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《甜瓜果斑病抗性鉴定及抗性相关形态和生理研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
Ｉ？Ｉｄ？记；ｌ１．３６５学校代码１０＾８Ｓ４．；分类号：１３３３０２０４２１：密级：公开学号．一－．ｉ？一：艮丈養Ｊｉ謀《４參ｆ装、…硕±学位论文甜瓜果斑病抗性鉴定及抗性相关形态和生理硏唉究］＇．．ｉｔ％Ｓ？成民ｅｓｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔＭｅｌｏｎｓ化？似：ｉｓ化ｎｅｅＩｄｅｎｔｉ＊？－ｈＲｉｃ化《／／／ａｎｄＳ化ｄｉｅｓｏｎＭｏｉｐｈｐｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆＤｉｓｅａｓｅｅｓｓ化ｎｅｅ研究生姓杂张亮－导师姓秦及职称王惠林副教授＾合作导师姓名及职称＾’：学位口类级别农学硕去成专业葦＾蔬莱学，＇方向，研究西甜瓜遗传育种ｆ去所在学院林学与园艺学院心苗、＇＾新疆鲁齐ｉ；Ｉｈ，：５秦Ｖ写Ｖ．嗦 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名；输时间；年／月日＾关于学位论文使用授权的说明疆本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，目Ｐ；新农业大学有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子文培，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论入文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编有关数据库进行检索，可Ｗ公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：时间；ｔＷ／年＾月／日＾导师签名：时间：年月日寺＾ 甜瓜果斑病抗性鉴定及抗性相关形态和生理研究摘要本研究以25份不同来源的甜瓜材料为试验对象，在室内采用人工喷雾接种法对2～3片真叶时的幼苗进行果斑病抗性鉴定。在室内采用喷雾接种法分别对幼果期和膨大期的果实进行2次果斑病抗性鉴定。同时根据抗性鉴定结果分别筛选出抗、感材料进行生理指标的测定，测定不同抗性材料叶片中可溶性蛋白、总糖、游离氨基酸、总酚、类黄酮、叶绿素的含量以及含水量。最后对抗、感材料的叶片绒毛、气孔等组织形态结构进行显微和电镜观察，对不同时期的果实表皮结构进行观察。并得出以下主要研究成果：（1）采用苗期人工喷雾法，从25份甜瓜材料中，筛选出了T1、T4、T11等中抗材料8份，中感材料8份，T6、T12、T13等感病材料9份。没有免疫和高抗材料。另外，田间植株自然发病抗性调查结果T12、T13、T20等5份材料表现中感或感病级别，其余20份材料未表现病症（2）对幼果期和膨大期采用离体果实喷雾接种法，筛选出了11份中抗材料，5份中感材料，9份感病材料。没有筛选出免疫和高抗材料。材料T4、T10、T6综合抗病指数最高，均达到0.7以上，材料T2、T23、T24综合抗病指数最低。两次抗性鉴定中T6、T9等5份材料的幼果期抗性指数均明显高于膨大期，T3、T8等材料7份材料果实膨大期抗性指数均明显高于幼果期。（3）综合25份不同甜瓜材料苗期和两个不同时期果实对果斑病的抗性指数，结果表明，多数材料幼苗与果实的抗性表现并不一致，部分材料的幼果期与膨大期的抗病指数也不一致。T4和T10材料综合抗性最高，可作为抗病育种的材料。（4）通过对不同抗性材料叶片相关生理指标的测定。结果表明，多数材料含水量、可溶性蛋白、总糖、游离氨基酸含量虽然有显著差异性，但是抗病、感病材料之间并没有规律性。而相对叶绿素含量、总酚和类黄酮含量与材料的抗性大小有关。抗病材料植株叶片中叶绿素含量普遍较感病材料中的叶绿素含量高，抗病材料叶片中总酚和类黄酮含量普遍较感病材料的含量低。（5）对抗、感材料的叶片绒毛、气孔等组织形态结构进行显微和电镜观察，结果表明，抗病材料叶片普遍比感病材料的叶片厚，且具有显著性差异。通过切片观察比较抗性差异较大2份材料发现叶片厚度同样具有极显著性差异。通过对比果实表皮结构初步发现抗病材料T4果皮表面皮孔数目比感病材料T20的数目多,但果实表皮形态结构并没有差异。对比发育前期的果皮结构发现，感病材料外表皮层细胞排列松散，而抗病外表皮层细胞排列紧密有序。抗病材料果实外表皮层厚度比感病材料的厚度厚。关键词：甜瓜；细菌性果斑病；抗病性鉴定；形态结构；生理指标.I ResistanceIdentificationofDifferentMelonstoAcidovoraxcitrulliandStudiesonMorph-physiologyofDiseaseResistanceAbstractThe25differentsourcesofmelonmaterialswereusedforthesubjects,identificationofmelonmaterialsresistancebythemethodofseedingsprayinoculationatgrowsto2-3trueleaveswithAcidovoraxcitrulliinglasshouse.Identifiedofmelonmaterialsresistancebythemethodofinvitrosprayinoculationinyoungfruitstageanddevelopingfruitstageinglasshouse.Atthetime,accordingtotheresultsofresistanceidentificationwerescreeneddeterminatedthephysiologicindex,determinatedthedifferentresistantmaterialsleafswithsolubleprotein,totalsugar,freeaminoacid,totalphenol,flavonoids,chlorophyllcontentandwatercontent.Finally,observedthemorphologicalstructureofresistantandsusceptiblematerialsoffluff,stomatabythemicroscopyandelectronmicroscopytechnology,observedtheskinstructureoffruitindifferenttimes.Andthemainresultswereasfollows:（1）Identifiedtheresistanceof25differentofmelonmaterialsbythemethodofsprayinoculationatseedlingstage.Theresultsshowedthatscreenedthe8middleresistantvarietiesincludedT1,T4,T11,etc.The8middlesensitivevarietiesand9highsensitivevarietiesincludedT6,T12,T13,etc.Noimmuneandhighresistantmaterials.Inaddition,theredultsofresistancetoinvestigationshowedthatfieldofplantdiseasesymptomsmaterialsT12,T13,T20sumto5materialswereallbelongtothelevelofhighormiddlesensitive.Therestof20melonmaterialshavenosymptoms.