂肪代谢、抑制炎症及氧化应激并[45,46]改善左心室功能。心梗小鼠给予替米沙坦干预后，心肌细胞PPARγmRNA及其蛋白表达增加，心梗后的心脏衰竭发生率明显下降，亦证实替米沙坦具有激活32 [10]PPARγ作用，且其激活作用表现在转录及蛋白修饰水平。替米沙坦干预治疗的ob/ob小鼠，可明显改善胰岛素敏感性并使肥大的胰岛素细胞体积缩小；体外培养的C2C12骨骼肌细胞，给予替米沙坦干预治疗，观察细胞Sirt1mRNA的表达水+平、AMPK磷酸化水平及NAD/NADPH的比例，实验结果提示Sirt1mRNA的表达+水平增加、AMPK磷酸化水平及NAD/NADPH的比例增加，提示替米沙坦可激[47]活AMPK。经异丙肾上腺素诱导的心力衰竭大鼠，给予替米沙坦治疗后，ADP表达增加、TNF-α减少，提示替米沙坦可通过PPARγ的活性作用增加ADP的表达[19]同时抑制炎性因子TNF-α的表达。替米沙坦具有PPARγ激活作用，刺激ADP表达，提高ADP水平，改善胰岛素敏感性、增加AMPK活性，发挥抗炎及抑制氧化[48,49]应激作用。本研究提示替米沙坦组小鼠血清ADP、肾脏组织PPARγmRNA及ZO-1表达水平明显高于氯沙坦组小鼠，替米沙坦组小鼠24h尿mALB、肾小球直径及肾脏湿重明显低于氯沙坦组小鼠，且肾脏病理改变明显轻于氯沙坦组小鼠，而氯沙坦组小鼠肾小球直径、肾脏湿重与肥胖组小鼠差异无统计意义，且光镜下氯沙坦组小鼠及肥胖组小鼠肾脏病理改变相似，提示替米沙坦通过对PPARγ激活作用，提高血清ADP水平，减少24h尿mALB排泄，增加ZO-1表达水平，较氯沙坦有更强的肾脏保护作用。综上所述，替米沙坦特殊的PPARγ激活作用，可提高单纯性肥胖小鼠血清ADP水平，促进肾小球足细胞ZO-1表达，抑制肾小球肥大，减少尿mALB排泄，使其较其他ARB类药物对单纯性肥胖小鼠有更强的肾脏保护作用，发挥更强的肾脏保护作用，为临床ORG的治疗提供了新思路。5、不足与展望肥胖相关性肾病病因及发病机制复杂，且同时合并有多种代谢紊乱等，如血脂异常等，由于小鼠血量有限故未给予测量实验前后小鼠血脂情况变化等，该项待以后研究中进一步完善。若今后实验条件及经费允许，可应用western-blot检测肾脏组织PPARγ蛋白的表达水平及使用电子显微镜了解肾脏病理改变情况。33 34 结论1、肥胖小鼠24h尿mALB排泄量增加、血清ADP水平下降、肾脏PPARγmRNA及肾脏ZO-1表达水平下降；肾脏病理提示肾小球体积增大部分伴有局灶节段硬化。2、替米沙坦及氯沙坦可通过改善肾脏血流动力学及非血流动力学效应减少单纯性肥胖小鼠24h尿mALB排泄量。3、替米沙坦通过其特殊的PPARγ激活作用，提高单纯性肥胖小鼠血清ADP水平、肾小球足细胞ZO-1表达增加并抑制肾小球肥大、减少24h尿mALB排泄，使其较其他ARB类药物于单纯性肥胖小鼠肾脏有更强的保护作用。35 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综述ARB在慢性肾脏病中的应用慢性肾脏病（chronickidneydisease，CKD）在我国目前已成为一严重的公共卫生问题，据最新的流行病学资料提示我国CKD患病率目前高达10.8%，意[1]味在我国有大约1.195亿人口为CKD患者，且CKD的患病率近年有明显上升趋势。改善全球肾脏病预后组织（KDIGO）于2012年发布的《CKD评估与临床实践指南》中针对CKD提出了全新的概念，同时制定了新的临床分期。其中CKD的定义为：肾脏结构或功能异常超过3个月，包括肾小球率过滤（glomerularfiltrationrate，GFR）正常或不正常的肾脏病理损伤、血液或者尿液成分异常及肾脏影像学异常；或者不明原因的GFR下降超过3个月。