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分类号：S482.292学校代码：10712UDC：632研究生学号：2013060031密级：公开2018届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导学科专业农药学研究方向农药毒理学研究生王兰英指导教师冯俊涛教授完成时间2018.5中国陕西杨凌 Classificationcode:S482.292Universitycode:10712UDC:632Postgraduatenumber:2013060031Confidentialitylevel:OpenDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018SUBCELLULARLOCATIONOFCARABRONEINGAEUMANNOMYCESGRAMINISVAR.TRITICIANDITSROLEININDUCEDCELLDEATHMajor:PesticideScienceResearchfield:PesticideToxicologyNameofPostgraduate:WangLanyingAdviser:FengJuntaoDateofsubmission:May2018YanglingShaanxiChina 资助课题国家自然科学基金项目：植物源活性物质天名精内酯酮抑菌作用机理研究（31272074）ThisstudywassupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina:FungicidalMechanismResearchofBotanicalActiveCompoundCarabrone（31272074） 天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导摘要天名精内酯酮属于倍半萜内酯类化合物，广泛分布于天名精属的多种植物中。西北农林科技大学无公害农药中心首次报道了该化合物的农用活性，并通过系统测试表明该化合物具备开发为新型杀菌剂的潜质，但该化合物的作用机理尚不明确。亚细胞定位对于揭示杀菌剂的作用机理具有重要的指导作用。本研究以小麦全蚀病菌Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt)为供试靶标菌，采用荧光示踪技术、免疫荧光技术以及免疫胶体金技术研究天名精内酯酮的靶向细胞器，并在此基础之上，测定其对靶标菌氧化胁迫与细胞凋亡的诱导，以期初步明确天名精内酯酮的作用机理。主要研究结果如下：1、设计合成天名精内酯酮荧光标记物TTY，以线粒体探针MitoTrackerRGreenFM和细胞核探针RedDot™为共定位探针，研究TTY在小麦全蚀病菌内的亚细胞分布。结果表明，TTY在菌丝内的分布区域与MitoTrackerRGreenFM探针很好的重叠，其皮尔森共定位系数为0.83。因此，推测天名精内酯酮作用的细胞器是线粒体。2、制备天名精内酯酮多克隆抗体TPAbs-4，以线粒体探针MitoTrackerRRedCMXRos作为共定位探针，采用免疫荧光法研究天名精内酯酮在靶标菌内的亚细胞定位。结果表明，荧光二抗Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC在菌丝细胞内的分布和线粒体探针(MitoTrackerRRedCMXRos)能够很好的重叠，其皮尔森共定位系数为0.86。由此推断，天名精内酯酮分布于线粒体。3、制备天名精内酯酮单克隆抗体F2B4，该抗体对天名精内酯酮敏感性强，其IC50为2.05ng/mL，且特异性好，与天名精内酯醇交叉反应率仅为1.8%，与γ-苯基-α-亚甲基-γ-丁内酯无明显交叉反应。随后，采用免疫胶体金法观察天名精内酯酮在靶标菌内亚细胞定位，结果表明：（1）经天名精内酯酮孵育30min，细胞膜上有大量的胶体金颗粒排列；1h后，胶体金颗粒向细胞质和线粒体迁移，细胞膜、细胞质及线粒体均有分布；2h后，胶体金颗粒主要分布在线粒体上，其它细胞器未见分布。（2）经天名精内酯酮孵育2h，线粒体的脊清晰可见，而孵育6h、12h线粒体的脊逐渐变得模糊，孵育48h线粒体脊消失且出现空泡化。这些结果再次证明了天名精内酯酮作用的细胞器为线粒体。4、检测天名精内酯酮对靶标菌氧化胁迫的诱导，结果表明：（1）经天名精内酯酮孵育3h，菌丝内出现活性氧迸发，且6h后线粒体膜电位明显降低。（2）天名精内酯酮能够抑制线粒体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GR）的活性，同时促进谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性，从而使谷胱甘肽（GSH） 含量显著降低，导致ROS消除通路受阻，ROS蓄积，造成氧化胁迫。（3）抗氧化系统中，GR对天名精内酯酮最敏感，其IC50值低于3.125µg/mL，由于天名精内酯酮能够与其活性中心起催化作用的半胱氨酸残基反应，推测该酶可是天名精内酯酮的潜在靶标作用靶标之一。5、检测天名精内酯酮对靶标菌细胞凋亡的诱导，结果表明，经天名精内酯酮孵育2h，可检测到磷脂酰丝氨酸（PS）外翻；孵育6hDNA明显受损，TUNEL检测结果为阳性，DNA电泳条带200bp处出现明显弥散状，且弥散区域随着时间延长变大。同时，相关基因Ggmet1和Ggmet2的表达量显著上调。以上结果证明天名精内酯酮可诱导小麦全蚀病菌的细胞凋亡。综上所述，天名精内酯酮作用细胞器为线粒体，该化合物可以诱导靶标菌产生氧化应激与细胞凋亡。结合前期研究结果推测其作用机理为：天名精内酯酮进入靶标菌后在线粒体内逐渐富集，影响线粒体复合酶III的活性，阻断线粒体呼吸链电子传递，影响能量生成；同时对GR等抗氧化酶的抑制作用导致ROS蓄积，使线粒体膜通透性增加，激活线粒体介导的细胞凋亡通路，最终使得菌体死亡。关键词：天名精内酯酮；小麦全蚀病菌；亚细胞定位；氧化应激；细胞凋亡 SUBCELLULARLOCATIONOFCARABRONEINGAEUMANNOMYCESGRAMINISVAR.TRITICIANDITSROLEININDUCEDCELLDEATHABSTRACTCarabrone,asesquiterpenelactonecompound,iswidelydistributedinmanyplantspeciesofCompositaeCarpesium.Theresultsofpreviousresearchsindicateditspotentialasanewfungicide.However,theantifungalmechanismofcarabronestillremainsunclear.Subcellularlocationtechnologyisoneoftheimportantmethodstorevealtheactionmechanismofafungicide.Inthisstudy,threetechniquesoffluorescenttracer,immunofluorescenceandimmunecolloidalgoldwereusedtoinvestigatethetargetorganelleofcarabroneusingGaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt)asthetestedfungus.Simultaneously,carabroneinducedoxidativestressandcellularapoptosisofGgtwerealsomeasured.Themainresultsandconclusionsofthethesisareasfollows:1.Afluorescentconjugate(TTY)analogousofcarbronewasdesignedandsynthesizedtoexplorethesubcellularlocationofcarabroneinGgtusingMitoTrackerRGreenFM(amitochondrialdye)andRedDot™(acommercialnuclearprobe)astheco-locatingprobes.TTYandMitoTrackerRGreenFMoverlappedperfectlywithapearson’scolocalizationcoefficientof0.83whereasnooverlaywasobservedbetweenTTYandRedDot™.Theseresultsstronglysupportsthemitochondriallocalizationofcarabrone.2.ApolyclonalantibodyTPAbs-4specifictocarabronewaspreparedtodeterminethesubcellularlocationofcarabroneinGgtusingamitochondrialdyeofMitoTrackerRRedCMXRosastheco-locatingprobe.ExcellentcolocalizationwasobservedbetweenthesecondaryantibodyAnti-MouseIgG(wholemolecule)-FITCandtheMitoTrackerRRedCMXRos,withthePearson'sco-localizationcoefficiencybeing0.86.Theseresultsdeclaredthatcarabroneispredominantlypresentinthemitochondria.3.F2B4,amonoclonalantibodyspecifictocarabronewasalsopreparedwithagoodsensitivity,theIC50valueofwhichwasaslowas2.05ng/mL.Italsoexhibitedhighspecificitiesofacrossreactionrateof1.8%withcarabrol,andnoobviouscrossreactionwithγ-phenyl-α-methylene-γ-butyrolactone.Theimmuno-goldlocalizationstudyrevealedthatthegoldparticlesextensivelydistributedonthecytomembraneafter30-minexposuretothecarabrone.Subsequently,theymovedtothecytoplasmandenteredintomitochondriaafter1h incubation.Whenthetimeextendedto2hormorelonger,thegoldparticleswereselectivelypresentinthemitochondriaandnogoldparticleswereobservedinothersubcellularstructures,indicatingthatmitochondriaaretheactionareaofcarabroneinGgt.4.TheroleofcarabroneontheinductionofGgtoxidativestresswasdetectedandtheresultsshewthatROSburstemergedinthemyceliumafter3-hincubationwithcarabroneandthatthemitochondrialmembranepotentialwasreducedafter6-hincubation.Moreover,carabronecouldinhibittheactivitiesofSOD,CATandGR,butactivatetheactivityofGSH-PXleadingtoaremarkabledecreasionofGSHlevelinGgt.Thatis,carabroneexertsoxidativestressonGgtthroughactivatingROSproductionandconcurrentlyinhibitingtheirelimination.Notably,GRwasmostsensitivetocarabronewithaIC50valuelowerthan3.125µg/mL.ThisinhibitioncanbeexplainedbythereactionofcysteineresiduesintheGRactivecenterwithcarabrone.Takentogether,GRmaybeapotentialtargetofcarabrone.5.carabroneinducedcellapoptosisofGgtwasalsoconformed.phosphatidylserineeversionwasobservedinmyceliumtreatedwithcarabronefor2h.DNAdamagewasdetectedbyTUNELanalysisafter6hcarabronetreatment,whichwasexacerbatedwithextensionoftheexposuretime.Meanwhile,theexpressionlevelsofGgmet1andGgmet2werealsoupregulatedobviously.AlltheseresultsindicatetheroleofcarabroneoninducedcellapoptosisofGgt.Insummary,carabroneselectivelyactedonmitochondriaandsubsequentlyinducetheoxidativestressandapoptosisofGgt.Takingpreviousstudyresultsintoconsideration,wecanspeculatethemechanismofactionofcarabroneagainstGgtasfollows:carabronewillaccumulateinthemitochondriaspecificallyafterenteringintoGgtandthenaffectsthefunctionsofcomplexIII,whichcanblocktheelectrontransportprocessoftherespiratorychainandaffectitsenergygeneration;Meanwhile,carabronecanalsoinhibittheactivitiesofantioxidasesincludingGR,leadingtosuccessivelinkageeffectsofROSaccumulation,highmitochondrialmembranepermeabilityandcellapoptosis.KEYWORDS:carabrone,Gaeumannomycesgraminisvar.tritici,subcellularlocation,oxidativestress;apoptosis 目录第一章文献综述......................................................................................................................11.1倍半萜内酯类化合物研究进展..................................................................................11.1.1倍半萜内酯类化合物的生物活性研究进展.......................................................11.1.2倍半萜内酯类化合物作用机制研究进展...........................................................51.1.3倍半萜内酯类化合物构效关系研究...................................................................81.2天名精内酯酮研究概况..............................................................................................91.2.1天名精内酯酮医用活性.......................................................................................91.2.2天名精内酯酮农用活性.......................................................................................91.3亚细胞定位研究方法................................................................................................101.3.1荧光示踪法亚细胞定位.....................................................................................111.3.2免疫荧光法亚细胞定位.....................................................................................111.3.3免疫胶体金法亚细胞定位.................................................................................121.4问题的提出与论文设计思路....................................................................................14第二章天名精内酯酮荧光示踪法亚细胞定位....................................................................162.1材料与方法................................................................................................................162.1.1供试材料.............................................................................................................162.1.2试验方法.............................................................................................................172.2结果与分析................................................................................................................202.2.1天名精内酯酮荧光标记物的合成.....................................................................202.2.2TTY荧光光谱测定..............................................................................................212.2.3TTY抑菌活性测定..............................................................................................212.2.4TTY浓度与荧光强度关系的测定......................................................................222.2.5不同光照强度对TTY荧光强度的影响............................................................222.2.6TTY及线粒体探针吸收动力学曲线测定..........................................................232.2.7TTY洗脱曲线测定..............................................................................................242.2.8TTY在小麦全蚀病菌菌丝内稳定性测定..........................................................252.2.9TTY在小麦全蚀病菌内亚细胞定位..................................................................272.3讨论............................................................................................................................282.4小结............................................................................................................................29第三章天名精内酯酮免疫荧光法亚细胞定位....................................................................303.1材料与方法................................................................................................................303.1.1供试材料.............................................................................................................30 3.1.2试验方法.............................................................................................................313.2结果与分析................................................................................................................363.2.1人工抗原鉴定.....................................................................................................363.2.2多克隆抗体效价测定.........................................................................................373.2.3免疫荧光法亚细胞定位.....................................................................................383.3讨论............................................................................................................................393.4小结............................................................................................................................39第四章天名精内酯酮免疫金法亚细胞定位........................................................................414.1材料与方法................................................................................................................414.1.1供试材料.............................................................................................................414.1.2试验方法.............................................................................................................424.2结果与分析................................................................................................................474.2.1BALB/c小鼠免疫及血清效价测定....................................................................474.2.2细胞融合与杂交瘤细胞的筛选.........................................................................474.2.3亚克隆.................................................................................................................484.2.4腹水制备.............................................................................................................484.2.5单克隆抗体蛋白浓度测定.................................................................................484.2.6单克隆抗体效价及对天名精内酯酮敏感性测定.............................................484.2.7单克隆抗体交叉抑制率测定.............................................................................494.2.8免疫胶体金法亚细胞定位.................................................................................494.3讨论.............................................................................................................................514.3.1细胞融合前要进行SP2/0骨髓瘤细胞的筛选..................................................514.3.2F2B4特异性较强................................................................................................514.3.3包埋后染色更适合于亚细胞定位研究.............................................................524.3.4选择适宜的封闭剂可以减少非特异性的标记..................................................524.4小结............................................................................................................................52第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡............................................................545.1材料与方法................................................................................................................545.1.1供试材料.............................................................................................................545.1.2试验方法.............................................................................................................555.2结果与分析................................................................................................................645.2.1对细胞内ROS影响............................................................................................645.2.2对线粒体膜电位影响.........................................................................................665.2.3对线粒体内抗氧化酶系的影响.........................................................................675.2.4对线粒体内还原型谷胱甘肽（GSH）含量的影响.........................................71 5.2.5天名精内酯酮与L-半胱氨酸、GSH加成反应................................................715.2.6对小麦全蚀病菌细胞凋亡的诱导.....................................................................725.3讨论............................................................................................................................765.3.1对靶标菌线粒体抗氧化系统的抑制可能是天名精内酯酮抑菌机制之一......765.3.2Melacaspase1在真菌细胞凋亡过程中起着重要作用.......................................765.4小结............................................................................................................................77第六章讨论与结论................................................................................................................786.1讨论............................................................................................................................786.1.1天名精内酯酮靶标位于线粒体.........................................................................786.1.2线粒体复合酶III可能是天名精内酯酮重要作用靶标...................................796.1.3GR可能是天名精内酯酮作用靶标之一............................................................796.1.4天名精内酯酮抑菌作用机理推测.....................................................................806.2结论............................................................................................................................826.3本研究创新点............................................................................................................836.4有待进一步解决的问题............................................................................................83致谢......................................................................................................................................100附图......................................................................................................................................101作者简介................................................................................................................................117 第一章文献综述1第一章文献综述新农药创制的重要途径之一便是对天然产物的研究与利用，倍半萜内酯类化合物是植物自身产生的典型的先天防御物质（phytoanticipin），具有结构类型丰富、数量庞大、生物活性多样等特点，在新农药创制上具有重要潜质。开展该类化合物作用机制的研究对于促进我国农药的创制、农作物病害治理和农业生态环境的保护等方面均具有重要的意义。1.1倍半萜内酯类化合物研究进展倍半萜内酯类化合物是一个庞大而多样化天然产物群，存在于100多个开花植物中。其中，菊科（Asteraceae）植物如蒙大拿山金车（Arnicamontana）、青蒿（Artemisiaannua）、小白菊（Tanacetumparthenium）主要活性成分便是倍半萜内酯类化合物（Sokovicetal.2017）。人们认为，大多数的倍半萜内酯类化合物分离自植物的叶子和花序，这些部位中倍半萜内酯类化合物可占干重的5%（Heywoodetal.1977）。从结构上来看，倍半萜内酯类化合物可归纳为愈创木内酯（Guaianolide）、伪愈创木内酯（Pesudoguaianolide）、桉烷内酯类（Eudesmanolides）、卡拉布烷内酯（Carabrone）、吉马内酯（Germaorenolide）、桉叶内酯（Eudesmanolide）等（姚新生2001）。到目前为止，针对倍半萜内酯类化合物开展的研究，主要包括以下几方面：1.1.1倍半萜内酯类化合物的生物活性研究进展1.1.1.1倍半萜内酯类化合物的医用活性抗肿瘤活性是众多倍半萜内酯类化合物具有的生物活性，当今报道较多的主要有吉马内酯、愈创木内酯、桉叶内酯、伪愈创木内酯等。如早期Gonzale（1978）等报道的广木香内酯（Costunolide）、柔毛地胆素（Molephantin）、倍累素（Baileyin）等均属于吉马内酯类，这些化合物对小鼠艾氏腹水癌及小鼠P388淋巴细胞白血病都具有显著的抑制作用。另外，Kupchan（1967,1968,1971）曾先后指出土荆芥内酯(Ambrosin)、乙酰泽兰苦内酯（Acetyleuparotin）、泽兰苦内酯（Euparotin）等都具有显著的抗癌活性；曹智勇等（1996）研究发现去酰基菜蓟苦素（Desacylcynaropicrin）、菜蓟苦素（Cy-naropicin）对S180肉瘤及艾氏腹水癌细胞有细胞毒作用；小西天二等（2003）研究表明土木香内酯，对小鼠黑素瘤细胞（B16F10）、人子宫癌细胞（Hela）以及人胃癌细胞（MK-1）增殖有抑制作用；赵雷（2010）以土木香地上部分为研究对象，从中分离纯化出的异土木香内酯有较强的抗肿瘤细胞增殖活性；近期Shabir等（2015）分离的Arglabin，Zeng等（2016）报道的C17-guaianolides，Ito等（2016）报道的vernonilidesA和B，以及Formisano等（2017）分离的aguerinB（1）和cynaropicrin（2）也被指出具有抗肿瘤活。上述菜蓟苦素、去酰基菜蓟苦素、土木香内酯、土荆芥内酯、乙酰泽兰苦内酯、泽兰苦内酯、 2天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导Arglabin、C17-guaianolides、vernonilidesA和B、aguerinB（1）和cynaropicrin（2）均属于愈创木内酯类。也有研究指出桉叶内酯类具有抗肿瘤活性，如从欧亚旋复花（菊科）中提取出的bigelovin、8-表-堆心菊内酯（8-epi-helenalin）对HL-60细胞有很高的细胞毒性，以及从旋覆花中分得去乙酰基旋覆花内酯（Deacetylinulin）和旋覆花内酯（Inulin）对小鼠P388淋巴白血病细胞有较好抑制率（Evstratovaetal.1974;Kiselevaetal.1971;Parketal.1998）。再如Lee（1972,1974）报道的对多种人体癌细胞、小鼠P388淋巴白血病都具有显著的抑制作用的堆心菊内酯（Helenalin）则属于伪愈创木内酯类化合物。同时，日本Taniguchi等（1995）研究发现的具有显著细胞毒活性的木香烯内酯和去氢木香内酯也是伪愈创木内酯类化合物。除此以外，榄烷内酯类化合物：Vernolepin、土木香内酯（Alantolactone）、异土木香内酯（Isoalantolactone），艾里莫芬烷型内酯类化合物：8,9-开链艾里莫芬烷型内酯也经实验证实具有抗肿瘤活性（高坤等2003;Griecoetal.1977;Woerdenbagetal.1986）。除上述主要倍半萜内酯结构的化合物报道较多外，近年，也有其他结构的化合物被报道，如黄雪松等（2003）研究证明南美蟛蜞菊倍半萜内酯A和B具有较强的抗肿瘤作用；陈进军（2011）研究表明：冷蒿中的去氢-姜黄烯对子宫颈肿瘤细胞、人肝癌细胞和色素瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用；于盼盼（2014）从菊科植物欧蓍草的头状花序中分离纯化的欧蓍草倍半萜内酯化合物MillifolideC对人肺肿瘤细胞A549有明显的诱导凋亡活性；杨超等（2002,2003）从大花金挖耳和长叶天名精中分离到的化合物parthenolide、michelenolide和2α,5α-dihydroxy-11αH-eudesma-4(15)-en-12,8β-olide具有明显的抗人体肿瘤细胞的活性，等等。综上可见，倍半萜内酯类化合物种类多样，并且不同倍半萜内酯类化合物抗肿瘤细胞的种类也不同。倍半萜内酯类化合物抗炎活性是医学领域的另一个科研热区，人们对倍半萜内酯类化合物抗炎活性的研究仅次于抗肿瘤活性的研究。早在七十年代，我国屠呦呦就发现从黄花篙中分离获得的伪愈创木内酯类化合物—青蒿素（Artemisine）可应用于各种疟疾治疗，具有体内吸收快、分布广、无毒副作用等优点（沈硕等2015）。不久伪愈创木内酯类化合物在消炎方面的活性也被报道，如Chien等（1995）发现伪愈创木内酯类化合物木香烯内酯和去氢木香内酯可以有效抑制人类B型肝炎表面抗原的基因表达；近年，杨辉亮等（2014）也证实了青蒿素的抗炎作用。在抗炎活性方面其他倍半萜内酯类化合物报道也较多，如Hu等（2012）报道一种新的愈创木内酯类化合物对脂多糖（LPS）诱导BV-2细胞中一氧化氮（NO）有很好的抑制作用，随后Turak等（2014）和Chi等（2016）报道的愈创木内酯类化合物也有相同的功效；Tambewagh等（2017）发现桉烷内酯具有很好的抗关节炎活性。除上述两大研究热点外，对神经系统的作用也有一定研究。Okugawa等（1996）研究去氢木香内酯和木香烯内酯的药理作用发现，两个化合物具有催眠的作用；KimHuang等（2001）指出1A-羟基-3-去氧假莽草素、环滇西八角内酯（Cyclomerrillianolide）、 第一章文献综述3滇西八角内酯（Merrillianolide）等具有引起中枢神经兴奋致惊厥的作用；Fukuyama等（2005）研究表明来自八角的倍半萜内酯merrilactoneA、11-debenzoyltashironin和jiadifenin在原代培养的大鼠皮质神经元中具有促进神经突生长的活性。日本有人研究发现化合物去氢木香内酯能加速小鼠胃内炭灰食物的排空，具有增加胃肠蠕动的作用，并且对人类消化道Anisakis传染病的控制非常有效（Jojietal.1990;山原条二等1992）。近年，Funakami（2010）研究发现斑鸠菊内酯对豚鼠肠道平滑肌的收缩具有时间依赖性的增强和抑制作用；Peng等（2016）指出土木香倍半萜内酯可调节阿托品或新斯的明诱发的肠道的偏亢状态，但不影响正常小鼠胃肠动力。这些现象表明倍半萜内酯类化合物对胃肠道具有一定调节作用，是潜在的消化系统治疗药物。Gupta等（1967）和侯鹏飞等（2008）研究发现，去氢木香内酯和木香烃内酯具有抑制ADP诱导的血小板聚集作用，二氢木香内酯和12-甲氧基二氢木香烃内酯等具有扩张血管和降压的作用；Barsby等（1993）认为，小白菊内酯以及其他倍半萜A-亚甲基丁酰内酯可以抑制血管平滑肌主动脉环的收缩应答。在人们研究倍半萜内酯类化合物抗肿瘤作用的同时，还发现了该类化合物的解痉镇痛作用。如木香烃内酯、二氢木香烃内酯和二氢木香内酯对兔的十二指肠有舒张作用，能够减轻由组胺和乙酰胆碱气雾剂引起的豚鼠支气管痉挛（Guptaetal.1967;Jamshaidetal.1986）。在欧洲和南亚，莴苣鸦片（lactucarium）作为镇痛剂已被使用了数个世纪，有人指出莴苣鸦片中发挥镇痛作用的主要成分是倍半萜内酯类化合物莴苣毒素lactucopicrin（Wesołowskaetal.2006）。Chaves等（2008）认为广木香能够起到镇痛作用是因为其所含的倍半萜内酯α-humulene能够穿过血脑屏障，等等。1980年德国学者和英国学者证实来源于蒲公英的吉马内酯类化合物有很强的致敏活性（Hanseletal.1980）。Awe等（1999）证实了倍半萜内酯vernolepin具有抗血小板活性，其来源于扁桃斑鸠菊。由上述内容可以看出，倍半萜内酯类化合物的生物活性在医学领域得到了广泛的关注，该类化合物所具备的功效不断的被挖掘，其所应用的领域也在日益扩展。