（2）Identifiedthedifferentofmelonmaterialsbythemethodofinvitrosprayinoculationinyoungstageanddevelopingstage.Theresultsshowedthat11copiesweremiddleresistantmaterials，5copiesweremiddlesusceptiblematerialsand9copiesweresusceptiblematerials.ThetopthreecomprehensiveresistanceindexesofthematerialswereT4，T10andT6achieves0.7above.ThelowestcomprehensiveresistanceindexssofthematerialswereT2,T23andT24.Theresistanceindexofthe5copiesmaterialsincludedT6andT9intheyoungstageoffruitweresignificantlyhigherthandevelopingstage.Theresistanceindexof7copiesmaterialsincludedT3andT8inthedevelopingstageweresignificantlyhigherthantheyoungstage.（3）Comprehensived25differentmuskmelonseedlingstagesandtwodifferentstagesoffruitwithresistanceindextoAcidovoraxcitrulli.Theresultsshowedthatmostmaterialsseedlingsandfruitsresistantperformancewerenotconsistent.SomeofmaterialshasobviousdifferencestoAcidovoraxcitrulliinthefruitgrowthindifferentstages.ThehighestcomprehensiveresistancematerialswereT4andT10,T4materialfleshysoft,crispanddelicious,couldgiveprioritytoasthematerialofdiseaseresistancebreeding.（4）Throughdeterminedtherelatedphysiologicalindexesofdifferentresistantmaterialsleaves.Theresultsshowedthatalthoughwatercontent,solubleprotein,totalsugar,freeaminoacidcontentweresignificantdifference,buttheresistancematerialsbetweensusceptiblematerialshavenoregularity.Andrelativechlorophyllcontent,totalphenolandflavonoidscontentwereconnectedwithresistanceofmaterials.Thechlorophyllcontentofresistantmaterialslivingplantinleaveswashigherthansusceptiblematerials.Thetotalphenolandflavonoidscontentofresistancematerialsintheleavesweregenerallylowerthansusceptiblematerials.（5）Observedthefluffandstomatatissuemorphologystructureinleavesoftheresistantandsusceptiblematerialsbymicroscopicandelectronmicroscopictechnology.Theresultsshowedthatresistantmaterialsleavesweregenerallythicknessthansusceptiblematerialsandhavesignificantdifference.Bycomparingtheobservationof2differentresistancematerialsfoundthattheleavesthicknesswerealsoextremelysignificantdifference.BycomparingthefruitskinstructurepreliminaryfoundthatthelenticelsnumbersoffruitskinsurfaceofresistantmaterialsT4morethansusceptiblematerialsT20.Butthefruitskinstructureshavenodifference.Bycomparingthefruitskinstructureinearlystagefoundthattheouterepidermiscellsofsusceptiblematerialsarrangedloosely，theouterepidermiscellsofresistantmaterialsarrangedcloselyandorderly.Thethicknessesofcortexfruitappearanceofresistantmaterialswerethickerthansusceptiblematerials.Keywords:Melon;Bacterialfruitblotch;Resistanceidentification;morphologicalstructure;physiologicalindexII 目录第1章绪论.........................................................................................................11.1细菌性果斑病菌的生物学鉴定及检测研究进展..........................................................21.2细菌性果斑病的发病特点..............................................................................................31.3细菌性果斑病的防治措施..............................................................................................41.4（瓜类细菌性果斑病）种质资源抗病性鉴定方法的应用..........................................61.5植物抗病生理生化防御机制..........................................................................................61.6本文研究的目的与意义..................................................................................................7第2章不同甜瓜材料苗期细菌性果斑病抗性鉴定........................................92.1材料和方法......................................................................................................................92.2结果与分析....................................................................................................................112.3讨论................................................................................................................................12第3章甜瓜果实不同时期对细菌性果斑病抗性鉴定..................................143.1材料与方法....................................................................................................................143.2结果与分析....................................................