肾脏受损的标准包含有：尿检异常（血尿或蛋白尿等）、因肾小管功能紊乱而导致的电解质紊乱及其他的异常、肾脏组织学检测异常、肾脏影像学检查有结构异常、有肾脏移植病[2]史及GFR的下降。CKD病因繁多，如慢性肾小球肾炎、慢性肾间质疾病、肾血管疾病、糖尿病肾病、高血压肾小动脉硬化、结缔组织疾病或其他疾病累及肾脏引发的继发性肾脏损伤、先天性或是遗传性肾脏疾病等。发达国家，CKD的最主要病因为糖尿病肾病及高血压肾小动脉硬化，而在我国CKD最常见的病因为原发性肾小球肾炎，其次为糖尿病肾病、高血压肾病、狼疮性肾炎等。尽管CKD发病病因不同，但在其疾病进展过程中有某些共同的机制。这些机制包括有：肾脏血流动力学异常、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（reninangiotensinaldosteronesystem，RAAS）的激活、尿蛋白、高血压、脂类代谢紊乱、尿酸异常等。CKD是不可逆的，因此延缓CKD的进展尤为重要。RAAS系统的激活促进[3]CKD进展，因此抑制RAAS系统可以有效的延缓CKD进展。RAAS在人体内发挥重要的生理作用，其主要由肾素、血管紧张素Ⅰ（angiotensinⅠ,AngⅠ）、血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）、血管紧张素受体（AT）及血管紧张素转换酶（angiotensinenzyme，ACE）组成。人体内存在两种RAAS：循环及局部RAAS。循环RAAS系统的主要功能为维持全身血流动力学的稳定。肾脏内即有完整的RAAS组分，即局部RAAS，肾小球球旁细胞及近端肾小管上皮细胞合成肾素及血管紧张素原，再经过自分泌及旁分泌等方式发挥生物学作用。CKD42 患者RAAS系统过度激活，而RAAS系统的激活则为CKD患者进入终末期肾脏病（endstagerenaldiease，ESRD）的重要原因之一。RAAS系统激活不仅可通过改变血流动力学导致系统血压升高，致使肾小球呈高灌注、高滤过状态，同时还可以通过其非血流动力学机制如损伤内皮细胞、系膜细胞、上调促纤维化[4-6]因子表达及促使细胞基质沉积等作用导致肾小球硬化及肾脏纤维化。故在[7]CKD患者的治疗中，抑制RAAS系统是必须的且可以有效延缓CKD的进展。AngⅡ是体内RAAS的主要效应物质，AT1为其发挥作用的受体，两者结合后，可发挥收缩血管、升高血压、醛固酮释放增加、促进胞外基质积聚及纤维[8-10]化及造成不良心血管疾病事件的生物学效应。AngⅡ拮抗剂由血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensincovertingenzymeinhibitor,ACEI）及血管紧张素ATⅠ受体阻断剂（angiotensinATⅠreceptorblocker,ARB）组成。ACEI使血管AngⅡ生成减少，而ARB则可阻断AngⅡ与AT1受体结合，故两者都具有拮抗AngⅡ的作用，可明显减少醛固酮的生成、降低血压、减少蛋白尿及减少不良心血管事[11,12][13,14]件发生的风险，于CKD治疗中被广泛推荐。本文就ARB在CKD患者中的应用进行描述。1.ARB在CKD中的治疗1.1控制血压CKD患者约有90%会出现高血压，高血压发生率高且多严重并难以控制，[15]持续性高血压会加重肾脏损害，并会引起多靶器官如心、脑、眼等并发症。CKD患者高血压严重且难以控制其原因多考虑与以下因素有关：1）水钠潴留：血容量增加引起容量负荷依赖性高血压；2）肾素分泌增多：肾实质缺血激活RAAS系统，肾素-血管紧张素-醛固酮分泌增多，小动脉收缩、外周阻力增加所致的肾素依赖性高血压；3）肾脏实质受损后肾内降压物质分泌减少：肾脏具有内分泌功能，肾实质受损后肾脏分泌的激肽释放酶-激肽、前列腺素生成减少，[16]血管舒张因子一氧化氮生成减少等。