1.1.1.2倍半萜内酯类化合物的农用活性倍半萜内酯类化合物突出的生物活性，同样也引起了农业领域人们的高度重视，并且在杀虫、杀菌以及除草等方面均有所开展：早期Picman等（1984）人报道了3种对杂拟谷盗（Triboliumconfusum）和拟谷盗（T.castaneum）有较高胃毒活性的伪愈创木内酯类化合物。随后倍半萜内酯类化合物的杀虫活性陆续被报道，如Goren等（1994）发现从菊科属植物Neurolaenalobata中分离出来的10个大根香叶内酯类化合物对斜纹夜蛾（Prodenialitura）的幼虫有较强的拒食活性；RosselliSergio等人（2006）也证实愈创木内酯类化合物对银纹夜蛾（Argyrogrammaagnata）具有较强的拒食活性。近年，Wu等（2016）报道了一种新的愈创木内酯类化合物1，也发现了该化合物的拒食活性。周琼等（2008）研究发现，愈创木内酯类化合 4天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导物L-Ⅱ除对小菜蛾具有很好的拒食活性外，还对萝卜蚜和菜蚜具有很强的趋避活性。除此外，Cantrell等人（1999）曾证明从土木香中分离出来的alantolactone和isoalantolactone对埃及伊蚊（Aedesaegypti）幼虫和成虫有触杀活性；崔俊（2013）和郭新荣（2014）指出倍半萜内酯类化合物羟基马桑毒素有显著的神经毒性与行为干扰等活性。总之，倍半萜内酯类化合物杀虫活性逐渐被挖掘，所报道的该类化合物的种类也不断的在更新。同杀虫活性研究几乎同步，Watanabe等（1985）报道了伪愈创木内酯类化合物具有抑菌活性。随后国内外对该类化合物的杀菌活性进行了大量的报道，汇总见表1-1。表1-1倍半萜内酯类化合物农用杀菌活性统计表Table1-1Anti-inflammatorymechanismofsesquiterpenelactone供试浓度或抑制类型化合物名称抑菌谱EC50参考文献InhibitionCompoundsInhibitionspectrumTestedconcentriReferencetypetionorEC50长蠕孢属（Helminthosporium）、isoalloalantolactoneCaleraet腐霉属（Pythium）、镰刀菌属菌丝生长<50μg/mL榄烷型倍半萜内酯al.1992（Fusarium）芒果炭疽病菌（Colletotrichumacutatum）、草莓炭疽病菌（C.fragariae）、黄柏炭疽病菌（C.Wedgeet大根香叶内酯菌丝生长30μg/mLgloeosporioides）、枯萎病菌（F.al.2000oxysporum）灰霉病菌（Botrytis.cinerea）黄瓜疫病菌（PhytophthoraKimetal.8-epi-xanthatin孢子萌发15.6μg/mLdrechsleri）2002灰葡萄孢菌（B.cinerea）、立枯KrishnaetzaluzaninD菌丝生长200μg/mL丝核菌（Rhizoctoniasolani）al.2003广木香内酯、小白Ahmedet菊内酯、1,10-环氧尖孢镰刀菌（F.oxysporum)等菌丝生长-al.2005基-小白菊内酯番茄灰霉病菌（B.cinerea）、番茄张文渊异土木香内酯灰叶斑病菌（Stemphylium菌丝生长μg/mL2007lycopersici）玉米小斑病菌（Bipolariamaydis）吴静等青蒿素小麦纹枯病菌（Rhizotonia孢子萌发-2008cerealis）去氧薇甘菊内酯小麦纹枯病菌（R.cerealis）等菌丝生长5.61μg/mL庄世宏去氧薇甘菊内酯番茄灰霉病菌（B.cinerea）孢子萌发10.49μg/mL2010二氢薇甘菊内酯辣椒疫霉病菌（P.capsici）等孢子萌发12.84μg/mL玉米大斑病菌（Exserohilum郭新荣羟基马桑毒素菌丝生长-turcicum）2013 第一章文献综述5从表中可以看出，该类化合物抑菌谱普遍较广，抑菌活性较高，有些化合物可以抑制菌丝生长，有些可以抑制孢子萌发，而有些化合物兼具抑制菌丝生长和孢子萌发的活性。Xuan等（2006）报道了存在于卡瓦胡椒（Pipermethysticum）中的去甲氧基羊高宁、醉椒素等内酯类化合物对莴苣和谷场草有很好的生长抑制作用；Macias等研究了大根香叶内酯、木香烯内酯、小白菊内酯、向日葵内酯及17种愈创木内酯的除草活性，认为大根香叶内酯和愈创木内酯可作为潜在的天然除草剂的模板，同时指出倍半萜内酯argophyllinsA、B可以干扰IAA的作用，能够使IAA诱导的小豆下胚轴生长减少40%（Macíasetal.1999a;1999b;2000;2006）；Kalsi等（1995）报道分离于云木香中的去氢木香内酯具有抑制植物发芽的作用；张玉虎等（2004）从三裂蟛蜞菊中分离获得4个单体倍半萜内酯类化合物对萝卜、小白菜及西红柿生长有很强的抑制作用，等等。1.1.2倍半萜内酯类化合物作用机制研究进展从倍半萜内酯类化合物发现至今，其生物活性引起了科研领域的各界人士的大量关注，所报道的该类化合物的种类也在日益更新。但关于该类化合物的作用机制研究主要集中于医用抗炎与抗肿瘤两个方面，在农业领域研究较少。1.1.2.1倍半萜内酯类化合物的抗炎作用机制核转录因子（nucleartranscriptionfactor）是一类能够与启动子区的固定核苷酸序列结合，启动基因转录的蛋白质。其中转录因子kappaB（NF-κB）是一类重要的核转录激活因子，普遍存在于各种真核细胞中（Baldwinetal.1996）。在没有刺激的细胞中，大部分的NF-κB以二聚体的形式与细胞质中抑制因子I-κB结合呈现无活性的状态存在（郭伟等2006）。I-κB激酶复合物IKK可以降解I-κB，从而使NF-κB活化，进入细胞核内与DNA结合，诱导细胞炎症因子（TNF-α、IL-1、IL-6等）、黏附分子（ICAM-1、VCAM-1）、炎性酶（iNOS、COX-2）等基因的表达（Ledgerwoodetal.1999;Guptaetal.2001）。堆心菊素是一种效用非常显著的抗炎药物，经Lyss等人研究证实，堆心菊素主要是通过作用于NF-κB二聚体P50-P65中的亚组分P65，从而抑制NF-κB的活性，与此类似的还有菜蓟苦素等倍半萜内酯类化合物（Castroetal.2000;Choetal.2000;Liuetal.2017;Lyssetal.1999;Zhongetal.2017）；广木香内酯和小白菊内酯主要是通过分泌碱性磷酸酶SEAP使得I-κB激酶复合物IKK不能磷酸化而发挥抗炎作用；青蒿素等化合物抗炎作用机制是抑制I-κB的降解（Hehneretal.1998;Kooetal.2001;Kwoketal.2001;杨辉亮等2014;Zingarellietal.2002）；去氢木香内酯、saussureamineA、saussureamineB、木香烃内酯能够通过影响NF-κB移位等效应使其失活发挥抗炎作用；并且木香烃内酯还能降低MAPKs蛋白激酶的活化和AP-1蛋白的DNA结合活性，从而抑制IL-1β基因的表达（Jinetal.2000;Kangetal.2004;Leeetal.1999;Matsudaetal.2003）。除此之外，CYL-19s和CYL-26z，能够通过抑制黏附分子ICAM-1的表达起到抗炎的作用（Huang 6天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导etal.2004）。可见，在NF-κB调节的信号通路中，存在着多处倍半萜内酯类化合物的靶标位点，汇总如下图。图1-1倍半萜内酯类化合物抗炎作用机制Fig.1-1Themechanismsofanti-inflammatoryactionsofsesquiterpenelactone1.1.2.2倍半萜内酯类化合物的抗肿瘤作用机制在肿瘤治疗过程中，许多抗肿瘤药物均是通过启动细胞凋亡机制完成的。因此从药物诱导细胞凋亡的机制入手研究其抗肿瘤活性具有更为直观的意义。目前所研究报道的细胞凋亡通路中与倍半萜内酯类化合物相关的主要是死亡受体通路与线粒体通路。倍半萜内酯类化合物与死亡受体介导的通路：DR是一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员中的最大的死亡受体家族，主要包括TNFR1（p55，CD120a）、TNFR2（p75，CD120b）、Fas（CD95，Apo-1）等。其中TNFR1的信号传导的途径是通过激活后续MAPK信号，由转录因子JNK激酶、P38激酶、ERK等诱导细胞凋亡；Fas的信号传导途径是通过改变下游的FADD构象，激活caspase8，从而引发下游的caspase级联反应引起细胞凋亡（Stewartetal.2002）。Lotem等（1999）发现，在M1骨髓白血病细胞中，倍半萜内酯类化合物毒胡萝卜内酯可以瞬时诱导p38和ERK的磷酸化，从而导致细胞凋亡；Chen等（2017）也指出（+）-Strebloside通过诱导ERK的活性促使卵巢癌细胞凋亡；Estafiatin是一种代表性的倍半萜内酯类化合物，Schepetkin（2017）认为该化合物也可以通过诱导ERK的活性发挥其抗肿瘤的活性；Zhang等（2005）证明用非细胞毒性浓度的小白菊内酯预处理细胞，可持续激活JNK，促进细胞凋亡；Oh（2004）和Jeon等（2005）认为去氢木香内酯能通过增强caspase-8和caspase-3活性使HL-60癌细胞发生凋亡，等等。总之，倍半萜内酯类化合物可以通过多种方式激活死亡受体介导的细胞凋亡通路，诱导细胞凋亡。倍半萜内酯类化合物与死亡受体介导的 第一章文献综述7细胞凋亡通路汇总图见1-2。TNFRFas1FADDDDFAcaspase8MAPKcaspase3JNKP38ERKStreblosideEstafiatin图1-2倍半萜内酯类化合物与死亡受体介导的细胞凋亡Fig.1-2Cellapoptosismediatedbysesquiterpenelactoneanddeathreceptors倍半萜内酯类化合物与线粒体介导的通路：线粒体膜通透性转运孔（mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP）位于线粒体内外膜之间，在线粒体调控细胞凋亡中起着关键作用（Petersenetal.2006）。正常情况下MPTP周期性开放，若线粒体呼吸链受抑制，线粒体膜电位降低，将导致MPTP持续性开放，使得细胞色素C（cytochromeC）等凋亡因子释放，进而诱导细胞凋亡（Bernardietal.2006）。促凋亡因子Bax同MPTP结合，促进MPTP开放，而抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl同MPTP结合，抑制MPTP开放。Dirsch指出堆心菊素作用机制是通过抑制抗凋亡基因Bcl-xL的表达从而诱导癌细胞凋亡（Dirschetal.2001）；Lee等认为木香烃内酯、川木香内酯、天人菊内酯可通过引起线粒体通透性变化（MPT），释放细胞色素C诱导HL-60凋亡（Leeetal.2001;Yunetal.2004）；于盼盼（2014）发现欧蓍草倍半萜内酯化合物MillifolideC可通过上调Bax和Caspase-3蛋白表达，从而引起A549细胞凋亡；而Fallahian等（2015）认为化合物Gaillardin可通过上调促凋亡因子Bax和下调抗凋亡因子Bcl-2起到抑制乳腺癌细胞的增殖。除上述人们提出的观点外，关于倍半萜内酯类化合物通过诱导氧化应激导致细胞凋亡的观点也不断提出，当巯基浓度降低时，细胞中的氧化还原电位发生改变，引起氧化应激并形成活性氧（ROS），其通过线粒体依赖的途径引发细胞凋亡。如parthenolide5是迄今为止所报道的唯一的能够选择性靶向癌细胞的小分子化合物，Parthenolide5作用机制在于过度消耗谷胱甘肽（GSH），使得ROS大量产生从而诱导癌细胞发生凋亡（Wenetal.2002）。此外，Choi等（2009）认为，木香烃内酯诱导的癌细胞凋亡机制在于木香烃内酯消耗细胞内GSH，破坏细胞内氧化还原的平衡，随之产生的ROS起到了关键的 8天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导作用。可见，倍半萜内酯类化合物通过氧化应激诱导的细胞凋亡逐渐受到关注。倍半萜内酯类化合物与线粒体介导的细胞凋亡汇总图见1-3。Gaillardinparthenolide5MillifolideCGSHBcl-2Bcl-xlROSMPTPCytochromeCCaspase-9图1-3倍半萜内酯类化合物与线粒体介导的细胞凋亡Fig.1-3Cellapoptosismediatedbysesquiterpenelactoneandmitochondria综上所述，倍半萜内酯类化合物可以通过死亡受体通路、线粒体通路诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤活性，并且不同的化合物参与的通路不同，所扮演的角色不同。1.1.3倍半萜内酯类化合物构效关系研究倍半萜内酯类化合物的结构与生物活性之间的关系，早就引起了科研者们的兴趣。Kupchan等在七十年代就指出亚甲基内酯基团对于倍半萜内酯类化合物生物活性是必不可少的，如果改变了该结构将会导致倍半萜内酯类化合物细胞毒性以及对肿瘤细胞的抑制活性明显降低（Kupchanetal.1971）。随后有研究证明，α-亚甲基-γ-丁内酯或α，β-不饱和环戊烯酮基是倍半萜内酯类化合物存在生物活性的关键基团（Leeetal.1977;Halletal.1978），当α-亚甲基-γ-丁内酯和环戊烯酮结构被改变时，化合物活性会大大的降低（Beekmanetal.1997;Leeetal.2002）。Schmidt（1997）证实helenanolide型倍半萜内酯化合物在体外可以和硫醇、谷胱甘肽或者半胱氨酸发生迈克尔加成反应，从而推测这是倍半萜内酯类化合物发挥生物活性的关键。随后该说法不断得到支持，人们认为倍半萜内酯类化合物在细胞中可以和含巯基的蛋白以及游离的谷胱甘肽发生反应，从而引起细胞内特定的含巯基的酶活降低或者导致维持细胞内氧化还原反应的谷胱甘肽代谢通路被破坏，最终发挥其生物活性（Shinetal.2017;Wenetal.2002；Zhangetal.2004a）。RuÈngeler（1999）和同事分析了28种倍半萜内酯类化合物结构与抗肿瘤坏死因子活性的关系，发现含有α-亚甲基-γ-丁内酯或α，β-不饱和环戊烯酮基的倍半萜内酯类化合物 第一章文献综述9大多数可以抑制核转录因子NF-kB的活性，进一步通过分子建模和计算模拟分析认为，该类化合物分子机制为倍半萜内酯类化合物通过α-亚甲基-γ-丁内酯或α，β-不饱和环戊烯酮结构与NF-kB上p65亚基的半胱氨酸残基发生加成反应，直接干扰p65与DNA结合活性，从而使得NF-kB不能正常行驶核转录功能。但是，Janecka等（2012）研究指出，虽然倍半萜内酯类化合物在结构上具有共性的活性基团，其作用机制却不尽相同，这些化合物与生物亲核试剂的巯基的反应取决于α，β-不饱和羰基位点的数量和类型、硫醇的浓度以及巯基结构的特征；目标巯基的化学环境具有至关重要的作用，尤其是在更具空间需求的情况下（例如在酶的疏水口袋中），更灵活的α-亚甲基-γ-丁内酯反应的机会将会增加。可见，倍半萜内酯类化合物的作用机制并不能仅从所含有的活性基团上简单断定，还需考虑化合物所处的生物环境及巯基存在的位点等多种因素。1.2天名精内酯酮研究概况天名精内酯酮属于卡拉布烷型倍半萜内酯类化合物。首次从天名精属天名精果实中分离发现（Minatoetal.1964），后来报道在天名精属的土木香、大花金挖耳等多种植物中广泛存在，陆续被人们分离获得（Bohlmannetal.1978;Springetal.1991;Kimetal.2004;Wangetal.2009）。自得到该化合物以来众多的学者在医用及农用领域作了大量卓有成效的工作。1.2.1天名精内酯酮医用活性早期Maruyama等（1977）就报道过天名精内酯酮具有抗人类病原真菌与细菌的活性，后来随着研究进一步开展，Gülaçti等（1993）测定天名精内酯酮医用活性发现，该化合物对金黄葡萄球菌（Staphylococcusaureus）有较好的拮抗活性，同时发现天名精内酯酮对小鼠白血病淋巴细胞P-388、鼻咽癌细胞KB-3、抗长春花碱KB-V1的细胞均有明显的细胞毒活性。Lee等（2002）则报道了天名精内酯酮的抗肿瘤活性。但关于天名精内酯酮医用活性作用机理未见报道。1.2.2天名精内酯酮农用活性天名精内酯酮的农用活性最早由西北农林科技大学无公害农药研究中心冯俊涛（2006）发现，在对大花金挖耳（Carpesiummacrocephalum）粗提物杀菌活性系统研究中发现，天名精内酯酮是该种植物主要的抑菌活性成分。随即测定了天名精内酯酮离体活性，结果表明，该化合物对19种植物病原真菌菌丝生长均有很好的抑制效果，尤其对小麦全蚀病菌抑制毒力最高。后期王箐霞（2007）测定了天名精内酯酮对黄瓜炭疽病菌、番茄叶霉病菌（Fulviafulva）、玉米大斑病菌等6种植物病原菌孢子萌发的抑制效果，结果表明天名精内酯酮对供试靶标菌孢子萌发均有一定的抑制效果，尤其对黄瓜炭疽病菌的孢子萌发表现出很高的毒力。在进行天名精内酯酮离体活性测试的同时，西北农林科技大学无公害农药研究中 10天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导心还开展了该化合物盆栽、活体组织的药效试验，结果发现天名精内酯酮对小麦白粉病的盆栽防效较高，在1000mg/L剂量下，其对小麦白粉病的保护与治疗效果同150mg/L的三唑酮无显著差异（任双喜等2012）。韩兴帅等（2014）进一步测定了天名精内酯酮对小麦全蚀病、黄瓜炭疽病等4种植物病害的保护和治疗效果，发现该化合物对小麦全蚀病的保护效果最高，在1000mg/L剂量下，保护效果为85.48%，供试浓度下对小麦全蚀病的治疗效果也达60%左右。同时研究发现，天名精内酯酮在单子叶作物小麦和双子叶作物黄瓜的叶部和根部均具有较好的内吸活性，并可向上传导。为了分析该化合物的活性基团，冯俊涛等（2007）以天名精内酯酮为先导化合物，通过双取代和还原羰基得到了11,13-双氢天名精内酯酮和卡拉布烷-3(4)-烯-12,8β-内酯，发现两者化合物活性显著降低，实验结果可以初步确定11，13位双键和4位羰基是化合物活性基团所在部位。李江华等（2009）在此研究基础上进一步对11，13位双键和羰基进行修饰，对得到的天名精内酯酮衍生物进行抑菌活性测定，发现C-4位羰基修饰得到的化合物天名精内酯酮-2,4-二硝基苯腙和天名精内酯酮缩氨基脲对孢子萌发的活性比天名精内酯酮显著提高，而对γ-内酯环改造得到的化合物13-甲氧基天名精内酯酮抑制毒力比天名精内酯酮显著降低，证明天名精内酯酮的主要活性基团是α-亚甲基-γ-丁内酯。这一结论与医学上报道一致（Leeetal.1977;Halletal.1978），该结论为天名精内酯酮作用机理研究提供了线索。杀菌剂的作用机理研究可为化合物的应用与新农药创制奠定基础，基于此，西北农林科技大学无公害农药中心对天名精内酯酮作用机理进行了初步探讨。采用电子显微镜观察发现，天名精内酯酮可导致病原菌菌丝生长杂乱、扭曲、畸形，生长点膨大和塌陷；对线粒体影响尤为严重，表现为：线粒体肿胀、髓样化，后期空泡化，最终线粒体崩解；对靶标菌细胞膜无明显影响（冯俊涛2006;王艳梅2009）。生理生化测试表明，经天名精内酯酮处理后，小麦全蚀病菌内总蛋白、总糖、还原糖、脂肪含量均显著下降（王艳梅2009）；线粒体含量明显降低、ATP酶活性显著下降，线粒体呼吸电子传递链复合酶活性受到明显抑制，尤其线粒体复合酶III受影响最大（王艳梅2009;许丹2011）；靶标菌细胞膜通透性无明显变化。基于以上结论，结合离体测试结果（该化合物不仅可以抑制靶标菌的菌丝生长也可以抑制靶标菌的孢子萌发），推测该化合物对靶标菌的生物合成和生物氧化均有一定的影响。由此可见，天名精内酯酮对病原菌抑菌作用机理较为复杂，值得进一步深入研究。1.3亚细胞定位研究方法真核微生物同其他生物体一样，其细胞是一个高度有序的结构，由细胞壁、细胞膜、细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、微管等细胞器组成。而在杀菌剂研究中，人们发现这些行使着各种重要功能的亚细胞单位，往往就是杀菌剂的工作室。如天然产物多氧菌素D（polyoxinD）作用于细胞壁（Cabibetal.1991），苯菌灵（benomyl）和苯酰菌 第一章文献综述11胺（xamide）作用于细胞微管蛋白（Youngetal.2001;Zhouetal.2016），而新型吡啶酰胺类杀菌剂fenpicoxamid作用于线粒体（Owenetal.2017），等等。因此，明确杀菌剂的亚细胞定位能够大大缩小寻找药物作用靶标的范围，能为揭示杀菌剂的作用机理提供直接的依据，具有重要的意义。杀菌剂的亚细胞定位是指借助于亚细胞定位的手段明确杀菌物质具体作用的细胞器的研究，依据杀菌剂种类、结构不同，其作用位点存在有很大的差异（Jenssenetal.2006）。当今关于亚细胞定位研究主要有荧光标记技术和免疫胶体金技术，其中荧光标记技术又分为荧光示踪技术与免疫荧光技术（李立奇和万瑛2009;游雪娇等2015）。1.3.1荧光示踪法亚细胞定位荧光示踪技术是借助于荧光化合物研究目标物在生物体内生物进程的技术（Leietal.2015）。该技术在医学领域广泛被应用于抗菌肽的亚细胞定位研究，如Sung等（2008）将多肽用荧光素FITC标记后处理白色念珠菌，发现多肽亚细胞定位于细胞膜。Sharma等（2012）用羧基荧光素（Carboxyfluorescein）标记人类ß-防御素类似物抗菌肽N2、N4与NS后，处理大肠杆菌，并用膜特异性荧光染料FM4-64进行双染，发现抗菌肽的作用位点不是在细胞膜，而在菌体内。Imran等（2013）运用荧光素钠（5-(Aminoacetamido)fluorescein）标记乳链菌肽（NisinZ）后，研究发现NisinZ主要作用于李氏杆菌（Listeriaivahoii）及无害李斯特菌（L.innocua）等菌体分裂处的隔膜。Lee等（2013）用荧光化合物四乙基罗丹明（Tetraethylrhodamine）标记抗菌肽HPA3NT3与HPA3NT3-A2后，比较两者在大肠杆菌内作用位点差异发现，HPA3NT3定位于细胞膜，HPA3NT3-A2则渗入细胞内。进一步通过实验证实HPA3NT3-A2定位于菌体的核酸。可见，荧光示踪技术为揭示抗菌肽抑制机理提供了直观的证据。荧光示踪手段除在医学领域得到很好的应用外，该技术在农业领域也引起了广大科研者们的浓厚兴趣。如Muñoz等（2013）研究罗丹明标记的抗菌肽PAF26对植物真菌细胞的作用，发现该抗菌肽先定位于真菌细胞膜，然后被真菌内吞至液泡后转运至细胞质，进而破坏细胞核。Puig等（2016）采用罗丹明标记的抗菌肽研究对膨胀匐柄霉（Stemphyliumvesicarium）的影响，发现抗菌肽BP15主要危害菌体的细胞膜。除抗菌肽的研究外，小分子化合物的荧光示踪也是人们研究的也有报道，如Xu等（2007）用2-氨基吖啶酮（2-Aminoacridone）标记壳寡糖后，处理辣椒疫霉，发现壳寡糖分布于辣椒疫霉萌发管和孢囊孢子内部。Wang等（2014）利用点击化学技术合成了氟虫腈的糖基荧光标记物，初步明确了氟虫腈在蓖麻内的转运路线。因此，荧光示踪技术在揭示农用化合物作用机理研究中也是普遍被认可的技术。1.3.2免疫荧光法亚细胞定位免疫荧光技术是将免疫学与荧光标记技术结合起来研究抗原蛋白在细胞内分布的方法。这种技术已被医学界科研者们广泛用于蛋白质的亚细胞定位或两个蛋白质的共定 12天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导位研究。如Jang等（2006）通过免疫荧光抗菌肽di-K19Hc亚细胞定位发现，di-K19Hc既可定位于细胞壁，也可定位于细胞膜。Morita等（2013）利用免疫荧光技术确定了核心组蛋白H2B定位于细胞表面。Scaglione（2017）将该方法应用于人类甾体5α-还原酶家族的5个成员的亚细胞定位，最终确定了这些酶亚细胞定位在HeLa内质网中。Vazquez等（2017）采用免疫荧光技术制定了线粒体抗病毒信号（MAVS）亚细胞定位方案，推进了MAVS功能的研究。Yuen等（2017）通过免疫荧光技术研究Na/K-ATP酶亚型的亚细胞定位发现，NKA-α2定位于横向T型小管（TT）元素，而α1位于横向和纵向TT元素，并通过最终结果分析驳斥了Ryanodine受体簇不接近NKA-α2与α1这一假设。树突状细胞因子1（DCF1）是一种跨膜蛋白，在调节神经干细胞分化和树突棘形成中发挥重要作用。除了其细胞质功能外，DCF1在调节淀粉样蛋白前体蛋白过程中发挥作用。Chen（2018）借助于免疫荧光手段明确了DCF1主要定位于线粒体、内体/溶酶体、内质网和蛋白酶体。总之，免疫荧光技术在医学领域研究酶及蛋白的亚细胞定位方面一直都在发挥着重要的作用。同其他技术手段一样，免疫荧光技术在农业研究领域也得到了广泛的应用。如Hansen等（2017）借助于免疫荧光技术观察了过氧化物酶基质和酿酒酵母的膜蛋白。锰超氧化物歧化酶（MnSOD）是保护细胞免受氧化应激的关键酶，Wang等（2017）借助于免疫荧光技术研究了寄生虫Nosemabombycis的基因组中的NbMnSOD1和NbMnSOD2在细胞内的定位。结果发现，NbMnSOD1存在于成熟孢子的胞质溶胶中，而NbMnSOD2定位在极管和孢壁上，为阐明NbMnSOD2独特作用奠定了基础。除此外免疫荧光技术也可用于研究药物作用机理或由发育引起的亚细胞定位的变化（Brelieetal.2002;Huetal.2004;Milleretal.1995）。Perkhofer等（2007）采用免疫荧光标记确定了5-羟色胺（5-Hydroxytryptamine）分布于黄曲霉（Aspergillusflavus）细胞质。Wu（2017）采用免疫荧光技术研究了S期核糖核苷酸还原酶（dNTP）的亚细胞再分布，并发现，S期Rnr2-Rnr4重新分布是由Clb6-Cdc28介导的Rnr2磷酸化引发的，它会破坏Rnr2-Wtm1相互作用并促进Rnr2-Rnr4从细胞核释放。总体来讲，同医学领域相似，免疫荧光技术主要被应用于酶及相关蛋白的亚细胞定位研究，用该手段追踪小分子化合物亚细胞定位的研究较少。1.3.3免疫胶体金法亚细胞定位胶体金是氯金酸（HAuCl4）经还原剂聚合而成的金颗粒，其表面带负电荷，在水溶液中保持溶胶状态，因此称为胶体金（Dreadenetal.2012）。胶体金金颗粒呈圆形、边缘平滑，直径从几纳米到几十纳米，其溶液呈酒红色，大颗粒胶体金溶液呈紫红色（曾辉等2006）。由于胶体金颗粒表面带的电荷与蛋白质所带电荷相反，因此对蛋白有很强的吸附功能，利用这一特性在其表面吸附蛋白等物质就形成了胶体金标记。胶体金颗粒可与免疫球蛋白G、牛血清白蛋白、酶、毒素、抗生素和激素等多种抗原或抗体结合（孔 第一章文献综述13繁德等2002;Sotnikovetal.2014），从而制作成不同的免疫胶体金探针。这些探针可以利用各自识别功能将胶体金富集到特定的位置，然后借助于光学显微镜、电子显微镜进行抗原定位、定量和定性研究。该项技术优点在于不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，成为继荧光素、酶、同位素三大标记技术之后的一种新型免疫标记技术（萨仁高娃等2007）。当今应用较多的是借助于特异性较强的单克隆抗作为第一抗体，胶体金作为第二抗体，利用透射显微镜观察抗原在组织或细胞中的分布位点。主要应用如下：免疫胶体金技术早期在医学领域主要应用于组织定位。如Kawauchi等（1996）采用胶体金免疫电镜观察分化的小圆细胞软组织肉瘤发现，横纹肌肉瘤定位于肌丝或肌节的短束中。Lombard等（1997）采用该技术对分化差的嗜酸性甲状腺癌进行研究发现，BCL-2定位于线粒体基质中，分化较好的还出现在线粒体脊中。近年，该技术在医学领域依然发挥着重要的作用，如Ballesteros-Merino（2014）研究SK3（KCNN3）亚基的表达时，采用免疫胶体金技术证实了SK3早期先定位于内质网，到后期阶段逐渐集中在树突棘中。分枝杆菌tlyA基因产物Rv1694（MtbTlyA）已被注解为“溶血素”，Kumar（2015）研究分枝杆菌tlyA基因产物亚细胞定位发现，胶体金颗粒周围具有外膜囊泡。通过与其它处理比较可知，细菌表达的TlyA能够利用囊泡介导的运输途径到达细胞膜外，从而为分枝杆菌tlyA基因产物定位于没有信号序列的细胞壁提供了依据。Faris（2017）利用胶体金免疫电镜研究细胞朊病毒蛋白（PrPC）的亚细胞定位发现，PrPC存在于健康小鼠的线粒体中，并且可以影响线粒体功能，等等。总之，作为医学研究的一个有效手段，人们对它的关注度一直有增无减。鉴于免疫胶体金技术的优点，其在农业领域也得到了广泛的应用，如胶体金标记技术成功地应用于植物激素分析，大大促进了人们对激素的认知（Dewitteetal.2001）。Vysotskaya等（2007）利用该技术研究玉米和小麦根的生长规律发现，小麦主根被切除24h后，IAA主要定位在维管束和侧根的根源基细胞中，玉米根水平放置培养2d后，IAA定位在下半部分的中柱鞘内，而上半部分的IAA较少。兰秒等（2016）采用免疫胶体金标记技术对内源生长素结合蛋白ABP1进行定位分析，发现ABP1在细胞壁、质膜、等多种细胞器上均有分布，其中内质网和质膜上胶体金颗粒更多。除上述研究外，胶体金标记技术也成功地应用于植物保护中，Giunchedi等（1982）于1982年首次利用胶体金探针明确了大麦条纹花叶病毒（BSMV）在寄主组织中的分布，使得该技术在植物病毒研究中得以推广。如Otulak（2015）研究烟草脆裂病毒（TRV）时，借助于免疫胶体金技术检测TRV的亚细胞分布情况，发现该病毒在细胞核、线粒体和紊乱的叶绿体中均有分布。Erokhina等（2017）采用免疫胶体金技术检测烟草花叶病毒ORF6蛋白的亚细胞定位情况，发现ORF6基因的产物主要存在于细胞核中。基于此国内也展开了相关的研究，如李云琴等（2004）利用免疫胶体金技术对感病烟草中TbCSVAC4蛋白进行亚细胞定位发现，该蛋白主要在细胞质的叶绿体和线粒体中积累。秦艳红等 14天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导（2009）研究甘蔗花叶病毒VPg在玉米中的免疫定位发现，在玉米茎和叶脉的韧皮部筛管的细胞壁处有金颗粒沉积。同样，该技术在其它病原的细胞定位研究中也得到了应用，如玉米小斑病菌、禾白粉病菌及泡桐丛枝病菌等在植物的组织或细胞定位研究（范国强等2008;Healyetal.2004;芦光新等2004）。病原的亚细胞定位对揭示病原与寄主的互作、寻找病原发展规律具有重要的意义，而免疫胶体金标记技术为细胞定位提供了有效的手段。有别于上述研究，免疫胶体金技术在植物保护领域应用的另一重要的方面是，基于病原微生物亚细胞定位的研究，如Kozuka等（1985）用胶体金IgG探针定位了枯草芽胞杆菌休眠孢子内2，6-吡啶二羧酸（DPA）的分布情况。相比较之下，这方面的研究相对较少。综上所述，免疫胶体金技术具有特异性强、灵敏度高、简单快速，实验结果易久存等优点，在组织以及细胞定位研究中发挥着重要作用。随着科技的进步，胶体金技术必将进一步完善，有人预测该技术发展趋势是一、灵敏度逐步提高（陈凤梅等2004）；二、检测逐步多元化（严华等2005）；三、可实现定量或半定量检测（李国峰等2013）。因此，免疫胶体金技术将普及应用于各研究领域。1.4问题的提出与论文设计思路天名精内酯酮属于卡拉布烷型倍半萜内酯类化合物，广泛存在于天名精属的多种植物中。西北农林科技大学无公害农药研究中心自报道了该化合物的农用活性以来，对其离体活性、盆栽活体防效以及抑菌机理进行了大量细致的研究，并取得了一定的成绩。但从天名精内酯酮的应用发展整体来看，对这一化合物的认识还存在一定的不足，尤其对其作用机理方面尚存在以下问题：（1）前期研究证明，天名精内酯酮对小麦全蚀病菌的生物氧化和生物合成均有一定的影响，但哪个是该化合物引起的主导效应有待于进一步确定。（2）天名精内酯酮对靶标菌线粒体影响较大，对细胞膜无明显影响，但其对靶标菌细胞核等其它细胞器是否存在影响尚不明确。（3）电子显微镜观察发现，天名精内酯酮可造成小麦全蚀病菌线粒体肿胀，髓样、空泡化，但造成线粒体病变的成因有待于进一步确定。基于上述问题，依据医学领域关于倍半萜内酯类化合物作用机理，本研究主要从以下几方面进一步深入探讨天名精内酯酮作用机理。（1）通过荧光示踪法、免疫荧光法、免疫胶体金法研究天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位。（2）基于以上研究内容，确定天名精内酯酮作用的靶标细胞器，并推测天名精内酯酮作用靶标后引起的后效应，测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌的氧化应激与细胞凋亡的诱导，探讨造成线粒体肿胀，髓样、空泡化的成因。技术路线如图1-4所示： 第一章文献综述15小麦全蚀病菌天名精内酯酮C-4位衍生合成荧光标记物人工抗原氧抑菌活性多克隆抗体单克隆抗体化菌丝内稳定性小麦全蚀病菌FM小麦全蚀病菌CLSM小麦全蚀病菌TEM胁荧光示踪定位免疫荧光定位免疫胶体金定位迫定位细胞器（线粒体？）细胞凋亡机理推测图1-4研究技术路线Fig1-4Technologyrouteofthisresearch 16天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导第二章天名精内酯酮荧光示踪法亚细胞定位荧光示踪技术是指将荧光基团共价结合或物理吸附在目标物分子上，示踪目标物在生物体内动态进程的一项技术（陈中举等2004）。由于该技术可以对于生物体系中荧光标记的目标分子进行实时无损检测和监控，已经成为当今亚细胞定位研究不可缺少的手段（Satorietal.2013）。鉴于该技术在医学和农业领域成功的应用，本研究采用该技术研究天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内的亚细胞定位。首先在天名精内酯酮非主要活性位点C-4位偶联荧光基团（N-甲基邻氨基苯甲酸），制成天名精内酯酮的荧光标记物，然后借助于线粒体探针MitoTrackerRGreenFM（M7514）、细胞核探针RedDot™1，采用荧光共定位法观察天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内的分布，以期探明天名精内酯酮作用的细胞器。2.1材料与方法2.1.1供试材料2.1.1.1供试菌种小麦全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminisvar.tritici）由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。2.1.1.2供试试剂天名精内酯酮（纯度>98%），由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。N-甲基邻氨基苯甲酸、羧甲氧基胺半盐酸盐、氮羟基琥珀酰亚胺（NHS）、乙二胺、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、N,N-二环己基碳二酰亚胺（DCC）、二甲基亚砜（DMSO）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；无水乙酸钠、无水硫酸钠、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇、氨水、盐酸、氯化钠，以上化剂均为分析纯，购自广州华大化学试剂有限公司；80～100目硅胶、200～300目硅胶、薄层层析板GF254购自青岛海洋化工厂；线粒体探针MitoTrackerRGreenFM（M7514）购自Invitrogen、核探针RedDot™1（200X）购买自Biotium。2.1.1.3仪器设备恒温定时磁力搅拌器（浙江金坛富华仪器有限公司）、AvanceⅢ500MHz型核磁共振仪（德国Bruker）、API2000三重四极杆液质联用仪（美国ABSciex）、U-3310紫外-可见分光光度计（日立）、FL-4500荧光分光光度计（日立）、电子天平（长沙光大科学仪器有限公司）、MH-2000电子调温电热套（北京化玻联医疗器械有限公司）、GZX-9070-MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业医疗设备厂）、SENCO-W201S恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）、SHZ-95循环水式多用真空泵（河南巩义英峪予华仪器 第二章天名精内酯酮荧光示踪法亚细胞定位17厂）、SENCOR旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）、倒置荧光光切显微镜（德国Observer.Zl，Zeiss）。2.1.2试验方法2.1.2.1天名精内酯酮荧光标记物的合成首先将N-甲基邻氨基苯甲酸经DCC、DMAP催化后与NHS生成活化的N-琥珀酰亚胺酯（Gavandeetal.2013），得到化合物（1），该化合物与乙二胺反应，使得N-甲基邻氨基苯甲酸连上一个游离的氨基（Leungetal.2014），得到化合物（2），命名为HH2；同时天名精内酯酮与羧甲氧基胺半盐酸盐反应（Boivinetal.1994），得到化合物（3），命名为HH3；最后化合物（2）与化合物（3）进一步发生缩合反应得到目标终产物，命名为TTY。具体步骤如下：分别称取N-甲基邻氨基苯甲酸302.3mg、NHS345.3mg、DMAP24.4mg于100mL三口圆底烧瓶中，用注射器移入20mL无水二氯甲烷，将反应体系接入氮气保护装置，并置于冰盐浴中；称取619.0mg的DCC置于恒压漏斗中，加入10mL无水二氯甲烷，待药品溶解后将恒压漏斗接入上述反应瓶，使DCC逐滴加入反应体系，滴加时间约为45min；撤去恒压漏斗后体系在冰盐浴下反应45min，随即室温反应16h。将反应体系过滤后依次用0.05N的HCl、饱和的氯化钠水溶液洗涤两遍，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后加入少量乙酸乙酯，置于-20℃重结晶过夜。收集黄色晶体为化合物（1），备用。移取2.404g乙二胺于三口圆底烧瓶中，加入10mL无水二氯甲烷，混匀。称取496.52mg化合物（1）置于恒压漏斗中，加入10mL无水二氯甲烷使其充分溶解，将恒压漏斗接入上述反应瓶，使化合物（1）逐滴加入反应体系，滴加时间约为120min；滴加完毕后撤去恒压漏斗室温反应24h。将反应体系过滤后，滤液用饱和的氯化钠水溶液洗涤3遍，收集有机相；然后用0.05N的HCl洗涤3遍，收集水相；用氨水将水相调置pH为10.0左右，用二氯甲烷萃取，合并萃取液，经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩、柱分离（二氯甲烷:乙醇:氨水=30:1:0.05）得到化合物（2），备用。称取无水乙酸钠196.82mg、羧甲氧基胺半盐酸盐261.6mg、天名精内酯酮496.0mg于100mL圆底烧瓶中，移入20mL绝对乙醇，氮气保护下室温反应12h。然后将反应体系过滤除去沉淀，浓缩、柱分离（石油醚:乙酸乙酯:冰醋酸=2:1:0.05）得到化合物（3），备用。分别称取化合物HH3250mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐179.2mg、DMAP9.51mg于100mL圆底烧瓶中，移入30mL无水二氯甲烷，冰盐浴反应30min。然后将150.5mg化合物HH2用少量无水二氯甲烷溶解后加入反应体系，室温反应24h。然后将反应体系过滤除去沉淀，浓缩、柱分离（石油醚:乙酸乙酯:氨水=1:5:0.05）得到天名精内酯酮荧光标记物，命名为TTY。合成路线见图2-1： 18天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导图2-1天名精内酯酮荧光标记物合成流程Fig.2-1Compositeprocessoffluorescentlabelofcarabrone2.1.2.2TTY荧光光谱测定用甲醇配制1×10-4M的TTY溶液，于荧光分光光度计扫描TTY的荧光光谱，激发光谱扫描范围为250～400nm，发射光谱扫描范围为415～800nm，激发光和发射光狭缝宽度均为10nm，扫描速度为1000nm/min。2.1.2.3TTY抑菌活性测定采用生长速率法（Rios1988）测定TTY对小麦全蚀病菌菌丝生长的抑制毒力：用DMSO将化合物HH2、HH3、TTY及天名精内酯酮配成2000μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL的母液。分别移取50μL药液加入至50mL融化的PDA培养基内，摇匀后迅速分装于3个9cm培养皿内，以加入50μLDMSO作溶剂对照，以不加任何药剂处理作空白对照。待培养平板冷却凝固后，在平板中央接入直径为40mm的靶标菌菌饼，每处理3次重复，于25℃培养，待空白对照长至2/3皿时十字交叉法测量菌落直径，按公式2-1计算抑制率，并用SPSS软件求回归方程和抑制中浓度（EC50）。对照菌落直径−处理菌落直径抑菌率（%）=×100（公式2-1）对照菌落直径−402.1.2.4TTY浓度与荧光强度关系的测定用DMSO将供试化合物TTY依次配制成1.6μM、1.2μM、0.8μM、0.6μM、0.4μM、0.2μM、0.1μM。取10μL滴于载玻片上，盖上盖玻片后做好标记，在倒置荧光光切显微镜20倍物镜、光照强度为12%和25%条件下观察化合物荧光强度，以滴加相同体积的DMSO作溶剂对照。每处理重复3次。用软件Re1ease.4.8.2SP3采集图片，用ImageJ软件统计图片的荧光强度值，然后按公式2-2计算化合物荧光强度。 第二章天名精内酯酮荧光示踪法亚细胞定位19化合物荧光强度（a.u.）=处理的荧光强度值-溶剂对照的荧光强度值（公式2-2）2.1.2.5不同光照强度对TTY荧光强度的影响用DMSO将供试化合物TTY配制成0.8μM，取10μL滴于载玻片上，盖上盖玻片后做好标记，于倒置荧光光切显微镜20倍物镜下，观察在0%、12%、25%、50%、100%光照强度下化合物荧光强度，以滴加相同体积的DMSO作溶剂对照，每处理重复3次。用软件Re1ease.4.8.2SP3采集图片，用ImageJ软件统计图片的荧光强度值，然后按公式2-2计算化合物荧光强度。2.1.2.6TTY及线粒体探针吸收动力学曲线测定将小麦全蚀病菌接种于PD培养液25℃、150r/min恒温振荡培养72h，备用。用0.2%的DMSO水溶液将供试化合物TTY依次配制成0.8μM、0.4μM、0.35μM、0.3μM，备用；线粒体探针MitoTrackerRGreenFM用DMSO配制成1mM母液，用超纯水稀释至200nM、100nM、50nM，37℃温育45min，备用。取少量菌丝用超纯水冲洗3遍，放于载玻片上，滴加20μL上述探针染液，分别于室温避光染色5min、10min、15min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min。将染色后的菌丝用超纯水漂洗3遍，在倒置荧光光切显微镜20倍物镜、25%透光率下观察化合物荧光强度，以滴加相同浓度与体积的DMSO水溶液作溶剂对照。每处理重复3次。用软件Re1ease.4.8.2SP3采集图片，用ImageJ软件统计图片中菌丝的荧光强度值。然后按公式2-2计算各处理的菌丝荧光强度值。2.1.2.7TTY洗脱曲线测定用0.2%DMSO水溶液将供试化合物TTY、HH2配制成0.4μM，备用。将小麦全蚀病菌接种于PD培养液25℃、150r/min恒温振荡培养72h。取少量菌丝用超纯水冲洗3遍，放于载玻片上，滴加20μL上述配制的TTY、HH2溶液，分别于室温避光染色90min。将染色后的菌丝用超纯水分别漂洗1次、2次、3次、4次、5次，在倒置荧光光切显微镜20倍物镜、25%透光率下观察菌丝内荧光强度，以滴加相同浓度与体积的DMSO作溶剂对照。每处理重复3次。用Re1ease.4.8.2SP3采集图片，用ImageJ软件统计图片中菌丝的荧光强度值。2.1.2.8TTY在小麦全蚀病菌菌丝内稳定性测定用0.2%DMSO水溶液将供试化合物TTY配制成0.4μM，备用。将小麦全蚀病菌接种于PD培养液中，25℃、150r/min恒温振荡培养72h。挑取新鲜菌丝用无菌水冲洗3次，称取500mg（湿重）用1mL0.4μMTTY室温避光孵育90min，取出菌丝用超纯水洗涤5次，将菌丝室温避光悬浮于无菌水中2h。收集菌丝抽滤，液氮研磨，用2mL甲醇萃取，然后于离心机4℃、8000r离心5min，取上清用0.22μm微孔过滤器过滤两遍，用于LC-HRMS分析。以未经TTY处理的菌丝样品做对照。LC-HRMS洗脱体系为梯度洗脱：10%甲醇（CH3OH/水，V/V）保持5min，40%甲醇保持5min，70%甲醇保 20天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导持5min，90%甲醇保持5min，100%甲醇保持5min。色谱柱为C18反相柱，进样量为10μL，流速为1mL/min。