................................................................163.3讨论................................................................................................................................173.4甜瓜材料苗期及离体果实细菌性果斑病的综合评价................................................18第4章不同抗性甜瓜材料生理生化指标的分析..........................................204.1材料与方法....................................................................................................................204.2结果与分析....................................................................................................................224.3讨论................................................................................................................................24第5章不同甜瓜材料形态结构的观察与分析..............................................265.1材料与方法....................................................................................................................265.2结果与分析....................................................................................................................275.3不同甜瓜材料叶片和果实形态结构观察与分析........................................................325.4讨论................................................................................................................................33第6章结论.......................................................................................................35参考文献.............................................................................................................37附录.....................................................................................................................41III 第1章绪论甜瓜(Cucumismelo)属于葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(Cucumis)中的甜瓜种（Cucumismelon.L），为一年生草本植物，主要包括哈密瓜、白兰瓜、香瓜、梨瓜等，是世界重要的十大水果之一。甜瓜果实营养丰富、清凉爽口、汁甜味美，并具有多种保健功效，深受消费者喜爱。甜瓜作为重要的瓜类作物，在我国农业生产中占据重要地位。2012年我2国甜瓜种植面积达到41.04万hm，约占蔬菜种植面积的11.6%～12.7%。新疆昼夜温差大，光照充足这一特点为生产优质甜瓜提供了充足的条件，生产的甜瓜以优良的品质畅销全国。近年来，随着市场对甜瓜的需求及新疆农业产业结构的调整。2013年新疆甜瓜2[1]种植面积达7.3万hm，产量达到150万t，带动了新疆经济的发展。近年来，细菌性果斑病(Acidovoraxcitrulli简称BFB)也称果腐病，在甜瓜作物上发病较重。该病害不仅导致叶片产生褐斑，也可危害果实产生水浸状病斑发生腐烂，降低其品质。同时导致种子表面和内部带病原菌，药剂等处理方式并不能完全杀死病菌，并成为下一年重要的初[2]侵染源。其病原菌主要侵染西瓜、甜瓜、籽瓜，同时也能侵染葫芦科的其它作物，如[3]黄瓜、南瓜、西葫芦等，国外报道中大部分在西瓜、甜瓜方面经济损失主要是由细菌性果斑病引起的。该病具有传播快、危害广、损失重等特点，对瓜类生产造成严重的影[4][5]响在一些田地，细菌性果斑病引起的损失超过总商品果的90%。1999年新疆生产兵团因该病害发生造成经济损失3000～4000万元。2000年该病害在内蒙古巴彦淖尔市的2[6]发病面积达1.1万～1.13万hm，病株率可达10%～90%，给当地甜瓜产业够成了威胁，[7]新疆阿勒泰地区每年瓜类细菌性果斑病发病率可达100%，平均减产达46%。2013年该地区受气候影响，气温降低，降雨量大量增加，造成果斑病发病严重。细菌性果斑病已成为危害我国瓜类生产的重要病害之一，其病原菌分别被我国农业部（2006年3月）和国家质检总局列入（2007年5月）对内和对外检疫性有害生物名单。从1989年在美国佛罗里达州西瓜大田生产中大面积发生细菌性果斑病以来，已迅速蔓延至澳大利亚、[8]马里亚纳群岛、巴西、日本、印度尼西亚和土耳其等瓜类生产大国，此外，在新疆、内蒙古、福建、湖南、山东、广东等省份西瓜、甜瓜作物上也陆续发生了细菌性果斑病。1 1.1细菌性果斑病菌的生物学鉴定及检测研究进展[9]甜瓜细菌性果斑病病原为Acidovoraxavenaesubsp.Citrulli，1965年，Webb和Goth在美国佐治亚州第一次从西瓜幼苗上分离到细菌性果斑病病菌，1978年命名为类产碱假单胞菌西瓜亚种（Pseudomonaspseudoalcaligenessubsp.citrulli），1992年该病菌改名为[10]燕麦嗜酸菌西瓜亚种。2008年，Schaad等通过分子技术以及AFLP分析等研究结果，[11]将燕麦食酸菌西瓜亚种归类为西瓜食酸菌，即Acidovoraxcitrulli。周黎等对新疆部分地区果斑病病原菌进行鉴定，培养性状为表面光滑、边缘整齐、直径大小为1.2mm的透明颗粒，培养48h后形成半透明、表面光滑的圆状菌苔。菌体形态表现为短杆状，两边钝圆，一端生一根鞭毛。生理生化性状表现为在KB培养基上不产生荧光色素，YDC培养基上菌落颜色为奶白色，41℃条件下能够生长，甲基红反应和PHB颗粒均为阴性，[12][13]革兰氏染色为阴性，不能水解淀粉等。李鹏等人从西瓜、甜瓜病株分离纯化病菌后进行培养和电镜透射观察，同样观察到菌落不产生荧光，呈圆形半透明光滑，菌体细胞呈短杆状，单根极有鞭毛，革兰氏染色为阴性的特征。王政等人从内蒙古地区哈密瓜病叶上分离病菌培养观察得到氧化酶反应为阳性，不引起马铃薯腐败，41℃条件下能够生[14,15]长等实验结果。上述病原菌特征可以确定为燕麦嗜酸菌西瓜亚种。传统的细菌鉴定检测方法是根据对叶片和果实发病部位和症状等对病原菌进行判断分析，再对病原菌进行分离纯化，观察菌落形态、大小等形态进行观察最后进行致病[16]性和相关生理生化测定，做出最后判断。张荣意等将海南省西瓜种植区采集分离到的3个菌株进行了鉴定，将其鉴定为燕麦嗜酸菌西瓜亚种，张昕等将新疆哈密瓜病叶上采集菌株进行测定分离出丁香假单胞菌黄瓜致病变种（Pseudomonassyringaepv.lachrymans）和燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovoraxavenaesubsp.Citrulli）认为在哈密瓜[17,18]整个生长期两种病菌均可侵染植株。金岩等对南京和吉林发生的西瓜细菌性果斑病[19]进行了鉴定，结果均为燕麦嗜酸菌西瓜亚种。