肾小球疾病所引发的高血压多数表现为容量依赖型高血压，少数表现为肾素依赖型高血压，但两种类型的高血压于CKD患者中常混合存在，很难截然分开。另近几年有多项研究表明，CKD患者体内交感神经过度兴奋同样也可引起难治性高血压。随着肾功能的恶化，高血压发生的机率逐渐增高，且高血压的控制率随肾43 [17]功能恶化逐渐呈现下降趋势，而持续性的高血压会加重肾脏损害。高血压为CKD患者加速进展为ERSD的危险因素之一，同时也是CKD患者发生心血管疾病（cardiovasculardiease，CVD）的危险因素，故CKD患者高血压的治疗在CKD一体化治疗中应占有重要位置。有效的控制血压可减缓肾功能恶化、降低[18]CKD患者心脑血管疾病死亡率。目前CKD患者的高血压的治疗多选用钙离子拮抗剂、β受体阻滞剂、RAAS阻断剂等联合或不联合利尿剂。因CKD患者血压严重且难以控制，故多数患者降压方案为多种降压药物联合应用。CKD患者体内RAAS系统的常有不同程度的激活，肾脏局部产生的肾素、血管紧张素Ⅱ增多，继而刺激醛固酮生成增多，导致水钠潴留、外周血管收缩、心房利钠肽释放减少等导致血压增高。RAAS阻断剂为KDOQI指南推荐的降压药，RAS阻断剂除可针对性抑制RAAS系统，有明显的降压效果外，另针对于CKD患者[19-21]可有减少尿蛋白排泄、对肾脏及其他脏器有保护作用。多项临床研究提示CKD患者使用RAAS阻断剂降压效果更好，且CVD及其他脏器的并发症发生[22]率明显下降。1.2肾脏保护作用1.2.1减少尿蛋白蛋白尿为CKD患者最常见的临床表现，蛋白尿产生的主要为滤过屏障通透性增加或损伤所致。长期蛋白尿未得到有效控制，不仅可导致肾小球硬化也可对肾小管间质造成一定的损害。有研究提示，蛋白尿每升高1g/d，肾功能恶化的相对风险增加39%。尿蛋白对肾小球、肾小管均有损害作用，其中尿蛋白对肾小球的作用主要表现为：可损害肾小球毛细血管内皮细胞、系膜细胞等，同时促使内皮细胞释放炎性因素白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、单核细胞趋化肽-1（MCP-1）等炎性因子释放增加，最终导致肾小球硬化发生，有效肾单位逐渐减少，最终出现肾功能异常。尿蛋白对肾小管的损害主要表现为：白蛋白通过肾小管上皮细胞转录因子NF-Kb通路，使MCP-1、肿瘤坏死因[23]子β1（TNF-β1）等炎性因子分泌增多，导致肾小管纤维化。另肾小球滤过的蛋白经过近曲小管时可通过胞饮的方式被摄取，致使肾脏血管紧张素转化酶活[24]性增强，损伤肾脏。ARB类药物不仅可通过改善肾脏血流动力学效应保护肾脏，且多项研究显示其也可通过非血流动力学效应保护肾脏，继而减少尿蛋白排泄。其改善肾脏44 血流动力学效益主要为：1）扩张肾小球入球、出球小动脉（RAB对出球动脉的扩张作用强于入球动脉）改善肾小球内“三高”（高压力、高灌注、高滤过）状态，另近年有研究提示ARB可增强ACE2的活性，从而增加血管紧张素1-7（Ang1-7）的合成而降低系统血压；2）ARB可以重调肾小管-肾小球反馈系统，并减少入[25]球小动脉扩血管性前列腺素分泌减少，防治肾小球“三高”。3）CKD患者肾小球入球小动脉常常处于扩张状态，此时若CKD患者合并有高血压，系统高血压较易通过扩张的入球小动脉传人肾小球内，继而导致肾小球内出现“三高”状态；ARB可以通过降低系统血压，从而改善肾小球内“三高”状态。其对肾脏的非血流动力学保护作用主要表现为：1）AngⅡ可使肾小球滤过膜孔径变大，ARB阻[4,26]断AngⅡ缩小肾小球滤过膜孔径继而改善肾小球滤过屏障功能，最终减少尿蛋白的滤过及排泄；2）ARB通过阻断AngⅡ使肾小球基底膜足突隔膜的Nephrin[27]丢失减少，导致足细胞从基底膜上脱落减少，从而保护足细胞；3）AngⅡ使滤过膜上的硫酸类肝素转运速度加快，滤过膜电荷屏障功能受损，而ARB通过[5]阻断AngⅡ可维持电荷屏障的稳定性。