2.1.2.9TTY在小麦全蚀病菌内亚细胞定位（1）药品配制用DMSO将供试化合物TTY、HH2配制成0.4mM，备用；线粒体探针MitoTrackerRGreenFM用DMSO配制成1mM母液，用超纯水稀释至100nM，37℃温育45min，加入TTY，使TTY终浓度为0.4μM。设置相同浓度的HH2为对照。（2）小麦全蚀病菌染色与观察将小麦全蚀病菌接种于PD培养液，25℃、150r/min恒温振荡培养72h。取少量菌丝用超纯水冲洗3遍，用吸水纸吸干多余水分。将菌丝加入上述染色液中，室温避光染色60min，染色后用超纯水漂洗3遍。用吸水纸吸干多余水分，加入到核探针RedDot™1染色液（稀释200倍）中，30℃避光染色60min，染色后用超纯水漂洗3遍。取少量于载玻片上制片。将样品至于倒置荧光光切显微镜下观察。其中TTY采用紫外激发模块（蓝色荧光）观察（激发波长365nm，分色镜395nm，发射波长445nm，滤光片为带通）；线粒体探针MitoTrackerRGreenFM采用蓝色激发块（绿色荧光）观察（激发波长470nm，分色镜495nm，发射波长525nm，滤光片为带通）；核探针采用红色激发块（红色荧光）观察（激发波长640nm，分光镜660nm，发射波长690nm，滤光片为带通）。用Re1ease.4.8.2SP3采集图片。用ImageJ软件处理图片。共同成像区域用皮尔森共定位系数表示。2.2结果与分析2.2.1天名精内酯酮荧光标记物的合成1HNMR(500MHz,CDCl经柱分离得到化合物HH2为黄色油状物，产率为67.2%。3)δ7.42(s,1H),7.40(dd,J=7.5,1.2Hz,1H),7.32-7.27(m,1H),7.15(t,J=5.4Hz,1H),6.64(d,J=8.3Hz,1H),6.55(t,J=7.5Hz,1H),3.40(dd,J=11.6,5.8Hz,1H),3.14(s,1H),2.85(t,J=5.8Hz,1H),2.81(s,1H).13CNMR(125MHz,CDCl3)δ170.48,150.38,132.74,127.77,115.28,114.55,110.99,41.53,41.04,29.65.（核磁图谱见附图1-2）。经柱分离得到化合物HH3乳白色油状物，产率为90.3%。1HNMR(500MHz,CD3OD)δ6.17(d,J=2.0Hz,1H),5.68(d,J=2.0Hz,1H),4.53(d,J=11.5Hz,2H),3.30–3.19(m,1H),2.50(t,J=7.6Hz,1H),2.45–2.35(m,1H),2.24–2.32(m,3H),1.90(d,J=25.2Hz,3H),1.66–1.56(m,1H),1.51(dq,J=14.8,7.5Hz,1H),1.12(dd,J=10.8,5.6Hz,4H),0.99(m,2H),0.62–0.52(m,1H),0.51–0.39(m,1H);13CNMR(125MHz,MeOD)δ171.31,159.94,159.44,139.72,121.69,76.33,69.43,37.61,36.82,35.03,33.95,30.36,25.60,22.97,16.55,13.15;ESI-MS,m/z322.2[M+H]+.（核磁及质谱图谱见附图3-5）。经柱分离得到化合物TTY为淡黄色油状物，产率为61.7%。1HNMR(500MHz, 第二章天名精内酯酮荧光示踪法亚细胞定位21CDCl3)δ7.56(s,1H),7.41(dd,J=7.8,1.1Hz,1H),7.33(t,J=7.8Hz,1H),7.29(s,1H),7.28(s,1H),6.67(d,J=8.4Hz,1H),6.61(t,J=7.5Hz,1H),6.25(d,J=2.3Hz,1H),5.57(d,J=2.3Hz,1H),4.85-4.69(m,1H),4.52(s,2H),3.56(s,3H),3.16(dt,J=11.6,9.0Hz,1H),2.87(s,3H),2.32(ddd,J=20.1,13.9,6.4Hz,2H),2.25-2.18(m,2H),1.93(s,3H),1.54(dt,J=14.3,7.1Hz,1H),1.48-1.37(m,1H),1.28(t,J=7.1Hz,1H),1.07(s,3H),1.05-0.88(m,2H),0.41(dt,J=11.2,5.7Hz,1H),0.38-0.32(m,1H);13CNMR(125MHz,CDCl3)δ171.69,170.72,170.63,160.08,150.60,139.09,132.98,127.59,122.72,114.69,114.46,111.04,75.72,72.45,40.26,39.59,37.52,37.10,35.64,33.89,30.61,29.68,25.87,22.83,18.36,17.09,14.56;ESI-MS,m/z497.3[M+H]+.（核磁及质谱图谱见附图6-8）。2.2.2TTY荧光光谱测定使用荧光分光光度计以扫描模式检测化合物TTY的荧光特性，结果（图2-2）发现，TTY最大激发波长为381nm，最大发射波长为445nm。7000激发光谱6000发射广谱5000/a.u.40003000荧光强度200010000250300350400450500550600650700750800波长（nm）图2-2TTY激发和发射光谱Fig.2-2ExcitationandemissionspectraofTTY2.2.3TTY抑菌活性测定采用生长速率法测定天名精内酯酮、天名精内酯酮荧光标记物（TTY）、中间体（HH2和HH3）对小麦全蚀病菌的毒力，结果见表2-1。从表中数据可以发现供试的四种化合2均在0.9之上，说明方程相关性好，可信度高。比较四种化合物的EC物的毒力方程R50可知，天名精内酯酮、TTY以及HH3对小麦全蚀病菌抑菌活性均较高，其原因应该是这三种化合物存在相同的活性基团，可见，天名精内酯酮偶联了荧光基团后对其活性影响不大。而中间体HH2对小麦全蚀病菌的抑制中浓度为372.53μg/mL，是天名精内酯酮的13倍，是TTY的11倍，可见中间体HH2与这两种化合物毒力差异较大。说明TTY 22天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导对靶标菌的活性不是来源于该基团。表2-1TTY及中间体抑菌活性测定Table2-1AntifungalactivitytestofTYYanditsintermediates95%置信限名称毒力方程EC50（μg/mL）R295%confidenceCompoundsVirulenceequationlimits天名精内酯酮y=2.1514x+1.871628.45Bb0.980325.0727-29.0076TTYy=3.3477x+1.081833.68Bb0.997229.1432-35.4553HH3y=1.9656x+1.879338.70Bb0.932637.5656-40.0003HH2y=6.3848x-10.465372.53Aa0.9416350.2367-392.4892注：同列小写字母表示0.05水平的差异显著性，大写字母表示0.01水平的差异显著性。下表同。Note：Differentlowercaseinacolumnmeansignificantdifferenceat0.05level,differentcapitallettersinacolumnmeansignificantdifferenceat0.01level.Thesameasbelow.2.2.4TTY浓度与荧光强度关系的测定利用荧光显微镜，测定在12%和25%光照强度下，TTY浓度与荧光强度之间的关系，结果（图2-3）发现，在供试的光照强度下，随着TTY浓度的增加，该化合物荧光强度均呈指数增长。所拟合的方程分别为：y1.74271.734312%=39.558x、y25%=24.321x，相关系数分别为0.9738、0.9749。160012%25%14001200y=39.558x1.7427/a.u.100012%R²=0.97388006004001.7343荧光吸收强度y25%=24.321x200R²=0.974901.61.20.80.60.40.20.1浓度（μM）图2-3TTY浓度与荧光吸收的关系Fig.2-3RelationshipbetweenTTYconcentrationandfluorescenceabsorption2.2.5不同光照强度对TTY荧光强度的影响测定不同光照强度下TTY荧光强度，结果（图2-4）发现，随着光照强度增强，TTY荧光强度呈线性增加，测定的方程为y=356.99x-337.79，相关系数为0.9943。 第二章天名精内酯酮荧光示踪法亚细胞定位23图2-4光照强度对TTY荧光强度的影响Fig.2-4EffectsofilluminationintensityonfluorescenceintensityofTYY2.2.6TTY及线粒体探针吸收动力学曲线测定2.2.6.1TTY吸收动力学曲线为确定TTY适宜的孵育时间与浓度，以小麦全蚀病菌为供试菌株测定不同TTY浓度处理下菌丝内荧光强度随时间变化曲线。结果（图2-5）发现，用不同浓度TTY孵育小麦全蚀病菌菌丝后，孵育5～90min所有处理的菌丝荧光强度均呈上升趋势，孵育90～150min菌丝内荧光强度趋于平稳，孵育150～240min菌丝荧光强度呈下降趋势，由此可见孵育90～150min菌丝对该药剂吸收达到动态平衡，该时间段可作为药剂孵育菌丝的适宜时间。另外从图中还可以看出，随着药剂处理浓度的增加，菌丝内荧光强度值迅速增加，但在0.4μM之上再增加药剂浓度，菌丝内荧光强度变化不大，说明0.4μM处理下，菌丝对药剂的吸收接近饱和，因此在后续试验中选取0.4μM作为处理浓度。7000.8μM0.4μM0.35μM0.3μM600500/a.u.400300200荧光强度100051015306090120150180210240时间（min）图2-5TTY吸收动力学曲线Fig.2-5AdsorptionkineticcurveofTYY2.2.6.2MitoTrackerRGreenFM吸收动力学曲线 24天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导为确定线粒体探针适宜的孵育时间和浓度，以小麦全蚀病菌为供试菌株测定不同MitoTrackerRGreenFM浓度处理下菌丝内荧光强度随时间变化曲线。结果（图2-6）发现，用浓度为200nM的线粒体探针孵育菌丝，约在90～120min出现吸收动态平衡；用浓度为100nM和50nM线粒体探针孵育菌丝，约在120～180min出现吸收动态平衡。相比较而言100nM和50nM处理吸收曲线更为平滑，规律性更强。同时观察发现，经200nM浓度线粒体探针孵育后样品背景荧光相对较强，而经50nM浓度处理的菌丝荧光较弱，因此综合上述因素选用100nM浓度作为后续试验处理浓度，处理时间控制在120～180min。200nM100nM50nM700600500/a.u.400300荧光强度200100051015306090120150180210240时间（min）图2-6MitoTrackerRGreenFM吸收动力学曲线Fig.2-6AbsorptionkineticscurveofMitoTrackerRGreenFM2.2.7TTY洗脱曲线测定为确定TTY在靶标菌菌丝细胞内是否有特异性的结合位点，以中间产物HH2为对照，测定两种化合物孵育后的菌丝经不同洗脱次数洗脱后菌丝内荧光强度。结果（图2-7）发现，菌丝经TTY孵育后，洗脱两次菌丝内荧光强度迅速降低，但洗脱3次后菌丝荧光强度基本不变，由此推断该药剂在细胞内可能有特定的结合位点。而HH2所孵育的菌丝荧光强度随着洗脱次数增加呈现持续降低趋势，并且在第5次洗脱后菌丝荧光强度接近背景值，由此可见该药剂不能在细胞内结合，可随着洗脱液流失至胞外。 第二章天名精内酯酮荧光示踪法亚细胞定位25图2-7TTY及HH2洗脱曲线Fig.2-7ElutioncurvesofTTYandHH22.2.8TTY在小麦全蚀病菌菌丝内稳定性测定理想的荧光示踪标记物在成像期间应该是稳定的。因此，本试验利用LC-HRMS检测经药剂孵育90min，再经静止放置2h后小麦全蚀病菌细胞内TTY是否存在分解的情况。结果发现（图2-8），经TTY孵育处理的菌丝样品在14.18min时具有明显的色谱峰，质谱检测的分子量为497.2751（m/z,[M+H]+497.2751,[M+Na]+519.2583）与TTY分子量吻合（图2-8（a），（b）），而空白样品没有发现相同的色谱峰（图2-8（c），（d））。同时使用TF1.7.1分析软件对TTY可能存在的分解片段（图2-9）进行相应色谱峰匹配搜索，发现从6～25min没有可匹配的峰出现（附图9）。因此，综合上述结果可以确定TTY在试验期间是稳定的。 26天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导图2-8TTYLC-HRMS检测Fig.2-8LC-HRMSanalysisofTTY 第二章天名精内酯酮荧光示踪法亚细胞定位27NHOHNNHOOONOTTYNHONHONH2OHNHC8H9NO2C10H15N3Om/zcalcd([M+H]+)152.0712and([M+Na]+)174.0531.m/zcalcd([M+H]+)194.1293and([M+Na]+)216.1113.NHOHNNH2ONOHOOH2NOHC12H18N4O3C2H5NO3m/zcalcd([M+H]+)267.1457and([M+Na]+)289.1277.m/zcalcd([M+H]+)92.0348and([M+Na]+)114.0167.HOOOOOOONOC15H20O3C17H23NO5m/zcalcd([M+H]+)249.1491and([M+Na]+)271.1310.m/zcalcd([M+H]+)322.1654and([M+Na]+)344.1474.NH2HNOOONOC19H29N3O4m/zcalcd([M+H]+)364.2236and([M+Na]+)386.2056.图2-9TTY可能的分解片段Fig.2-9PossibledecomposedproductsofTTY2.2.9TTY在小麦全蚀病菌内亚细胞定位用TTY示踪天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内分布位置，结果（图2-10、附图10-11）发现，TTY在菌丝内分布位置基本与线粒体探针MitoTrackerRGreenFM重合（图2-10e），而TTY和核探针RedDot™图像不能重合（图2-10f）。计算TTY和MitoTrackerRGreenFM分布区域的皮尔森共定位系数为0.83。同时，本试验观察经化合物HH2孵育后的菌丝，未检测到荧光信号，说明化合物HH2在菌丝内没有结合位点，可能随着洗脱而流失。 28天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导图2-10天名精内酯酮荧光示踪（a）示明场菌丝；（b）示TTY在菌丝内荧光成像(发射波长445nm)；（c）示MitoTrackerRGreenFM在菌丝内荧光成像（发射波长525nm）；（d）示RedDot™在菌丝内荧光成像（发射波长690nm）；（e）示TTY和MitoTrackerRGreenFM叠加图像；（f）示TTY和RedDot™叠加图像；（g）示TTY、MitoTrackerRGreenFM和RedDot™叠加图像；（h）示TTY和MitoTrackerRGreenFM共定位剖面。标尺为2μm；×100。Figure2-10.Fluorescenceimagesofhyphaeco-stainedwithTTY,MitoTrackerRGreenFMandRedDot™.(a)Bright-fieldimageofthemycelialcellsinsample;(b)ImageofTTY(emissionwavelength,445nm);(c)ImageofMitoTrackerRGreenFM(emissionwavelength,525nm);(d)ImageofRedDot™(emissionwavelength,690nm);(e)overlayimageof(bandc);(f)overlayimageof(bandd);(g)overlayimageof(b,candd);(h)Co-localizationprofilebetweenTTYandMitoTrackerRGreenFM.Scalebar:2μm;×100.2.3讨论荧光标记物是一类利用荧光信号有效表达目标物生物进程的荧光传感器（Kobayashietal.2009）。在农药研究领域，基于农药合成的荧光标记物不断的为我们揭示着农药在植物与微生物体内的生物进程。如Wang等（2014）合成的氟虫腈的糖基荧光标记物使得氟虫腈在蓖麻内的转运路线变得可视；Xu等（2007）用2-氨基吖啶酮（2-Aminoacridone）标记壳寡糖，使得壳寡糖在辣椒疫霉内分布可以追踪。因此借助于荧光标记物研究目标化合物在生物体内亚细胞分布切实可行。有研究指出，如果荧光标记物不具母体化合物的代表性将使得检测结果不具实际意义，同样荧光标记物进入生物体内如果荧光基团脱落，检测结果也不能真实反映母体化合物的真实动态。因此，荧光示踪法亚细胞定位的关键在于荧光标记物的代表性和稳定性（Lichtmanetal.2005）。本研究合成的天名精内酯酮荧光标记物TTY具备以下三个特点：其一，偶联的荧光基团较小。该特点一方面保障了化合物进入细胞受到较小的阻力，另一方面尽可量的减少了荧光基团对母体化合物分子构型的影响。经TTY吸收动力学曲线测定发现，TTY能够穿透小麦全蚀病菌的细胞壁及细胞膜，顺利进入菌体内部（图2-5）。其二，保留了母体化合物的生物活性。TTY合成时修饰位点选择在C-4位，避开了天名精内酯酮主要活性基团α-亚甲基-γ-丁内酯结 第二章天名精内酯酮荧光示踪法亚细胞定位29构（冯俊涛等2007;Xuetal.2007）。皿内抑菌活性测试证实，天名精内酯酮和TTY的EC50分别是28.45和33.68μg/mL，经分析无显著差异（表2-1）。其三，稳定性好。本研究选择了酰胺键和碳二亚胺键合，经LC-HRMS检测，TTY在菌丝内稳定性好，未发现化合物可能解离的荧光基团等分子片段（图2-9）。总之，TTY具有母体化合物代表性，稳定性好，实用性强，可真实反映母体化合物的生物进程。除应用于本研究外，还可以扩展应用于天名精内酯酮在植物体内的示踪，以及在其它靶标菌内的定位研究，也可以作为倍半萜内酯化合物一类荧光探针应用于其他领域，具有进一步应用的价值。2.4小结本研究合成了天名精内酯酮的荧光标记物TTY，测定了该标记物荧光光广谱及对小麦全蚀病菌的抑菌活性，检测了该标记物在靶标菌内的稳定性，并以此示踪了天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内分布，主要得到以下结论：（1）在天名精内酯酮非主要活性位点C-4位偶联荧光基团合成了天名精内酯酮的荧光标记物TTY，该化合物分子量为496.3，最大激发波长为381nm，最大发射波长为445nm。（2）TTY对小麦全蚀病菌抑制中浓度为33.68μg/mL，与母体化合物天名精内酯酮（EC50为28.45μg/mL）无显著差异；TTY洗脱曲线测定结果表明TTY在靶标菌菌丝内有特异性结合位点；LC-HRMS检测TTY在小麦全蚀病菌内稳定性表明，TTY在试验时间内比较稳定，未检测到该化合物分解的分子片段。（3）TTY和MitoTrackerRGreenFM吸收动力学曲线表明，TTY适宜孵育浓度为0.4μM，孵育时间为90～150min；MitoTrackerRGreenFM适宜孵育浓度为100nM，孵育时间为120～180min。（4）用TTY示踪天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内分布，结果表明，TTY在菌丝内分布位置基本与线粒体探针MitoTrackerRGreenFM重合，与核探针不重合。TTY与MitoTrackerRGreenFM皮尔森共定位系数为0.83，由此，推测天名精内酯酮作用的细胞器是线粒体。 30天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导第三章天名精内酯酮免疫荧光法亚细胞定位免疫荧光技术是将免疫学与荧光标记技术结合起来的一项技术，该技术的原理在于借助于抗体（经荧光标记的抗体）对抗原识别的特性，使得抗原的分布可视化。因此，采用该技术进行亚细胞定位首先要获得特异性强的抗体。一般情况下，由免疫动物制备的多克隆抗体或单克隆抗体均可满足免疫荧光试验的要求。本研究鉴于多克隆抗体容易制备、免疫周期短等优点采用多克隆抗体进行免疫荧光试验。由于天名精内酯酮为小分子化合物，本身不具备免疫原性，须制备人工抗原。但该化合物分子中没有可以和载体蛋白直接偶联的基团，还需要对其进行衍生合成，制备半抗原。而第二章合成TTY的中间体HH3，是在天名精内酯酮非主要活性位点C-4位衍生合成的含羧基的并且具有一定间隔臂的化合物，具备半抗原的要求，可以用于制备人工抗原。基于此，本章以HH3作为半抗原，以牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）作为载体蛋白制备人工抗原，然后通过免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体，利用免疫荧光技术观察天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内的分布，旨在明确天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位。3.1材料与方法3.1.1供试材料3.1.1.1供试菌种小麦全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminisvar.tritici）由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。3.1.1.2供试试剂及耗材天名精内酯酮（纯度>98%），由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。BSA、OVA、费氏不完全佐剂（FICA）、费氏完全佐剂（FCA）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（H+L）、Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC、纤维素酶、崩溃酶、溶壁酶购自Sigma，线粒体探针MitoTrackerRRedCMXRos购自Invitrogen，Sepharose-4B亲和层析柱购自Pharmacia，哌嗪-1,4-二乙磺酸（PIPES）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）购自BioBasjcine，氯甲酸异丁酯、三正丁胺、NHS、DCC、DMSO、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、Tween-20、四甲基联苯胺（TMB）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司，透析袋（截留量14000）购自上海华美生物工程有限公司，丙酮、乙酸乙酯、石油醚（60～90℃）、二氯甲烷、甲醇、吡啶、硫酸镁、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸铵、柠檬酸、硫酸、30%双氧水，以上化剂均为分析纯，购自广州华大化学试剂有限公司，96孔酶标板购自Coring-Costar，BALB/c雌性小鼠（6周龄）购自中国第四军医大学。 第三章天名精内酯酮免疫荧光法亚细胞定位313.1.1.3仪器设备恒温定时磁力搅拌器（浙江金坛富华仪器有限公司）、CR22G高速冷冻离心机（日本Hitachi）、伯乐小型垂直电泳槽165-8001（美国Bio-Rad）、TECANSunrise酶标仪（奥地利TECAN）、WELLWASHPLUS型洗板机（美国Thermo）、D8611超纯水净化仪（美国Branstead）、激光共聚焦显微镜（德国，Leica，TCC-SP8）。3.1.2试验方法3.1.2.1天名精内酯酮人工抗原的制备（1）免疫原制备采用活化酯法（Weetall1976）。称取15.6mg的半抗原（HH3）、41.2mgDCC、32.0mgNHS于5mL的圆底烧瓶中，移入1mL无水DMF，室温避光反应5h。将反应体系于4℃下10000r/min离心10min，取上清液得到A液；称取50mgBSA于25mL的圆底烧瓶中，加入5mL碳酸盐缓冲溶液（CBS，pH9.6），使BSA充分溶解，得到B液；将A液置于恒压漏斗中，在冰浴、磁力搅拌下将A液逐滴加入B液中，滴加时间为30min。滴加完毕维持条件不变，反应6h。将反应混合液加入透析袋中，于磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）中4℃下透析3d，前两天每4h更换一次透析液，以后每8h更换一次透析液。透析完毕后，分装，于-20℃保存，记为T-BSA。制备路线如图3-1：图3-1T-BSA制备路线Fig.3-1SynthesisofT-BSA（2）包被原制备采用混合酸酐法（Gendloffetal.1986）。称取15.6mg的半抗原、77μL三正丁胺、22μL氯甲酸异丁酯于5mL的圆底烧瓶中，移入1mL无水DMF，室温反应5h得到A液；称取88mgOVA于25mL的圆底烧瓶中，加入10mLDMF与水的混合液，混合比例为DMF:H2O（V/V）=1:4，待OVA溶解后将A液置于恒压漏斗中，在冰浴、磁力搅拌下将A液逐滴加入B液中，滴加时间为30min。滴加完毕维持条件不变，反应6h。将反应混合液加入透析袋中，于磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）中4℃下透析3d，前两天每4h更换一次透析液，以后每8h更换一次透析液。透析完毕后， 32天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导分装，于-20℃保存，记为T-OVA。制备路线如图3-2：图3-2T-OVA制备路线Fig.3-2SynthesisofT-OVA3.1.2.2人工抗原鉴定（1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）法：天名精内酯酮半抗原偶联上载体蛋白后，其分子质量会与载体蛋白的相对分子质量存在差异，因此可以采用SDS-PAGE法验证人工抗原是否制备成功。采用电泳试剂盒测定。（2）紫外吸收扫描法：用pH7.4的PBS将BSA、T-BSA、OVA、T-OVA配制成100μg/mL，在紫外-可见分光光度计上扫描240～320nm紫外吸收峰，并通过公式3-1计算人工抗原蛋白浓度。蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260（公式3-1）（3）人工抗原偶联比测定（Garcia-Febreroetal.2014）：将2μL浓度为10mg/mL的人工抗原溶液（0.1%TFA，50%甲腈，50%水）与2μL浓度为10mg/mL新制备的trans-3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸溶液（0.1%TFA，50%甲腈、50%水）混匀，取1μL点靶，通过MALDI-TOF/MS测定人工抗原的相对分子质量，并根据公式3-2计算偶联比。偶联物相对分子量−载体蛋白相对分子量偶联比=（公式3-2）半抗原相对分子量3.1.2.3天名精内酯酮多克隆抗体制备（1）免疫原乳化采用涡旋混合法乳化免疫原（侯吉波等1990）：将低温保存的免疫原T-BSA于4℃下过夜，用生理盐水稀释后加入等体积的费氏佐剂，于涡旋仪上高速旋转2h。然后用注射器移取少量免疫原乳剂滴入静置的冷水中，若乳剂无扩散现象发生，证明免疫原乳剂制备成功。（2）BALB/c小鼠免疫 第三章天名精内酯酮免疫荧光法亚细胞定位33采用张权庚等（2010）的方法制定免疫方案（表3-1）：首次免疫取0.1mg免疫原与等体积FCA混合，采用背部皮下多位点注射方式注射6只6周龄小鼠（昆白系BALB/c）。两周后用FICA乳化与首次免疫相同剂量的免疫原进行加强免疫，之后每隔10d进行一次加强免疫，免疫原使用剂量与第1次加强免疫相同，自第2次加强免疫起，每次免疫后第7天通过断尾取血法收集小鼠血清，测定抗血清效价。冲击免疫在第3次加强免疫后10d，用两倍剂量的免疫原不加佐剂直接腹腔注射免疫。冲击免疫3d后，摘除眼球取血，拉颈处死，同时小鼠脾脏用于后续单克隆抗体制备。表3-1免疫方案Table3-1Protocolforimmunization免疫时间免疫间隔时间免疫剂量免疫方法ImmunizationTimeintervalImmunedosageVaccinatemethods0.1mg/只免疫原首次免疫-背部皮下多点注射+等体积FCA0.1mg/只免疫原第1次加强免疫2周背部皮下多点注射+等体积FICA0.1mg/只免疫原第2次较强免疫10d背部皮下多点注射+等体积FICA0.1mg/只免疫原第3次加强免疫10d背部皮下多点注射+等体积FICA0.2mg/只免疫原冲击免疫10d腹腔注射+等体积生理盐水注：a抗血清效价是Goatanti-MouseHRP-IgG稀释3000倍时测得；b表中数据是4次重复的平均值。Note:a3000dilutionforGoatanti-MouseHRP-IgG；bValuesareaveragesoffourreplications.（3）抗血清的纯化将收集到的新鲜血液在室温下静置1h，凝固后，用针剥离血球与离心管壁，置4℃下过夜。次日，低温离心10min（4000rpm，4℃）。取上清液，即为抗血清。采用Sepharose-4B亲和层析柱纯化抗体，参照试剂说明书进行，获得的多克隆抗体于-20℃保存，备用。（4）抗血清效价的测定采用间接非竞争ELISA检测抗血清应答效价（ManclusandMontoya1995）：①主要溶液配制碳酸盐缓冲溶液（CBS，pH9.6）：NaCO31.59g、NaHCO32.93g，超纯水1000mL，pH9.6。 34天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）：NaCl8.0g、KCl223.6mg、Na2HPO41.1356g、KH2PO4204.13mg，超纯水1000mL，pH7.4。酶标板洗涤液（0.05%PBST）：含有0.05%的Tween-20磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）。底物溶液：A液：柠檬酸盐缓冲溶液（CPBS），称取柠檬酸21g，Na2HPO4·12H2O71.6g加超纯水溶解后定容至1000mL，4℃下保存备用。B液：浓度为10mg/mL的TMB溶液：称取TMB10mg溶于1mLDMSO中。C液：0.65%H2O2溶液：0.195mL3%H2O2，加入9.805mL超纯水。配制底物溶液时，取9.875mLA液，0.1mLB液，25μLC液，三者混匀，现配现用。封闭液（1%OVA）：称取OVA1g，溶于100mLPBS溶液中，4℃避光保存。终止液（2MH2SO4）：11.8mL98%的H2SO4，溶于80mL超纯水中，冷却后定容至100mL。酶标二抗稀释液：取辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（H+L）30μL加入90mL1%OVA。②包被原和抗体工作浓度的确定包被：用CBS倍比稀释包被原（1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL），以100μL/孔分别加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜。封闭：向96孔酶标板中加入1%OVA封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h。加样：用PBS倍比稀释抗血清至合适的浓度，100μL/孔加入到96孔酶标板中，空白对照孔加入等量的PBS，37℃孵育1h。加酶标二抗：用含有1%OVA的PBS溶液将酶标二抗稀释至工作浓度，100μL/孔加入到96孔酶标板中，37℃孵育1h。（以上每步结束后都用PBST洗涤液洗涤3次，每次洗涤后都将酶标板拍干。）显色：以100μL/孔的剂量，将底物溶液加入到96孔酶标板中，避光显色15min。终止反应：向96孔酶标板中加入2MH2SO4溶液，50μL/孔，于450nm波长下读取OD值。最终以450nm波长，吸光度值为1.0时的包被原和抗体的稀释倍数作为工作浓度。③抗血清效价的测定以包被原的工作浓度包被96孔酶标板，分别将抗血清和阴性血清倍比稀释，使用间接非竞争ELISA法测定OD值。空白对照孔加入PBS。以阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值>2.1（P/N>2.1）的最大稀释倍数作为抗血清的最终效价。3.1.2.4免疫荧光法亚细胞定位（1）药品配制 第三章天名精内酯酮免疫荧光法亚细胞定位35天名精内酯酮工作液：用DMSO将天名精内酯酮配制成0.2mM，用灭菌超纯水稀释至0.2μM，备用。线粒体探针染色液：用DMSO将MitoTrackerRRedCMXRos（M7512）配制成1mM母液，用超纯水稀释至100nM，37℃孵育45min，备用。MSB（漂洗液1）：哌嗪-1,4-二乙磺酸50mM，EGTA2mM，MgSO42mM，pH6.9。固定液：哌嗪-1,4-二乙磺酸50mM，EGTA2mM，MgSO42mM，pH6.9加入0.1%的TritonX-100，3.7%（w/v）Parafomaldehyde。酶解液：将纤维素酶:崩溃酶:溶壁酶=1:1:1（M/M）配制成10g/L的混合酶液，80r/min，30℃温育50min。将混合酶液经孔径为0.45μm细菌过滤器过滤除去杂质，备用。PBS（漂洗液2）：NaCl0.15M，KCl2.7mM，KH2PO41.2mM，Na2HPO46.5mM，pH7.2。封闭液：用pH为7.2的PBS将BSA配制成浓度为5g/L，备用。第一抗体工作液：用pH为7.2的PBS将天名精内酯酮多克隆抗体TPAbs-4稀释2000倍，备用。第二抗体工作液：用pH为7.2的PBS将Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC母液稀释100倍，备用。（2）小麦全蚀病菌免疫染色①小麦全蚀病菌菌丝前处理将小麦全蚀病菌接种于PD培养液25℃、150r/min恒温振荡培养72h。取少量菌丝用灭菌超纯水冲洗3遍，用吸水纸吸干多余水分。将菌丝浸泡于0.2μM的天名精内酯酮药剂中25℃孵育12h，用灭菌超纯水冲洗3遍，备用。以未经天名精内酯酮孵育的菌丝做对照。②线粒体探针染色将前处理后的菌丝浸泡于100nM线粒体探针MitoTrackerRRedCMXRos（M7512）中，25℃避光染色2h，备用。③免疫染色固定：将经线粒体探针染色后的菌丝用超纯水漂洗3遍，用吸水纸吸干多余水分，迅速放入固定液中，25℃避光固定40min。漂洗：用漂洗液1（MSB）避光漂洗3次，每次5min。细胞壁酶解：将样品用吸水纸吸干多余水分，迅速放入酶解液中，25℃避光酶解5min。漂洗：将酶解后的菌丝用漂洗液2（PBS）避光漂洗3次，每次5min。封闭非特异性结合位点：将样品转移至浓度为5g/L的BSA溶液中，25℃避光静置30min。特异性抗体（第一抗体）与抗原结合：将样品转至第一抗体TPAbs-4工作液中，37℃ 36天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导保温保湿、避光孵育1h。漂洗：将孵育后的菌丝用漂洗液2（PBS）避光漂洗3次，每次5min。第二抗体与第一抗体识别：将样品转移至第2抗体工作液中，37℃保温保湿、避光孵育1h。漂洗：将孵育后的菌丝用漂洗液2（PBS）避光漂洗3次，每次5min。样品避光保存于pH为7.2的PBS中。以上试验设不经天名精内酯酮处理的菌丝为对照。（3）样品观察将样品至于激光共聚焦显微镜60倍油镜下观察。其中第二抗体Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC采用488nm激发器激发，于520～550nm波段收集发射信号；线粒体探针MitoTrackerRRedCMXRos（M7512）采用561nm激发器激发，于630～660收集发射信号。用LeicaApplicationSuiteAdvancedFluorescence软件采集图片。3.2结果与分析3.2.1人工抗原鉴定（1）采用SDS-PAGE鉴定人工抗原，结果如图3-3A，可以看出T-BSA、T-OVA电泳条带分别与相应的载体蛋白BSA、OVA电泳条带相对滞后，说明T-BSA、T-OVA分子量比相应的载体蛋白有一定增加，初步说明半抗原与载体蛋白偶联成功。（2）采用紫外吸收扫描法鉴定人工抗原，结果如图3-3B，可以看出，人工抗原T-BSA、T-OVA最大紫外吸收峰分别为268nm和270nm，而载体蛋白最大紫外吸收峰均为278nm。可见，人工抗原最大吸收峰相对于载体蛋白最大吸收峰发生了明显的蓝移，进一步证明半抗原与载体蛋白偶联成功。由公式3-1计算T-BSA蛋白浓度为3.515mg/mL，T-OVA蛋白浓度为5.212mg/mL。（3）使用MALDI-TOF/MS测定人工抗原偶联比，测得T-BSA相对分子质量为69129.93，T-OVA的相对分子质量为48598.27。而BSA的相对分子质量为66528.209，OVA的相对分子质量为44326.309，与载体蛋白相比，T-BSA和T-OVA的相对分子质量均有增加，根据公式3-2，求得T-BSA的偶联比为8.1:1，T-OVA的偶联比为13.3:1。 第三章天名精内酯酮免疫荧光法亚细胞定位37AB图3-3人工抗原鉴定结果A为人工抗原和载体蛋白的SDS-PAGE图，B为人工抗原和载体蛋白的紫外吸收图。Fig.3-3Identificationofartificialantigen.(A)SDS-PAGEanalysisofhapten-proteinconjugates,(B)UVspectraofhapten-proteinconjugates.3.2.2多克隆抗体效价测定用免疫原T-BSA免疫6只BALB/c小鼠，最终测定纯化后的多克隆抗体蛋白浓度及效价见表3-2。由表中数据可知，供试小鼠均产生了一定的应答反应，所测得的多克隆抗体效价在0.64×105～2.56×105之间，效价大于1×105的小鼠有1#、4#、5#，其中4#小鼠产生的效价最高，达到了2.56×105，纯化后的多克隆抗体浓度为4.52mg/mL。因此将4#免疫小鼠获得的抗体TPAbs-4用于后续试验。表3-2间接ELISA法测定抗血清效价Table3-2DeterminationofantiserumtitersbyindirectELISA抗血清浓度（mg/mL）小鼠编号抗血清编号抗血清效价（×105）ConcentrationofantiserumNO.ofBALB/cNO.ofantiserumAntiserumtiters（×105）(mg/mL)1#TPAbs-14.43±0.111.282#TPAbs-24.11±0.130.643#TPAbs-33.96±0.090.644#TPAbs-44.52±0.062.565#TPAbs-54.03±0.131.286#TPAbs-64.30±0.120.64注：表中数据是阳性对照OD值/阴性对照OD值>2.1（P/N>2.1）的最大稀释倍数。Note:DataintablewerethemaximumdilutionratioofOD(positivecontrol)/OD(nagetivecontrol)>2.1（P/N>2.1） 38天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导3.2.3免疫荧光法亚细胞定位将小麦全蚀病菌菌丝经天名精内酯酮处理后，用线粒体探针MitoTrackerRRedCMXRos孵育菌丝，然后用上述制备的TPAbs-4作为第一抗体对天名精内酯酮进行识别，随即用Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC作为第二抗体识别第一抗体，采用激光共聚焦显微镜观察Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC在小麦全蚀病菌细胞内分布情况，结果如图3-4。由图可知，Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC在菌丝细胞内分布和MitoTrackerRRedCMXRos基本吻合（图3-4d-e），计算分布区域的皮尔森共定位系数为0.86（图3-4f），该结果提示天名精内酯酮主要存在于线粒体。同时，未经天名精内酯酮处理的菌丝未检测到Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC的荧光信号，说明Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC分布取决于天名精内酯酮的分布。图3-4天名精内酯酮免疫荧光定位（a）示明场菌丝；（b）示Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC菌丝内荧光成像(520～550nm)；（c）示MitoTrackerRRedCMXRos菌丝内荧光成像(630～660nm)；（d）示Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC和MitoTrackerRRedCMXRos菌丝内重叠呈像；（e）示（a）、（b）和（c）重叠图像；（f）示Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC和MitoTrackerRRedCMXRos共定位剖面。标尺为5μm；×60。Figure3-4Confocalimmunofluorescenceimagesofhyphaetreatedwithcarabroneandco-stainedwithAnti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC,andMitoTrackerRRedCMXRos.(a)Bright-fieldimageofthehyphae;(b)Greenemission(520-550nm);(c)Redemission(630-660nm);(d)OverlayimageofAnti-MouseIgG(wholemolecule)-FITCandMitoTrackerRRedCMXRos;(e)Overlayimageof(a,bandc);(f)Co-localizationprofilebetweenAnti-MouseIgG(wholemolecule)-FITCandMitoTrackerRGreenFM.Scalebar:5μm;×60. 第三章天名精内酯酮免疫荧光法亚细胞定位393.3讨论Juan等（2010）指出半抗原设计首先要保持母体化合物的结构，其次间隔臂的衍生位点要远离母体化合物的主要活性位点，这样半抗原偶联载体蛋白后，才能够充分暴露母体化合物的活性基团，最大限度刺激动物产生特异性免疫应答反应，从而获得高亲和力、高特异性的抗体。天名精内酯酮化合物本身没有可以和载体蛋白直接偶联的活性基团，而本研究第二章所合成的HH3是远离了天名精内酯酮主要活性基团，在C-4位衍生的具有一定间隔臂的含有羧基的化合物，经测定其活性和母体化合物无显著差异（表2-1）。可见HH3符合半抗原的特征，以该化合物偶联载体蛋白免疫BALB/c小鼠能够刺激小鼠机体产生特异性免疫应答反应。另外，机体的免疫应答是一个复杂的生理生化过程，包括免疫系统对抗原分子的识别、免疫细胞的增殖和分化以及最终发生免疫效应。刘建欣和郑昌学（2002）指出，当机体免疫系统对某一抗原产生免疫应答后，如果在一定时间内机体再次经该抗原的刺激，机体将会产生比第一次更快和更强的二次免疫应答。因此，典型的免疫策略就是反复使用抗原刺激动物的免疫系统，扩大动物体内的抗原反应性B细胞的数量，增强特异性抗体的数量。但免疫应保持合理的时间间隔，一般间隔为10～20d。如果在第一次免疫后，过快的进行第二次免疫，则很容易引起免疫抑制（周丽萍2013）。本研究制备多克隆抗体一共进行了5次免疫注射，除初次免疫与第一次加强免疫时间间隔为2周外，其余免疫时间间隔均为10d。经血清效价追踪发现，小鼠产生的应答效应是逐渐增强的，最终获得的多克隆抗体TPAbs-4效价为2.56×105，该效价高于Liu等（2016）报道的多种农药的多克隆抗体效价。以TPAbs-4作为天名精内酯酮第一识别抗体进行免疫荧光定位发现，只有经天名精内酯酮处理的样品才能观察到Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC的分布，说明TPAbs-4对天名精内酯酮特异性强。