传统的检测方法不仅费时费力，而且具有不稳定、反应不灵敏和结果不是很准确等特点，不便于应用。近年来，由于分子生物学的发展，使果斑病的检测技术发展到分子、基因水平上，有多种有效方法进行快速准确的检测。美国学者Walcott使用IMS—PCR技术检测西瓜2 [20]种子带菌率灵敏度有了很大的提高，能检测到种子洗脱液中接近10Cfu/ml的病原菌。4赵廷昌等用水解荧光探针法检测精度达到3×10Cfu/ml。目前主要有血清学检测法、常规PCR法、免疫PCR法、免疫磁性分离PCR法、基于实时荧光定量的检测方法等其他[21]检测方法。建立快速、准确、低成本、高效的检测技术是未来防治果斑病具有重要的意义。1.2细菌性果斑病的发病特点近年来，细菌性果斑病呈现出自然发病寄主种类少，而潜在寄主种类多的特点。果斑病菌寄主主要包括西瓜、甜瓜、籽瓜等，也可侵染黄瓜、南瓜和西葫芦等葫芦科植物[6]。目前国内报道的自然发病寄主植物仅有西瓜、甜瓜，种类较少.在葫芦科其他作物上尚未发现该病害的发生为害报道，可能现实生产中存在病菌侵染后症状不明显，未引起重视等情况。另外，果斑病菌也可能由茄属植物种子携带，如Assouline等报道从进[22]口茄子种子培育的幼苗和进境番茄种子上检测到A.avenasubsp.Citrulli。细菌性果斑病传播途径主要以种子带菌传播为主，虽然果斑病菌可以依靠农事操作嫁接、灌溉、授粉、打杈等方式传播，但其远距离传播主要通过种子带菌，这是过去十几年中该病在我国传播的主要原因。其中部分省市经调查发现，病情发生的原因确是种子来源于疫区或者是种子公司生产基地位于疫区，如刘刚报道2009年山东省安丘市保[23]护地西瓜上发现的果斑病，种子就来源于某种子公司。果斑病菌可以存活于土壤、病残体及田间自生杂草上，但存活时间一般较短，能否成为下茬葫芦科作物的初侵染源目前仍不十分明确。Richard等将带有果斑病菌的旧塑料盘(留有基质和病株残余)贮存在4℃以下，63d后检测不到病原菌，22℃下14d后检测不到病原菌，，贮存于室温中（24～36℃）1d后也检测不到病原。因此，认为病原菌不太可能随塑料盘上的病残体从一个生[24][25]长季存活到下一个生长季。Isakeit等人1998年在有果斑病西瓜田附近，发现citronmelon(Citrulluslanatusvar.citroids(Bailey)Mansf.)被果斑病菌自然侵染，这种植物是美国德克萨斯州南部的一种被当做杂草的野生瓜类植物（非洲西瓜），该发现表明果斑病菌除了可以侵染栽培品种外，也可侵染野生种。该病害主要危害叶片和果实，尤其在甜瓜植株上表现明显。能在整个生长期表现症3 状，一旦田间发病，药物防治并不能完全控制。在幼苗期，子叶上就能出现褐色病斑，并随着植株的生长能够侵染新的叶片，发病严重时，能个够导致整片叶干枯穿孔。到果实成熟期时，病菌侵染到果实，导致果实表面出现水浸状斑点，严重时整个果实出现病斑，后期腐生菌侵入后，整个果实出现腐烂，严重影响果实的商品价值。另外，外界的环境气候条件也是影响病害严重程度重要因素，同样的品种类型在雨水较多、气候湿润的气候条件下，田间病害更严重，蔓延的更快。不同的年份也有所不同。1.3细菌性果斑病的防治措施1.3.1药剂及综合防治措施种子带菌处理是防治果斑病的重要手段，目前还没有理想的种子带菌处理技术。通[26]常通过发酵处理、热处理、快速干燥、药剂处理等方式进行种子处理。Hopkins等将西瓜种子与果肉发酵24～48h，再用1%的盐酸或1%的次氯酸浸种15min后水洗风干，[27]能够有效去除种子所带病菌。但发酵后干燥过程中也能再次感染病菌，发酵处理方式还需进一步完善。热处理方式能够达到消毒灭菌作用，但对BFB防治效果并不明显。[28]快速干燥方式也能有效降低BFB的发病率。洪日新等研究发现用过氧乙酸酸化处理带菌种子能有效预防BFB的发生，但防治效果与晾晒种子时能否快速干燥关系很大。[29]宋顺华也进一步研究证实快速烘干带菌西瓜种子的确能提高种子的健康状况且能降[30]低幼苗果斑病的发病率。药剂处理目前是最普遍也最有效的处理方式。赵廷昌等利用3%盐酸、克菌宝52%可湿性粉剂等20种药剂对哈密瓜接菌种子进行浸种处理，结果表[31]明3%盐酸处理方式防治效果最好，且对种子发芽率无影响。杜艳梅等分别也采用5种不同方法对带菌西瓜种子进行处理，结果也证实1%的盐酸浸种5min防治效果最好。[32]王爽等对果斑病菌具有明显的抑菌效果的6种药剂分别浸泡甜瓜带菌种子，通过调查处理后种子发芽率和苗期发病情况，结果表明福尔马林和果腐净一号防治效果最好。除低浓度盐酸溶液和福尔马林溶液外，硫酸铜溶液、过氧乙酸等其他处理剂均能对病菌有防治作用。张静等采用63种药剂处理带菌西瓜种子，结果显示90%新植霉素SPX和72%农用硫酸链霉素SPX这2种药剂处理后发病率明显低于对照，且对出苗率及生长无影[33]响。4 与植物保护相关实验室可应用分子生物学检测技术为种子生产企业提供技术服务，检测处理后种子的带菌情况，从源头上控制果斑病的发生。目前在新疆西域瓜菜种子健康检测中心已经根据瓜类细菌性果斑病检疫鉴定方法(SN-T1465-2004）为瓜类种子生产企业提供检测服务。目前，田间一旦发生果斑病，基本上都采用化学药剂防治措施。生产实践中，防治该病害的药剂主要有：47%加瑞农可湿性粉剂（加收米、碱性氢氧化铜）、琥胶肥酸铜（戊二酸与己二酸的络合混合物）、53%可杀得可湿性粉剂（氢氧化铜）、农用链霉素（抗菌素药剂）、波尔多液（熟石灰、硫酸铜）等化学药剂。正确的田间操作及管理等农业防治手段虽然有效，但田间环境复杂多变，实践中不好控制。1.3.2选用抗病品种的措施选用抗病品种是植物病害综合防治中最简便、经济、有效的措施。近年来，育种家和植物病理学家在瓜类作物上利用野生近缘种发现的许多抗病基因培育出了抗单一病害的新品种，同时也获得了兼抗多种病害的亲本材料和新品种。在瓜类其他病害方面已发现多种抗原材料，如甜瓜抗白粉病抗源材料为PI79374、PI12411、和PI134198。对于黄瓜细菌性角斑病，常用的黄瓜抗源为PI197087、PI16400、SontheraCross等。但培育的抗病品种几乎都根据单基因抗性选育出来的，在各种遗传背景的植物经过人工接种鉴定，寻找高度抗性基因，通过多代杂交回交选育过程获得具有稳定的抗病品种。目前还没有发现对果斑病免疫的品种，不同的品种材料对果斑病的抗性也存在差异。Hopkins等通过田间调查结果表明三倍体西瓜较二倍体抗病，果皮较深色的品种抗[34]性较强，最抗病的是具有深绿色坚实瓜皮品种，浅绿色西瓜最感病。Francisc等对西瓜不同生长阶段接种细菌性果斑病筛选出了“BGCIA34”和“SugarBaby”这两种在大部分[35]生长时期表现高抗的材料。杨小丽等对30份哈密瓜材料苗期进行抗性鉴定，筛选出[36]了“新金雪莲”一份高抗品种。胡俊等也通过苗期与田间鉴定筛选出了“超早丰F1”高抗[37]品种。筛选出的高抗品种还需进一步育种工作中完善确认，并应用到生产实践中，才能达到防治果斑病的效果。5 1.4（瓜类细菌性果斑病）种质资源抗病性鉴定方法的应用种质资源抗病性鉴定是抗病育种的基础工作，大量种质资源需要经过重复、精细的鉴定和筛选，才能筛选出高抗的抗原材料。不同的植物种类和不同的病原物可以采取不同的鉴定方法。目前的鉴定方法主要有：田间鉴定、室内鉴定以及离体鉴定。田间鉴定是最普遍也是最基本的鉴定方法，能较真实和客观的反映出作物的抗性水平，在生产中具有代表性。但田间环境复杂多变，抗性表现容易受到自然环境的限制，即使是人工病圃，也应多次重复鉴定。室内鉴定是在温室或人工气候室内鉴定作物的抗病性的方法，温室内可以使温度和湿度等因素基本保持一致，达到最有利于发病的状态。其中应用最多为苗期鉴定。但有些品种的苗期抗性与成株期抗病性表现不一致，需要进一步在田间[38]进行验证。离体鉴定是利用作物的器官、组织或细胞作为鉴定的材料的方法，可直接从植株上分离出叶片或果实进行鉴定。离体叶片接种鉴定已经广泛应用于对作物的抗病[39]性鉴定，是一种快速、简便且适合大量材料的鉴定方法。雷新涛等人采用室内果实离[40]体接种法，对杧果不同品种进行抗炭疽病的鉴定，筛选出了抗性较高的品种。1.5植物抗病生理生化防御机制植物一般从两个方面来保卫自己和抵御病原物的侵染。第一方面是起着机械障碍作用和抑制病原物侵入或植物体内扩展的结构特性。第二方面是在植物细胞和组织内发生的生化反应，产生对病原物具有毒性物质的物质或抑制病原物在植物生长的条件。而防御结构又分为先天性防御结构和对病原物侵染的反应所形成的防御结构。先天性防御结构如：叶片表面的绒毛、角质层、叶片和果实表面的蜡质以及栅栏组织和海绵组织的厚[41]度。郑喜清等通过实验发现哈密瓜抗病品种种皮蜡质含量较感病品种的高。