ARB类药物不仅可通过改善肾脏血流动力学效应保护肾脏，且多项研究显示其也可通过非血流动力学效应保护肾脏，继而减少尿蛋白排泄。ARB发挥减尿蛋白作用，通常要求应用剂量需要高于常规降压剂量，故须注意使用过程中应检测患者血压变化情况。1.2.2抑制肾脏纤维化AngⅡ导致肾小球转化生长因子β1（TGF-β1）分泌增多及促进细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）蓄积，加快肾脏纤维化进程，ARB阻断AngⅡ抑[6]制上述作用延缓肾脏病变发展。Obata的一项关于大鼠高血压肾小球硬化的研究中发现，高血压大鼠经ARB与肼苯哒嗪干预治疗后，结果提示两者降压效果相当，但ARB干预后的大鼠肾脏病理结果提示肾小球内TGF-β1、内皮素-1、内皮生长因子生成明显减少，ARB干预组大鼠肾脏出现硬化较肼苯哒嗪组大鼠少，[28]且两组之间差异有统计学意义，证实ARB有抑制肾小球硬化的作用。ARB还可通过阻断AngⅡ明显减少肾脏炎性因子的浸润、抑制活性氧自由基的生成，[29,30]减轻炎症反应及氧化应激作用，从而减轻对肾脏的损害。ARB也可于转录[29]水平明显减少肾小球系膜基质的生成，减轻基质蓄积。1.3ARB对于CKD患者心脑血管并发症的干预治疗全球有数百万CKD患者合并有CVD。统计学资料显示CVD为CKD患者45 最常见的并发症及最主要的死因。CVD主要包含有：左心室扩张及心肌肥厚、血管钙化、动脉粥样硬化及小血管硬化、心力衰竭及尿毒症心肌病等。而其中心力衰竭则为尿毒症患者最常见的死亡原因。之所以如此多CKD患者合并有CVD其原因考虑如下：1）高血压：CKD患者高血压发生率高、病情严重并难以控制，其原因考虑多与水钠潴留等原因所致容量负荷加重、肾素分泌增多、交感神经过度兴奋、肾脏实质受损后肾脏分泌的激肽释放酶-激肽、前列腺素等降压因子生成减少，且血管舒张因子一氧化氮生成也减少等。CKD患者血压难以控制，导致心脏后负荷增加，长时间高血压导致左心室肥大并增加心脏耗氧量。CKD患者RAS系统过度激活及左心室肥大，导致ADP受体密度减少促进动脉粥样硬化。CKD患者GFR下降，血压增高会显著增加血管斑块破裂风险；2）代谢异常：全球约40%ERSD患者病因为糖尿病，在我国糖尿病则为CKD[25]患者第二病因。糖尿病患者体内血清胰岛素浓度显著升高，而胰岛素则为动脉粥样硬化形成的危险因素之一。约有67%CKD患者通常伴有血脂异常，对心脏有保护作用的高密度脂蛋白含量减少，而致动脉粥样硬化的低密度脂蛋白含量则显著增加。最新研究显示，同型半胱氨酸（Homocysteinaemia，Hcy）-蛋氨酸代谢产物，是致冠状动脉粥样硬化新的危险因素。Hcy通过肾小球排泄约占总排泄量的70%，随着GFR下降，血清Hcy含量逐渐增高，促进粥样硬化的形成。3）心脏前负荷增加：CKD患者体内RAAS系统过度激活，致使醛固酮分泌增多，加重水钠潴留；另CKD患者因长期尿蛋白及消化系统受累食欲减退、纳差等，常伴有明显的低蛋白血症，故多伴有周身水肿；随着CKD患者GFR下降，尿量逐渐减少，但多数患者不注意控制饮水量，以上多因素最终导致CKD患者容量负荷加重；4）氧化应激作用：CKD患者因RAAS系统过度激活，体内AngⅡ生成增多，通过激活NADPH氧化酶，使体内过氧化物生成增多，损伤正常细胞；5）CKD患者随着有效肾单位的减少GFR逐渐下降，通过肾脏排出的血磷明显减少，血磷浓度逐渐升高，体内血磷与血钙结合可形成磷酸钙沉积于软组织，使血钙浓度明显下降。而高磷血症及血钙浓度下降及分布不均，都会促使发生血管钙化。一项台湾的研究表明，CKD患者联用氯沙坦及其他传统降压药有明显减少[31]不良心血管事件发生的风险。