因此，本研究获得的多克隆抗体TPAbs-4效价高，特异性强，适合用于天名精内酯酮免疫荧光定位分析。3.4小结本研究以HH3为半抗原，以BSA为免疫原载体蛋白，以OVA为包被原载体蛋白制备了人工抗原T-BSA、T-OVA，以T-BSA作为免疫原对BALB/c小鼠进行免疫，获得了天名精内酯酮多克隆抗体，利用该抗体对天名精内酯酮进行免疫荧光亚细胞定位研究，主要得到以下结论：（1）成功制备了人工抗原T-BSA、T-OVA，其中制得免疫原T-BSA蛋白浓度为3.515mg/mL，包被原T-OVA蛋白浓度为5.212mg/mL。（2）用免疫原T-BSA免疫6只BALB/c小鼠，其中3只小鼠均产生较好的应答抗体，4#小鼠产生的抗体效价最高，效价为2.56×105，其次1#、5#小鼠的效价也在1×105以上。 40天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导（3）以4#小鼠制备的抗体TPAbs-4作为第一识别抗体，以Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC作为第二识别抗体，对小麦全蚀病菌内天名精内酯酮进行识别，结果发现，Anti-MouseIgG(wholemolecule)-FITC的分布和线粒体探针MitoTrackerRRedCMXRos基本吻合，计算分布区域的皮尔森共定位系数为0.86，可见天名精内酯酮主要分布于线粒体。（4）本章结果验证了荧光示踪法亚细胞定位的结论。 第四章天名精内酯酮免疫金法亚细胞定位41第四章天名精内酯酮免疫金法亚细胞定位免疫胶体金技术是继荧光素、酶、同位素三大标记技术之后的一种新型免疫标记技术（萨仁高娃等2007），由于该技术不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，被广泛的应用于病害的检测以及病原在寄主中的亚细胞定位研究（Achachietal.2014;Liuetal.2011;Pakdeletal.2015）。同免疫荧光技术类似，免疫胶体金技术也是基于免疫学原理的一项技术，同样对抗体的特异性要求较高。单克隆抗体因具备特异性强、性状均一、效价高等优点，在胶体金技术中被广泛采用（冯志敏2006）。本章以第三章获得的免疫应答效果最好的4#小鼠的脾细胞作为融合细胞，制备单克隆抗体，然后以制得的单克隆抗体作为第一识别抗体，以12nmColloidalGold-AffiniPureGoatAnti-MouseIgG（H+L）作为第二识别抗体，研究天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位，并验证荧光示踪和免疫荧光定位的结论。4.1材料与方法4.1.1供试材料4.1.1.1供试菌种小麦全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminisvar.tritici）由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。4.1.1.2供试试剂及耗材天名精内酯酮（纯度>98%），由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。免疫原（T-BSA）、包被原（T-OVA）根据第三章所述自制，BSA、OVA、FICA、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（H+L）、硫酸链霉素、氨苄青霉素钠、HAT贮液（50×）、HT贮液（100×）、8-氮鸟嘌呤贮液（8-AG，100×）、锇酸、醋酸双氧铀、柠檬酸铅购自Sigma，DMEM培养基（高糖）购自Gibcorl，胎牛血清（FBS）购自Invitrogen，4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液购自Amresco，聚乙二醇（PEG）购自Merck，DMSO、Tween-20、TMB购自阿拉丁试剂（上海）有限公司，40µm细胞筛网购自BDFalcon，LRWhite树脂购自SPI，12nmColloidalGold-AffiniPureGoatAnti-MouseIgG（H+L）购自Jackson，封闭用山羊血清（原液）购于Solarbio，碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、辛酸、硫酸铵、柠檬酸、硫酸、30%双氧水，以上化剂均为分析纯，购自广州华大化学试剂有限公司，96孔酶标板购自Coring-Costar，200目镍网（英国）购自GilderGrids，BALB/c雌性小鼠（6周龄）购自中国第四军医大学。4.1.1.3仪器设备TECANSunrise酶标仪（奥地利TECAN）、WELLWASHPLUS型洗板机（美国 42天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导Thermo）、D8611超纯水净化仪（美国Branstead）、CR22G高速冷冻离心机（日本Hitachi）、MIR-262恒温培养箱（日本SANYO）、NU-4780型自动水套式CO2培养箱（美国NUAIRE）、透射电镜JEM-1230（日本Hitachi）。4.1.2试验方法4.1.2.1BALB/c小鼠免疫及抗血清效价测定见第三章。4.1.2.2细胞融合（1）骨髓瘤细胞制备将FICA注射于BALB/c雌性小鼠腹腔，0.2mL/只，正常饲喂一周，备用。取SP2/0骨髓瘤细胞解冻后，用含20µg/mL8-AG的DMEM完全培养基培养一周，选取存活下来的细胞接种到上述小鼠腹腔中，正常饲喂至小鼠腹腔膨大，无菌采集腹水，收集获得的SP2/0骨髓瘤细胞，于DMEM完全培养基中扩大培养，备用。（2）饲养层细胞的制备将健康的BALB/c小鼠拉颈处死，用自来水冲洗后于75%的乙醇中浸泡5min，在无菌超净台上将小鼠固定于解剖板中央，用眼科剪剪开小鼠腹下部，暴露腹膜，随即用酒精棉擦拭对小鼠腹部进行消毒。取10mLDMEM基础培养液注入小鼠腹腔内，然后用棉球揉动腹部，使溶液浸入各个部位，待培养基变为黄色后吸取腹腔液体到10mL离心管中，1000r/min离心5min，收集细胞。用HAT选择培养基稀释细胞至1×105个/mL，铺于96孔细胞培养板，100µL/孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，选择透亮、贴壁牢固细胞备用。（3）小鼠免疫脾细胞的制备将处死的4#小鼠置于75%的乙醇中浸泡5min，在无菌超净台上将其固定于解剖板中央，用眼科剪剪开小鼠腹部，暴露腹膜。无菌操作取出脾脏放于灭菌的培养皿中，用DMEM培养液清洗，去除黏附的血液和多余的脂肪，用无菌剪刀将其剪成小块。将BD40µm孔径的细胞筛网放在50mL一次性离心管管口，取小块脾脏组织放在筛网上，用1mL的无菌玻璃注射器的内芯研磨脾脏，并且边研磨边滴加DMEM培养液，滴加10mL左右。收集的脾细胞于离心机1500rpm离心10min，弃上清，用少量的DMEM培养基重悬，并用台盼蓝染色计数（Karstenetal.1985）。（4）参照Hansbrough等（1989）方法进行细胞融合①将上述制备的脾细胞和骨髓瘤细胞按照5:1的比例混合在50mL离心管中，加入10mLDMEM培养基，吹打混匀。室温下1000rpm离心8min，去除上清液。②将离心管底部放于EP管板上，轻轻振荡混匀两种细胞，然后将离心管放入37℃水浴中。③一边匀速摇动水浴中的离心管，一边匀速加入1mLPEG，控制在45s内加完， 第四章天名精内酯酮免疫金法亚细胞定位43随即37℃温浴静置1min。然后加入25mL的DMEM培养基，使PEG失去作用。具体操作方法为，首先匀速加入1mLDMEM溶液，1min内加完；随即匀速加入4mLDMEM溶液，2min内加完；最后匀速加入20mLDMEM溶液，2min内加完。加完DMEM溶液后37℃温浴静置10min。④温浴静置后于离心机上1000rpm离心8min，去除上清液。用预热HAT培养液轻轻吹吸沉积的细胞，待细胞悬浮均匀后继续加入HAT培养液至45mL。⑤将悬浮均匀的细胞加入到铺有饲养细胞的96孔板中，100µL/孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。⑥隔日检查有无污染，待第4天采用半量换液法更换板内培养液，第8天更换HTDMEM培养液。4.1.2.3杂交瘤细胞的筛选及对天名精内酯酮敏感性测定（1）主要溶液配制碳酸盐缓冲溶液（CBS，pH9.6）：NaCO31.59g、NaHCO32.93g，超纯水1000mL，pH9.6。磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）：NaCl8.0g、KCl223.6mg、Na2HPO41.1356g、KH2PO4204.13mg，超纯水1000mL，pH7.4。酶标板洗涤液（0.05%PBST）：0.5mL的Tween-20加入至1000mL磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）中。底物溶液：A液：柠檬酸盐缓冲溶液（CPBS）：称取柠檬酸21.0g，Na2HPO4·12H2O71.6g加超纯水溶解后定容至1000mL，4℃下保存备用。B液：浓度为10mg/mL的TMB溶液：称取TMB10mg溶于1mLDMSO中。C液：0.65%H2O2溶液：0.195mL3%H2O2，加入9.805mL超纯水。配制底物溶液时，取9.875mLA液，0.1mLB液，25μLC液，三者混匀，现配现用。封闭液（1%OVA）：称取OVA1.0g，溶于100mLPBS溶液中，4℃避光保存。终止液（2MH2SO4）：移取11.8mL98%的H2SO4，溶于80mL超纯水中，冷却后定容至100mL。酶标二抗稀释液：取辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG30μL加入90mL1%OVA。（2）杂交瘤细胞的筛选待细胞融合第9天开始观察细胞生长状态，记录有串状细胞团的孔，待细胞覆盖孔底1/3时吸取各孔的细胞上清进行间接非竞争ELISA检测。方法如下：包被抗原：用CBS缓冲液将包被原（T-OVA）稀释至1µg/mL，50µL/孔，37℃孵育2h；封闭：以1%OVA作为封闭液封闭，200µL/孔，37℃孵育1h； 44天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导加样：将细胞培养板每个孔上清稀释100倍后取100µL加入96孔板中，以加入等量骨髓瘤细胞为阴性对照，加入等量PBS溶液为空白对照，37℃孵育1h。加酶标二抗：用含有1%OVA的PBS溶液将酶标二抗稀释至工作浓度，100μL/孔加入到96孔酶标板中，37℃孵育45min。（以上每步结束后都用PBST洗涤液洗涤3次，每次洗涤后都将酶标板拍干。）显色：以100μL/孔的剂量，将底物溶液加入到96孔酶标板中，37℃避光孵育15min。终止反应：向96孔酶标板中加入2MH2SO4溶液，50μL/孔，终止反应。于450nm波长下读取OD值。以细胞上清OD值/阴性对照孔OD值>2.1为阳性孔。（P/N>2.1）（3）杂交瘤细胞对天名精内酯酮敏感性测定对筛选出的阳性孔采用间接竞争ELISA检测其对天名精内酯酮的敏感性，天名精内酯酮供试浓度为50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL和0ng/mL。间接竞争ELISA检测方法如下：包被：用CBS将包被原稀释至1μg/mL加入到96孔酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜。封闭：向96孔酶标板中加入1%OVA封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h。加样：用PBS稀释上述阳性孔上清液至合适的浓度，50μL/孔加入到96孔酶标板中，然后每孔再分别加入50μL不同浓度的药剂，混匀。空白对照孔加入等量的PBS，37℃孵育1h。加酶标二抗：用含有1%OVA的PBS溶液将酶标二抗稀释至工作浓度，100μL/孔加入到96孔酶标板中，37℃孵育1h。（以上每步结束后都用PBST洗涤液洗涤3次，每次洗涤后都将酶标板拍干。）显色：以100μL/孔的剂量，将底物溶液加入到96孔酶标板中，避光显色15min。终止反应：向96孔酶标板中加入2MH2SO4溶液，50μL/孔，终止反应。于450nm波长下读取OD值。4.1.2.4亚克隆在亚克隆前一天制备饲养层细胞，再进行亚克隆。亚克隆采用有限稀释法（Heddy1991）：用吸管将阳性孔内细胞集落吹打散开，用细胞培养液将其稀释至2000个细胞/mL。取0.1mL用细胞悬浮液稀释至50个细胞/mL，在含饲养层细胞的96孔酶标板A、B两排每孔各加入100μL细胞悬浮液，此时每孔大约5个细胞；再将剩余细胞稀释至20个细胞/mL，在96孔酶标板C、D两排每孔各加入100μL，此时每孔大约2个细胞；继续稀释细胞悬浮液至5个细胞/mL，在96孔酶标板E、F、G、H四排每孔各加入100μL最终细胞悬浮液，此时每孔大约0.5个细胞；置于37℃、5%CO2培养箱中培养。隔日检查有无污染，待第4天用含15%血清的HAT培养基补液，第7天用含15%血清的HTDMEM培养基换液，第9天左右，细胞覆盖孔底1/3时吸取各孔的细胞上清进行间接竞争ELISA检测（检测方法同上）。将具有单个克隆的阳性细胞孔继续进行第二次亚克隆， 第四章天名精内酯酮免疫金法亚细胞定位45直到每个杂交瘤细胞孔均为阳性为止。4.1.2.5杂交瘤细胞扩大培养和腹水制备杂交瘤细胞扩大培养：将上述获得的杂交瘤细胞用新鲜的HT培养基在24孔细胞板中培养，然后转入6孔细胞板中扩大培养，最后转入细胞瓶中培养。待细胞处于生长对数期时（7～10d左右），倾去培养液，用新鲜的培养液洗涤沉淀细胞，1500rpm离心10min，弃上清，用含有20%的DMSO培养液重悬细胞，分装于冻存管中，做好标记。先在4℃中预冷30min，然后在-20℃冷冻2h，之后放入70℃超低温冰箱中过夜，次日将冻存管投入液氮中保存。采用动物体内诱生腹水法制备单克隆抗体：取8周龄期雌性BALB/c小鼠，采用腹腔注射法每只注入0.5mLFICA，同时培养杂交瘤细胞。一周后每只注入1mL预先培养好的生长对数期的杂交瘤细胞，细胞浓度为1×106个/mL。10d左右，待小鼠腹部明显隆起，行动迟缓时，收集小鼠腹水。1000rpm/min离心5min，去除上层油脂即为腹水抗体，分装后保存于-70℃贮存备用。每隔3d收集一次腹水，直至小鼠死亡。4.1.2.6单克隆抗体纯化及蛋白浓度测定采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水（Wuetal.1999）：（1）将制备的腹水于6000rpm离心30min，去除上清后用SiO2过滤去除掉酯类；（2）按照1:2比例加入pH为4.8的醋酸盐缓冲液，混匀，然后将辛酸滴加到腹水中（加入量为每毫升加33微升），震荡15min，4℃静止2h，6000rpm离心30min，收集上清液。（3）将0.1M的PBS加入到上清液中，调节pH至7.4左右，然后滴加等体积的饱和硫酸铵，震荡15min，4℃静止2h，6000rpm离心30min去除上清。（4）用1/10体积的0.01M的PBS复溶沉淀，4℃搅拌透析过夜，分装备用。蛋白含量测定采用紫外扫描法，具体方法同第三章3.1.2.2人工抗原蛋白浓度测定。4.1.2.7单克隆抗体效价及对天名精内酯酮敏感性测定包被原和单克隆抗体工作浓度的测定：采用方阵法确定包被原和抗体的工作浓度。以450nm波长下吸光度值为1.0时的包被原和抗体的稀释倍数作为工作浓度。包被：用CBS倍比稀释包被原（1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL），以100μL/孔分别加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜。封闭：向96孔酶标板中加入1%OVA封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h。加样：用PBS倍比稀释抗体至合适的浓度，以100μL/孔剂量加入到96孔酶标板中，空白对照孔加入等量的PBS，37℃孵育1h。加酶标二抗：用含有1%OVA的PBS溶液将酶标二抗稀释至工作浓度，100μL/孔加入到96孔酶标板中，37℃孵育1h。（以上每步结束后都用PBST洗涤液洗涤3次，每次洗涤后都将酶标板拍干。）显色：以100μL/孔的剂量，将底物溶液加入到96孔酶标板中，避光显色15min。 46天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导终止反应：向96孔酶标板中加入2MH2SO4溶液，50μL/孔，于450nm波长下读取OD值。单克隆抗体的效价测定：以包被原的工作浓度包被96孔酶标板，将抗体和阴性血清倍比稀释，使用间接非竞争ELISA法测定OD值。空白对照孔加入PBS。以阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值>2.1（P/N>2.1）的最大稀释倍数作为抗体的最终效价。单克隆抗体对天名精内酯酮敏感性测定：将天名精内酯酮梯度稀释法稀释至200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL，参照本章杂交瘤细胞敏感性测定方法测定获得的单克隆抗体敏感性。4.1.2.8单克隆抗体交叉反应率测定将天名精内酯醇、γ-苯基-α-亚甲基-γ-丁内酯梯度稀释法稀释至4000ng/mL、2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL，使用间接竞争ELISA测定单克隆抗体450nm处OD值，计算每种药剂的IC50，按下列公式计算交叉反应率。天名精内酯酮ICହ交叉反应率（%）=×100（公式4-1）其他药物的ICହ4.1.2.9免疫胶体金法亚细胞定位（1）药品配制封闭液：用PBS（7.4）将封闭用的山羊血清（原液）配成5%的工作液，4℃避光临时保存。第一抗体：用封闭液将天名精内酯酮单克隆抗体稀释1000倍，备用。第二抗体：用封闭液将ColloidalGold-AffiniPureGoatAnti-MouseIgG（H+L）稀释100倍，备用。（2）菌丝前处理将小麦全蚀病菌接种于PD培养液25℃、150r/min恒温振荡培养72h，备用。配制PD培养液分装于100mL三角瓶中，每瓶50mL，121℃高温高压灭菌20min。待培养液冷却后加入50µL天名精内酯酮的DMSO液，使终浓度为0.2μM。然后接入小麦全蚀病原菌菌丝，25℃、150r/min恒温振荡培养，分别于0.5h、1h、2h、6h、12h、48h取样制样。以不经天名精内酯酮处理的菌丝为对照。（3）超薄切片制备取上述处理的少量菌丝放入1.5mL离心管底部，加入1mL0.2%低熔点琼脂，用无菌接种针拨动菌丝，使其均匀分散在琼脂中，待琼脂凝固后取出，然后将样品切成约3mm×5mm×7mm菌块。样品固定、脱水、包埋参照Gao等（2005）方法进行改进，具体步骤如下：固定：将上述切好的样品浸没于含有2%（V/V）戊二醛的0.1M二甲砷酸钠缓冲溶液（pH7.4）中，室温固定3h，然后以相同的缓冲液彻底冲洗。 第四章天名精内酯酮免疫金法亚细胞定位47脱水：将固定后的样品依次用30%、50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水10min，最后用100%的乙醇脱水3次，每次20min。渗透：彻底脱水后的样品用系列浓度的LRWhite渗透。包埋：渗透后的样品浸入100%的LRWhite中包埋，在65℃下聚合36h。修块：用双面刀片将包埋块顶端多余树脂切除，以刚露出样品为宜。定位、切片：将修整好的包埋块在切片机上进行半超薄及超薄切片，样品承载于200目镍网上。（4）胶体金免疫染色免疫金染色参照KangandBuchenaue（2002,2003）方法稍作改动：①将载有超薄切片样品的镍网倒置在超纯水水滴上，润湿1min。随即用封闭液漂浮封闭10min。②用封闭液将第一抗体稀释1000倍后，室温孵育超薄切片1h，随后用PBS漂洗5次。③用封闭液将第二抗体稀释100倍后，室温下孵育超薄切片30min，用PBS漂洗5次，再用超纯水漂洗5次，晾干。④用醋酸双氧铀染色3min，用超纯水小心冲洗干净。⑤用柠檬酸铅染色8min，用超纯水小心彻底冲洗，晾干。⑥将样品于JEOLJEM-1230型透射电镜下观察结果。4.2结果与分析4.2.1BALB/c小鼠免疫及血清效价测定见第三章。4.2.2细胞融合与杂交瘤细胞的筛选以PEG4000为融和剂进行小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，第4天采用半量换液更换板内培养液，第8天改用HTDMEM培养液培养，第9天开始观察细胞生长状态，第12天观察到有细胞的孔为128个（一共4块96孔板），融合率为33.33%。待这些孔内细胞覆盖孔底约1/3时，吸取各孔的细胞上清进行间接非竞争ELISA检测，最终确定高效价阳性孔为7个（1A8，1B8，2B4，3C4，3C6，3E9，3H5）。将天名精内酯酮配制为50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL和0ng/mL，采用间接竞争ELISA检测1A8，1B8，2B4，3C4，3C6，3E9，3H5孔内细胞对天名精内酯酮的敏感性，结果表明（表4-1），所筛选的7个阳性孔的细胞对天名精内酯酮均有不同程度的敏感性，并呈浓度依赖性。其中，2B4对天名精内酯酮最敏感，5ng/mL天名精内酯酮对其抑制率就可达50%以上；其次1B8对天名精内酯酮也较为敏感，10ng/mL天名精内酯酮对其抑制率达50%以上；选择2B4进行亚克隆实验。 48天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导表4-1杂交瘤细胞对天名精内酯酮敏感性测定Table4-1Sensitivitytestofhybridomacellstocarabrone天名精内酯酮浓度高效价阳性孔编号（ng/mL）PositivewellswithhightiterCarabroneconcentration1A81B82B43C43C63E93H5（ng/mL）500.2980.1720.1200.1510.2020.2160.291100.3790.3420.2250.2290.3060.3480.23750.4620.4710.3830.3070.3890.4500.34200.5920.7210.8020.4390.5830.5500.4554.2.3亚克隆对获得的杂交瘤细胞筛选发现，2B4孔内杂交瘤细胞对天名精内酯酮较为敏感，采用有限稀释法对该孔内的细胞进行亚克隆实验。经过3次亚克隆后共得到1株能分泌天名精内酯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为F2B4。4.2.4腹水制备取8周龄期雌性BALB/c小鼠，在腹腔注入0.5mLFICA，将生长对数期的F2B4稀释至1×106个/mL注入小鼠腹腔，每只注入1mL，定期收集腹水。图4-1正常小鼠（左）和诱生腹水后（右）的BALB/c小鼠Fig.4-1Normalmouse(left)andBALB/cmousewhichwasinducedascites(right)4.2.5单克隆抗体蛋白浓度测定采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化细胞株腹水单抗F2B4，采用A280nm和A260nm光吸收差法测定其蛋白浓度为3.46mg/mL。4.2.6单克隆抗体效价及对天名精内酯酮敏感性测定采用间接非竞争ELISA测定包被原和单抗最佳工作浓度，结果表明，包被原浓度为1µg/mL单抗稀释度为1:16000时，OD450最接近1。因此后续ELISA包被原浓度确定为1µg/mL，单克隆抗体敏感性测定稀释倍数确定为1:16000。以1µg/mL包被原包被96孔酶标板，倍比稀释法稀释单克隆抗体，采用间接非竞争ELISA测定单抗F2B4效价为1.28×10-5。测定该抗体对天名精内酯酮敏感性线性回归方程为y=-0.2602x+0.5809，R2=0.9947。该抗体对天名精内酯酮的IC50为2.05ng/mL。 第四章天名精内酯酮免疫金法亚细胞定位490.70.60.5y=-0.2602x+0.5809R²=0.994700.4B/B0.30.20.1000.511.522.5-0.1浓度对数图4-2单克隆对天名精内酯酮的间接竞争ELISA抑制曲线Fig.4-2InhibitioncurveofindirectcompetitiveELISAofmonocloneagainstcarabrone4.2.7单克隆抗体交叉抑制率测定本研究使用间接竞争ELISA测定所获得单克隆抗体与天名精内酯酮有相似结构的两种化合物的交叉反应率，结果（表4-2）表明，天名精内酯酮单克隆抗体与天名精内酯醇有轻微交叉，交叉反应率为1.8%，与γ-苯基-α-亚甲基-γ-丁内酯基本无交叉反应，交叉反应率小于0.05%，说明抗体特异性很好。表4-2单克隆抗体对天名精内酯酮类似物交叉反应Table4-2Crossreactionsofmonoclonalantibodiestocarabroneanalogue化合物名称化合物结构交叉反应率（%）IC50（ng/L）CompundsCompundstructureCrossreactionrate(%)天名精内酯酮2.05±0.03Cc-天名精内酯醇112.96±1.28Bb1.8γ-苯基-α-亚甲基-γ-丁内酯4169.06±6.11Aa<0.05注：同列小写字母表示0.05水平的差异显著性，大写字母表示0.01水平的差异显著性。下表同。Note：Differentlowercaseinacolumnmeansignificantdifferenceat0.05level,differentcapitallettersinacolumnmeansignificantdifferenceat0.01level.Thesameasbelow.4.2.8免疫胶体金法亚细胞定位以单克隆抗体F2B4作为天名精内酯酮第一识别抗体，以12nmColloidal 50天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导Gold-AffiniPureGoatAnti-MouseIgG（H+L）作为第二抗体，采用免疫胶体金法观察天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内分布情况，结果（图4-3）发现：未经天名精内酯酮孵育的菌丝内未见胶体金颗粒分布（图4-3a-c）；经天名精内酯酮孵育30min时，细胞膜上可以看见有大量的胶体金颗粒排列（图4-3d黑色箭头处），此时细胞内未见胶体金颗粒沉积；孵育1h时可以看见胶体金颗粒除在细胞膜上有分布外，逐步在细胞内及线粒体中分布（图4-3e黑色箭头处）；随后孵育2h、6h、12h、48h细胞内只有线粒体上有大量胶体金颗粒分布（图4-3f-i黑色箭头处），其他位点未见胶体金颗粒。可见，天名精内酯酮在细胞内分布的动态是进入细胞后并没有在膜上长期停留，而是随即进入到细胞内，逐步在线粒上汇集。另外从图中还可以发现，天名精内酯酮孵育2h线粒体的脊还清晰可见（图4-3f白色V型箭头处），而孵育6h、12h线粒体的脊逐渐出现模糊（图4-3g-h黑色V型箭头处），孵育48h线粒体脊消失，线粒体趋向于空泡化（图4-3i黑色箭头处）。总之，经免疫胶体金试验再次证明天名精内酯酮作用的细胞器为线粒体。图4-3天名精内酯酮免疫胶体金定位（a）示空白对照；（b）示未经天名精内酯酮孵育，经第一抗体 第四章天名精内酯酮免疫金法亚细胞定位51及第二抗体孵育的细胞内无胶体金颗粒分布；（c）示未经天名精内酯酮及第一抗体孵育，仅经第二抗体孵育的细胞内无胶体金颗粒分布；（d）示经天名精内酯酮孵育30min，大量胶体金颗粒分布在细胞膜上；（e）示经天名精内酯酮孵育1h，胶体金除在膜上有分布外，在线粒体上也可以看到大量胶体金颗粒，黑色箭头处示胶体金颗粒；（f）示经天名精内酯酮孵育2h，大量胶体金颗粒分布在线粒体上，黑色箭头处示胶体金颗粒，白色V型箭头处示线粒体的脊清晰可见；（g）示经天名精内酯酮孵育6h，大量胶体金颗粒分布在线粒体上，黑色箭头处示胶体金颗粒，黑色V型箭头处示脊模糊；（h）示经天名精内酯酮孵育12h，大量胶体金颗粒分布在线粒体上，黑色箭头处示胶体金颗粒，黑色V型箭头处示线粒体的脊模糊；（i）示经天名精内酯酮孵育48h，大量胶体金颗粒也分布在线粒体上。箭头处示线粒体的脊消失，线粒体趋向于空泡化。标尺“-”为500nm。Fig.4-3Localizationofcarabronebyimmunecolloidalgoldtechnique(a)Blankcontrol;(b)Celltreatedwiththefirstandsecondantibodis,butwithoutcarabrone,nonecolloidalgoldparticlesweredetectedinnercell;(c)Cellstreatedwiththesecondantibody,withoutcarabroneandthefirstantibody,nonecolloidalgoldparticlesweredetectedinnercell;(d)Celltreatedwithcarabronefor30min,alotsofcolloidalgoldparticlesdistributedincellmembrane;(e)Celltreatedwithcarabronefor1h,colloidalgoldparticlesweredetectedbothincellmembraneandmitochondria.Colloidalgoldparticleswereindicatedbyblackarrow;(f)Celltreatedwithcarabronefor2h,alotsofcolloidalgoldparticlesdistributedinmitochondria.Colloidalgoldparticleswereindicatedbyblackarrowandthevisiblemitochondriaridgewereshowedbywhite“V”;（g）Celltreatedwithcarabronefor6h,alotsofcolloidalgoldparticlesdistributedinmitochondria.Colloidalgoldparticleswereindicatedbyblackarrowandtheindistinctmitochondriaridgewereshowedbyblack“V”;(h)Celltreatedwithcarabronefor12h,alotsofcolloidalgoldparticlesdistributedinmitochondria.Colloidalgoldparticleswereindicatedbyblackarrowandtheindistinctmitochondriaridgewereshowedbyblack“V”;(i)Celltreatedwithcarabronefor48h,alotsofcolloidalgoldparticlesdistributedinmitochondria.Arrowshowedthatthemitochondriaridgedisappearedandmitochondriabecamevacuolation.Bar:5μm.4.3讨论4.3.1细胞融合前要进行SP2/0骨髓瘤细胞的筛选有研究指出SP2/0骨髓瘤细胞在传代培养的过程中可能会出现返祖现象（张静2008），本研究也证实了这一点。在试验过程中发现，如果骨髓瘤细胞不在含有8-AG的培养基中培养，或者培养时间过短，都会出现假阳性的杂交瘤细胞。这种细胞可以较长时间存活，但不会出现克隆孔。因此，解冻后的SP2/0骨髓瘤细胞在含8-AG的DMEM完全培养基上培养一周至关重要，这样可以完成SP2/0骨髓瘤细胞的筛选，保障后续融合试验的成功。4.3.2F2B4特异性较强抗体与抗原表面不同结构的抗原决定簇的结合能力可以用抗体的交叉反应率表示。 52天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导抗体与相似结构的化合物的交叉反应率越低，表明抗体的特异性越强（Liu2016）。本研究测定了天名精内酯酮单克隆抗体F2B4与天名精内酯醇及γ-苯基-α-亚甲基-γ-丁内酯的交叉反应，结果发现该抗体与天名精内酯醇有轻微交叉，交叉反应率为1.8%。分析其原因，可能是天名精内酯酮与天名精内酯醇结构极为相似所致（Chenetal.2014;Liuetal.2011;Wangetal.2014）。同时，抗体与天名精内酯醇存在交叉，但交叉率较低，说明抗体对天名精内酯酮更具特异性，该特异性很可能取决于C-4位的双键结构所致。另外，本研究测定抗体与γ-苯基-α-亚甲基-γ-丁内酯的交叉反应发现，抗体与此化合物基本不存在交叉反应，交叉反应率小于0.05%，分析其原因可能后者分子结构中存在苯环，对抗体识别影响很大。可见，天名精内酯酮与供试的其他两个化合物虽然都具备α-亚甲基-γ-丁内酯结构，但由于分子结构的差异使得F2B4对化合物识别能力不同，其对天名精内酯酮识别能力更强。4.3.3包埋后染色更适合于亚细胞定位研究免疫胶体金技术是基于免疫学原理，以胶体金颗粒标识抗原存在部位的一门技术。由于胶体金的观察往往借助于透射电镜来完成，因此需要按照透射电镜的要求进行样品制备。依据胶体金染色与样品包埋顺序的不同，胶体金制样可分为包埋前染色与包埋后染色。包埋前染色是先对完整细胞样品进行的染色，然后进行后续包埋制样。而包埋后染色是先进行透射电镜制样，对超薄切片上细胞结构进行免疫标记（倪灿荣2006）。由于亚细胞定位研究中用于标记的第一抗体和第二抗体都是分子量较大的蛋白，很难穿透细胞壁（微生物及植物）和细胞膜，因此更适用于包埋后染色。如果进行细胞表面的抗原标记可以考虑上述包埋前染色方案。本研究采用的是包埋后染色。4.3.4选择适宜的封闭剂可以减少非特异性的标记免疫金染色时，非特异性的标记会给实验结果造成很严重的干扰。因此，在操作程序中，封闭非特异性的结合位点非常重要。一般封闭非特异性的结合位点可采用BSA、明胶、脱脂奶粉、山羊血清等，其中BSA因为其成分单一，大多数情况都适用，是免疫组化中常用的封闭剂。但本研究免疫原偶联的是BSA，如果用BSA作为封闭剂，可能会产生交叉反应，因此基于同源血清不发生结合的原则，本研究选用了与胶体金二抗ColloidalGold-AffiniPureGoatAnti-MouseIgG（H+L）同源的山羊血清作为封闭剂，供试的工作浓度为5%，试验证明封闭效果比较理想，在未经天名精内酯酮孵育的菌丝上未见非特异性的结合（图4-3b-c）。另外，值得注意的是封闭液一般临时配制，不宜久存。在本试验过程中，由于封闭液存放过久，造成封闭液污染，在电镜观察时发现样品上存在大量的细菌菌体，导致当次试验失败。4.4小结本研究在第三章多克隆抗体制备的基础上，以4#小鼠脾细胞作为融合细胞，制备单 第四章天名精内酯酮免疫金法亚细胞定位53克隆抗体，同时对获得的单克隆抗体进行了敏感性及特异性的检测，最后以制得的单克隆抗体作为天名精内酯酮第一识别抗体，以12nmColloidalGold-AffiniPureGoatAnti-MouseIgG（H+L）作为第二识别抗体，采用免疫胶体金法观察天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位情况，主要得到以下结论：（1）以4#小鼠脾细胞以及SP2/0骨髓瘤作为融合细胞进行细胞融合，最终获得7个杂交瘤细胞阳性孔（1A8，1B8，2B4，3C4，3C6，3E9，3H5），采用间接竞争ELISA筛选出2B4对天名精内酯酮最敏感。（2）对获得的杂交瘤细胞进行亚克隆实验。经过3次亚克隆后共得到1株能分泌天名精内酯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为F2B4。（3）采用动物体内诱生腹水法制备单克隆抗体，用辛酸-饱和硫酸铵法纯化细胞株腹水单抗，最终获得单克隆抗体F2B4的蛋白浓度为3.46mg/mL。（4）采用间接非竞争ELISA测定单克隆抗体F2B4的效价为1.28×10-5，采用间接竞争ELISA测定该抗体对天名精内酯酮的敏感性与特异性，结果表明，F2B4对天名精内酯酮较为敏感，IC50为2.05ng/mL，其与天名精内酯醇有轻微交叉，交叉反应率为1.8%，与γ-苯基-α-亚甲基-γ-丁内酯基本无交叉反应，交叉反应率小于0.05%，说明抗体特异性很好。（5）采用免疫金法进行天名精内酯酮亚细胞定位研究发现，①天名精内酯酮在细胞内分布的动态是进入细胞后不在膜上滞留，而是在线粒上汇集。②天名精内酯酮孵育后靶标菌线粒体病变过程是先出现脊模糊，然后脊消失，最后线粒体空泡化。③天名精内酯酮作用的细胞器为线粒体。 54天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡本研究前面通过对天名精内酯酮亚细胞定位研究发现，天名精内酯酮主要分布于线粒体，细胞核等其它细胞器上未见分布。西北农林科技大学无公害农药研究中心早期研究表明，天名精内酯酮对靶标菌线粒体影响主要是（1）导致线粒体肿胀，髓样、空泡化；（2）抑制线粒体复合酶的活性，尤其对线粒复合酶III影响较大。本研究发现天名精内酯酮汇集于线粒体之后，线粒体的脊逐渐变得模糊，随之脊消失，最终线粒体空泡化；2017年，课题组的其他成员再次验证了天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体复合酶III的抑制作用（Wangetal.2017）。可见天名精内酯酮对线粒体的影响主要是这两个方面，因此可以从这两点切入进一步揭示天名精内酯酮的作用机理。关于天名精内酯酮对线粒体复合酶III作用机制研究课题组其他成员已经开展，本章基于线粒体出现脊消失，空泡化，推测线粒体内大分子蛋白受了严重的损伤，其成因可能是天名精内酯酮造成的靶标菌氧化应激。氧化应激（OxidativeStress）是指机体或细胞内氧自由基的产生与清除失衡，导致超氧自由基（ReactiveoxidativespeciesROS）蓄积，进而引起机体或细胞氧化损伤的过程（王旭等2015）。在真核生物中，ROS来源于线粒体（Turrens2003），线粒体复合酶III被认为是ROS的主要生产者（BleierandDröse2013）。当线粒体功能受损、膜结构遭到破坏，线粒体将会产生更多的ROS（BrunkandTerman2002）。基于此，本章测定天名精内酯酮对靶标菌氧化应激的诱导，同时测定ROS过度蓄积导致的细胞凋亡（王近近等2016;吴丽华等2016;吴志明等2018）。以期明确线粒体病变的成因，初步揭示天名精内酯酮作用机理。5.1材料与方法5.1.1供试材料5.1.1.1供试菌种小麦全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminisvar.tritici）由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。5.1.1.2供试试剂及耗材纤维素酶、崩溃酶、溶壁酶、HEPES、乙二胺四乙酸（EDTA）、溴化十六烷三甲基铵（CTAB）、Tris购自sigma；Hoechst33342/PI双染试剂盒、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、免疫染色固定液、免疫染色洗涤液、Z-VAD-FMK试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；DCFH-DA荧光试剂盒、微生物活性氧测定试剂盒、还原型谷胱甘肽（GlutathioneReduced，GSH）含量测定试剂盒购自 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡55Solarbio；谷胱甘肽还原酶（GR）酶联免疫分析试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）酶联免疫分析试剂盒购自TSZ；碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠均为分析纯，购自广州华大化学试剂有限公司；96孔酶标板购自Coring-Costar；载玻片购自江苏世泰实验器材有限公司。5.1.1.3仪器设备U-3310紫外-可见分光光度计（日立）、FL-4500荧光分光光度计（日立）、电子天平（长沙光大科学仪器有限公司）、TECANSunrise酶标仪（奥地利TECAN）、CR22G高速冷冻离心机（日本Hitachi）、荧光显微镜（德国Observer.Zl，Zeiss）。5.1.2试验方法5.1.2.1主要溶液配制（1）磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.2）：NaCl8.8g、KCl201.15mg、Na2HPO42.328g、KH2PO4163.296mg，超纯水1000mL，pH7.2。（2）酶解液：将纤维素酶:崩溃酶:溶壁酶=1:1:1（M/M）配制成10g/L的混合酶液，80r/min，30℃温育50min。将混合酶液经孔径为0.45μm细菌过滤器过滤除去杂质，备用。（3）天名精内酯酮工作液：用DMSO将天名精内酯酮配制成0.1mM，用灭菌超纯水稀释至0.1μM（25µg/mL），备用。（4）1.7MTris：Tris41.188g，超纯水200mL。（5）HEPES-Trisbuffer（20mM，pH7.2）：HEPES2.383g，超纯水500mL，以1.7MTris调pH至7.2，备用。（6）线粒体提取缓冲液：蔗糖42.79g，KCl372.8mg，EDTA930.6mg，HEPES2.383g，超纯水500mL，以1.7MTris调pH至7.2，临时用时加入BSA，BSA终浓度为1.5mg/mL。（7）线粒体保存缓冲液：蔗糖42.79g，EDTA19.02mg，HEPES2.383g，超纯水500mL，以1.7MTris调pH至7.2，临时用时加入BSA，BSA终浓度为1.5mg/mL。（8）1MTris·HCl（pH8.0）：Tris12.1g溶于100mL超纯水中，用HCl调pH至8.0。（9）0.5MEDTA：18.61g溶于100mL超纯水中。（10）2%CTAB：CTAB4.0g、NaCl16.364g、1MTris·HCl20mL、0.5MEDTA80mL、1%巯基乙醇400μL、超纯水200mL。（11）苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）：Tris饱和酚50mL、氯仿48mL、异戊醇2mL，混匀后加入10mLTris，使用时吸取下层液体，避光低温保存。（12）含有RNase的超纯水：2mL灭菌超纯水加入40μLRNase。5.1.2.2对细胞内ROS影响 56天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导（1）ROS定性测定①将小麦全蚀病菌接种在PD培养液中，25℃、150r/min恒温振荡培养72h。②用超纯水将菌丝洗涤3次，每次5min。③用0.1μM天名精内酯酮孵育菌丝，孵育时间分别为30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h。以不加任何药剂的菌丝为阴性对照。用pH为7.2的PBS将Rosup稀释100倍做阳性对照。④用pH为7.2的PBS将DCFH-DA稀释至10µM。⑤将孵育后的菌丝悬浮于稀释后的DCFH-DA中，37℃孵育20min进行探针装载。每5min颠倒混匀一次样品，使得DCFH-DA与细胞充分接触。⑥用pH为7.2的PBS洗涤菌丝3次，每次5min。⑦挑取少量菌丝在荧光显微镜上观察菌丝细胞着色情况，并采集图片。（2）ROS定量测定挑取PD液体培养的小麦全蚀病菌70mg用超纯水将菌丝洗涤3次后，进行天名精内酯酮孵育及DCFH-DA探针装载，方法同上。孵育后的菌丝用pH为7.2的PBS避光洗涤菌丝3次，然后用细胞破碎仪冰浴避光超声3min，每超声1min间隔1min。将超声后的菌丝于离心机上4℃、25000g离心5min。取上清稀释至合适的倍数，于荧光分光光度计上488nm激发光和525nm发射光下测定上清液吸光度。5.1.2.3对线粒体膜电位影响使用线粒体膜电位检测试剂盒测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体膜电位（ΔΨm）的影响。菌丝培育同ROS测定。菌丝经超纯水洗涤后，用0.1μM天名精内酯酮分别孵育2h、3h、4h、5h、6h，以不经天名精内酯酮处理的菌丝为阴性对照，以经羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）孵育的菌丝为阳性对照（在装载探针前20min孵育菌丝）。然后将菌丝用超纯水充分洗涤后悬浮于1mLJC-1探针工作液中，37℃孵育20min进行探针装载。