猕猴桃叶[42]片气孔密度和大小可以作为猕猴桃品种抗溃疡病鉴定指标。而对病原物侵染的反应所形成的防御结构更为复杂。如：木栓层、脱落层、侵填体的形成以及细胞壁的变化等。真菌或细菌侵染植物后常在侵染点外引起几层木栓细胞的形成，是病原分泌物刺激寄主细胞的结果。虽然结构特性为植物对病原物的侵染提供了不同程度的防御，但植物对病原物侵染6 的抗性并不是主要决定于在结构上的防御。更重要的是决定于在被侵染前或侵染后所产生的物质。侵染前存在于植物细胞中的抑菌物质，如一些酚类化合物、皂角苷、还有一些蛋白质水解酶类。幼嫩的果实和叶片中存在许多酚类化合物和丹宁物质，被认为是幼嫩植物组织对病原微生物抗性的原因。葡萄糖酶和几丁质酶，能分解病原物细胞壁成分，因而表现对病原侵染的抗性。此外，叶绿体中含有很多光合作用所必须的光合色素。植物对光能的吸收和转化也离不开叶绿素和类胡萝卜素。植物叶绿素含量的高低能间接反映出光合作用的强弱及抗逆性的大小。植物在经过病原物的侵染后发生一系列生理生化反应诱导产生一些抑菌物质，包括大多数酚类化合物，如绿原酸、咖啡酸、木质素以及酚类化合物的氧化产物。寄主细胞木质化是植物抗病的一个重要的因素，研究表明，木质素具有主动抗性和被动抗性的双重功能。而与植保素和木质素的合成相关的酶有苯丙氨酸解氨酶（PAL），过氧化物酶(POD)，有过氧化氢酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO)等。某些相关酶类的活性与甜瓜对白粉[43]病的抗性存在显著的正相关性。郑喜清实验结果表明：对果斑病的不同抗性哈密瓜品种叶片的POD、PAL活性与细菌性果斑病的抗病性成正相关，PPO活性变化与抗病性[44]之间存在一定的负相关，而SOD活性变化与哈密瓜抗病果斑病之间没有明显相关性。植物的抗病机理是复杂多样的，酶在植物抗病机理中是重要的成分之一。某些酶在物种抗病性中有遵循一定的规律，可以考虑作为抗病性鉴鉴定的生化指标。这种生化指标作为一种辅助手段，虽不能脱离常规方法，但是它却可以加快育种速度，在植物抗病育种[45]中理应得到应用。1.6本文研究的目的与意义目前国内外学者在对果斑病的研究集中在病原菌鉴定和生物学特性、病害发生发展规律、致病机理、种子带菌检测技术、药效筛选及综合防治方面等一系列研究领域。但在抗病育种领域报道的较少，至今还没有报道对细菌性果斑病免疫的品种。这在一定程度上制约了国内优质抗病高产甜瓜品种的选育速度。叶片的健康是果实品质的关键，而果实的健康是经济来源重要的保证。目前在果斑病的抗性鉴定方面，国内多集中在关于苗期叶片的抗性鉴定，对果实的抗性鉴定鲜有报道。本文以幼苗、果实为鉴定对象选取7 25份甜瓜材料分别采用苗期喷雾接种法和果实喷雾接种法进行抗性鉴定，初步探究幼苗与果实之间抗性表现是否一致，筛选出高抗材料，为抗病育种提供依据。同时观察杂交F1代材料与双亲的抗性表现，初步了解遗传规律。此外，可以了解果实上发病规律，为果斑病的防治提供依据。在抗性机制的研究方面，目前抗病性与酶活性相关性的研究多有报道。本研究旨在自然条件下通过初步观察抗病、感病甜瓜叶片表皮的绒毛长短、气孔大小、密度和组织结构，研究先天性防御结构，找出两者之间具有差异性的形态指标。同时，在自然条件下测定较稳定的生理生化指标(可溶性蛋白、总糖、游离氨基酸、总酚、类黄酮、叶绿素、含水量)找出两者之间本身固有的具有差异性的生理指标。为甜瓜细菌性果斑病的防治和抗性材料的选育提供参考。8 第2章不同甜瓜材料苗期细菌性果斑病抗性鉴定细菌性果斑病菌可侵染甜瓜生长的整个时期，导致甜瓜叶片枯萎和果实腐烂。一旦发病，用药防治并不能完全消除病害，且生产成本增加。同时导致种子带菌，成为下一年重要的初侵染源。该病害已成为我国瓜类生产的重要病害之一。目前，由于细菌性果斑病导致瓜类商品的经济效益严重下降，对瓜类产业造成了威胁，因此，必须采取有效的措施防治该病害的发生，生产实践和研究结果表明利用抗性强的品种是最经济、最有[46]效的控制该病的措施。本实验通过室内苗期喷雾接种法，对25份甜瓜材料进行抗性鉴定，为甜瓜抗病性育种提供可参考的依据。2.1材料和方法2.1.1试验材料供试甜瓜材料共计25份，编号分别为T1～T25，其中自交系材料20份，杂交一代材料5份，由国家瓜类工程技术研究中心提供。供试的细菌性果斑病菌株由南京农业大学提供，菌株代号为M2。供试甜瓜材料名称和来源见表2-1。表2-1供试甜瓜名称和来源Table2-1Thenameandsourceoftheexperimentalmuskmelons材料材料材料材料材料材料编号名称来源编号名称来源MaterialMaterialSourceofMaterialMaterialSourceofnumbernameMaterialnumbernameMaterialT1M867皇后×韩国甜瓜后代自交系T21(T1×T8)M867×M600F1T2NM90-1以色列甜瓜自交系T22(T1×T9)M867×NM89F1T3M809日本甜瓜自交系T23(T2×T8)NM90-1×M600F1T4M835欧洲甜瓜×哈密瓜自交系T24(T2×T9)NM90-1×NM89F1T5M843B日本甜瓜自交系T25(T9×T8)NM89×M600F1T6M888哈密瓜自交系T7M439日本甜瓜自交系T8M600日本甜瓜自交系T9NM89哈萨克斯坦甜瓜自交系T10M916哈密瓜自交系T11M880日本甜瓜自交系T12谢开心新疆早熟地方品种T13伽师瓜新疆晚熟地方品种T14卡拉尕西新疆中熟地方品种T15M581安农2号×伽师瓜后代自交系T16M633皇后×韩国甜瓜后代自交系T17M711哈密瓜自交系T18M607日本甜瓜自交系系9 续表：2-1T19M833哈密瓜自交系T20M805哈密瓜自交系注：M、NM表示自交纯系材料,T21～T25为杂交一代材料Note:M、Nmaretheinbredpurelinematerialofmuskmelon,T21～T25ishybridmaterialsofmuskmelon;2.1.2试验方法2.1.2.1病原菌悬浮液的制备果斑病菌的扩繁活化参照《植物病害研究方法》，菌株在KMB（10g胰蛋白胨，.[47]0.75gMgSO47H2O，5g丙三醇，5g琼脂，定容至500ml，PH7）固体培养基活化，在28℃温度下培养48h，并在无菌条件下挑取单菌落于NB（1.5g牛肉膏，2.5g蛋白胨，定容到500ml，PH=7）液体培养基中，在28℃、220r/min条件下震荡培养24h。用无菌水将菌悬8[48]液浓度调至5×10cfu/ml备用接种。2.1.2.2试验材料的准备供试的种子先在恒温培养箱中30℃条件下处理12h，最后65℃条件下干热灭菌48h[49]。育苗基质采用杨树锯末和蛭石的混合物，混合比例约为5:1。锯末先用100℃水消毒灭菌。播种前用水将基质浇透，装入5×10的（经过巴氏消毒液杀菌后）的穴盘中。每穴播3粒种子，每个材料播5穴，3次重复，并设置对照。播种后覆盖塑料膜进行保温保湿，并定时浇水。出苗后去膜进行正常管理。苗期喷施Hoagland营养液以提供幼苗生长所需的营养。2.1.2.3接种方法当幼苗生长至2～4片真叶（生长25天幼苗）完全展开时，将调好的菌悬液采用喷雾接种法接种，并用塑料膜保温（20℃～35℃）保湿48h，揭膜后继续保温保湿并正常管理。2.1.2.4苗期抗病性鉴定接种一周后开始调查记录甜瓜叶片的发病情况，5d后再调查一次，重复两次，调查对象为植株的全部叶片，计算病情指数DI。病情级数调查根据Hopkins分级标准，稍有改动。叶片发病分级标准如下:表2-2细菌性果斑病分级标准Table2-2GradingstandardofBacterialfruitblotch病情级别病情分级标准SeveritylevelGradingstandard0级无病斑10 续表：2-21级叶片病斑面积占整片叶面积10%以下2级病斑较多，病斑面积占整叶面积的10%~30%：3级病斑融合成大病斑，病斑面积占整叶面积的30%~50%:4级病斑很多融合成大病斑，病斑面积占整叶面积50%~70%，片斑干枯。5级叶片病斑很多或融合成大斑，病斑面积占整个面积的71%以上病情指数的计算方法如下:发病级数×发病叶片数DI﹦×100（2-1）最高病级×总叶片数[50]采用相对抗病性方法评价其抗病程度，相对抗病程度分为免疫Immunity(1.00)、高抗Highresistant(0.80～0.99)、中抗Middleresistant(0.40～0.79)、中感Middlesusceptible(0.20～0.39)、感病Susceptible(0.20以下)。