RAB可以通过降低系统血压、抑制RAAS系统等减少心脏前后负荷，同时部分ARB具有PPARγ激活作用，可以提高血清ADP[32,33]水平，减少心肌梗死后心力衰竭的发生率并对心室的重构发挥有益作用。46 高脂喂养大鼠6月后，给予厄贝沙坦干预治疗，发现厄贝沙坦可明显降低大鼠[34]的甘油三酯及胆固醇水平，表明ARB可能具有降低血脂的作用。多项研究表明，ARB通过阻断AngⅡ，抑制血管壁氧自由基的合成，同时抑制TGF-β1、CRP等，减少对动脉的损伤。2.ARB药物的不良反应及注意事项2.1不良反应2.1.1低血压多发生在初次使用时发生，尤其对于老年人、合并有心力衰竭、血容量不足或是协同使用大剂量利尿剂时更容易出现。为预防出现低血压，建议首次使用时计量减半或是减量或停用利尿剂后再开始给药，给药后检测血压变化。2.1.2高钾血症ACEI可通过减少醛固酮生成及增加前列腺素浓度（通过影响远端肾小管的钠钾交换功能，减少钠离子的排泄）导致血钾增高，ARB类药物较ACEI对于血钾的影响较轻，但对于有肾功能异常患者、联合使用保钾利尿剂或是口服补钾治疗时容易出现，用药过程中应密切检测血钾的变化水平。2.1.3肾功能恶化ACEI可扩张肾小球入球小动脉及出球小动脉，但其对出球小动脉的扩张作用显著强于对入球小动脉的扩张作用，故可改善肾小球的高灌注及高滤过。但对于肾功能异常患者，其排毒主要依靠残余肾单位的出球小动脉的收缩，若此次服用ACEI扩张出球小动脉，则导致肾脏GFR下降，可出现血肌酐水平显著升高。ARB虽较ACEI对出球动脉扩张效应差，但对于肾功能异常患者使用ARB时应密切检测肾功能变化。2.1.4妊娠毒性妊娠初期及中晚期的高血压患者若服用ACEI及ARB降压治疗，可能会出现胎儿畸形、肾脏发育障碍、新生儿无尿及死亡等事件发生，故妊娠期高血压患者应明确禁止使用ACEI及ARB。另ACEI及ARB可从乳汁分泌，故哺乳期妇女应明确禁用上述药物。2.2使用注意事项ARB在临床中应用广泛，因其有可能出现的不良反应，故在临床工作中我47 们在应用ARB时应注意以下事项：使用药物过程中注意检测患者立位、卧位血压情况；脱水患者禁用；孕妇禁用；用药7-10天后复查肾功能及电解质；与非甾体类药物合用时更应注意密切检测肾功能变化；综上所述，ARB在延缓CKD进展中有关键作用，ARB通过阻断AngⅡ降低系统血压，延缓肾功能恶化；通过改善肾脏血流动力学效应及非血流动力学效应减少尿蛋白，同时通过抑制炎性因子及氧化应激作用延缓肾小球硬化；通过降低心脏前后负荷、降脂及抑制氧化应激作用减少CVD事件的发生，故对于CKD患者，ARB有较高的应用价值，但在应用ARB药物时应注意检测其不良反应。综述参考文献[1]ZhangL,WangF,WangL,etal.PrevalenceofchronickidneydiseaseinChina:across-sectionalsurvey[J].Lancet,2012,379(9818):815-822.[2]AndrassyKM.Commentson'KDIGO2012ClinicalPracticeGuidelinefortheEvaluationandManagementofChronicKidneyDisease'[J].KidneyInt,2013,84(3):622-623.[3]TaalMW,BrennerBM.RenoprotectivebenefitsofRASinhibition:fromACEItoangiotensinIIantagonists[J].KidneyInt,2000,57(5):1803-1817.[4]KurtzTW,PravenecM.Antidiabeticmechanismsofangiotensin-convertingenzymeinhibitorsandangiotensinIIreceptorantagonists:beyondtherenin-angiotensinsystem[J].JHypertens,2004,22(12):2253-2261.