用试剂盒中洗涤液充分洗涤装载探针后的菌丝，挑取少量菌丝放于载玻片上，置于荧光显微镜上观察并采集图片。5.1.2.4对线粒体内抗氧化酶系的影响（1）小麦全蚀病菌线粒体提取参照Frazier等（2012）和Tamura等（1999）方法略作修改：将小麦全蚀病菌接种在PD培养液中，25℃、150r/min恒温振荡培养72h。收集菌丝并抽滤，取20g用预冷的HEPES-Trisbuffer（20mM，pH7.2）冲洗3次后，将菌丝重悬于3倍体积预冷的线粒体提取缓冲液中，匀浆破碎。将匀浆于4℃、1500×g离心10min，收集上清液。沉淀重悬于预冷的线粒体提取缓冲液中，继续于4℃、1500×g离心10min，合并上清液。将合并后的上清液于4℃、10000×g离心20min，弃去上清液，以不含BSA的线粒体提取缓冲液冲洗沉淀，于4℃下10000×g离心20min，收集沉淀。沉淀即为线粒体粗提物。取10μL线粒体溶液，以BSA为标准蛋白，利用Bradford法（Bradford1976）测定蛋 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡57白浓度，其余的用线粒体保存缓冲液调节蛋白浓度至5mg/mL，置于冰上备用，或分装后以液氮速冻，-80℃保存。测定酶活性前，将线粒体溶液置于液氮/室温反复冻融3次。（2）对CAT影响采用CAT试剂盒测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内CAT影响：将天名精内酯酮配制成5×104µg/mL、2.5×104µg/mL、1.25×104µg/mL、6.25×103µg/mL、3.125×103µg/mL备用。按照表1顺序将各试剂加到5mL离心管中，混匀后在分光光度计405nm处测定各处理OD值。将每毫升样品每秒钟分解1µmoL的H2O2的量定义为一个活力单位。按照下列公式5-1计算各处理CAT酶活。271×1CAT活力（U/mgHb)=（空白对照OD值-处理测定OD值）×60×取样量×A注：271为斜率的倒数，A为样品蛋白含量（U/mgHb）（公式5-1）表5-1CAT测定试剂添加顺序表Table5-1ReagentadditionorderinCATmeasurement添加试剂空白对照（mL）药剂处理（mL）ReagentsBlackcontrol（mL）Treatment（mL）试剂1*1.01.0试剂2*0.10.1双蒸水0.0010线粒体00.01天名精内酯酮00.001试剂31.01.0试剂40.10.1线粒体0.010注：a“*”处试剂需要37℃预温；b.添加试剂3之前混匀，37℃反应1min。Note:a.“*”Reagentsshouldbepreheatedat37℃;b.thethirdreagentshouldbemixedandresponse1minbeforeaddition（3）对SOD影响采用SOD试剂盒测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内SOD影响：将天名精内酯酮配制成5×104µg/mL、2.5×104µg/mL、1.25×104µg/mL、6.25×103µg/mL、3.125×103µg/mL备用。按照表5-2顺序将各试剂加到5mL离心管中，加入显色剂后室温放置10min，在分光光度计550nm，光径10cm处测定各处理OD值。将每毫升样品蛋白在每毫升反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量定义为一个SOD活力单位（U）。按照公式5-2计算各处理SOD酶活。 58天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导对照OD值−处理测定OD值反应液总体积（mL）OD活力（U/݉݃ݎݐ)=÷50%×对照OD值取样量（mL）÷待测样品蛋白浓度（݉݃ݎݐ/݉ܮ）注：mgprot为毫克蛋白数。（公式5-2）表5-2SOD测定试剂添加顺序表Table5-2ReagentadditionorderinSODmeasurement添加试剂空白对照（mL）药剂处理（mL）ReagentsBlackcontrolTreatment试剂11.01.0天名精内酯酮00.001线粒体0.0040.004超纯水0.0010试剂20.10.1试剂30.10.1试剂40.10.1显色剂2.02.0注：添加试剂4后需涡旋混匀，然后37℃温育40min。Note:Solutionshouldbemixedbyvertexafteradding4#reagent,thenincubate40minat37℃.（4）对谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）影响采用谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内GSH-PX影响，步骤如下：①将天名精内酯酮配制成62.5µg/mL、31.25µg/mL、15.625µg/mL、7.8125µg/mL、3.906µg/mL备用。②按照说明书要求倍比法将试剂盒中标准品依次稀释至200IU/L、100IU/L、50IU/L、25IU/L、12.5IU/L备用。③加样：分别设空白孔、标准样品孔、待测样品孔。其中空白孔不加样品和酶标试剂；标准样品孔加入50μL标准样品；待测样品孔先加不同浓度的天名精内酯酮稀释液40μL，再加入10μL线粒体溶液，轻轻晃动混匀。④温育：将酶标板用封板膜封住后于37℃温育30min。⑤洗涤：揭掉封板膜将板内液体倒掉，甩干，用超纯水将洗涤液稀释30倍后每孔加入200μL，静置30s后弃去，拍干，重复5次。⑥加酶液：除空白孔外每孔加入50μL酶标试剂。⑦将酶标板用封板膜封住后于37℃温育30min。 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡59⑧洗涤：揭掉封板膜将板内液体倒掉，甩干，用超纯水将洗涤液稀释30倍后每孔加入200μL，静置30s后弃去，拍干，重复5次。⑨显色：每孔先加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。⑩终止：每孔加50μL终止液，终止反应（此时蓝色立刻转黄色）。⑪测定：以空白孔调零，于酶标仪450nm波长下测量各孔的吸光度（OD值）。注意，测定应在加终止液后15min以内进行。⑫数据统计：以标准品的酶活为横坐标，OD值为纵坐标求标准曲线的直线回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品酶活，再乘以稀释倍数，即为样品的实际酶活。（5）对谷胱甘肽还原酶（GR）影响采用谷胱甘肽还原酶（GR）试剂盒测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内GR影响，步骤如下：①将天名精内酯酮配制成62.5µg/mL、31.25µg/mL、15.625µg/mL、7.8125µg/mL、3.906µg/mL备用。②按照说明书要求倍比法将试剂盒中标准品依次稀释至120ng/L、60ng/L、30ng/L、15ng/L、7.5ng/L备用。③加样：分别设空白孔、标准样品孔、待测样品孔。其中空白孔不加样品和酶标试剂；标准样品孔加入50μL标准样品；待测样品孔先加不同浓度的天名精内酯酮稀释液40μL，再加入10μL线粒体溶液，轻轻晃动混匀。④温育：将酶标板用封板膜封住后于37℃温育30min。⑤洗涤：揭掉封板膜将板内液体倒掉，甩干，用超纯水将洗涤液稀释30倍后每孔加入200μL，静置30s后弃去，拍干，重复5次。⑥加酶液：除空白孔外每孔加入50μL酶标试剂。⑦将酶标板用封板膜封住后于37℃温育30min。⑧洗涤：揭掉封板膜将板内液体倒掉，甩干，用超纯水将洗涤液稀释30倍后每孔加入200μL，静置30s后弃去，拍干，重复5次。⑨显色：每孔先加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。⑩终止：每孔加50μL终止液，终止反应（此时蓝色立刻转黄色）。⑪测定：以空白孔调零，于酶标仪450nm波长下测量各孔的吸光度（OD值）。注意，测定应在加终止液后15min以内进行。⑫数据统计：以标准样品的酶活为横坐标，OD值为纵坐标求标准曲线的直线回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品酶活，再乘以稀释倍数，即为样品的实际酶活。 60天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导（6）对抗氧化酶系基因表达的影响①菌丝处理不同浓度的天名精内酯酮对靶标菌线粒体抗氧化酶系基因表达的影响：将天名精内酯酮配制成5×104µg/mL、2.5×104µg/mL、1.25×104µg/mL备用。配制PD培养液至250mL三角瓶中，每瓶装样量为100mL，121℃高温高压灭菌20min备用。灭菌后分别加入100µL天名精内酯酮药液致使终浓度为50µg/mL、25µg/mL、12.5µg/mL，将培养的小麦全蚀病菌菌丝接入培养液，25℃、150r/min恒温振荡培养12h，收集菌丝，备用。天名精内酯酮不同孵育时间对靶标菌线粒体抗氧化酶系基因表达的影响：将灭菌后的PD培养液中加入100µL天名精内酯酮药液，致使终浓度为25µg/mL，将培养的小麦全蚀病菌菌丝接入培养液，25℃、150r/min恒温振荡培养，分别在0h、2h、4h、6h、12h、24h，收集菌丝，备用。②小麦全蚀病菌RNA提取及纯化将收集的菌丝经无菌水洗涤、过滤后放入液氮研磨至粉状，采用CTAB法提取总RNA：i将5mLEP管中加入4mL2%的CTABbuffer和5%β-巯基乙醇于65℃水浴锅中预热10min；ii预热后的EP管中加入研磨好的菌丝，继续于65℃水浴锅中加热10min，每间隔2～3min摇晃混匀一次；iii所得溶液分装至2mL离心管中，每管1mL，然后加入等体积氯仿/异戊醇（24:1，V/V），涡漩振荡2min，冰浴冷却10min；iv冰浴冷却后样品于4℃、13000g，离心14min；v移取上清液至另一支EP管，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1，V/V），涡漩振荡2min，冰浴冷却10min；vi将冷却后的溶液于4℃、13000g，离心12min；vii移取上清液加入1/3体积8MLiCl，放于-80℃超低温冰箱中冷藏处理1.5h；viii冷藏处理后样品于4℃、12000g，离心30min；ix弃掉上清液，用500μL75%乙醇洗涤沉淀，于4℃、8000g，离心6min；x弃掉上清液，将样品放入超净工作台，待乙醇挥发至少量（不能完全挥发，否则核酸不溶于水），加入40μL灭菌后的DEPC-H2O溶解，-80℃保存。③相关基因cDNA的合成cDNA第一条链的合成根据PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraserKit反转录试剂盒（TaKaRa）的方法制备获得，具体操作如下：i去除基因组DNA：配制MasterMix分装至每个反应管中，加入上述RNA样品。然后加入5×DNAEraserBuffer2.0µL、gDNAEraser1.0µL、TotalRNA1.0µg、RNaseFreeH2O补足10µL。42℃反应2min。 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡61ii反转录反应：取上述反应液10µL加入PrimeScriptRTEnzymeMixI1.0µL、RTPrimeMix1.0µL、5*PrimeScriptBuffer2(forRealtime)4.0µL、RNaseFreeH2O4.0µL、Total20.0µL，于37℃反应15min；随即85℃反应5s。样品4℃保存。④qRT-PCR检测使用BeaconDesigener7.0软件设计小麦全蚀病菌线粒体内CAT3等酶的基因引物，引物序列见表5-3。表5-3荧光定量PCR所用引物Table5-3PrimersinfluorescentquantitativePCR基因名称基因ID序列(5’-3’)基因注释GenenameGeneIDSequence(5’-3’)GeneannotationF:CTCTTGGTTCTGGCATCG18SrRNAU08320管家基因R:GCTGGGCTTGAGTGGTGF:CGAGGGAAACTTTGATATTGGgCat320340469线粒体内CATR:CTGCGGTATCTCATTGTTF:CTTCCACATCCACACCTTGgZn/CuSod20351862细胞之内SODR:TTGATGAGCTTGTCCTCGF:CCGTACCGTTGTCGTCCTGgMnSod20341868线粒体内SODR:GGCGTTGCCAGTCTTCTTF:CTTGTGCCGCTTACTCATTCGgGr20351661线粒体内GRR:CTCTGGGATTCGGCTGTG利用SYBR®PremixExTaqTMII为染料检测小麦全蚀病菌相关基因在不同处理条件下的表达趋势，内参基因为18SrRNA，qRT-PCR反应的cDNA第一条链均来自同一批。反应体系见表5-4。反应程序为，预变性95℃、30s，进入循环：变性95℃、5s；－△△CT复性60℃、30s。40个循环。采用2方法分析基因表达数据。表5-4荧光定量PCR反应体系Table5-4ReactionsystemoffluorescentquantitativePCR试剂体积（µL）ReagentsVolumSYBR®PremixExTaqTMII5.0PCRForwardPrimer(10um)0.3PCRReversePrimer(10um)0.3RT反应液（cDNA溶液）1.0Easydilution(forRealTime)3.4注：反应体系为10µL。Note:Reactionsystemwas10µL. 62天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导5.1.2.5对线粒体内还原型谷胱甘肽（GSH）含量的影响采用还原型谷胱甘肽（GSH）含量测定试剂盒测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内GSH影响：将天名精内酯酮配制成5×104µg/mL、2.5×104µg/mL、1.25×104µg/mL、6.25×103µg/mL、3.125×103µg/mL备用；将前述提取的线粒体加入3倍体积的试剂1，反复冻融2～3次，8000g离心10min，收集上清于4℃备用。按照如下步骤测定线粒体内GSH含量。（1）空白管检测（A1）：取1mL离心管，依次加入100μL超纯水，700μL试剂2（预先经25℃预热），200μL试剂3，混匀，室温静置2min，于分光光度上412nm处测定吸光度。（2）标准曲线制作：准确称取1mg标准品，用1mL超纯水配制成浓度为1mg/mL标准品母液。将试剂1配制成10倍稀释液，然后稀释标准品至200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL。取1.5mL离心管依次加入100μL标准品，700μL试剂2（预先经25℃预热），200μL试剂3，混匀，室温静置2min，于分光光度计上412nm处测定吸光度。以所测定的吸光度减去空白管检测值（A1）为横坐标，以标准品供试浓度为纵坐标绘制标准曲线。（3）样品管测定（A2）：取1mL离心管，依次加入100μL样品，1μL各浓度天名精内酯酮25℃孵育10min，然后加入700μL试剂2（预先经25℃预热），200μL试剂3，混匀，室温静置2min，于分光光度计上412nm处测定吸光度，计算△A=A2-A1，将△A代入标准曲线公式中，计算出样品浓度y（μg/mL），按照公式5-3计算样品中GSH的含量。ݕ×V总GSH（μg/mgprot）=（公式5-3）V×Cpr样品注：y为样品浓度（μg/mL），V总为反应总体积，V样品为加入样品体积，Cpr为样品蛋白浓度。5.1.2.6天名精内酯酮与L-半胱氨酸、GSH加成反应天名精内酯酮与L-半胱氨酸、GSH的加成反应参照Schmidt（1997）方法稍作改动：将0.1mM天名精内酯酮用3mL的甲醇溶解，然后加入10mLPBS（pH7.4），随即加入等量的L-半胱氨酸或GSH，充分混匀后，室温下于搅拌反应约6h。采用纤维素薄层层析板法监测反应，展开剂为乙酸乙酯:乙酸:正丁醇:水=2:1:1:1，用25%茚三酮丙酮液显色，跟踪至只有一个紫红色的产物点为止，用氯仿萃取除去剩余的天名精内酯酮，水相在冻干机中低温冷冻除去溶剂。最后将获得产物经质谱表征。5.1.2.7对小麦全蚀病菌细胞凋亡的诱导（1）末端脱氧核苷酸转移酶荧光素-12UTP缺口末端标记（TUNEL）TUNEL测定参照Liu等（2010）进行修改，具体步骤如下：①将小麦全蚀病菌接种在PD培养液中，25℃、150r/min恒温振荡培养72h。 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡63②用超纯水将菌丝洗涤3次，每次5min。③用0.1μM天名精内酯酮孵育菌丝2h、4h、6h、12h，以不经天名精内酯酮处理的菌丝为对照。④用超纯水将孵育后的菌丝洗涤3次，每次5min。⑤用免疫染色固定液固定40min。⑥用pH为7.2的PBS洗涤菌丝3次，每次5min。⑦用免疫染色洗涤液重悬菌丝，冰浴2min，重复3次。⑧用酶解液室温下破损细胞壁5min。⑨用pH为7.2的PBS浸泡洗涤菌丝5min。⑩按照每个样品2µLTdT酶、48µL荧光标记液配制TUNEL检测液。⑪用TUNEL检测液37℃避光孵育60min。⑫用pH为7.2的PBS洗涤菌丝2次，每次5min。⑬用超纯水将Hoechst33342染色液稀释100倍，将洗涤后的菌丝浸入染色液，37℃避光孵育10min。⑭用pH为7.2的PBS洗涤菌丝2次，每次5min，洗涤后的菌丝悬浮于pH为7.2的PBS中。⑮挑取少量菌丝在荧光显微镜上观察，并采集图片。（2）测试磷脂酰丝氨酸（PS）外翻采用PI和FITC缀合的膜联蛋白V（VFITC细胞凋亡试剂盒）测试磷脂酰丝氨酸（PS）外翻：天名精内酯酮孵育和破损细胞壁步骤同TUNEL测定，将破损细胞壁后的菌丝用pH为7.2的PBS洗涤3次。然后用试剂盒中结合液500µL重悬菌丝，随即加入5μLAnnexinV-FITC混匀，再加入5μLPI混匀。室温避光孵育10min。挑取少量菌丝放于载玻片上，置于荧光显微镜上观察并采集图片。（3）对小麦全蚀病菌DNA影响①菌丝培养及孵育将小麦全蚀病菌接种在PD培养液中，25℃、150r/min恒温振荡培养72h。用0.1μM天名精内酯酮分别孵育菌丝0h、2h、4h、6h、12h、24h、48h，备用。②DNA的提取i将孵育的菌丝真空抽滤至干，称取100mg于预冷的研钵中，加入少量石英砂及液氮研磨成粉状，收集菌丝粉于1.5mL离心管中，迅速加入400μL2%CTAB；ii将样品于65℃孵育60min，孵育期间颠倒样品混匀3次；iii温育后的样品于离心机12000r/min，离心15min，取上清液至另一个1.5mL离心管中，约350μL；iv加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇，颠倒混匀后12000r/min，离心15min；v小心移除上清液至另一个1.5mL离心管中，加入等体积的异戊醇，-20℃放置30 64天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导min，然后12000r/min，离心10min，弃上清；vi加入500μL70%乙醇漂洗，12000r/min，离心2min，弃上清，风干10min；vii加入含有RNase的超纯水30μL，37℃温育30min，低温保存。③电泳检测i配制2%琼脂糖30mL；ii加入1μLGelRed核酸染料；iii将胶液倒入水平放置的有机玻璃内槽，插好梳子，室温下冷却；iv胶凝固后拔掉梳子并把胶与有机玻璃内槽一起放入电泳槽中；v取5μL样品与1μL6×Loadingbuffer充分混匀后加入点样孔中；vi接通电源，在100V恒压，100mA以上电流条件下电泳60min；vii电泳结束后，将凝胶从电泳槽中取出，放入凝胶成像仪中观察DNA条带是否为弥散状，并拍照记录。（4）对Melacaspase1基因表达的影响天名精内酯酮孵育小麦全蚀病菌时间、RNA提取及纯化、相关基因cDNA的合成、qRT-PCR检测方法同5.1.2.4（6）。Melacaspase1的表达基因选择Ggmet1、Ggmet2，使用BeaconDesigener7.0软件设计的引物序列见表5-5。表5-5荧光定量PCR所用引物Table5-5PrimersinfluorescentquantitativePCR基因名称基因ID序列(5’-3’)GenenameGeneIDSequence(5’-3’)F:ACTACTTTGGTCAGAAGGGgmet120342939R:GTAGCCATAGAACTCCTGF:CCTACCCTACATCTACTCGgmet220345658R:CACCATTCATATCACCAC5.2结果与分析5.2.1对细胞内ROS影响5.2.1.1ROS定性测定本研究采用DCFH-DA荧光试剂盒检测经天名精内酯酮处理后，小麦全蚀病菌菌丝内ROS变化，结果（图5-1）发现：未经天名精内酯酮处理的小麦全蚀病菌菌丝内无荧光（图5-1b）；经阳性对照Rosup处理后的菌丝可观察到绿色荧光（图5-1d）；经天名精内酯酮处理30min、1h后菌丝内无荧光；经天名精内酯酮处理2h后个别菌丝分布微弱荧光，经天名精内酯酮处理3h后菌丝内荧光明显增强，几乎所有菌丝均可见绿色荧光（图5-1f）；经天名精内酯酮处理4h后菌丝内荧光明显减弱，只有个别菌丝分布 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡65微弱荧光；经天名精内酯酮处理5h、6h后菌丝内基本无荧光。由此可见天名精内酯酮处理小麦全蚀病菌后可产生活性氧，但产生的强度并不是随着时间的延长一直增强，而是在处理3h出现活性氧迸发状态，3h后活性氧产生量明显降低，至处理6h时便基本检测不到荧光。图5-1天名精内酯酮对小麦全蚀病菌细胞内ROS影响（a）示明场对照菌丝；（b）示对照无荧光；（c）示经DCFH-DA和Rosup（阳性对照）孵育后明场菌丝；（d）示Rosup荧光图片；（e）示经DCFH-DA和0.1μM天名精内酯酮孵育3h明场菌丝；（f）示经DCFH-DA和0.1μM天名精内酯酮孵育3h荧光图片。Fig.5-1influenceofcarabroneonROSincellsofGgt(a)Bright-fieldimageofcontrolhypha;(b)Controlwithoutfluorescence;(c)Bright-fieldimageofhyphatreatedwithDCFH-DaandRosup(positivecontrol);(d)FluorescenceimagesofRosup;(e)Bright-fieldimageofhyphatreatedwith0.1μMcarabronefor3h;(f)Fluorescenceimageofhyphatreatedwith0.1μMcarabronefor3h.5.2.1.2ROS定量测定以DCFH-DA为探针测定天名精内酯酮孵育6h以内，小麦全蚀病菌细胞内ROS产生情况，结果（图5-2）发现：测定时间内随着天名精内酯酮孵育时间的延长，小麦全 66天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导蚀病菌细胞内ROS的产生呈现先升高后降低的趋势，在孵育3h时菌丝内ROS量达到最大值，可见经天名精内酯酮孵育3h菌丝内活性氧出现迸发状态，这与定性观察结果一致。图5-2天名精内酯酮对小麦全蚀病菌细胞内ROS影响Fig.5-2InfluencecurveofcarabroneonROSincellsofGgt5.2.2对线粒体膜电位影响经荧光显微镜观察天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体膜电位的影响（图5-3）发现，未经天名精内酯酮孵育的健康的小麦全蚀病菌菌丝仅呈现红色荧光（图5-3b）；经阳性对照CCCP孵育后菌丝线粒体膜电位明显降低，菌丝仅呈现明亮的绿色荧光（图5-3f）；经天名精内酯酮孵育3～5h内可检测到红色荧光逐渐减弱，绿色荧光逐渐增强；孵育6h的菌丝仅呈现明亮的绿色荧光，红色荧光信号消失（图5-3i），说明此时线粒体膜电位明显降低。 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡67图5-3天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体膜电位的影响（a）、（d）、（g）示明场菌丝；（b）示健康的菌丝呈现红色荧光；（c）示健康的菌丝无绿色荧光信号；（e）示经CCCP（阳性对照）孵育后，菌丝线粒体膜电位明显降低，菌丝内无红色荧光；（f）示经CCCP（阳性对照）孵育后，菌丝内呈现绿色荧光；（h）经0.1μM天名精内酯酮孵育6h，线粒体膜电位明显降低，无红色荧光；（i）示经0.1μM天名精内酯酮孵育6h菌丝呈现明亮的绿色荧光。Fig.5-3InfluenceofcarabroneonmitochondrialmembranepotentialofGgt(a),(d),(g)Bright-fieldimageofmycelia;(b)Healthymyceliapresentedredfluorescence;(c)Healthymyceliahadnogreenfluorescence;(e)MitochondrialmembranepotentialwasobviouslyimpairedandnoredfluorescencewasdetectedAftermyceliatreatedwithCCCP(positivecontrol);(f)MyceliapresentedgreenfluorescenceaftertreatedwithCCCP(positivecontrol);(h)Mitochondrialmembranepotentialwasobviouslyimpairedandnoredfluorescencewasdetectedaftermyceliatreatedwith0.1μMcarabronefor6h;（i）Brightgreenfluorescencecouldbedetectedinmyceliatreatedwith0.1μMcarabronefor6h.5.2.3对线粒体内抗氧化酶系的影响5.2.3.1小麦全蚀病菌线粒体提取以BSA为标准蛋白，利用Bradford法测定蛋白的标准曲线为：y=6.4227x+0.1161，相关系数R2为0.9908。采用差速离心法对小麦全蚀病菌线粒体进行提取，通过蛋白标准曲线计算线粒体溶液的蛋白浓度为：127.24mg/mL。5.2.3.2对CAT影响 68天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导采用CAT试剂盒测定经天名精内酯酮处理后小麦全蚀病菌线粒体内CAT活性变化，结果（表5-6）发现，天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内CAT存在明显影响，并且呈剂量依赖性，随着处理浓度升高，线粒体内CAT活性明显降低，25µg/mL浓度下抑制率可达50%以上。表5-6天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内CAT活性影响Table5-6InfluenceofcarabroneonCATactivityinmitochondrionofGgt天名精内酯酮（µg/mL）CAT酶活（U/mgprot）抑菌率（%）Carabrone(µg/mL)CATactivity(U/mgprot)Inhibitionrate(%)500.61±0.01f72.34±0.92a250.99±0.02e54.78±1.23b12.51.23±0.16d43.86±2.96c6.251.64±0.03c25.06±1.73d3.1251.86±0.01b15.23±0.99e对照2.19±0.05a-注：同列小写字母表示0.05水平的差异显著性。下表同。Note：Differentlowercaseinacolumnmeansignificantdifferenceat0.05level.5.2.3.3对SOD影响SOD对于细胞内氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶可以清除超氧阴离子（O-2·），从而保护细胞免受损伤。试验采用SOD试剂盒测定经天名精内酯酮处理后小麦全蚀病菌线粒体内SOD活性，结果（表5-7）发现，天名精内酯酮对靶标菌线粒体内SOD存在明显抑制作用，随着处理浓度升高，线粒体内SOD活性明显降低，50µg/mL浓度下抑制率可达50%以上。表5-7天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内SOD活性影响Table5-7InfluenceofcarabroneonSODactivityinmitochondrionofGgt天名精内酯酮（µg/mL）SOD酶活（U/mgprot）抑菌率（%）Carabrone(µg/mL)SODactivity(U/mgprot)Inhibitionrate(%)504.47±0.17d59.83±1.09a256.98±0.35c37.26±0.58b12.58.84±0.13b20.55±1.52c6.259.37±0.12b15.81±1.58d3.12510.60±0.22a4.75±2.35e对照11.13±0.40a-5.2.3.4对谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）影响 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡69采用GSH-PX试剂盒测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内GSH-PX活性的影响。测得GSH-PX酶活回归方程为y=0.0186x+0.2207，R²=0.9957。进一步测得天名精内酯酮处理后的小麦全蚀病菌线粒体内GSH-PX活性（表5-8）发现，随着天名精内酯酮浓度的增加小麦全蚀病菌线粒体内GSH-PX活性逐渐升高，6.25µg/mL处理下该酶的活性就可达空白对照的2倍，50µg/mL处理下该酶的活性是空白对照的8倍，可见天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内GSH-PX的活性存在明显的促进作用。表5-8天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内GSH-PX活性影响Table5-8InfluenceofcarabroneonGSH-PXactivityinmitochondrionofGgt天名精内酯酮（µg/mL）GSH-PX酶活（IU/L）Carabrone(µg/mL)GSH-PXactivity(IU/L)5024.984±0.17a2518.078±0.07b12.511.753±0.38c6.256.185±0.15d3.1254.468±0.16e对照3.137±0.04f5.2.3.5对谷胱甘肽还原酶（GR）影响采用GR试剂盒测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内GR影响。测得GR酶活标准曲线的回归方程为y=0.0102x+0.2092，R²=0.9962。进一步测得天名精内酯酮不同浓度处理下小麦全蚀病菌线粒体内GR酶活如表5-9。可见，随着天名精内酯酮浓度的增加线粒体内GR活性逐渐降低。计算各浓度天名精内酯酮对GR抑制率发现，3.125µg/mL处理下该酶的活性就可被抑制50%以上，50µg/mL的天名精内酯酮对该酶的活性抑制率可达90%以上，由此可见天名精内酯酮对GR影响较大。表5-9天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内GR活性影响Table5-9InfluenceofcarabroneonGRactivityinmitochondrionofGgt天名精内酯酮（µg/mL）GR酶活（IU/L）抑制率（%）Carabrone(µg/mL)GRactivity(IU/L)Inhibitionrate(%)504.61±0.07f96.70±3.03a2516.27±0.59e88.35±2.57b12.541.04±1.08d70.62±3.13c6.2552.18±1.20c62.65±1.88c3.12564.42±1.74b53.88±2.40d对照139.68±3.08a-5.2.3.6对抗氧化酶系基因表达的影响 70天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导采用qRT-PCR检测天名精内酯酮不同处理浓度对小麦全蚀病菌线粒体抗氧化酶系基因表达的影响，结果（图5-4）发现，随着处理浓度的升高，线粒体内GR、SOD及CAT的基因GgGr、GgCat3、GgMnSod相对表达量均呈现上升趋势，并呈现明显的剂量依赖性。相比较之下，GgGr受影响最大。另外，本试验测定天名精内酯酮对细胞质内SOD基因GgZn/CuSod表达量的影响发现，该基因表达量与对照无显著差异。10aCK12.5μg/mL25μg/mL50μg/mL9b8a7ba65cb4c基因相对表达量3c2dddaaaa10GgGrGgCat3GgMnSodGgZn/CuSod基因名称图5-4不同浓度的天名精内酯酮对线粒体抗氧化酶系基因表达的影响Fig.5-4Influenceofdifferentconcentrationofcarabroneongeneexpressionofmitochondrialantioxidasesystem检测天名精内酯酮不同孵育时间对小麦全蚀病原菌线粒体抗氧化酶系基因表达的影响，结果（图5-5）发现，随着孵育时间的延长，GgCat3表达量呈现持续上升趋势，GgGr和GgMnSod呈现先上升后下降的趋势。与对照相比，所检测的基因相对表达量均显著上调，其中GgGr受影响最大，GgMnSod受影响相对较小。另外，本试验测定天名精内酯酮对细胞质内SOD基因GgZn/CuSod表达影响发现，该基因表达量与对照无显著差异。 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡71图5-5天名精内酯酮不同孵育时间对线粒体抗氧化酶系基因表达的影响Fig.5-5Influenceofdifferentincubationtimeofcarabroneongeneexpressionofmitochondrialantioxidasesystem5.2.4对线粒体内还原型谷胱甘肽（GSH）含量的影响采用GSH含量测定试剂盒测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内GSH含量的影响。测得GSH标准曲线的方程为：y=0.0065x-0.0144，R²=0.9998。进一步测得不同浓度天名精内酯酮对线粒体内GSH含量的影响（表5-10）发现，用6.25µg/mL浓度处理后线粒体内GSH含量就可降低90%以上，进一步升高处理药剂浓度GSH含量下降趋势变得缓慢。表5-10天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内GSH影响Table5-10InfluenceofcarabroneonGSHinmitochondrionofGgt天名精内酯酮（µg/mL）GSH含量（μg/mgprot）下降百分比（%）Carabrone(µg/mL)GSHcontent(μg/mgprot)Declineinthepercentage（%）502.30±0.61d95.19±3.21a253.05±0.76d93.62±2.15a12.53.32±0.54d93.07±2.17a6.254.50±0.18c90.59±3.05a3.12512.14±0.10b74.63±2.24b对照47.86±1.94a-5.2.5天名精内酯酮与L-半胱氨酸、GSH加成反应测定天名精内酯酮与L-半胱氨酸加成反应发现，天名精内酯酮与L-半胱氨酸在室温 72天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导下可进行加成反应，所得产物为白色粉末固体，溶于水及甲醇、乙醇等有机溶剂，不溶于氯仿。在ESI-HRMS谱中显示m/z=408.1250（[M+K]+），目标产物计算值369.47（附图12），并且NMR谱中天名精内酯酮C11和C13在13CNMR谱原有的位于120～130左右的化学位移信号消失（附图13），说明天名精内酯酮亚甲基发生了加成反应。1HNMR(CD3OD+D2O,400MHz)δ:4.92-4.98(1H,m,H8),3.89-3.94(1H,m,S-CHH-CH-NH2),3.24-3.28(1H,m,H11),3.19-3.22(1H,m,H13α),3.12-3.14(1H,m,H13β),2.99-3.11(1H,m,S-CHH-CH-NH2),2.66-2.72(2H,overlap,H7,S-CHH-CH-NH2),2.63-2.66(2H,t,J=2.65),2.44-2.50(1H,m,Hα),2.24(3H,s,H15),2.12-2.18(1H,m,H6α),1.54-1.65(1H,m,H2),1.10(3H,s,H14),0.99-1.05(1H,m,H9β),0.64-0.73(1H,m,H6β),0.46-0.51(1H,m,H1),0.37-0.42(1H,m,H5)。13CNMR(CD3OD+D2O,100MHz)δ:216.24(C4),181.05(CH-COOH),173.3(C12),80.00(C8),55.09(CH-NH2),44.60(C3),44.43(C11),38.69(C7),38.00(C9),34.95(C1),34.76(C13),30.56(C15),29.37(S-CHH-CH-NH2),25.24(C5),24.86(C2),23.14(C6),19.50(C14),16.72(C10)；ESI-HRMS，m/z=408.1250[M+K]+。测定天名精内酯酮与GSH加成反应，在反应时间内未检测到目标产物（附图14），因此，推测天名精内酯酮与GSH不能进行加成反应。5.2.6对小麦全蚀病菌细胞凋亡的诱导5.2.6.1末端脱氧核苷酸转移酶荧光素-12UTP缺口末端标记（TUNEL）使用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒和Hoechst33342检测经天名精内酯酮孵育的小麦全蚀病菌菌丝发现（图5-6）：未经处理的小麦全蚀病菌菌丝呈淡蓝色，未检测到绿色荧光信号（图5-6b、c），提示该菌丝为健康菌丝；经天名精内酯酮孵育2h、4h菌丝内未检测到明显的绿色荧光信号；而孵育6h、12h的菌丝内可检测到明亮的绿色和蓝色荧光信号（图5-6e-i），可见，小麦全蚀病菌经天名精内酯酮孵育6h以上菌丝内有大量断裂的基因组DNA，所暴露的3'-OH可被末端脱氧核苷酸转移酶加上荧光素（FITC）标记的dUTP。同时该处理下的菌丝可以被Hoechst33342着色，此结果提示天名精内酯酮可以诱导小麦全蚀病菌细胞凋亡。 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡73图5-6小麦全蚀病菌TUNEL检测（a）、（d）、（g）示明场菌丝；（b）示正常菌丝无绿色荧光信号；（c）示正常菌丝可检测到淡蓝色荧光信号；（e）示经0.1μM天名精内酯酮孵育6h的菌丝可检测到较强的绿色荧光信号；（f）示经0.1μM天名精内酯酮孵育6h的菌丝可检测到较强的蓝色荧光信号；（h）示经0.1μM天名精内酯酮孵育12h的菌丝可检测到较强的绿色荧光信号；（i）示经0.1μM天名精内酯酮孵育12h的菌丝可检测到较强的蓝色荧光信号。Fig.5-6TUNELstainofGgt(a),(d),(g)Bright-fieldimageofmycelia;(b)Nogreenfluorescencesignalwasdetectedinnormalmycelia;(c)Lightbluefluorescentsignalwasdetectedinnormalmycelia;(e)Stronggreenfluorescencecouldbedetectedinmyceliatreated6hwith0.1μMcarabrone;(f)Strongbluefluorescencecouldbedetectedinmyceliatreated6hwith0.1μMcarabrone;(h)Stronggreenfluorescencecouldbedetectedinmyceliatreated12hwith0.1μMcarabrone;(i)Strongbluefluorescencecouldbedetectedinmyceliatreated12hwith0.1μMcarabrone.5.2.6.2测试磷脂酰丝氨酸（PS）外翻本试验用0.1μM天名精内酯酮孵育小麦全蚀病菌菌丝2h、4h、6h，然后用AnnexinV-FITC及PI测试菌丝的PS外翻情况，结果发现（图5-7）：未经天名精内酯酮孵育的菌丝检测不到任何荧光（图5-7b、c），提示该处理菌丝为健康菌丝，不存在PS外翻情况；经天名精内酯酮孵育2h后的菌丝可观察到明亮的绿色荧光（图5-7f），未观察到红色荧光信号；经天名精内酯酮孵育4～6h的菌丝检测到绿色荧光逐渐减弱，未观察到 74天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导红色荧光信号。以上检测到绿色荧光信号证明天名精内酯酮可以诱导小麦全蚀病菌PS外翻，未检测到红色荧光信号说明菌丝不能被PI着色，提示菌丝并未坏死。因此，经天名精内酯酮孵育2h后，菌丝便出现PS外翻。图5-7小麦全蚀病菌磷脂酰丝氨酸（PS）外翻测定（a）、（d）示明场菌丝；（b）示对照菌丝无红色荧光信号；（c）示对照菌丝无绿色荧光信号；（e）示经0.1μM天名精内酯酮孵育2h菌丝无红色荧光信号；（f）示经0.1μM天名精内酯酮孵育2h菌丝呈明亮的绿色。Fig.5-7PSeversionmeasurementofGgt(a),(d)Bright-fieldimageofmycelia;(b)Nogreenfluorescenceincontrolmycelium;(c)Noredfluorescenceincontrolmycelium;(e)Noredfluorescencecouldbedetectedinmyceliatreatedwith0.1μMcarabronefor2h;(f)Brightgreenfluorescencecouldbedetectedinmyceliatreatedwith0.1μMcarabronefor2h.5.2.6.3对小麦全蚀病菌DNA影响细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现DNA呈弥散状（Ghoshetal2015）。本试验用0.1μM天名精内酯酮分别孵育菌丝0h、2h、4h、6h、12h、24h、48h，提取各处理基因组的DNA，于100V恒压，100mA电流条件下2%琼脂糖上电泳60min，结果（图5-8）发现：经天名精内酯酮孵育菌丝2h、4h菌丝DNA完整，孵育6h，200bp处出现明显弥散状条带，随着处理时间延长，菌丝DNA弥散区域变大，预示菌丝DNA断裂，受损。 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡75图5-8天名精内酯酮对小麦全蚀病菌DNA影响1、2泳道分别为23130bp、500bpDNAmarker；3～9泳道依次为经0.1μM天名精内酯酮孵育0h、2h、4h、6h、12h、24h、48h菌丝DNA条带。可见，孵育6h以上菌丝DNA呈现弥散状。Fig.5-8InfluenceofcarabroneonDNAofGgt.1,2:23130bpDNAmarker,500bpDNAmarker;3-9:DNAbandsofGgtmyceliaafter0h,2h,4h,6h,12h,24h,48hincubatedin0.1μMcarabrone,respectively.DNAbandsofmyceliaweredispersiveafter6hincubatedincarabrone5.2.6.4对Melacaspase1基因表达量的影响真菌的Melacaspase1在进化上起源于caspases，在外源刺激和内源信号引起的众多凋亡过程中起核心作用。