相对抗病指数（RI）＝1－相对病情指数（2-2）相对病情指数＝鉴定品种平均病情指数/对照品种平均病情指数(病情指数最高者为对照品种)（2-3）2.1.2.5田间病情调查对生长到30d的甜瓜植株进行田间调查，每份材料随机选择11株植株，调查对象为甜瓜植株2～4节位上的所有真叶，并计算病情指数，计算方法同苗期鉴定方法。田间叶片果斑病病害分级标准如下：表2-3田间细菌性果斑病分级标准Table2-3GradingstandardofBacterialfruitblotchinfield病情级别病情分级标准SeveritylevelGradingstandard0级无病斑：1级病斑面积占整个叶面积的5%以下：3级病斑面积占整叶面积的6%-10%：5级病斑面积占整叶面积的11%-20%：7级病斑面积占整叶面积的21%-50%：9级病斑面积占整叶面积的50%以上2.2结果与分析幼苗接种后，25份甜瓜植株都出现不同程度的病害，接种2d后有部分植株子叶已经出现棕褐色病斑，真叶边缘处呈密集的星点状病斑。5d后病害发展较迅速，且病情达到稳定状态。叶片病斑呈不规则多角形，空气湿度大时病斑呈水浸状。干燥时，病叶干11 枯且易脱落。后期时，多个病斑融合成大病斑，颜色加深，呈深褐色。不同甜瓜品种苗期细菌性果斑病抗性鉴定结果见表2-4。中抗材料T1、T2与感病材料T12、T13症状表现和接种后感病材料T13与对照见图2-3、2-4。表2-4不同甜瓜材料苗期细菌性果斑病的抗性鉴定结果Table2-4ResultsofidentificationofResistancetoAcidovoraxavenaesubsp.CitrulliamongDifferentMelon(Cucumisspp.)intheseedlingstage材料平均病相对抗抗性材料平均病相对抗抗性编号情指数病指数评价编号情指数病指数评价MaterialAverageRelativeEvaluationMaterialAverageRelativeEvaluationnumberdiseaseresistanceresistancenumberdiseaseresistanceresistanceindexIndexindexindexT118.420.70MRT2245.850.26MST421.840.65MRT2145.990.26MST1124.710.60MRT1849.060.21MST2529.460.52MRT1949.900.19ST233.330.46MRT1351.540.17ST835.300.43MRT1751.580.16ST736.590.41MRT2353.610.13ST1036.750.41MRT1553.950.13ST537.560.39MST2456.000.09ST2039.110.37MST1656.170.09ST940.960.34MST1258.130.06ST1443.580.29MST661.770ST344.780.28MS抗性鉴定的调查结果表明，接种后的25份甜瓜材料均发病，没有免疫和高抗的甜瓜材料。编号T1的材料病情指数最低，相对抗病指数最高为0.70，属于中抗级别。T6的平均病情指数最低为61.77，属于感病级别。供试的材料中分为三种类型：中抗（MR）材料共有8份，相对抗病指数为0.70~0.41，中感（MS）材料共有8份，相对抗病指数为0.39~0.21。感病（S）材料9份，相对抗病指数为0~0.19。通过调查田间生长到30d左右甜瓜植株叶片，25份材料中，只有T12、T13、T10、T17、T20田间表现果斑病症状，其余均没有发病。叶片症状表现为病斑沿叶缘叶脉处呈棕褐色V字型或多角形水浸状病斑，病情严重时病斑沿着叶边缘向中部扩展。空气湿度大时，有白色菌脓溢出。空气干燥时，叶片病斑处变薄变脆，易穿孔脱落，并有白色菌脓粘着在叶片上。田间细菌性果斑病调查结果见表2-5。感病材料T12、T13田间叶片病害表现见图2-2。表2-5不同甜瓜材料田间细菌性果斑病的调查结果Table2-5ResultsofinvestigationtoAcidovoraxavenaesubsp.CitrulliamongDifferentMelon(Cucumisspp.)inthefield材料病叶数各级病叶数病情编号（%）Numberofdifferentdiseasedleafe指数MaterialNumberof013579diseasenumberdiseasedleafeindex12 续表：2-5T2072.7392400008.08T1081.82619701015.82T1393.942191020019.87T1796.971191030021.55T1296.97113485239.73注：其余甜瓜材料病情指数均为0。Note:Theindexoftherestofthemelonmaterialswere02.3讨论通过室内苗期喷雾接种鉴定，调查植株所有叶片病斑面积大小统计病情指数，以此[35]确定不同甜瓜材料之间的抗病指数，较能准确的反应不同材料之间存在的差异。胡俊等通过调查研究发现不同哈密瓜品种田间自然条件下的抗病性与温室人工接种下的抗病性完全一致，能间接的反应出田间抗性表现。苗期接种试验的抗性鉴定由于接种量的大小、浓度、温度与湿度条件一致，所以能客观的反映出不同材料之间的抗性差异。但是，由于光照营养条件等不可控因素影响植株的长势，对苗期抗病性结果有一定的影响。田间发病的材料中，多数材料未表现细菌性果斑病，除T20属于中感级别，其余4份均属于感病材料。经过田间观察，病害的发病程度比苗期接种实验的发病等级较轻，[36]与杨小丽等人的研究结果相一致。田间的病害表现与复杂的环境因素有密切的关系，湿度大有利于病害的传播。正常情况下，田间通风透光好，湿度小不利于病害的侵染与[51]传播。并不是甜瓜品种本身不感病，而是品种在田间条件下的的避病反应。同时，不同甜瓜材料田间生长形态与病害的严重程度可能存在相关性。需要进一步观察研究。本次供试的甜瓜材料中，材料T1与T4苗期抗病指数最高，T1材料来源于皇后×韩国甜瓜后代自交系，T4材料来源于欧洲甜瓜×哈密瓜后代自交系。中抗材料除T10、T25其余均来源于外国甜瓜自交系或外国甜瓜与哈密瓜的杂交后代自交系，感病材料基本来源[51]于哈密瓜自交系或新疆地方品种。新疆地方品种均属于中感或感病级别。李威等研究表明新疆目前主栽哈密瓜都严重感染细菌性果斑病。因此，引进国外高抗品种对于抗果斑病的育种具有重要的意义。关于材料(T21～T25)杂交F1代的抗性表现，并没有表现出明显的遗传规律，可能是由多基因控制，而不同甜瓜材料不同的杂交组合也表现出不同的抗性表现。目前国内关于抗果斑病的遗传机制研究很少，遗传规律并不清楚。有待进一步探索。13 第3章甜瓜果实不同时期对细菌性果斑病抗性鉴定细菌性果斑病是甜瓜(Cucumismelo)作物上田间常见的病害，可危害甜瓜植株的整个生长期，浸染叶片和果实，导致果实腐烂，失去了商品价值，造成不同程度的减产，对瓜类产业造成了很大的经济损失。目前，生产上栽培的甜瓜品种基本上表现感病的，且田间一旦发生病害，在适宜的环境条件下病害会迅速蔓延。对此病的防治也以化学防治为主。目前，关于甜瓜果斑病抗性种质鉴定多采用苗期抗性鉴定，以叶片的抗性来鉴定甜瓜的抗病性，实际生产中植株叶片与果实的抗性表现并不一致。本实验通过对25份甜瓜材料在果实发育期，采用离体果实人工喷雾接种法，比较并鉴定供试果实抗性表现，初步筛选抗病品种，为抗病遗传和抗病育种的研究提供参考。3.1材料与方法3.1.1材料供试的甜瓜材料编号为T1～T25，其中自交系材料20份，杂交一代材料5份，共计25份，由国家瓜类工程技术研究中心提供。供试的细菌性果斑病菌株由南京农业大学提供，菌株代号为M2。供试甜瓜果实特征见表3-1。