[5]BerlT.Angiotensin-convertingenzymeinhibitorsversusAT1receptorantagonistincardiovascularandrenalprotection:thecaseforAT1receptorantagonist[J].JAmSocNephrol,2004,15Suppl1:S71-S76.[6]PetersH,BorderWA,NobleNA.TargetingTGF-betaoverexpressioninrenaldisease:maximizingtheantifibroticactionofangiotensinIIblockade[J].KidneyInt,1998,54(5):1570-1580.[7]ChobanianAV,BakrisGL,BlackHR,etal.SeventhreportoftheJointNationalCommitteeonPrevention,Detection,Evaluation,andTreatmentofHighBloodPressure[J].Hypertension,2003,42(6):1206-1252.[8]BlantzRC,GabbaiFB.EffectofangiotensinIIonglomerularhemodynamics48 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致谢谨在此论文完成之际，衷心感谢所有真心帮助过我的老师、同学、朋友及家人，若没有他们的帮助，我的实验将不能顺利完成。回想过去在天医三年硕士生涯，最应感谢的是我的导师夏天教授。夏老师三年来不仅在工作、学习及科研上对我谆谆教导，并为我提供了很多锻炼提高的机会。夏老师不仅学术造诣深厚、治学风格严谨，其诲人不倦、宽厚待人的风范更是令我深深折服；他对工作的认真负责以及对学术的执着严谨的态度，都将会使我毕生受益。师恩如海，衔草难报，在即将离开校园之际，向我的导师夏天教授献上由衷的敬意与感谢！在整个实验的各个环节及论文的撰写期间，师姐李颖、张秋平、王安凤及师兄孙鹏给予我极大的帮助，使得我的实验能够平稳顺利完成，避免了不少弯路；论文书写过程中结构清楚，条理清晰，再次感谢我的师兄师姐对我的帮助和支持！感谢天医基础医学院卫生系毒理学教研室王永明老师及王伟老师在动物饲养及相关实验操作上给予的大力支持与帮助！感谢医大二院检验科魏建军主任、王洪礼老师、门坤老师给予的支持与帮助！感谢医大二院泌尿外科研究所尚老师在实验操作上给予的支持与帮助！另感谢于医大二院泌尿外科研究所内同期做实验的各位泌尿外科的同学们，没有你们的帮助我很难完成我的实验，真心谢谢你们！在三年的临床工作和学习中，感谢医大二院肾内科张宁副主任、李艳伟副主任、杨虎及戎凯师兄以及科里其他老师们在临床工作上给予的指导与帮助，在此表示深深的谢意；感谢医大二院肾内科全体护理人员在临床工作中给予的多方面的理解、支持、关怀与帮助！感谢我的师弟师妹给予的关心与支持！感谢舍友程婷婷、袁丽娜、谢春晓和张文婷同学3年来在生活各方面给予的帮助、在心理上给予的安慰及在精神上给予的支持，谢谢！衷心感谢参加论文评阅、答辩工作的专家在百忙之中抽出宝贵时间为我评阅论文，在此向各位专家致以最真诚的谢意！最后要感谢的是我的家人，感谢家人对我的理解、关怀与支持，是家人的默默付出使我能够顺利完成学业！谢谢大家！52 个人简历姓名：性别：女赵菊兰出生年月：1988年12月籍贯：河南省辉县市主要学习和工作经历：（从本科开始）2008年08月-2013年06月新乡医学院临床医学专业，获医学学士学位53