本研究检测了天名精内酯酮对Melacaspase1两个亚基（Ggmet1、Ggmet2）的相对表达量的影响，结果（图5-9）发现，天名精内酯酮处理菌丝6h，Ggmet1、Ggmet2的表达量均显著提高，随着处理时间延长，相对表达量有下降的趋势，但依然显著高于空白对照。该结果进一步说明，天名精内酯酮可以诱导靶标菌细胞凋亡。图5-9天名精内酯酮对Ggmet1、Ggmet2表达量的影响Fig.5-9EffectsofcarabroneonexpressionofGgmet1,Ggmet2 76天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导5.3讨论5.3.1对靶标菌线粒体抗氧化系统的抑制可能是天名精内酯酮抑菌机制之一ROS水平过度升高会给生物机体造成极大的危害，而生物体内抗氧化系统起着清除ROS的重要作用。该抗氧化系统是由抗氧化酶系和小分子抗氧化剂组成。其中SOD、CAT是该酶系中关键酶，SOD能够通过歧化反应催化超氧阴离子（O-2·）生成H2O2，H2O2再经过CAT转化为水（Vlasitsetal.2010）。GSH是由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）组成的天然三肽，是小分子抗氧化剂中最为重要的成员，其在GSH-PX协助下消除生物体内ROS，自身变为氧化型谷胱甘肽（GSSG），后者在GR的作用下再生，如此循环，在抗氧化系统中起着至关重要的作用。鉴于此，本研究测定了天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内CAT、SOD、GSH-PX、GR活性及GHS含量的变化，结果发现，天名精内酯酮对CAT存在明显的抑制作用，随着处理浓度升高，线粒体内CAT活性明显降低，SOD受药剂影响趋势与CAT相同。由此可见经药剂处理后CAT与SOD所在的抗氧化通路受到了明显的抑制。另外，随着药剂处理浓度的升高GSH-PX活性呈现升高趋势，而GR活性受抑制明显，GHS含量迅速降低，致使GHS主导的抗氧化通路也被抑制。因而，通过上述结果可以确定天名精内酯酮抑制了靶标菌线粒体抗氧化通路，使得ROS不能及时消除，造成蓄积，从而引起线粒体膜电位的改变，诱导靶标菌细胞凋亡。另外，本研究还测定了天名精内酯酮对CAT、SOD、GR基因表达的影响，发现该三种酶的基因表达量均显著高于对照，并呈明显的剂量依赖性和一定的时间相关性。这一结果进一步说明，经药剂处理后，靶标菌线粒体内这几种酶的活性受到了明显影响，机体为了代谢补偿，上调这些酶的基因，大量表达这些酶，以促进ROS的消除。同时可见天名精内酯酮影响CAT、SOD、GR活性，但不影响这些酶的基因表达。5.3.2Melacaspase1在真菌细胞凋亡过程中起着重要作用含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspases）是存在于胞质中具有类似结构的一组蛋白水解酶，该酶在动物的细胞凋亡过程中起着重要作用。Melacaspase1是Caspases的同系物。Watanabe和Lam（2005）认为，在氧化胁迫诱导的细胞凋亡过程中，酵母中的Melacaspase1的表达可以导致下游蛋白酶的激活，表现出类似Caspases酶的活性；卢丽等（2010）通过基因干扰等手段也证明了Melacaspase1在线粒体介导的酵母细胞凋亡中起着决定性的作用；Léger等（2016）研究认为，Melacaspase1在法尼醇引发的白色念珠菌的凋亡反应中起关键作用。可见，在真菌细胞凋亡中，Melacaspase1与Caspases具有同等重要作用。测定其基因表达量的变化对于明确细胞内是否存在细胞凋亡具有重要的意义。本研究测定了天名精内酯酮对Melacaspase1基因表达量的影响，结果发现，经天名精内酯酮处理后，小麦全蚀病原菌菌丝内Melacaspase1两个亚基（Ggmet1、Ggmet2）的表达量均显著上调，上调的时间与线粒体膜电位改变时间一致。该结论进一步证实了 第五章天名精内酯酮诱导的氧化应激及细胞凋亡77天名精内酯酮可诱导小麦全蚀病菌细胞凋亡，且氧化胁迫很可能是Melacaspase1基因表达量上调的主要因素，而细胞凋亡则是Melacaspase1基因表达量上调的后效应。5.4小结本研究以小麦全蚀病菌作为靶标菌，检测了天名精内酯酮对其氧化胁迫与细胞凋亡的诱导，主要得到以下结论：（1）测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌氧化胁迫的诱导发现，经天名精内酯酮孵育3h菌丝细胞内出现活性氧迸发，定性与定量测定结果一致。（2）测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体膜电位的影响发现，经天名精内酯酮孵育6h小麦全蚀病菌线粒体膜电位明显降低。（3）测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体内抗氧化酶系的影响发现，随着处理浓度升高，线粒体内CAT、SOD、GR活性均明显降低，GSH-PX活性显著升高。检测天名精内酯酮对CAT、SOD、GR基因表达量的影响发现，GgCat3、GgGr和GgMnSod表达量均显著高于对照，并呈明显的剂量依赖性和一定的时间相关性。而细胞质内SOD的基因GgZn/CuSod的表达量与对照无显著差异。（4）在抗氧化酶系中，GR对天名精内酯酮最敏感，3.125µg/mL处理下该酶的活性就可被抑制50%以上，50µg/mL处理下，抑制率可达90%以上。该酶的活性中心起催化作用的是半胱氨酸残基，推测该酶为天名精内酯酮靶标酶。（5）测定天名精内酯酮对GSH含量的影响发现，经6.25µg/mL的天名精内酯酮处理后，线粒内GSH可减少90%以上，随着浓度升高，线粒体内GSH含量下降趋势变得缓慢。（6）测定天名精内酯酮与L-半胱氨酸和GSH的加成反应发现，天名精内酯酮与L-半胱氨酸反应产物为白色粉末固体，溶于水及甲醇、乙醇等有机溶剂，不溶于氯仿，目标产物分子量为369.47，NMR谱说明天名精内酯酮通过其亚甲基结构与半胱氨酸发生加成反应。未检测到天名精内酯酮与GSH反应的产物。（7）测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌细胞凋亡的诱导发现，经天名精内酯酮孵育菌丝6h，末端脱氧核苷酸转移酶荧光素-12UTP缺口末端标记检测为阳性，DNA电泳条带200bp处出现明显弥散状，小麦全蚀病原菌菌丝内Ggmet1、Ggmet2的表达量显著上调；经天名精内酯酮孵育2h磷脂酰丝氨酸（PS）外翻测试结果为阳性。以上结果提示天名精内酯酮可诱导小麦全蚀病菌细胞凋亡。 78天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导第六章讨论与结论6.1讨论6.1.1天名精内酯酮靶标位于线粒体本研究采用荧光示踪法观察了天名精内酯酮荧光标记物（TTY）在小麦全蚀病菌内的亚细胞定位，结果表明：天名精内酯酮作用细胞器是线粒体。荧光示踪技术在医学和农业领域被广泛应用于抗菌肽亚细胞定位研究（详见1.3.1），该技术优点在于：第一，具有非放射性，在检测时不存在安全隐患；第二，染色操作方法快捷、简单，所需的工作条件要求不高；第三，基于激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的应用，所获得的荧光图像比普通光学显微镜分辨力更高，图像清晰、美观（游雪娇等2004）。但该技术的缺点也是显而易见的：第一，由于多数目标分子物本身不具荧光特性（如天名精内酯酮），需要在其上偶联荧光基团。因此目标分子物在具备了荧光特性的同时，也在一定程度上改变了母体化合物的结构。虽然在合成荧光标记物时，尽量的兼具母体化合物的代表性，但毕竟不是母体化合物本身，因此获得结果是间接性的证据；第二，该技术局限性还在于不能清晰的看到探针定位的具体细胞器，只能借助于其他商业探针进行共定位。如果共定位的探针选择不当，可能会造成图像不清晰，试验失败（胡晓棣等2016）。因此，基于以上因素，采用该技术获得的试验结果仅能初步证明天名精内酯酮分布于线粒体。鉴于荧光示踪法存在的不足，本研究采用免疫荧光法观察天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位，结果表明：天名精内酯酮分布位置和线粒体探针基本吻合，证明天名精内酯酮作用于线粒体。免疫荧光技术更多的被应用于蛋白的亚细胞定位研究（详见1.3.2），该技术的优点在于：第一，制样程序简单、周期短，样品保存时间相对较长；第二，同荧光示踪技术相同，可以借助于LSCM获得美观的图片；第三，所呈现的是未经任何修饰的目标物本身所产生的结果，获得的是直接的证据。虽然该技术已经比较成熟，但是其缺点也是不可忽视的：第一，该技术和荧光示踪技术观察方法相同，不能达到亚细胞水平，只能借助于其他荧光探针共定位进行评价；第二，小分子化合物只具备反应原性不具有免疫原性（Shinkaruketal.2010），免疫动物之前需要先合成半抗原，然后制备人工抗原，前期试验相对繁琐；第三，试验的成败取决于抗体的特异性，对抗体要求高。本研究采用免疫荧光法试验结果验证了荧光示踪试验结果，但鉴于该方法存在的不足，进一步采用免疫胶体金法观察天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞的分布。免疫胶体金技术优点在于：第一，可以借助于透射电镜从细胞及亚细胞水平直接观察目标分子物定位的情况，不需要其他探针辅助识别；第二，该技术在获得目标物定位信息的同时也可以观察细胞及亚细胞的变化；第三，该技术可以追踪标记目标物进入细胞的过程；第四，该技术一般采用的抗体是特异性强的单克隆抗体，因此所获得的结果理论上更具可信性。但该技术同其他试验技术一样，不可避免的具有其不足的一面：第 第六章讨论与结论79一，单克隆抗体制备难度大，周期长；第二，样品制备不仅包括了透射电镜制样的流程还包括了胶体金染色的流程，制样程序繁琐；第三，样品制备许多环节都需要进行摸索，处理不当有可能造成目标物不能被识别，或者造成假阳性，使得不能准确获得定位结果。本研究采用免疫胶体金法确证了荧光示踪及免疫荧光法的试验结果，同时发现天名精内酯酮孵育30min时在细胞膜上有大量沉积的胶体金颗粒，随着药剂处理时间的延长，天名精内酯酮逐渐汇集到线粒体；线粒体病变的过程是先出现脊模糊，随后脊消失，最终线粒体空泡化。经上述三种方法证明天名精内酯酮作用细胞器为线粒体，因此可以推断天名精内酯酮靶标一定位于线粒体。6.1.2线粒体复合酶III可能是天名精内酯酮作用靶标前期研究发现，线粒体复合酶III对天名精内酯酮最敏感（许丹2011），经荧光定量PCR也证实，线粒体复合酶III的基因表达受天名精内酯酮影响最显著（Wangetal.2017）。该酶不仅是呼吸链上产生能量的主要成员，同时也被认为是ROS的主要产生者。本研究证实ROS不仅是靶标菌线粒体发生病变的成因，也是引发靶标菌发生细胞凋亡的关键。由此推测线粒体复合酶III可能是天名精内酯酮的作用靶标。作用于线粒体呼吸链的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂和琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI）被称为是里程碑式杀菌剂，在当今病害防治中发挥着极为重要的作用（张一宾2016）。尤其甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂拥有世界最大的杀菌剂市场，其作用位点是线粒体复合酶III的泛醌还原中心（Qo）。类似此作用机制的杀菌剂还有以天然产物UK-2A衍生修饰得到新型吡啶酰胺类杀菌剂fenpicoxamid以及来源于多种链霉菌的抗霉素A，它们作用位点是线粒体复合物III的泛醌还原中心（Qi）（Bartlettetal.2004;Owenetal.2017）。可见，所报道的这些杀菌剂已经有了明确的抑菌机制以及靶标位点，但它们和天名精内酯酮均不属于同类化合物，因此天名精内酯酮作用机制及作用位点还有待于进一步研究。6.1.3GR可能是天名精内酯酮作用靶标之一真核生物为了避免ROS造成的DNA、蛋白质、脂质等生物大分子损伤，细胞内抗氧化酶系（如CAT、SOD）和抗氧化小分子化合物（如GSH）行使着消除ROS的功能。本研究测定了天名精内酯酮对抗氧化系统中几种关键酶的活性，结果发现经该化合物处理后，靶标菌线粒体内CAT、SOD、GR的活性均显著低于对照。其中，GR受影响最大，在3.125µg/mL（相当于12.6mM）浓度处理下该酶的活性可被抑制50%以上。该酶在GSH再生中起着决定性的作用，其活性中心结构域蛋白序列是高度保守的，Cys39/Cys44的残基负责与GSSG结合并将其还原成GSH（Trivedietal.2013）。在医学上研究普遍认为倍半萜内脂类化合物中所含有的α-亚甲基-γ-丁内酯结构可以与细胞内的巯基进行迈克尔加成反应（Wenetal.2002；Zhangetal.2004b）。Shin等（2017）也曾指出生物细胞内酶或者蛋白上的巯基往往是倍半萜内酯类化合物的靶点。本研究发现， 80天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导天名精内酯酮在室温下很容易和L-半胱氨酸发生加成反应，导致C11-C13位双键被还原（详见5.2.5）。因此，推测天名精内酯酮进入线粒体后，可能与GSSG竞争性的和GR活性中心的半胱氨酸残基发生了加成反应，致使该酶失去活性，GR是天名精内酯酮的作用靶标。GR和还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR）是当今医学上被鉴定为多种药物开发的新型靶标（Gromeretal.2004;Krauth-Siegeletal.2005;Kuntzetal.2007;Sarmaetal.2003）。关于人类谷胱甘肽还原酶（hGR）的晶体结构医学界早已解析（Karplusetal.1987;Paietal.1988），并详细的阐明了该酶的抑制剂。其中抑制剂主要有异咯嗪（Beckeretal.1990;Schönleben-Janasetal.1996），甲萘醌（Karplusetal.2010）和氧杂蒽衍生物（Savvidesetal.1996）。所有这些化合物结合在位于hGR二聚体界面的空腔中（图6-2），能够以较低浓度非竞争性地抑制hGR。有研究证明，这个腔也是抑制恶性疟原虫谷胱甘肽还原酶（PfGR）的亚甲蓝的结合位点（Böhmeetal.2000）。由图6-2可知上述化合物在GR上的结合位点并不在该酶的活性中心Cys39/Cys44的残基处，和GSSG不存在竞争关系，因此，与天名精内酯酮对GR的作用机制并不相同。图6-2hGR模型（引自Sarmaetal.,2003）Fig.6-2ThetypeofhGR6.1.4天名精内酯酮抑菌作用机理推测前期离体试验表明，天名精内酯酮对多种靶标菌的孢子萌发具有很强的毒力，可见菌体内能量生成受到了明显的影响；生理生化测试表明，天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体呼吸链存在明显的抑制作用，尤其对线粒体复合酶III影响最大（许丹2011）。众所周知，生物生存所需的能量95%都是源自线粒体呼吸链，呼吸链上任何一个复合酶被抑制都发可能导致能量生成受到较大的影响。由此看来，天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体呼吸链尤其线粒体复合酶III的抑制作用，导致靶标菌能量匮乏，从而使得靶 第六章讨论与结论81标菌菌丝不能生长，孢子不能萌发，最终靶标菌死亡。因此，对线粒体复合酶III的抑制可能是天名精内酯酮抑菌机制。另外，线粒体呼吸链复合酶III不仅是能量的生产者，同时也是ROS的主要产生者（Brandetal.2010;DröseandBrandt2012;BleierandDröse2013），当细胞受到外来影响，尤其当线粒体功能受损时，其会产生更多的ROS（BrunkandTerman2002）。由此可知，天名精内酯酮不仅影响靶标菌能量合成受阻，还会造成靶标菌细胞ROS过度产生。除此外，本研究发现，天名精内酯酮2h可全部汇集于线粒体，此时细胞内活性氧信号较弱，但抗氧化酶系CAT、GR、SOD的相关基因GgCat3、GgGr和GgMnSod已经显著上调，推测此时CAT、GR、SOD已经受到了明显的抑制，使得ROS消除受阻，ROS开始蓄积；随着孵育时间的延长，在3h时出现活性氧迸发，随后（孵育6h）引起后续一系列效应：线粒体的脊出现模糊，线粒体膜电位降低，细胞凋亡酶Melacaspases1的基因显著上调，使得DNA出现断裂，引发细胞凋亡（汇总见图6-1）。由此可见，靶标菌内ROS的蓄积是天名精内酯酮作用靶标菌后引发菌体最终死亡的关键因素之一，而ROS的蓄积一方面源于天名精内酯酮对靶标菌线粒体复合酶III的抑制所造成的ROS过度产生，另一方面源于天名精内酯酮对靶标菌线粒体内抗氧化系统的干扰所造成的ROS不能及时消除，可见，促进ROS产生并抑制其消除是天名精内酯酮抑菌作用机制之一。图6-1小麦全蚀病菌变化时间轴Fig.6-1ThetimelineofGgt综上所述，天名精内酯酮抑菌机理较为复杂，是一多作用位点杀菌活性物质，其可能的作用机理是：该化合物进入小麦全蚀病菌后在线粒体内逐渐汇集，首先抑制线粒体 82天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导复合酶III使得靶标菌能量合成受阻（Wangetal.2017），从而抑制了靶标菌菌丝的生长与孢子的萌发，使得菌体死亡。另一方面，对线粒体复合酶III的抑制造成ROS过度产生以及对抗氧化系统的抑制作用使得ROS不能消除，最终导致细胞内ROS蓄积，造成线粒体膜电位降低，使得线粒体膜通透性增加，释放线粒体凋亡蛋白，诱导激活了Melacaspase1，引起小麦全蚀病菌细胞凋亡，最终使得靶标菌死亡。汇总图如下：消除ΔΨm图6-3天名精内酯酮作用机理推测“”示此途径受到抑制；“”示此途径受到促进；“”示此途径未受影响；红色字体酶示受抑制，绿色字体酶示被激活。Fig.6-3Speculationaboutactionmechanismofcarabrone“”thepathwayisrepressed;“”thepathwayispromoted;“”thepathwayisunaffected;enzymewithredfontrepresentbeinginhabited,withredfontrepresentbeingactivated.6.2结论本研究以小麦全蚀病菌为靶标菌，采用荧光示踪技术、免疫荧光技术以及免疫胶体金技术研究了天名精内酯酮在靶标菌中的亚细胞定位，通过生理生化方法测定了该化合物对靶标菌氧化胁迫与细胞凋亡的诱导，主要得到以下结论：（1）天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内作用细胞器为线粒体。（2）天名精内酯酮进入靶标菌细胞后2h基本汇集于线粒体，6-12h线粒体的脊逐渐模糊，48h线粒体的脊逐渐消失，最后线粒体趋向于空泡化。（3）天名精内酯酮能引起靶标菌细胞内ROS水平升高，导致SOD、CAT、GR的活性降低，促进GSH-PX活性增加，使得GSH含量降低，最终促进ROS蓄积。（4）经天名精内酯酮孵育3h细胞内出现活性氧迸发；孵育6h线粒体膜电位明显降低，DNA断裂，细胞凋亡酶Melacaspase1亚基的表达量上调，导致靶标菌细胞凋亡。（5）室温下天名精内酯酮可与L-半胱氨酸发生加成反应，供试条件下不和GSH发 第六章讨论与结论83生反应。（6）推测线粒体复合酶III与GR可能是天名精内酯酮作用靶标。（7）本研究推测天名精内酯酮抑菌机理是：该化合物进入小麦全蚀病菌后在线粒体内逐渐汇集，通过对线粒体复合酶III的抑制作用造成靶标菌能量匮乏以及ROS的过度产生，同时对GR等抗氧化酶的抑制作用导致ROS蓄积，改变了线粒体膜电位，使得线粒体膜通透性增加，引起小麦全蚀病菌细胞凋亡，最终达到抑菌的目的。6.3本研究创新点（1）首次采用荧光示踪法、免疫荧光法以及免疫胶体金法三种亚细胞定位方法对天名精内酯酮作用机理进行研究，为相关的杀菌毒理研究提供借鉴。（2）本研究确定了天名精内酯酮作用细胞器为线粒体。（3）初步明确了天名精内酯酮对小麦全蚀病菌的抑菌作用机理。6.4有待进一步解决的问题（1）本研究明确了天名精内酯酮主要定位细胞器为线粒体，前期研究发现，天名精内酯酮可干扰靶标菌线粒体呼吸链的电子传递，尤其对线粒体复合酶III的活性抑制最为明显（Wangetal.2017），但对线粒体复合酶III的抑制机制有待于进一步研究。（2）本研究表明天名精内酯酮对线粒体内GR的活性存在明显的抑制作用，其活性位点起着催化作用的是半胱氨酸残基。同时，本试验证明天名精内酯酮在室温下很容易和L-半胱氨酸发生加成反应。推测天名精内酯酮可能与GR活性中心的半胱氨酸残基发生了迈克尔加成反应，对该推测有待于进一步验证。 84天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导参考文献曹智勇.1996.藏药矮丛风毛菊有抗癌活性.江西中医学院学报,8(19):331.崔俊.2013.羟基马桑毒素结构改造及其对昆虫的毒杀机理研究.[博士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.陈凤梅,李娟,曲原君,牛钟相.2004.免疫胶体金技术的应用及研究进展.中国兽药杂志,38(8),33-35.陈进军,王思明,李存芳,张嫚丽,董玫,史清文.2011.冷蒿中五种倍半萜内酯化合物抑制人肿瘤细胞增殖活性及构效关系研究.中药药理与临床,27(2),24-26.陈中举,张燕玲,黄金瑛.2004.荧光标记生物大分子及其应用.国外医学:生物医学工程分册,27(6),348-352.范国强,曾辉,翟晓巧.2008.泡桐丛枝病发生特异相关蛋白质亚细胞定位及质谱鉴定.林业科学,44(4),83-86.冯俊涛.2006.大花金挖耳杀菌作用研究.[博士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.冯俊涛,张亚梅,王俊儒,张兴.2007.天名精内酯酮衍生物合成及其抑菌活性.农药学学报,9(2),185-188.冯志敏.2006.免疫金标记技术在植物蛋白质亚细胞定位中的应用.信阳农业高等专科学校学报,2006,16(1):105-108.高坤,王文蜀,贾忠建.2003.假橐吾中四对新的倍半萜结构研究.化学学报,61(7),1065-1070.郭伟,王奇,陈云波.2006.细胞核因子κB信号转导途径内的活化与调节机制研究进展.实用医学杂志,22(11),1332-1334.郭新荣.2014.马桑倍半萜内酯对粘虫毒理学研究.[博士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.郭新荣,郑友鹏,李孟楼.2013.马桑标本中马桑毒素的抑菌活性研究.陕西林业科技,(3),18-20.韩慧平,于三科.2012.小鼠抗HCMV-gB多克隆抗体的制备及初步应用.动物医学进展,33(2),51-54.韩兴帅,许丹,冯俊涛,张兴.2014.天名精内酯酮的抑菌活性.西北农林科技大学学报(自然科学版),8,027.侯鹏飞,陈文星,赵新慧,宿树兰,刘汉清,陆茵,段金廒.2008.木香挥发性成分气质联用分析及其抑制血小板聚集作用的研究.中国实验方剂学杂志,(7),26-30.黄雪松,黄荣春.2003.大孔树脂富集三裂叶蟛蜞菊倍半萜内酯A和B的研究.中草药,34(8),701-704.胡晓棣,李熠,任蜀豫,姚一建.2016.冬虫夏草,蛹虫草菌丝隔膜和细胞核荧光染色.菌物学报,35(9),1099-1105.计淑霞,盖国琛,戴绍军,刘炜.2010.应用改进的免疫荧光组织化学染色法对水稻根尖细胞微管结构的观察.山东农业科学,(4),40-42.孔繁德,黄印尧,赖清金.2002.免疫胶体金技术及其发展前景.福建畜牧兽医,24(7):42-43,45.兰秒,杨瑞,胡晓,侯旭,刘悦萍.2016.桃种皮细胞的超微结构观察及生长素结合蛋白ABP1亚细胞定位.电子显微学报,35(1),42-48.李国峰,韩鹤,翟宇.2013.胶体金技术及其应用.畜牧兽医科技信息,(9),4-6.李江华,冯俊涛,孙文文,张兴.2009.天名精内酯酮酯类衍生物的合成及其对黄瓜炭疽病菌的抑菌 参考文献85活性.西北农业学报,18(2),283-286.李立奇,万瑛.2009.蛋白质的亚细胞定位预测研究进展.免疫学杂志,(5).602-604.李冉,杨文理,覃扬,魏玲,沈文燕,刘秋英,俞小琴.2013.不同固定方法对细胞免疫荧光染色结果的影响.西部医学,25(11),1608-1610.李文楚,章羽,陈芳艳.2008.超氧化物歧化酶研究及应用概况.广东蚕业,42(1),45-49.李云琴,崔晓峰,胡东维,李桂新,周雪平.2004.烟草曲茎病毒AC4基因的原核表达与免疫定位.植物病理学报,34(5),414-418.刘建欣,郑昌学.2002.现代免疫学:免疫的细胞和分子基础.北京:清华大学出版社.芦光新.2004.胶体金标记小麦与白粉病菌中β-1,3-葡聚糖酶底物的制备及定位.青海大学学报:自然科学版,22(1),5-7.卢丽,冯霞,徐婷婷,李树峰,佟慧丽,严云勤.2010.Metacaspase在酵母凋亡过程中的作用.现代农业科技,2010(8),36-38.倪灿荣.2006.免疫组织化学实验技术及应用.北京:化学工业出版社.其木格,吴岩.2007.胶体金免疫电镜技术及其应用.内蒙古医学院学报,29(5),373-377.秦艳红,刘冬梅,周涛,范在丰.2009.甘蔗花叶病毒VPg蛋白的原核表达及其在玉米中的免疫定位.植物病理学报,(6),608-612.任双喜,许丹,韩立荣,冯俊涛,张兴.2012.天名精内酯酮对小麦白粉病的药效及病菌生长发育的影响.西北农林科技大学学报:自然科学版,40(8),77-82.沈硕,刘淑芝,杜茂波.2015.青蒿素类抗疟制剂研究概述.中国中医药信息杂志,22(10),125-128.孙勇.2012.氯霉素单克隆抗体的制备以及胶体金快速诊断方法的初步建立.[硕士学位论文].南京:南京农业大学.汪澈,张立军,李楠.2009.一种改进的观察植物细胞微管的免疫荧光染色方法.植物生理学通讯,(7),699-701.王箐霞.2007.大花金挖耳茎叶杀菌活性成分研究.[硕士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.王近近,邵兴锋,刘淑敏,许凤,王鸿飞.2016.茶树精油对灰葡萄孢霉生理功能的干扰研究.现代食品科技,(6),56-62.王旭,黄德玉,吴庆华,程古月,袁宗辉.2015.真菌毒素引起的氧化应激及其毒理学意义.生态毒理学报,10(6),62-70.王艳梅.2009.天名精内酯酮对5种植物病害的药效及对小麦全蚀病菌生长发育的影响.[硕士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.吴静.2008.黄花篱的抑菌活性及有效成分的初步分离研究.[硕士学位论文].重庆:西西南大学.吴丽华,陈燕飞,陈鹏,仪慧兰.2016.亚砷酸钠对酵母细胞抗氧化酶活性和脂质过氧化的影响.亚洲生态毒理学杂志,11(3),302-307.吴志明,钟敏,鹿承建,刘鹏,占昭宏,邵开生,李昆太.2018.新型农抗N2粗提物对水稻纹枯病菌细胞膜和抗氧化功能的影响.核农学报,32(4),700-707.小西天二.2003.土木香中抑制肿瘤细胞增殖的成分.国外医学中医中药分册,25(3):1741.许丹.2011.天名精内酯酮抑菌机理初步研究.[硕士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.杨辉亮,刘芃芃,贺超,杜雪,李怡坚,杨耀景,史梦丹,宋晨,朱玲.2014.青蒿素及其衍生物的抗炎作用及机制研究.四川生理科学杂志,36(3),124-127.严华,申厚凤.2005.胶体金免疫层析技术的应用与展望.微生物学免疫学进展,2005,33(3):86-89.姚新生.2001.天然药物化学.第三版.北京:人民卫生出版社. 86天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导游雪娇,李良秋,马连营,彭斐元.2015.激光共聚焦扫描显微镜在抗菌机理研究中的应用.微生物学通报,42(6),1108-1121.于盼盼.2014.欧蓍草中倍半萜内酯化合物抑制人肺肿瘤细胞增殖活性及作用机制研究.[硕士学位论文].石家庄:河北医科大学.张静.2008.川楝素免疫分析方法及其应用研究.[博士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.张鹏.2008.吡咯喹啉醌对甲基汞引起PC12细胞毒性的保护作用及其机理研究.[博士学位论文].大连:大连理工大学.张权庚，张玉祥,丁卫，王炜.2010.抗体制备与使用实验指南.北京:科学出版社.张文渊.2007.土木香抑菌活性成分的研究.[硕士学位论文].保定:河北农业大学.张一宾.2016.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的全球市场概况及进展.世界农药,38(4),30-34.张玉虎,刘梅芳,凌铁军,魏孝义.2004.三裂蟛蜞菊中的倍半萜内酯成分及其化感作用.热带作物学报,12(6):533-537.赵雷.2010.土木香中有效成分土木香内酯和异土木香内酯的提取分离及其在大鼠体内外的代谢研究.[硕士学位论文].石家庄:河北医科大学.曾辉,翟晓巧,刘艳萍,张国俊,李晓梦.2006.免疫胶体金技术及其应用.河南林业科技,26(3),37-38.周丽平.2013.八氯苯乙烯酶联免疫分析方法的建立.[硕士学位论文].长沙:湖南大学.周琼,魏美才,欧晓明,肖炜.2008.苍耳倍半萜内酯和博落回生物碱对3种蔬菜害虫的活性比较.植物保护,34(3):78-82.庄世宏.2010.小花假泽兰杀菌作用研究.[博士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.Zola,H.1991.单克隆抗体技术手册.南京:南京大学出版社.Abdelgaleil,S.A.M.,Badawy,M.E.I.,Suganuma,T.,Kitahara,K.2011.AntifungalandbiochemicaleffectsofpseudoguaianolidesesquiterpenesisolatedfromAmbrosiamaritimaL.AfricanJournalofMicrobiologyResearch.5(21),3385-3393.Achachi,A.,Barka,E.A.,Ibriz,M.2014.RecentadvancesinCitruspsorosisvirus.Virusdisease,25(3),261-276.Ahmed,S.M.,Abdelgaleil,S.A.2005.AntifungalactivityofextractsandsesquiterpenelactonesfromMagnoliagrandifloraL.(Magnoliaceae).Int.J.Agric.Biol,7,638-642.Awe,S.O.,Makinde,J.M.,Olajide,O.A.1999.CatharticeffectoftheleafextractofVernoniaamygdalina.Fitoterapia,70(2),161-165.Awouafack,M.D.,Tane,P.,Kuete,V.,Eloff,J.N.2013.SesquiterpenesfromthemedicinalplantsofAfrica.MedicinalPlantResearchinAfrica,33-103.BaldwinJr,A.S.1996.TheNF-κBandIκBproteins:newdiscoveriesandinsights.AnnualReviewofImmunology,14(1),649-681.Ballesteros-Merino,C.,Watanabe,M.,Shigemoto,R.,Fukazawa,Y.,Adelman,J.P.,Luján,R.2014.DifferentialsubcellularlocalizationofSK3-containingchannelsinthehippocampus.EuropeanJournalofNeuroscience,39(6),883-892.Barsby,R.W.J.,Salan,U.,Knight,D.W.,Hoult,J.R.S.1993.Feverfewandvascularsmoothmuscle:extractsfromfreshanddriedplantsshowopposingpharmacologicalprofiles,dependentuponsesquiterpenelactonecontent.PlantaMedica,59(01),20-25.Bartlett,D.W,,Clough,J.M.,Godwin.,J.R.,Hall.,A.A.,Hamer,M.B.,Parr-Dobrzanski.2004.Review: 参考文献87thestrobilurinfungicides.PestManagementScience,60(3),309-309.Becker,K.,Christopherson,R.I.,Cowden,W.B.,Hunt,N.H.,Schirmer,R.H.1990.Flavinanalogswithantimalarialactivityasglutathionereductaseinhibitors.BiochemicalPharmacology,39(1),59-65.Beekman,A.C.,Woerdenbag,H.J.,vanUden,W.,Pras,N.,Konings,A.W.,Wikström,H.V.,Schmidt,T.J.1997.Structure-cytotoxicityrelationshipsofsomehelenanolide-typesesquiterpenelactones.JournalofNaturalProducts,60(3),252-257.Bernardi,P.,Krauskopf,A.,Basso,E.,Petronilli,V.,Blalchy‐Dyson,E.,DiLisa,F.,Forte,M.A.2006.Themitochondrialpermeabilitytransitionfrominvitroartifacttodiseasetarget.TheFEBSJournal,273(10),2077-2099.Bleier,L.,Dröse,S.2013.SuperoxidegenerationbycomplexIII:frommechanisticrationalestofunctionalconsequences.BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Bioenergetics,1827(11-12),1320-1331.Bohlmann,F.,Mahanta,P.K.,Jakupovic,J.,Rastogi,R.C.,Natu,A.A.1978.NewsesquiterpenelactonesfromInulaspecies.Phytochemistry,17(7),1165-1172.Böhme,C.C.,Arscott,L.D.,Becker,K.,Schirmer,R.H.,Williams,C.H.J.2000.Kineticcharacterizationofglutathionereductasefromthemalarialparasiteplasmodiumfalciparum:comparisonwiththehumanenzyme.JournalofBiologicalChemistry,275(48),37317-37323.Boivin,J.,Fouquet,E.,Schiano,A.M.,Zard,S.Z.1994.Iminylradicals:PartIII.Furthersyntheticallyusefulsourcesofiminylradicals.Tetrahedron,50(6),1769-1776.Bradford,M.M.1976.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.AnalyticalBiochemistry,72(1-2),248-254.Brand,M.D.2010.Thesitesandtopologyofmitochondrialsuperoxideproduction.ExperimentalGerontology,45(7-8),466-472.Brelje,T.C.,Wessendorf,M.W.,Sorenson,R.L.2002.Multicolorlaserscanningconfocalimmunofluorescencemicroscopy:practicalapplicationandlimitations.CellBiologicalApplicationsofConfocalMicroscopy,70,165.Brunk,U.T.,Terman,A.2002.Themitochondrial‐lysosomalaxistheoryofaging.TheFEBSJournal,269(8),1996-2002.Cabib,E.1991.Differentialinhibitionofchitinsynthetases1and2fromSaccharomycescerevisiaebypolyoxinDandnikkomycins.AntimicrobialAgentsandChemotherapy,35(1),170-173.Calera,M.R.,Soto,F.,Sanchez,P.,Bye,R.,Hernandez-Bautista,B.,Anaya,A.L.,Hennsen,B.,Mata,R.1995.BiochemicallyactivesesquiterpenelactonesfromRatibidamexicana.Phytochemistry,40(2),419-425.Cantrell,C.L.,Abate,L.,Fronczek,F.R.,Franzblau,S.G.,Quijano,L.,Fischer,N.H.1999.AntimycobacterialeudesmanolidesfromInulaheleniumandRudbeckiasubtomentosa.PlantaMedica,65(4),351-355.Castro,V.,Murillo,R.,Klaas,C.A.,Meunier,C.,Mora,G.,Pahl,H.L.,Merfort,I.2000.InhibitionoftheTranscriptionFactorNF-κBbySesquiterpeneLactonesfromPodachaeniumeminens1.PlantaMedica,66(07),591-595.Chadwick,M.,Trewin,H.,Gawthrop,F.,Wagstaff,C.2013.Sesquiterpenoidslactones:benefitstoplantsandpeople.InternationalJournalofMolecularSciences,14(6),12780-12805.Chaves,J.S.,Leal,P.C.,Pianowisky,L.,Calixto,J.B.2008.Pharmacokineticsandtissuedistributionof 88天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导thesesquiterpeneα-humuleneinmice.PlantaMedica,74(14),1678-1683.Chen,C.N.,Huang,H.H.,Wu,C.L.,Lin,C.P.,Hsu,J.T.,Hsieh,H.P.,Chuang,S.E.,Lai,G.M.2007.Isocostunolide,asesquiterpenelactone,inducesmitochondrialmembranedepolarizationandcaspase-dependentapoptosisinhumanmelanomacells.Cancerletters,246(1),237-252.Chen,H.C.,Chou,C.K.,Lee,S.D.,Wang,J.C.,Yeh,S.F.1995.ActivecompoundsfromSaussurealappaClarksthatsuppresshepatitisBvirussurfaceantigengeneexpressioninhumanhepatomacells.AntiviralResearch,27(1-2),99-109.Chen,W.L.,Ren,Y.,Ren,J.,Erxleben,C.,Johnson,M.E.,Gentile,S.,Burdette,J.E.2017.(+)-Strebloside-InducedCytotoxicityinOvarianCancerCellsIsMediatedthroughCardiacGlycosideSignalingNetworks.JournalofNaturalProducts,80(3),659-669.Chen,X.,Xu,L.,Ma,W.,Liu,L.,Kuang,H.,Wang,L.,Xu,C.2014.Generalimmunoassayforpyrethroidsbasedonamonoclonalantibody.FoodandAgriculturalImmunology,25(3),341-349.Chen,Y.L.,Feng,R.L.,Luo,G.H.,Guo,J.L.,Wang,Y.J.,Sun,Y.Y.,Zheng,L.L.,Wen,T.Q.2018.DCF1subcellularlocalizationanditsfunctioninmitochondria.Biochimie,144,50-55.Choi,J.H.,Lee,K.T.2009.Costunolide-inducedapoptosisinhumanleukemiacells:involvementofc-junN-terminalkinaseactivation.BiologicalandPharmaceuticalBulletin,32(10),1803-1808.Cho,J.Y.,Baik,K.U.,Jung,J.H.,Park,M.H.2000.Invitroanti-inflammatoryeffectsofcynaropicrin,asesquiterpenelactone,fromSaussurealappa.EuropeanJournalofPharmacology,398(3),399-407.Chi,J.,Li,B.C.,Dai,W.F.,Liu,L.,Zhang,M.2016.HighlyoxidizedsesquiterpenesfromArtemisiaaustro-yunnanensis.Fitoterapia,115,182-188.Delahaut,P.2017.Immunisation–Choiceofhost,adjuvantsandboostingscheduleswithemphasisonpolyclonalantibodyproduction.Methods,116,4-11.Dewitte,W.,VanOnckelen,H.2001.Probingthedistributionofplanthormonesbyimmunocytochemistry.PlantGrowthRegulation,33(1),67-74.Dirsch,V.M.,Stuppner,H.,Vollmar,A.M.2001.HelenalintriggersaCD95deathreceptor-independentapoptosisthatisnotaffectedbyoverexpressionofBcl-xLorBcl-2.CancerResearch,61(15),5817-5823.Dreaden,E.C.,Alkilany,A.M.,Huang,X.,Murphy,C.J.,El-Sayed,M.A.2012.Thegoldenage:goldnanoparticlesforbiomedicine.ChemicalSocietyReviews,41(7),2740-2779.Dröse,S.,Brandt,U.2012.Molecularmechanismsofsuperoxideproductionbythemitochondrialrespiratorychain.MitochondrialOxidativePhosphorylation,145-169.Erokhina,T.N.,Lazareva,E.A.,Richert-Pöggeler,K.R.,Sheval,E.V.,Solovyev,A.G.,Morozov,S.Y.2017.SubcellularlocalizationanddetectionoftobaccomosaicvirusORF6proteinbyImmunoelectronMicroscopy.Biochemistry(Moscow),82(1),60-66.Evstratova,R.I.,Sheichenko,V.I.1974.RyballkoKS1Sesquiterpenelactonesfrominulajaponica.KhimPrirSoedin,9(6):7301.Fallahian,F.,Aghaei,M.,Abdolmohammadi,M.H.,Hamzeloo-Moghadam,M.2015.MolecularmechanismofapoptosisinductionbyGaillardin,asesquiterpenelactone,inbreastcancercelllines.CellBiologyandToxicology,31(6),295-305.Faris,R.,Moore,R.A.,Ward,A.,Race,B.,Dorward,D.W.,Hollister,J.R.,Fischer,E.R.,Priola,S.A.2017.Cellularprionproteinispresentinmitochondriaofhealthymice.ScientificReports,7,41556. 