表3-1供试甜瓜果实特征Table3-1thefeatureoftestedMuskmelon材料编号材料来源编号果实形态果实皮色果皮特征果肉特征MaterialnumberSourceofFruitSkincolorSkinfeaturePulpafeaturematerialnumbermorphologyT1M867椭圆形墨绿色光滑、绿麻点橘红肉、脆、软T2NM90-1圆形浅黄色网纹青边白肉、松、软T3M809卵圆形黄色光滑白肉、松软T4M835椭圆形浅黄色网纹白边红肉、柔软脆甜T5M843B卵圆形白色网纹绿肉、肉质紧脆T6M888椭圆形墨绿色光滑、麻点绿边粉红瓤、紧脆T7M439圆形墨绿色网纹青白肉、松软T8M600卵圆形黄色光滑白肉、松软、甜T9NM89橄榄形黄色光滑白肉、松脆T10M916椭圆形黄绿色网纹、绿条带粉红瓤、松脆T11M880圆形黄色光滑红瓤、柔、紧T12谢开心椭圆形墨绿色棱沟、网纹青白肉、松软、多汁T13伽师瓜橄榄形墨绿色光滑、麻点青边红肉、柔软T14卡拉尕西椭圆形墨绿色网纹青边红肉、紧软14 续表：3-1T15M581椭圆形黄绿色、墨绿网纹青白肉、松软、条带多汁T16M633椭圆形黄绿色网纹青白肉、松脆T17M711椭圆形黄色网纹橘红肉、紧脆T18M607圆形黄色光滑白肉、松软、多汁T19M833椭圆形淡黄色光滑橘红肉、松脆T20M805椭圆形青黄色网纹橘红肉、松软、多汁T21(T1×T8)M867×M600椭圆形黄绿色网纹橘红肉、紧脆T22(T1×T9)M867×NM89椭圆形黄色网纹橘红肉、柔软T23(T2×T8)NM90-1×M600椭圆形黄色光滑白肉、松软T24(T2×T9)NM90-1×NM89椭圆形黄色网纹青白肉、松软T25(T9×T8)NM89×M600卵圆形黄色光滑白瓤、紧、软注：Nm、m表示自交系材料，T21～T25为杂交一代材料Note:M、Nmweretheinbredpurelinematerialofmuskmelon,T21～T25ishybridmaterialsofmuskmelon;3.1.2方法3.1.2.1实验方法实验在新疆西域种业有限公司试验地进行。2015年5月中旬播种，采用直播方式，种植株距40cm，行距2m，采用单蔓整枝，按正常生产管理方法进行田间管理。对幼果期（授粉后8～11d）和膨大期(授粉后20～22d)两个时期的离体果实分别进行2次喷雾接种。每个时期接种对象选择大小一致、健康、生长时间一致的果实，实验设置3次重复并设置对照，鉴定材料共计25份。试验所用的接种器具为橡胶塞上插入六根平齐的针，每个甜瓜任意选取2个位置进行针刺（在果实表面形成伤口，有利于果斑病菌的侵入），共计12个针孔，针头扎的深度约1cm，然后在针刺部位用手持喷雾器喷洒菌液，同时进行保温（20℃～35℃）保湿，实验在相对封闭的环境（棚架）中进行。病菌的培养和悬浮液制备方法参照第2章。3.1.2.2鉴定方法喷雾接种11天后，以整个果实为鉴定对象，观察发病情况，统计病情指数。病情级数分级标准如下：表3-2细菌性果斑病分级标准Table3-2GradingstandardofBacterialfruitblotch病情级别病情分级标准SeveritylevelGradingstandard0级果实表面除有愈合痕迹外，未见病斑1级果实表面病斑占果实面积10%以下，病斑多为单个独立的水浸状病斑2级果实表面病斑占果实面积11%～50%，且病斑多聚集并融合，且未侵入果实表皮15 续表：3-23级果实表面病斑占果实面积11%～50%，且病斑多聚集并融合，且已侵入果实表皮4级果实表面病斑占果实面积11%～50%，且病斑多聚集并融合，且已侵入到果肉5级果实表面病斑占果实面积51%以上，果实部分腐烂6级果实表面病斑占果实面积51%以上，果实完全腐烂病情指数的计算方法如下：发病级数×发病数ＤＩ＝×100（3-1）最高病级×总数[50]采用相对抗病性方法评价其抗病程度。相对抗病程度略有改动，分为免疫Immunity(1.00)、高抗Highresistant(0.80～0.99)、中抗Middleresistant(0.40～0.79)、中感Middlesusceptible(0.20～0.39)、感病Susceptible(0.20以下)。相对抗病指数（RI）＝1-相对病情指数（3-2）相对病情指数＝鉴定品种平均病情指数/对照品种平均病情指数(病情指数最高者为对照品种)。（3-3）3.2结果与分析供试甜瓜材料幼果期和膨大期离体果实细菌性果斑病的抗性鉴定结果见表3-3表3-3甜瓜不同果实发育期细菌性果斑病的抗性鉴定结果Table3-3Theresistanceidentificationresultsofdifferentmuskmelonsfruittobacterialfruitblotchindifferentstage材料EF:平均病LF:平均病综合病相对抗综合抗性评价编号情指数情指数情指数病指数EvalutionofMaterialAveragediseasAveragediseasSyntheticdiseasRelativecomprehensivenumberindexindexindexdiseasindexresistanceT411.1116.6713.890.76MRT1022.2211.1116.670.71MRT627.785.5616.670.71MRT75.5638.8922.230.62MRT1427.7822.2225.000.57MRT1633.3316.6725.000.57MRT1533.3322.2227.780.52MRT927.7827.7827.780.52MRT1338.8916.6727.780.52MRT1838.8916.6727.780.52MRT1933.33ND33.330.43MRT2233.3341.6737.500.36MST1116.6761.1138.890.33MST1750.0027.7838.890.33MST2544.4441.6743.060.26MST2127.7861.1144.450.24MST2044.4450.0047.220.19ST327.7866.6747.230.19ST158.3341.6750.000.14ST5ND50.0050.000.14ST833.3372.2252.780.10ST1255.5655.5655.560.05S16 续表：3-3T2438.8975.0056.950.02ST2333.3383.3358.330.00ST255.5661.1158.340.00S注：EF果实表示幼果期，LF表示果实膨大期，ND为数据缺失Note:EF:Theyoungfruitstage,LF:Thedevelopingfruitstage,NDformissingdata喷雾接种后，对果实周围环境进行喷水保湿以有利于病菌的繁殖。一周内不同甜瓜材料果实未出现明显的变化。一周后部分果实表面出现单独小面积水浸状病斑。随着病菌的繁殖，病菌浸染果肉，有个别果实内部发生不同程度腐烂，对照则未出现病斑。其中大多数被侵染果实针刺处并未出现病斑，只有伤口愈合现象。表明病菌可以从果实表面皮孔或气孔侵入到果实内部。根据综合病情指数，筛选出了11份中抗材料，5份中感材料，9份感病材料。没有筛选出免疫和高抗材料。其中材料T4、T10、T6综合抗病指数最高，均达到0.7以上，材料T2、T23、T24综合抗病指数最低。T6、T9等5份材料的果实膨大前期抗性指数均明显高于后期，T3、T8等材料7份材料后期抗性指数均明显高于前期。图3-2为膨大前期接种后抗病与感病材料病状表现。图3-4为膨大后期接种后抗病与感病材料。图3-3为膨大后期接种后不同抗性材料发病症状。3.3讨论从2次接种鉴定结果来看，部分材料的幼果期与膨大期的抗病指数并不一致，如T6、T9等5份材料幼果期抗病指数大于膨大期，T3、T8等7份材料膨大期抗病指数大于幼果期。T4、T6、T10甜瓜材料在两次鉴定中均表现稳定的较高的抗性，可以作为抗病性育种研究材料。T4材料抗性指数最高，材料来源编号为m835，属于欧洲甜瓜和哈密瓜杂交后代自交系。果实特征为椭圆形、黄色、网纹，果肉脆甜可口，属于厚皮甜瓜类型。果斑病菌侵染果实的过程中，后期会发生腐烂现象，是腐生细菌和真菌共同影响的结果，也可以认为是果斑病菌间接导致的结果。Hopkins在田间调查研究发现西瓜抗性强的品种为深绿色，感病的品种偏浅色。本次试验中，偏绿皮甜瓜材料中除T1、T12、T13为感病外，其余材料均属于中抗级别。但果实皮色不是主要的因素，与果实抗性并没有相关性。关于果斑病菌侵染果实机制和途径普遍认为是通过气孔、自然孔口、伤口进入果实。[52]Wiebe等研究结果发现果实在授粉后接种细菌性果斑病菌，这个阶段果实更容易发病。本次田间调查发现，果斑病发病严重的果实表面并没有明显的病斑，但果斑病菌已侵入17 果实，造成果实内部腐烂。可能是在授粉期农事操作时交叉感染，病菌侵入子房，形成[53]对甜瓜果实的早期潜伏侵染。田间果斑病发病表现见图2-2。张辉等通过对田间生长哈密瓜的不同生长发育阶段果实组织带菌分离、鉴定和致病性测定，表明哈密瓜在整个生长发育过程中，均可受到致腐病原菌潜伏浸染，主要通过网纹裂口侵入。从幼果期到网纹形成期带菌率明显增加，成熟期与裂纹期增加不明显。本次实验接种后期接近网纹期，病情指数比前期病情指数严重，与上述研究结论一致对田间病害的控制应在网纹形成期到成熟期的阶段重点防治。此外，田间的环境条件也是病害发生的重要因素，高温高湿的环境有利于病害的传播。