参考文献89Feng,W.,Zhu,X.,Li,F.2013.Recentadvancesintheoptimizationandfunctionalizationofupconversionnanomaterialsforinvivobioapplications.NPGAsiaMaterials,5(12),e75.Formisano,C.,Sirignano,C.,Rigano,D.,Chianese,G.,Zengin,G.,Seo,E.J.,Taglialatela-Scafati,O.2017.AntiproliferativeactivityagainstleukemiacellsofsesquiterpenelactonesfromtheTurkishendemicplantCentaureadrabifoliasubsp.detonsa.Fitoterapia,120,98-102.Frazier,A.E.,Thorburn,D.R.2012.Biochemicalanalysesoftheelectrontransportchaincomplexesbyspectrophotometry.MitochondrialDisorders,49-62.Fukuyama,Y.,Huang,J.M.2005.Chemistryandneurotrophicactivityofseco-prezizaane-andanislactone-typesesquiterpenesfromIlliciumspecies.InStudiesinNaturalProductsChemistry,32,395-427.Funakami,Y.,Itoh,E.,Hata,T.,Wada,T.,Ichida,S.2010.Specificalternationofrhythmintemperature(SART)stress-inducedirritablebowelsyndrome-likechangesinmiceandeffectsofdrugs.BiologicalandPharmaceuticalBulletin,33(9),1545-1549.Gao,K.,Liu,X.,Kang,Z.,Mendgen,K.2005.MycoparasitismofRhizoctoniasolanibyendophyticChaetomiumspiraleND35:ultrastructureandcytochemistryoftheinteraction.JournalofPhytopathology,153(5),280-290.Garcia-Febrero,R.,Salvador,J.P.,Sanchez-Baeza,F.,Marco,M.P.2014.Rapidmethodbasedonimmunoassayfordeterminationofparaquatresiduesinwheat,barleyandpotato.FoodControl,41,193-201.Gavande,N.,Kim,H.L.,Doddareddy,M.R.,Johnston,G.A.,Chebib,M.,Hanrahan,J.R.2013.Design,synthesis,andpharmacologicalevaluationoffluorescentandbiotinylatedantagonistsofρ1GABACreceptors.ACSMedicinalChemistryLetters,4(4),402-407.Gendloff,E.H.,Casale,W.L.,Ram,B.P.,Tai,J.H.,Pestka,J.J.,Hart,L.P.1986.Hapten-proteinconjugatespreparedbythemixedanhydridemethod:Cross-reactiveantibodiesinheterologousantisera.JournalofImmunologicalMethods,92(1),15-20.Ghosh,P.,Roy,A.,Hess,D.,Ghosh,A.,Das,S.2015.DecipheringthemodeofactionofamutantAlliumsativumLeafAgglutinin(mASAL),apotentantifungalproteinonRhizoctoniaSolani.BMCmicrobiology,15(1),237.Giunchedi,L.,Langenberg,W.G.1982.EfficacyofColloidalGold-LabeledAntibodyasMeasuredinaBarleyStripMosaicVirus-Lectin-AntilectinSystem.Phytopathology,72(6),645-647.Gonzalez,A.G.,Darias,V.,Alonso,G.,Boada,J.N.,Feria,M.1978.CytostaticactivityofsesquiterpenelactonesfromCompositaeoftheCanaryIslands.PlantaMedica,33(04),356-359.GorenN,TahtasakalE,PezzutoJM,CordellGA,SchwarzB,ProkschP.1994.SesquiterpenelactonesfromTanacetumargenteum.Phytochemistry,36(2):389-392.Grieco,P.A.,Noguez,J.A.,Masaki,Y.,Hiroi,K.,Nishizawa,M.,Rosowsky,A.,Lazarus,H.1977.Synthesisofmono-andbifunctional.alpha.-methylenelactonesystemsaspotentialtumorinhibitors.JournalofMedicinalChemistry,20(1),71-76.Gromer,S.,Urig,S.,Becker,K.2004.Thethioredoxinsystemfromsciencetoclinic.MedicinalResearchReviews,24(1),40-89.Gupta,O.P.,Ghatak,B.J.1967.PharmacologicalinvestigationsonSaussurealappa(Clarke).TheIndianJournalofMedicalResearch,55(10),1078-1083. 90天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导Gupta,S.2001.Molecularstepsoftumornecrosisfactorreceptor-mediatedapoptosis.CurrentMolecularMedicine,1(3),317-324.Hall,I.H.,Lee,K.H.,Starnes,C.O.,Eigebaly,S.A.,Ibuka,T.,Wu,Y.S.,Kimura,T.,Haruna,M.1978.AntitumoragentsXXX:Evaluationofα‐methylene‐γ‐lactone‐containingagentsforinhibitionoftumorgrowth,respiration,andnucleicacidsynthesis.JournalofPharmaceuticalSciences,67(9),1235-1239.Hansbrough,J.F.,Gadd,M.A.1989.Temporalanalysisofmurinelymphocytesubpopulationsbymonoclonalantibodiesanddual-colorflowcytometryafterburnandnonburninjury.Surgery,106(1),69-80.Hansel,R.,Kartarahardja,M.,Huang,J.T.1980.Naturallyoccuringterpenederivatives,part263sequiterpenelactone-β-D-glucopyranosidetogetherwithaneweudesmano-lidemanolidefromtaraxacumofficinale.Phytochemistry,19(5),857-861.Hansen,T.,Girzalsky,W.,Erdmann,R.2017.InCelluloApproachestoStudyPeroxisomalProteinImport–YeastImmunofluorescenceMicroscopy.Peroxisomes:MethodsandProtocols,191-196.Hamzeloo-Moghadam,M.,Aghaei,M.,Fallahian,F.,Jafari,S.M.,Dolati,M.,Abdolmohammadi,M.H.,Hajiahmadi,S.,Esmaeili,S.2015.Britannin,asesquiterpenelactone,inhibitsproliferationandinducesapoptosisthroughthemitochondrialsignalingpathwayinhumanbreastcancercells.TumorBiology,36(2),1191-1198.Healy,R.A.,Horner,H.T.,Bronson,C.R.2004.VisualcharacterizationoftheextracellularmatrixofCochliobolusheterostrophusandamutantstrainwithamodifiedmatrix.CanadianJournalofBotany,82(1),75-88.Hehner,S.P.,Heinrich,M.,Bork,P.M.,Vogt,M.,Ratter,F.,Lehmann,V.,KlausS.O.,WulfD.,Schmitz,M.L.1998.SesquiterpenelactonesspecificallyinhibitactivationofNF-κBbypreventingthedegradationofIκB-αandIκB-β.JournalofBiologicalChemistry,273(3),1288-1297.Heywood,V.H.,Harborne,J.B.,Turner,B.L.1977.Thebiologyandchemistryofthecompositae,volsIandII,Academicpress:NewYork.Huang,J.M.,Yokoyama,R.,Yang,C.S.,Fukuyama,Y.2000.MerrilactoneA,anovelneurotrophicsesquiterpenedilactonefromIlliciummerrillianum.TetrahedronLetters,41(32),6111-6114.Huang,W.C.,Chan,S.T.,Yang,T.L.,Tzeng,C.C.,Chen,C.C.2004.InhibitionofICAM-1geneexpression,monocyteadhesionandcancercellinvasionbytargetingIKKcomplex:molecularandfunctionalstudyofnovelα-methylene-γ-butyrolactonederivatives.Carcinogenesis,25(10),1925-1934.Hu,Y.,Murphy,R.F.2004.Automatedinterpretationofsubcellularpatternsfromimmunofluorescencemicroscopy.JournalofImmunologicalMethods,290(1-2),93-105.Hu,Z.H.,Zhang,P.,Huang,D.B.,Wu,J.Z.2012.NewguaianolidesfromArtemisiaanomala.JournalofAsianNaturalProductsResearch,14(2),111-114.Imran,M.,Revol-Junelles,A.M.,deBruin,M.,Paris,C.,Breukink,E.,Desobry,S.2013.FluorescentlabelingofnisinZandassessmentofanti-listerialaction.JournalofMicrobiologicalMethods,95(2),107-113.Ito,T.,Aimaiti,S.,Win,N.N.,Kodama,T.,Morita,H.2016.Newsesquiterpenelactones,vernonilidesAandB,fromtheseedsofVernoniaanthelminticainUyghurandtheirantiproliferative 参考文献91activities.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,26(15),3608-3611.JamshaidM,AminM,KhokharMY.1986.ChemicalconstituentsofSaussurealappaandtheirpharmacology.PakJSci,38(1/4):51-59.Janecka,A.,Wyrębska,A.,Gach,K.,Fichna,J.,Janecki,T.2012.Naturalandsyntheticα-methylenelactonesandα-methylenelactamswithanticancerpotential.DrugDiscoveryToday,17(11-12),561-572.Jang,W.S.,Kim,H.K.,Lee,K.Y.,Kim,S.A.,Han,Y.S.,Lee,I.H.2006.Antifungalactivityofsyntheticpeptidederivedfromhalocidin,antimicrobialpeptidefromthetunicate,Halocynthiaaurantium.FEBSLetters,580(5),1490-1496.Jenssen,H.,Hamill,P.,Hancock,R.E.2006.Peptideantimicrobialagents.Clinicalmicrobiologyreviews,19(3),491-511.Jeon,Y.J.,Lee,H.S.,Yeon,S.W.,Ko,J.H.,An,K.M.,Yu,S.W.,Kim,T.Y.2005.InhibitoryeffectsofdehydrocostuslactoneisolatedfromSaussureaeradixonCDK2activity.KoreanJournalofPharmacognosy.36(2),97-101.Jin,M.,Lee,H.J.,Ryu,J.H.,Chung,K.S.2000.InhibitionofLPS-inducedNOproductionandNF-κBactivationbyasesquiterpenefromSaussurealappa.ArchivesofPharmacalResearch,23(1),54-58.Juan,S.O.N.G.,Rong-Mei,W.A.N.G.,Yue-Qiu,W.A.N.G.,Yu-Rong,T.A.N.G.,An-Ping,D.E.N.G.2010.Haptendesign,modificationandpreparationofartificialantigens.ChineseJournalofAnalyticalChemistry,38(8),1211-1218.Kalsi,P.S.,Kumar,S.,Jawanda,G.S.,Chhabra,B.R.1995.GuaianolidesfromSaussureaLappa.Phytochemistry,40(6),1713-1715.Kang,J.S.,Yoon,Y.D.,Lee,K.H.,Park,S.K.,Kim,H.M.2004.Costunolideinhibitsinterleukin-1βexpressionbydown-regulationofAP-1andMAPKactivityinLPS-stimulatedRAW264.7cells.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,313(1),171-177.Kang,Z.,Buchenauer,H.2002.Immunocytochemicallocalizationofβ-1,3-glucanaseandchitinaseinFusariumculmorum-infectedwheatspikes.PhysiologicalandMolecularPlantPathology,60(3),141-153.Kang,Z.,Buchenauer,H.2003.ImmunocytochemicalLocalizationofCellWall‐BoundThioninsandHydroxyproline‐RichGlycoproteinsinFusariumculmorum‐InfectedWheatSpikes.JournalofPhytopathology,151(3),120-129.Karplus,P.A.,Pai,E.F.,Schulz,G.E.2010.Acrystallographicstudyoftheglutathionebindingsiteofglutathionereductaseat0.3-nmresolution.FebsJournal,178(3),693-703.Karplus,P.A.,Schulz,G.E.1987.Refinedstructureofglutathionereductaseat1.54aresolution.JournalofMolecularBiology,195(3),701-29.Karsten,U.,Rudolph,M.1985.Monoclonalantibodiesagainsttumour-associatedantigens:mycoplasmaasamajortechnicalobstacleanditspossiblecircumventionbyazaserineselectionmedium.ArchivFurGeschwulstforschung,55(5),305-310.Krauth-Siegel,R.L.,BauerH.,Schirmer,R.H..2005.Dithiolproteinsasguardiansoftheintracellularredoxmilieuinparasites:oldandnewdrugtargetsintrypanosomesandmalaria-causingplasmodia.AngewandteChemieInternationalEdition,44(5),690-715.Kawauchi,S.,Fukuda,T.,Tsuneyoshi,M.1996.Differentiatingsmallroundcellsarcomasofthesoftparts 92天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导byaninnovativeimmunogoldlabelingmethod:Anultrastructuralstudy.UltrastructuralPathology,20(6),549-561.Kim,D.K.,Shim,C.K.,Bae,D.W.,Kawk,Y.S.,Yang,M.S.,Kim,H.K.2002.IdentificationandbiologicalcharacteristicsofanantifungalcompoundextractedfromCocklebur(XanthiumStrumarium)againstPhytophthoradrechsleri.ThePlantPathologyJournal,18(5),288-292.Kim,M.R.,Lee,S.K.,Kim,C.S.,Kim,K.S.,Moon,D.C.2004.PhytochemicalconstituentsofCarpesiummacrocephalumFR-etSAV.ArchivesofPharmacalResearch,27(10),1029-1033.Kiseleva,E.Y.,Sheichenko,V.I.,Ryballko,K.S.1971.Sesquiterpenelactoneofinuladinfrominulajaponica.KhimPrirSoedin,7(3):2631.Kobayashi,H.,Ogawa,M.,Alford,R.,Choyke,P.L.,Urano,Y.2009.Newstrategiesforfluorescentprobedesigninmedicaldiagnosticimaging.ChemicalReviews,110(5),2620-2640.Köhler,G.,Milstein,C.1975.Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.Nature,256(5517),495.Koo,T.H.,Lee,J.H.,Park,Y.J.,Hong,Y.S.,Kim,H.S.,Kim,K.W.,Lee,J.J.2001.Asesquiterpenelactone,costunolide,fromMagnoliagrandiflorainhibitsNF-κBbytargetingIκBphosphorylation.PlantaMedica,67(02),103-107.Kozuka,S.A.T.O.S.H.I.,Yasuda,Y.O.K.O.,Tochikubo,K.U.N.I.O.1985.UltrastructurallocalizationofdipicolinicacidindormantsporesofBacillussubtilisbyimmunoelectronmicroscopywithcolloidalgoldparticles.JournalofBacteriology,162(3),1250-1254.Kumari,G.K.,Masilamani,S.,Ganesh,M.R.,Aravind,S.,Sridhar,S.R.2003.ZaluzaninD:afungistaticsesquiterpenefromVernoniaarborea.Fitoterapia,74(5),479-482.Kumar,S.,Mittal,E.,Deore,S.,Kumar,A.,Rahman,A.,Musti,K.V.2015.MycobacterialtlyAgeneproductislocalizedtothecell-wallwithoutsignalsequence.FrontiersinCellularandInfectionMicrobiology,5,60.Kuntz,A.N.,Davioudcharvet,E.,Sayed,A.A.,Califf,L.L.,Dessolin,J.,Arnér,E.S.,WilliamsD.L.2007.ThioredoxinglutathionereductasefromSchistosomamansoni:anessentialparasiteenzymeandakeydrugtarget.PlosMedicine,4(6),e264.Kupchan,S.M.,Eakin,M.A.,Thomas,A.M.1971.Tumorinhibitors.69.Structure-cytotoxicityrelationsamongthesesquiterpenelactones.JournalofMedicinalChemistry,14(12),1147-1152.Kupchan,S.M.,Hemingway,J.C.,Cassady,J.M.,Knox,J.R.,McPhail,A.T.,Sim,G.A.1967.Theisolationandstructuralelucidationofeuparotinacetate,anovelguaianolidetumorinhibitorfromEupatoriumrotundifolium.JournaloftheAmericanChemicalSociety,89(2),465-466.Kupchan,S.M.,Kelsey,J.E.,Maruyama,M.,Cassady,J.M.1968.Eupachlorinacetate,anovelchloro-sesquiterpenoidlactonetumorinhibitorfromEupatoriumrotundifolium.TetrahedronLetters,9(31),3517-3520.Kwok,B.H.,Koh,B.,Ndubuisi,M.I.,Elofsson,M.,Crews,C.M.2001.Theanti-inflammatorynaturalproductparthenolidefromthemedicinalherbFeverfewdirectlybindstoandinhibitsIκBkinase.Chemistry&Biology,8(8),759-766.Lee,H.J.,Kim,N.Y.,Jang,M.K.,Son,H.J.,Kim,K.M.,Sohn,D.H.,LeeS.H.,Ryu,J.H.1999.Asesquiterpene,dehydrocostuslactone,inhibitstheexpressionofinduciblenitricoxidesynthaseandTNF-αinLPS-activatedmacrophages.PlantaMedica,65(02),104-108. 参考文献93Lee,J.K.,Park,S.C.,Hahm,K.S.,Park,Y.2013.AntimicrobialHPA3NT3peptideanalogs:placementofaromaticringsandpositivechargesarekeydeterminantsforcellselectivityandmechanismofaction.BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Biomembranes,1828(2),443-454.Lee,J.S.,Min,B.S.,Lee,S.M.,Na,M.K.,Kwon,B.M.,Lee,C.Kim,Y.,Bae,K.H.2002.CytotoxicsesquiterpenelactonesfromCarpesiumabrotanoides.PlantaMedica,68(08),745-747.Lee,K.H.,Furukawa,H.,Huang,E.S.1972.Antitumoragents.3.Synthesisandcytotoxicactivityofhelenalinamineadductsandrelatedderivatives.JournalofMedicinalChemistry,15(6),609-611.Lee,K.H.,Hall,I.H.,Mar,E.C.,Starnes,C.O.,ElGebaly,S.A.,Waddell,T.G.,Hadgraft,R.I.,Ruffner,C.G.,Weidner,I.,I.1977.Sesquiterpeneantitumoragents:inhibitorsofcellularmetabolism.Science,196(4289),533-536.Lee,K.,Ibuka,T.,Wu,R.1974.Betaunsubstitutedcyclopentenone,astructuralrequirementforantimicrobialandcytotoxicactivities.ChemicalandPharmaceuticalBulletin,22(9),2206-2208.Lee,M.G.,Lee,K.T.,Chi,S.G.,PARK,J.H.2001.ConstunolideInducesApoptosisbyROS-mediatedMitochondrialPermeabilityTransitionandCytochromeCRelease.BiologicalandPharmaceuticalBulletin,24(3),303-306.Leenaars,M.,Hendriksen,C.F.2005.Criticalstepsintheproductionofpolyclonalandmonoclonalantibodies:evaluationandrecommendations.IlarJournal,46(3),269-279.Ledgerwood,E.C.,Pober,J.S.,Bradley,J.R.1999.RecentadvancesinthemolecularbasisofTNFsignaltransduction.Laboratoryinvestigation;AJournalofTechnicalMethodsandPathology,79(9),1041-1050.Léger,T.,Garcia,C.,Camadro,J.M.2016.TheMetacaspase(Mca1p)RestrictsO-glycosylationDuringFarnesol-inducedApoptosisinCandidaalbicans.Molecular&CellularProteomics,15(7),2308-2323.Lei,Z.W.,Wang,J.,Tian,Y.X.,Song,G.P.,Zhao,G.,Xu,H.H.2015.Synthesisandapplicationofclickableandbiocompatiblefluorescentglycosyllabels.DyesandPigments,113,627-633.Leung,A.H.H.,Jin,J.,Wang,S.,Lei,H.,Wong,W.T.2014.InflammationtargetedGd3+-basedMRIcontrastagentsimagingtumorandrheumatoidarthritismodels.BioconjugateChemistry,25(6),1112-1123.Lichtman,J.W.,Conchello,J.A.2005.Fluorescencemicroscopy.NatureMethods,2(12),910.Liu,C.,Mishra,A.K.,He,B.,Tan,R.2001.Antimicrobialactivitiesofisoalantolactone,amajorsesquiterpenelactoneofInularacemosa.ChineseScienceBulletin,46(6),498-501.Liu,C.X.2017.DiscoveryandDevelopmentofArtemisininandRelatedCompounds.ChineseHerbalMedicines,9(2),101-114.Liu,P.,Luo,L.,Guo,J.,Liu,H.,Wang,B.,Deng,B.,Long,C.A.,Cheng,Y.2010.FarnesolinducesapoptosisandoxidativestressinthefungalpathogenPenicilliumExpansum.Mycologia,102(2),311-318.Liu,R.,Liu,Y.,Lan,M.J.,Taheri,N.,Cheng,J.L.,Guo,Y.R.,Zhu,G.N.2016.Evaluationofawater-solubleadjuvantforthedevelopmentofmonoclonalantibodiesagainstsmall-moleculecompounds.JournalofZhejiangUniversity-SCIENCEB,17(4),282-293.Liu,S.,Vijayendran,D.,Bonning,B.C.2011.Nextgenerationsequencingtechnologiesforinsectvirusdiscovery.Viruses,3(10),1849-1869.Liu,Y.H.,Chen,J.,Guo,Y.R.,Wang,C.M.,Liang,X.,Zhu,G.N.2011.Asensitivemonoclonal 94天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导antibody-basedenzyme-linkedimmunosorbentassayforchlorpyrifosresiduedeterminationinChineseagriculturalsamples.JournalofEnvironmentalScienceandHealthPartB,46(4),313-320.Li,X.W.,Weng,L.,Gao,X.,Zhao,Y.,Pang,F.,Liu,J.H.,Zhang,H.F.,Hu,J.F.2011.AntiproliferativeandapoptoticsesquiterpenelactonesfromCarpesiumfaberi.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,21(1),366-372.Lotem,J.,Kama,R.,Sachs,L.1999.Suppressionorinductionofapoptosisbyopposingpathwaysdownstreamfromcalcium-activatedcalcineurin.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,96(21),12016-12020.Lombardi,L.,Frigerio,S.,Collini,P.,Pilotti,S.1997.ImmunocytochemicalandimmunoelectronmicroscopicalanalysisofBCL2expressioninthyroidoxyphilictumors.UltrastructuralPathology,21(1),33-39.Lone,S.H.,Bhat,K.A.,Khuroo,M.A.2015.Arglabin:Fromisolationtoantitumorevaluation.Chemico-biologicalInteractions,240,180-198.Lyss,G.,Knorre,A.,Schmidt,T.J.,Pahl,H.L.,Merfort,I.1998.Theanti-inflammatorysesquiterpenelactonehelenalininhibitsthetranscriptionfactorNF-κBbydirectlytargetingp65.JournalofBiologicalChemistry,273(50),33508-33516.Macías,F.A.,Fernández,A.,Varela,R.M.,Molinillo,J.M.,Torres,A.,Alves,P.L.2006.Sesquiterpenelactonesasallelochemicals.JournalofNaturalProducts,69(5),795-800.Macías,F.A.,Galindo,J.C.,Castellano,D.,Velasco,R.F.1999a.Sesquiterpenelactoneswithpotentialuseasnaturalherbicidemodels(I):trans,trans-germacranolides.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,47(10),4407-4414.Macías,F.A.,Galindo,J.C.,Castellano,D.,Velasco,R.F.2000.Sesquiterpenelactoneswithpotentialuseasnaturalherbicidemodels.2.Guaianolides.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,48(11),5288-5296.Macı́as,F.A.,Oliva,R.M.,Varela,R.M.,Torres,A.,Molinillo,J.M.1999b.Allelochemicalsfromsunflowerleavescv.Peredovick.Phytochemistry,52(4),613-621.Manclús,J.J.,Montoya,A.1995.Developmentofimmunoassaysfortheanalysisofchlorpyrifosanditsmajormetabolite3,5,6-trichloro-2-pyridinolintheaquaticenvironment.AnalyticaChimicaActa,311(3),341-348.Maruyama,M.,Karube,A.,Sato,K.1983.SesquiterpenelactonesfromCarpesiumabrotanoides.Phytochemistry,22(12),2773-2774.Maruyama,M.,Omura,S.1977.CarpesiolinfromCarpesiumabrotanoides.Phytochemistry,16(6),782-783.Martínez,M.J.A.,DelOlmo,L.M.B.,Ticona,L.A.,Benito,P.B.2012.TheArtemisiaL.genus:areviewofbioactivesesquiterpenelactones.StudiesinNaturalProductsChemistry,37,43-65.Matsuda,H.,Toguchida,I.,Ninomiya,K.,Kageura,T.,Morikawa,T.,Yoshikawa,M.2003.Effectsofsesquiterpenesandaminoacid–sesquiterpeneconjugatesfromtherootsofSaussurealappaoninduciblenitricoxidesynthaseandheatshockproteininlipopolysaccharide-activatedmacrophages.Bioorganic&MedicinalChemistry,11(5),709-715.Miller,D.M.,Shakes,D.C.1995.Immunofluorescencemicroscopy.MethodsCellBiol.48,365.Minato,H.,Nosaka,S.,Horibe,I.1964.Studiesonsesquiterpenoids.PartVIII.Thestructureofcarabrone, 参考文献95anewcomponentofCarpesiumabrotanoides,Linn.JournaloftheChemicalSociety(Resumed),5503-5510.Morita,S.,Tagai,C.,Shiraishi,T.,Miyaji,K.,Iwamuro,S.2013.Differentialmodeofantimicrobialactionsofarginine-richandlysine-richhistonesagainstGram-positiveStaphylococcusAureus.Peptides,48,75-82.Muñoz,A.,Harries,E.,Contreras-Valenzuela,A.,Carmona,L.,Read,N.D.,Marcos,J.F.2013.Twofunctionalmotifsdefinetheinteraction,internalizationandtoxicityofthecell-penetratingantifungalpeptidePAF26onfungalcells.PLoSOne,8(1),e54813.Muzaffar,S.,Bose,C.,Banerji,A.,Nair,B.G.,Chattoo,B.B.2016.Anacardicacidinducesapoptosis-likecelldeathinthericeblastfungusMagnaportheoryzae.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,100(1),323-335.Nakagawa,Y.,Iinuma,M.,Matsuura,N.,Yi,K.,Naoi,M.,Nakayama,T.,Nozawa,Y.,Akao,Y.2005.Apotentapoptosis-inducingactivityofasesquiterpenelactone,arucanolide,inHL60cells:acrucialroleofapoptosis-inducingfactor.JournalofPharmacologicalSciences,97(2),242-252.Oh,G.S.,Pae,H.O.,Chung,H.T.,Kwon,J.W.,Lee,J.H.,Kwon,T.O.,Kwon,S.Y.,B.H.Chon,B.H.,Yun,Y.G.2004.DehydrocostusLactoneEnhancesTumorNecrosisFactor‐α‐InducedApoptosisofHumanLeukemiaHL‐60Cells.ImmunopharmacologyandImmunotoxicology,26(2),163-175.Okugawa,H.,Ueda,R.,Matsumoto,K.,Kawanishi,K.,Kato,A.1996.EffectofdehydrocostuslactoneandcostunolidefromSaussurearootonthecentralnervoussysteminmice.Phytomedicine,3(2),147-153.Otulak,K.,Chouda,M.,Bujarski,J.,Garbaczewska,G.2015.Theevidenceoftobaccorattlevirusimpactonhostplantorganellesultrastructure.Micron,70,7-20.Owen,W.J.,Yao,C.,Myung,K.,Kemmitt,G.,Leader,A.,Meyer,K.G.,Bowling,A.J.,Slanec,T.,Kramer,V.J.2017.Biologicalcharacterizationoffenpicoxamid,anewfungicidewithutilityincerealsandothercrops.PestManagementScience,73(10),2005-2016.Pai,E.F.,Karplus,P.A.,Schulz,G.E.1988.Crystallographicanalysisofthebindingofnadph,nadphfragments,andnadphanaloguestoglutathionereductase.Biochemistry,27(12),4465-4474.Pakdel,A.,Mounier,C.,Klein,E.,Hleibieh,K.,Monsion,B.,Mutterer,J.,Erhardt,M.,Bouzoubaa,S.,Gilmer,D.2015.Ontheinteractionandlocalizationofthebeetnecroticyellowveinvirusreplicase.VirusResearch,196,94-104.Park,E.J.,Kim,J.1998.CytotoxicsesquiterpenelactonesfromInulabritannica.Plantamedica,64(08),752-754.Peng,Y.,Wang,S.,Wang,M.,Wang,F.,Yang,J.,Wu,C.,Li,X.2016.Dualeffectsonconstipationanddiarrhea:protectivepotentialofRadixInulaelactonesonirritablebowelsyndrome.RSCAdvances,6(97),94486-94495.Perkhofer,S.,Niederegger,H.,Blum,G.,Burgstaller,W.,Ledochowski,M.,Dierich,M.P.,Lass-Flörl,C.2007.Interactionof5-hydroxytryptamine(serotonin)againstAspergillusspp.invitro.InternationalJournalofAntimicrobialAgents,29(4),424-429.Petersen,R.C.,Parisi,J.E.,Dickson,D.W.,Johnson,K.A.,Knopman,D.S.,Boeve,B.F.,Jicha,G.A.,Ivnik,R.J.,Smith,G.E.,Tangalos,E.G.,Braak,H.,Kokmen,E.2006.Neuropathologicfeaturesofamnesticmildcognitiveimpairment.ArchivesofNeurology,63(5),665-672.PicmanAK.1984.Antifungalactivityofsesquiterpenelactones.BiochemicalSystematicsand 96天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导Ecology,12(1),13-18.Picman,A.K.,Rodriguez,E.,Towers,G.H.N.1979.Formationofadductsofpartheninandrelatedsesquiterpenelactoneswithcysteineandglutathione.Chemico-biologicalInteractions,28(1),83-89.Rhee,S.G.,Bae,Y.S.,Lee,S.R.,Kwon,J.2000.Hydrogenperoxide:akeymessengerthatmodulatesproteinphosphorylationthroughcysteineoxidation.ScienceSignaling,(53),pe1.Rios,J.L.,Recio,M.C.,Villar,A.1988.Screeningmethodsfornaturalproductswithantimicrobialactivity:areviewoftheliterature.JournalofEthnopharmacology,23(2-3),127-149.Rosselli,S.,Maggio,A.,Raccuglia,R.,Arnold,N.,Bruno,M.2006.GuaianolidesfromtheaerialpartsofCentaureahololeuca.NaturalProductCommunications,1,281-285.RuÈngeler,P.,Castro,V.,Mora,G.,Gören,N.,Vichnewski,W.,Pahl,H.L.,Merfort,I.,Schmidt,T.J.1999.InhibitionoftranscriptionfactorNF-κBbysesquiterpenelactones:aproposedmolecularmechanismofaction.Bioorganic&MedicinalChemistry,7(11),2343-2352.Sarma,G.N.,Savvides,S.N.,Becker,K.,Schirmer,M.,Schirmer,R.H.,Karplus,P.A.2003.Glutathionereductaseofthemalarialparasiteplasmodiumfalciparum:crystalstructureandinhibitordevelopment.JournalofMolecularBiology,328(4),893-907.Satori,C.P.,Henderson,M.M.,Krautkramer,E.A.,Kostal,V.,Distefano,M.M.,Arriaga,E.A.2013.Bioanalysisofeukaryoticorganelles.ChemicalReviews,113(4),2733-2811.Savvides,S.N.,Karplus,P.A.1996.Kineticsandcrystallographicanalysisofhumanglutathionereductaseincomplexwithaxantheneinhibitor.JournalofBiologicalChemistry,271(14),8101-8107.Scaglione,A.,Montemiglio,L.C.,Parisi,G.,Asteriti,I.A.,Bruni,R.,Cerutti,G.,Testi,C.,Savino,C.,Mancia,F.,Lavia,P.,Vallone,B.2017.Subcellularlocalizationofthefivemembersofthehumansteroid5α-reductasefamily.BiochimieOpen,4,99-106.Schepetkin,I.A.,Kirpotina,L.N.,Mitchell,P.T.,Kishkentaeva,А.S.,Shaimerdenova,Z.R.,Atazhanova,G.A.,Adekenov,S.M.,Quinn,M.T.2018.Thenaturalsesquiterpenelactonesarglabin,grosheimin,agracin,parthenolide,andestafiatininhibitTcellreceptor(TCR)activation.Phytochemistry,146,36-46.Schmidt,T.J.1997.Helenanolide-typesesquiterpenelactones-III.Ratesandstereochemistryinthereactionofhelenalinandrelatedhelenanolideswithsulfhydrylcontainingbiomolecules.Bioorganic&MedicinalChemistry,5(4),645-653.Schönleben-Janas,A.,Kirsch,P.,Mittl,P.R.,Schirmer,R.H.Krauth-Siegel,R.L.1996.Inhibitionofhumanglutathionereductaseby10-arylisoalloxazines:crystallographic,kinetic,andelectrochemicalstudies.JournalofMedicinalChemistry,39(7),1549.Seca,A.M.,Silva,A.M.,Pinto,D.C.2017.PartheKimnolideandParthenolide-LikeSesquiterpeneLactonesasMultipleTargetsDrugs:CurrentKnowledgeandNewDevelopments.StudiesinNaturalProductsChemistry,52,337-372.Sharma,H.,Nagaraj,R.2012.Antimicrobialactivityofhumanβ-defensin4analogs:insightsintotheroleofdisulfidelinkagesinmodulatingactivity.Peptides,38(2),255-265.Shinkaruk,S.,Lamothe,V.,Schmitter,J.M.,Manach,C.,Morand,C.,Berard,A.,BennetauB.,Bennetau-Pelissero,C.2010.DevelopmentandvalidationoftwonewsensitiveELISAsforHesperetinandNaringenininbiologicalfluids.FoodChemistry,118(2),472-481.Shin,M.,McGowan,A.,DiNatale,G.J.,Chiramanewong,T.,Cai,T.,Connor,R.E.2017.Hsp72Isan 参考文献97IntracellularTargetoftheα,β-UnsaturatedSesquiterpeneLactone,Parthenolide.ACSOmega,2(10),7267-7274.Sokovic,M.,Ciric,A.,Glamoclija,J.,Skaltsa,H.2017.BiologicalactivitiesofsesquiterpenelactonesisolatedfromthegenusCentaureaL.(Asteraceae).CurrentPharmaceuticalDesign,23(19),2767-2786.Sotnikov,D.V.,Zherdev,A.V.,Dzantiev,B.B.2014.Developmentandapplicationofalabel-freefluorescencemethodfordeterminingthecompositionofgoldnanoparticle–proteinconjugates.InternationalJournalofMolecularSsciences,16(1),907-923.Spring,O.,Vargas,D.,Fischer,N.H.1991.SesquiterpenelactonesandbenzofuransinglandulartrichomesofthreePappobolusspecies.Phytochemistry,30(6),1861-1867.Stewart,J.H.,Nguyen,D.M.,Chen,G.A.,Schrump,D.S.2002.InductionofapoptosisinmalignantpleuralmesotheliomacellsbyactivationoftheFas(Apo-1/CD95)death-signalpathway.TheJournalofThoracicandCardiovascularSurgery,123(2),295-302.Sung,W.S.,Park,S.H.,Lee,D.G.2008.Antimicrobialeffectandmembrane‐activemechanismofUrechistachykinins,neuropeptidesderivedfromUrechisunicinctus.FEBSLetters,582(16),2463-2466.Susurluk,H.,Çalışkan,Z.,Gürkan,O.,Kırmızıgül,S.,Gören,N.2007.AntifeedantactivityofsomeTanacetumspeciesandbioassayguidedisolationofthesecondarymetabolitesofTanacetumcadmeumssp.cadmeum(Compositae).IndustrialCropsandProducts,26(2),220-228.Tambewagh,U.U.,Kandhare,A.D.,Honmore,V.S.,Kadam,P.P.,Khedkar,V.M.,Bodhankar,S.L.,Rojatkar,S.R.2017.Anti-inflammatoryandantioxidantpotentialofGuaianolideisolatedfromCyathoclinepurpurea:RoleofCOX-2inhibition.InternationalImmunopharmacology,52,110-118.Tamura,H.,Mizutani,A.,Yukioka,H.,Miki,N.,Ohba,K.,Masuko,M.1999.Effectofthemethoxyiminoacetamidefungicide,SSF129,onrespiratoryactivityinBotrytiscinerea.PestManagementScience,55(7),681-686.Taniguchi,M.,Kataoka,T.,Suzuki,H.,Uramoto,M.,Ando,M.,Arao,K.,Magae,J.,Nishimura,T.,Ōtake,N.,Nagai,K.1995.CostunolideanddehydrocostuslactoneasinhibitorsofkillingfunctionofcytotoxicTlymphocytes.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry,59(11),2064-2067.Topçu,G.,Öksüz,S.,Shieh,H.L.,Cordell,G.A.,Pezzuto,J.M.,Bozok-Johansson,C.1993.CytotoxicandantibacterialsesquiterpenesfromInulagraveolens.Phytochemistry,33(2),407-410.Trivedi,D.K.,Gill,S.S.,Yadav,S.,Tuteja,N.2013.Genome-wideanalysisofglutathionereductase(GR)genesfromriceandArabidopsis.PlantSignaling&Behavior,8(2),e23021.Turak,A.,Shi,S.P.,Jiang,Y.,Tu,P.F.2014.DimericguaianolidesfromArtemisiaabsinthium.Phytochemistry,105,109-114.Turrens,J.F.2003.Mitochondrialformationofreactiveoxygenspecies.TheJournalofPhysiology,552(2),335-344.Vazquez,C.,Beachboard,D.C.,Horner,S.M.2017.MethodstoVisualizeMAVSSubcellularLocalization.InInnateAntiviralImmunity.HumanaPress,NewYork,NY.131-142.Vlasits,J.,Jakopitsch,C.,Bernroitner,M.,Zamocky,M.,Furtmüller,P.G.,Obinger,C.2010.Mechanismsofcatalaseactivityofhemeperoxidases.ArchivesofBiochemistryandBiophysics,500(1),74-81.Vysotskaya,L.B.,Veselov,S.Y.,Veselov,D.S.,Filippenko,V.N.,Ivanov,E.A.,Ivanov,I.I.,Kudoyarova, 98天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导G.R.2007.ImmunohistologicallocalizationandquantificationofIAAinstudiesofrootgrowthregulation.RussianJournalofPlantPhysiology,54(6),827-832.Wang,C.,Liu,Y.,Guo,Y.,Liang,C.,Li,X.,Zhu,G.2009.DevelopmentofaMcAb-basedimmunoassayforparathionandinfluenceofthecompetitorstructure.FoodChemistry,115(1),365-370.Wang,H.,Joseph,J.A.1999.Quantifyingcellularoxidativestressbydichlorofluoresceinassayusingmicroplatereader1.FreeRadicalBiologyandMedicine,27(5-6),612-616.Wang,J.,Lei,Z.W.,Wen,Y.J.,Mao,G.L.,Wu,H.X.,Xu,H.H..2014.Anovelfluorescentconjugateapplicabletovisualizethetranslocationofglucose–fipronil.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,62(35),8791-8798.Wang,M.,Wang,L.,Han,L.,Zhang,X.,Feng,J.2017.TheeffectofcarabroneonmitochondrialrespiratorychaincomplexesinGaeumannomycesgraminis.JournalofAppliedMicrobiology.123(5):1100-1110.Wang,Y.,Zhang,R.,Barandun,J.,Du,H.,Chen,D.,Jia,Y.,Song,Y.,Vossbrinck,B.,Li,C.,Zhou,Z.,Vossbrinck,C.R.2017.DivergenceofaTandemDuplicationofManganeseSuperoxideDismutaseinNosemabombycis.JournalofEukaryoticMicrobiology.65(1),93-103.Watanabe,K.,Oguri,Y.,Miyakado,M.,Ohno,N.,Mabry,T.J.1985.StructureandfungicidalactivityoffourpseudoguaianolidesisolatedfromHeleniumquadridentatumLabill.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,33(1),83-86.Watanabe,N.,Lam,E.2005.TwoArabidopsismetacaspasesAtMCP1bandAtMCP2barearginine/lysine-specificcysteineproteasesandactivateapoptosis-likecelldeathinyeast.JournalofBiologicalChemistry,280(15),14691-14699.Weetall,H.H.1976.Covalentcouplingmethodsforinorganicsupportmaterials.MethodsinEnzymology,44,134-148.Wedge,D.E.,Galindo,J.C.G.,Macias,F.A.2000.Fungicidalactivityofnaturalandsyntheticsesquiterpenelactoneanalogs.Phytochemistry,53(7):747-757.Wen,J.,You,K.R.,Lee,S.Y.,Song,C.H.,Kim,D.G.2002.Oxidativestress-mediatedapoptosistheanticancereffectofthesesquiterpenelactoneparthenolide.JournalofBiologicalChemistry,277(41),38954-38964.Wesołowska,A.,Nikiforuk,A.,Michalska,K.,Kisiel,W.,Chojnacka-Wójcik,E.2006.Analgesicandsedativeactivitiesoflactucinandsomelactucin-likeguaianolidesinmice.JournalofEthnopharmacology,107(2),254-258.Woerdenbag,H.J.,Meijer,C.,Mulder,N.H.,DeVries,E.G.E.,Hendriks,H.,Malingré,T.M.1986.Evaluationoftheinvitrocytotoxicityofsomesesquiterpenelactonesonahumanlungcarcinomacelllineusingthefastgreendyeexclusionassay.PlantaMedica,52(02),112-114.Wu,H.B.,Wu,H.B.,Wang,W.S.,Liu,T.T.,Qi,M.G.,Feng,J.C.,Li,X.Y.,Liu,Y.2016.InsecticidalactivityofsesquiterpenelactonesandmonoterpenoidfromthefruitsofCarpesiumabrotanoides.IndustrialCropsandProducts,92,77-83.Wu,J.,Qing,L.,Zhou,X.,Chen,Z.,Li,D.1999.Productionofmonoclonalantibodiesagainstbroadbeanwiltvirus.ActaAgriculturaeUniversitatisChekianensis,25(2),147-150.Wu,X.,An,X.,Zhang,C.,Huang,M.2018.Clb6-Cdc28promotesribonucleotidereductasesubcellularredistributionduringSphase.MolecularandCellularBiology,38(6),e00497-17. 参考文献99Xuan,T.D.,Elzaawely,A.A.,Fukuta,M.,Tawata,S.2006.Herbicidalandfungicidalactivitiesoflactonesinkava(Pipermethysticum).JournalofAgriculturalandFoodChemistry,54(3),720-725.Xu,J.,Zhao,X.,Wang,X.,Zhao,Z.,Du,Y.2007.OligochitosaninhibitsPhytophthoracapsicibypenetratingthecellmembraneandputativebindingtointracellulartargets.PesticideBiochemistryandPhysiology,88(2),167-175.Yamahara,J.,Chisaka,T.,Huang,Q.,Kishi,K.,Kobayashi,H.,Kawahara,Y.1990.GastrointestinalmotilityenhancingeffectofSaussureaeradix.PhytotherapyResearch,4(4),160-161.Yang,C.,Shi,Y.P.,Jia,Z.J.2002.Sesquiterpenelactoneglycosides,eudesmanolides,andotherconstituentsfromCarpesiummacrocephalum.PlantaMedica,68(07),626-630.Yang,C.,Yuan,C.,Jia,Z.2003.Xanthanolides,Germacranolides,andOtherConstituentsfromCarpesiumlongifolium.JournalofNaturalProducts,66(12),1554-1557.Young,D.H.,Slawecki,R.A.2001.Modeofactionofzoxamide(RH-7281),anewOomycetefungicide.PesticideBiochemistryandPhysiology,69(2),100-111.Yuen,G.K.,Galice,S.,Bers,D.M.2017.SubcellularlocalizationofNa/K-ATPaseisoformsinventricularmyocytes.JournalofMolecularandCellularCardiology,108,158-169.Yun,Y.G.,Oh,H.,Oh,G.S.,Pae,H.O.,Choi,B.M.,Kwon,J.W.,Kwon,T.O.,Jang,S.I.,Chung,H.T.2004.InVitroCytotoxicityofMokkoLactoneinHumanLeukemiaHL‐60Cells:InductionofApoptoticCellDeathbyMitochondrialMembranePotentialCollapse.ImmunopharmacologyandImmunotoxicology,26(3),343-353.Zeng,R.T.,Fang,X.,Tian,X.H.,Shi,Z.R.,Dong,X.Y.,Zhuo,Z.G.,Shen,Y.H.,Zhang,W.D.2016.TriterpenoidsfromAinsliaeahenryiandtheircytotoxicactivities.PhytochemistryLetters,15,174-179.Zhang,S.,Ong,C.N.,Shen,H.M.2004a.Criticalrolesofintracellularthiolsandcalciuminparthenolide-inducedapoptosisinhumancolorectalcancercells.CancerLetters,208(2),143-153.Zhang,S.,Ong,C.N.,Shen,H.M.2004b.InvolvementofproapoptoticBcl-2familymembersinparthenolide-inducedmitochondrialdysfunctionandapoptosis.CancerLetters,211(2),175-188.Zhang,S.,Won,Y.K.,Ong,C.N.,Shen,H.M.2005.Anti-cancerpotentialofsesquiterpenelactones:bioactivityandmolecularmechanisms.CurrentMedicinalChemistry-Anti-CancerAgents,5(3),239-249.Zhong,C.,Wall,N.R.,Zu,Y.,Sui,G.2017.TherapeuticApplicationofNaturalMedicineMonomersinCancerTreatment.CurrentMedicinalChemistry,24(34),3681-3697.Zhou,Y.,Xu,J.,Zhu,Y.,Duan,Y.,Zhou,M.2016.MechanismofActionoftheBenzimidazoleFungicideonFusariumgraminearum:InterferingwithPolymerizationofMonomericTubulinButNotPolymerizedMicrotubule.Phytopathology,106(8),807-813.Zingarelli,B.,Hake,P.W.,Denenberg,A.,Wong,H.R.2002.Sesquiterpenelactoneparthenolide,aninhibitorofIκBkinasecomplexandnuclearfactor-κB,exertsbeneficialeffectsinmyocardialreperfusioninjury.Shock,17(2),127-134. 100天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导致谢逝水流年，转眼间，作为在职博士生已经入学五年，回首这五年走过的岁月，依旧历历在目，这段充满着成长、充满着历练的日子让我终生受益。值此毕业之际，我谨向所有指导我、关心我、帮助我的老师、同事、同学以及亲人致以最真诚的谢意。首先，我要感谢我的恩师冯俊涛教授，本论文是在导师的悉心指导和帮助下完成的，从论文的选题、试验设计、试验方案的制定和实施到论文的完成，无一不包含着导师的心血和汗水。导师敏锐的科研思路，严谨的治学态度，诲人不倦的高尚师德，精益求精的工作作风，平易近人的人格魅力，无一不对我产生深远影响。值此之际，对导师无微不至的关怀，宽宏大量的包容，学业、工作的指导，表达我最崇高的敬意和最诚挚的谢意！同时，从入学到现在，张兴教授给予的学业、事业、生活上的指导与关心也让我终生难忘，张教授宽以待人的崇高风范，科学高效的工作方法，尤其是科研中的哲学思想，使学生受益匪浅。借此机会向张教授表达我最衷心的感谢！在论文开题论证过程中，马志卿教授、胡兆农教授、王永红教授、王俊儒教授、单卫星教授、徐晖教授提出了许多宝贵的意见和建议；在论文实施过程中，“中心”的韩立荣、王勇、闫合、蔡崇林等老师给了我很多指导和帮助；此外，中国热带农业科学院品质资源研究所乔飞研究员在论文的设计与开展中提供了很多的指导与大力的支持，在此谨向各位老师致以诚挚的谢意！感谢海南大学骆焱平教授在工作中给予的支持与帮助，让我有更多的精力完成博士论文，感谢海南大学董存柱老师，对我离开学校后一些杂事琐事的照应。没有同事的支持，我不能安心、静心的做好一个学生，在这里向各位帮助我、关心我的所有同事致以诚挚的谢意！感谢“中心”办公室和实验室的高保卫、董艳玲、张璟、王智辉、冯梅、安芬霞、梁欲晓等老师给予的大力支持。特别感谢师弟张云飞在试验工作中给予的无私帮助。同时，还要感谢何泽瑜、张淑静、王德龙、王梅、钱磊、刘亚男、张小泉、钟陈佺、孙梦莉等师弟、师妹在试验上的帮助和支持。最后，我要特别感谢我的妈妈、爱人和朋友，没有他们的协助我无法完成我的学业，他们的支持和理解给了我战胜困难、完成学业的勇气和信心。王兰英2018年5月于杨凌 附图101附图6956544849432080531407.307.287.277.157.147.136.646.626.566.546.533.413.403.393.373.142.862.852.842.817.43NHHNNH2O7.57.06.56.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.5ppm0.761.131.001.001.071.212.172.182.143.23附图1化合物HH21HNMRFig.S11HNMRspectrumofHH2 102天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导35353170.4150.4132.80127.6115.21114.5111.041.5341.0329.67NHHNNH2O160150140130120110100908070605040302010ppm附图2化合物HH213CNMRFig.S213CNMRspectrumofHH2 附图1036106459275948406260984073617380685409480426.176.175.685.674.543.253.243.243.232.512.492.482.422.412.402.382.372.281.931.871.631.621.611.591.581.541.531.511.501.481.141.121.051.041.031.021.000.990.980.970.960.94HOOOONO6.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.5ppm1.001.001.420.721.000.641.112.612.401.031.410.853.642.281.061.07附图3化合物HH31HNMRFig.S31HNMRspectrumofHH3 104天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导1309171.3159.94159.4139.7121.676.3269.4337.6036.7935.0333.9430.3325.5922.9713.1534.4324.94OONOOOH170160150140130120110100908070605040302010ppm附图4化合物HH313CNMRFig.S413CNMRspectrumofHH3 附图105+Q1:0.570minfromSample1(TuneSampleID)ofMT20150629215257.wiff(TurboS...Max.4.5e6cps.322.24.5e64.0e63.5e63.0e6274.52.5e6318.42.0e61.5e61.0e6344.4246.4133.1256.359.1362.3282.45.0e5131.1302.4390.7149.1247.5270.5330.3334.4374.6159.1187.2284.3306.2358.5406.7102.3117.2258.2380.2418.581.0135.1145.0242.1331.4342.5384.560.069.0182.9205.0236.5292.7434.60.06080100120140160180200220240260280300320340360380400420440m/z,Da附图5化合物HH3MSFig.S5MSspectrumofHH3 106天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导9731381524750562957547356274961711849484273798298004627247.367.367.357.357.307.287.277.036.936.636.616.576.566.546.206.205.525.524.744.734.473.513.102.822.302.292.272.262.242.232.182.162.151.881.501.491.471.401.381.371.251.231.221.021.000.980.960.930.910.900.370.360.350.340.320.310.30OONOHNONHHNO7.57.06.56.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.5ppm1.001.061.051.010.971.061.050.990.991.072.133.370.973.262.112.103.101.041.091.363.031.201.091.010.97附图6TTY1HNMRFig.S61HNMRspectrumofTTY 附图107883819925347728527574170.71170.62160.07150.59139.08132.97127.58122.72114.68114.45111.0375.7172.4440.25339.5837.51937.0935.6333.89030.6029.6725.8622.82318.3517.08114.55OONOHNONHHNO170160150140130120110100908070605040302010ppm附图7TTY13CNMRFig.S713CNMRspectrumofTTY 108天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导+Q1:2.379minfromSample1(TuneSampleID)ofMT20151210212608.wiff(TurboS...Max.9.1e6cps.176.29.0e6194.18.5e6134.58.0e67.5e67.0e66.5e66.0e65.5e65.0e64.5e6116.14.0e6106.23.5e63.0e6497.32.5e691.32.0e61.5e6220.1274.4413.3318.479.01.0e6189.3206.1400.3485.3216.15.0e5136.2246.3302.5346.4362.4397.2425.3455.5523.1120.0161.1230.4256.3461.2500.3583.3613.2678.50.050100150200250300350400450500550600650700m/z,Da附图8TTYMSFig.S8MSspectrumofTTY 附图109附图9TTYTOFMS（6-25min）Fig.S9TTYTOFMS（6-25min） 110天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导附图10TTY、MitoTrackerRGreenFM和RedDot™在小麦全蚀病菌内荧光成像（a）示TTY菌丝内荧光成像(发射波长445nm)；（b）示MitoTrackerRGreenFM菌丝内荧光成像（发射波长525nm）；（c）示RedDot™菌丝内荧光成像（发射波长690nm）；（d）示TTY和MitoTrackerRGreenFM叠加图像；（e）示TTY和RedDot™叠加图像；（f）示TTY、MitoTrackerRGreenFM和RedDot™叠加图像。标尺为5μm；×40。Fig.S10Fluorescenceimagesofhyphaeco-stainedwithTTY,MitoTrackerRGreenFMandRedDot™.(a)ImageofTTY(emissionwavelength,445nm);(b)ImageofMitoTrackerRGreenFM(emissionwavelength,525nm);(c)ImageofRedDot™(emissionwavelength,690nm);(d)overlayimageof(aandb);(e)overlayimageof(aandc);(f)overlayimageof(a,bandc);Scalebar:5μm;×40. 附图111附图11TTY、MitoTrackerRGreenFM和RedDot™在小麦全蚀病菌内荧光成像（a）示明场菌丝；（b）示TTY菌丝内荧光成像(发射波长445nm)；（c）示MitoTrackerRGreenFM菌丝内荧光成像（发射波长525nm）；（d）示RedDot™菌丝内荧光成像（发射波长690nm）；（e）示TTY和MitoTrackerRGreenFM叠加图像；（f）示TTY和RedDot™叠加图像；（g）示TTY、MitoTrackerRGreenFM和RedDot™叠加图像；（h）示图片g方框处局部放大。标尺为5μm；×40。Fig.S11Fluorescenceimagesofhyphaeco-stainedwithTTY,MitoTrackerRGreenFMandRedDot™(a)Bright-fieldimageofhypha;(b)ImageofTTY(emissionwavelength,445nm);(c)ImageofMitoTrackerRGreenFM(emissionwavelength,525nm);(d)ImageofRedDot™(emissionwavelength,690nm);(e)overlayimageof(aandb);(f)overlayimageof(aandc);(g)overlayimageof(b,candd);(h)Partiallyenlargedofimageg.Scalebar:5μm;×40. 112天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导+TOFMS:0.0857minfromSample1(2018323TEST-27)of2018323TEST-27.wiffMax.1.5e6cps.a=7.02876928168870060e-004,t0=3.71247125095408300e-001(DuoSpray())289.11961.5e61.4e61.3e6408.12501.2e61.1e61.0e69.0e58.0e57.0e5Intensity,cps6.0e55.0e54.0e53.0e52.0e5290.1251446.08251.0e50.0150200250300350400450500550600650700m/z,Da 附图113m/zcalcdfor287.1050([M+K]+),found287.1055m/zcalcdfor408.1247([M+K]+),found408.1250附图12天名精内酯酮与L-半胱氨酸的加成物HRMSFig.S12HRMS,additivecompoundofcarabroneandL-cysteine 114天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导附图13天名精内酯酮与L-半胱氨酸的加成物NMRFig.S13NMR,additivecompoundofcarabroneandL-cysteine 附图115 116天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导m/zcalcdfor556.2329([M+H]+),578.2148([M+Na]+),594.1888([M+K]+);notfound附图14天名精内酯酮与GSHHRMSFig.S14CarabronaeandGSH 作者简介117作者简介王兰英，女，1976年生，山东郓城人，中共党员，副教授。2001年毕业于内蒙古农业大学农学院，获得农学学士学位。2003考入在内蒙古农业大学农学院植物病理专业攻读硕士学位，师从于刘正坪教授；2004年至2006年在西北农林科技大学植物保护学院完成硕士论文，师从于宗兆峰教授。2006年6月获得农学硕士学位，同年10月入职海南大学（原华南热带农业大学）工作，2013年评为副教授。同年考入西北农林科技大学农药学专业农药毒理学方向，攻读博士学位，师从于冯俊涛。主要从事农药毒理学、生物防治等方面的研究工作。一、读博期间参与的项目国家自然科学基金“植物源活性物质天名精内酯酮抑菌作用机理研究”（项目编号31272074）二、发表及在投论文（1）WangLanYing,ZhangYunFei,WangDeLong,WangMei,FengJunTao.MitochondrialSignsandSubcellularImagingImplytheAntifungalMechanismofCarabroneagainstGaeumannomycesgraminisvar.tritici[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry,2018,66(1):81-90.（2）WangLanYing#,WangYong#,HanLiRong,FengJunTao.Theefficacyandtranslocationbehaviorofcarabroneinwheatandcucumber[J].CropProtection,2017,100:87-95.（3）WangDeLong,WangLanYing,WuYongLing,FengJunTao.Naturalα-methylenelactamanalogues:Design,synthesisandevaluationofα-alkenyl-γandδ-lactamsaspotentialantifungalagentsagainstColletotrichumorbiculare[J].EuropeanJournalofMedicinalChemistry,2017,130:286-307.（4）WangMei,WangLanYing,HanLiRong,ZhangXing,FengJunTao.TheeffectofcarabroneonmitochondrialrespiratorychaincomplexesinGaeumannomy-cesgraminis[J].JournalofAppliedMicrobiology,2017,123(5):1100-1110.
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