3.4甜瓜材料苗期及离体果实细菌性果斑病的综合评价细菌性果斑病菌可侵染甜瓜植株生长的各个阶段，幼苗期时可侵染子叶和真叶，成株期时可传染成熟叶片，坐果期时可侵染果实。在适宜的高温高湿的环境下，病情加重。不同的甜瓜品种，病害潜伏期的长短也不一样，病菌侵染一个品种时可能立即有病害的症状，而侵染另一个品种一段时间后才表现出病害。表3-4甜瓜材料苗期及果实发育期细菌性果斑病的鉴定和综合排名Table3-4ThediseasesresistanceandcomprehensiverankingtoAcidovoraxavenaesubsp.CitrulliamongMeloninseedingandgrowthstage材料编号苗期相对抗病指数果实相对抗病指数综合得分综合抗性排名MaterialRelativeresistanceRelativeresistanceComprehensivecomprehensivenumberindexofseedindexoffruitscoreresistancerankT40.65(20)0.76(16)361T100.41(15)0.71(15)302T70.41(15)0.62(14)293T110.60(19)0.33(9)284T10.70(21)0.14(5)265T250.52(18)0.26(8)266T90.34(12)0.52(12)247T140.29(11)0.57(13)248T80.43(16)0.1(4)209T180.21(8)0.52(12)2010T50.39(14)0.14(5)1911T200.37(13)0.19(6)1912T220.26(9)0.36(10)1913T20.46(17)0（1）1814T190.19(7)0.43(11)1815T130.17(6)0.52(12)1816T30.28(10)0.19(6)1617T210.26(9)0.24(7)1618T150.13(4)0.52(12)1619T160.09(3)0.57(13)1620T60(1)0.71(15)1621T170.16(5)0.33(9)1422T230.13(4)0(1)523T240.09(3)0.02(2)524T120.06(2)0.05(3)52518 综合25份不同甜瓜材料苗期和两个不同时期果实对果斑病的抗性指数，采用名次倒序计分法，对抗病指数进行赋值，最后根据供试材料综合得分排序。其中T4和T10材料综合抗性最高。T4属于欧洲甜瓜×哈密瓜自交系后代，肉质脆甜可口可以优先考虑作为抗病育种的材料。T10材料来源于哈密瓜自交系后代，果实的抗病性较高。综合上述抗性鉴定结果表明：叶片与果实对果斑病的抗性表现并不一致，如T1、T2，供试材料中同一份材料果实生长的不同时期对细菌性果斑病抗性差异也较大，如材料T3、T11。在植株及果实生长的不同时期可以为果斑病的防治提供参考，但本试验的环境条件较为简单，具体的抗性表现还需在复杂的田间经过多年的观察和鉴定。表3-5杂交F1代及亲本材料病情指数比较Table3-5ThecomparationtodiseaseindexofhybridF1andtheirparents材料编号苗期病情指数果实病情指数材料编号苗期病情指数果实病情指数MaterialDiseaseindexDiseaseindexMaterialDiseaseindexofDiseaseindexnumberofseedoffruitnumberseedoffruitT118.4250.00T21（T1×T8）45.9944.45T233.3358.34T22（T1×T9）45.8537.50T835.3052.78T23（T2×T8）53.6158.33T940.9627.78T24（T2×T9）56.0056.95T25（T9×T8）29.4643.06关于抗性遗传表现，从表3-5可以看出杂交一代苗期病情指数并没有表现出明显的遗传规律，F1代除材料T25表现中抗外，其余均表现为中感或感病。抗性表现并不是简单的质量性状，可能是由多基因控制，为复杂的数量遗传性状。对于果实和苗期综合抗性表现，由于选择的亲本材料并不是抗性最高和最低的杂交组合，并且不同甜瓜材料不同的杂交组合也表现出不同的抗性表现。F1代材料抗性表现并没有规律性。19 第4章不同抗性甜瓜材料生理生化指标的分析细菌性果斑病侵染甜瓜植株，不同的抗性材料表现病害的严重程度也不一样。为了更好的研究甜瓜材料未受细菌侵染时，抗病、感病材料之间先天性某些生理生化指标的差异。本研究从25份甜瓜材料中筛选6份不同抗性材料对叶绿素等生理指标进行测定，为甜瓜育种、病害的防治提供初步探索性的理论依据。4.1材料与方法4.1.1供试材料根据苗期抗性鉴定及田间观察鉴定结果筛选出中抗(MR)材料T1、T2、T8，中感(MS)材料T9，感病(S)材料T12、T13共6份不同抗性材料作为测定对象，供试的材料均为自交系。4.1.2实验设计实验材料准备同第3章，在伸蔓期结束（45d）时，以上述6份不同抗性材料为对象，选取生长势相同、节位相近、健康完整的植株叶片低温保存。分别测定叶片中可溶性蛋白、总糖、游离氨基酸、总酚、类黄酮、叶绿素的含量以及含水量。测定叶片含水量时所用叶片为活体植株当天采下的叶片，测定相对叶绿素含量为活体植株上的叶片。4.1.2.1含水量的测定分别称取1g左右的新鲜叶片置于培养皿中，再放入烘箱中，在105℃下杀青30min，然后将温度调节到75℃左右烘干至恒重，最后称取材料干重。每份材料重复3次，计算每份材料平均含水量。4.1.2.2叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定分为叶片活体的相对叶绿素含量测定和离体叶片叶绿素含量的测定。在伸蔓期结束时，同一时间段使用SPAD-502叶绿素仪随机选取生长势相同、节位相近、健康完整的植株叶片，每份材料叶片选取相同部位测定，每片叶选取2个不同[54]的部位，重复测定3次。离体叶片叶绿素含量的测定采用利用二甲基亚砜法的方法称20 取50mg-100mg不同材料叶片组织，用DMSO(二甲基亚矾）溶液进行叶绿素的提取，样品放在65℃的条件下3h，直到看到叶绿素从叶片组织上被移除。每份材料重复3次，以DMSO溶液作空白，在OD值为665nm和648nm下用分光光度计测值，根据公式计算出叶绿素a、叶绿素b的含量，最后计算出总叶绿素的含量:Chl总=Chla+Chlb（4-1）4.1.2.3可溶性蛋白含量测定称取1g甜瓜样品叶片组织（每份材料重复2次）加入5ml蒸馏水研磨成匀浆，在4℃温度下12000r/min离心20min，收集上清液为可溶性蛋白提取液。吸取1ml样品提取液加入试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液充分混合，放置2min后在595nm处测得[55]吸光度值，根据标准曲线测得可溶性蛋白含量。4.1.2.4可溶性总糖含量测定[55]总糖含量测定采用蒽酮试剂法，称取1g甜瓜样品叶片组织（每份材料重复2次）于研钵中，研磨成匀浆转入试管中加入5ml蒸馏水，塑料膜密封，于沸水中提取30min，取出冷却后在过滤，残渣再加入5ml蒸馏水，再煮沸过滤，滤液转入容量瓶中定容。吸取0.5ml样品提取液加入到试管中，再加1.5ml蒸馏水最后分别加入0.5ml蒽酮—乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡放入沸水浴中保温1min。在波长630nm处测定吸光度值，根据标准曲线测得可溶性总糖含量。4.1.2.5游离氨基酸含量测定[55]氨基酸测定采用茚三酮法，称取1g甜瓜样品叶片组织（每份材料重复2次）置于研钵中，加入5ml10%乙酸溶液研磨成匀浆转入容量瓶，用蒸馏水稀释定容混匀，最后过滤到三角瓶中。吸取1ml样品滤液置于干燥试管中，加入1ml无氨蒸馏水。在沸水浴中加热15min冷却后加入5ml95%乙醇溶液密封后振荡试管，最后用60%乙醇稀释至20ml，在570nm处测定溶液的吸光度值，根据回归方程计算出游离氨基酸含量。4.1.2.6总酚、类黄酮含量测定[55]总酚、类黄酮测定采用甲醇法，称取1g甜瓜样品叶片组织（每份材料重复2次）置于研钵中，加入少量预冷的1%盐酸-甲醇溶液，冰水浴条件下研磨匀浆后转入试管中定容混匀，于4℃左右温度下避光放置20min，最后过滤收集滤液。在波长280nm处测21 得吸光度值为总酚含量，在波长325nm处吸光度值为类黄酮物质含量，根据回归方程测定各物质含量。4.1.2.7数据处理用Excel软件对所有实验数据进行初步处理，采用SPSS19.0软件进行数据处理和统计分析。4.2结果与分析4.2.1不同甜瓜材料相对叶绿素含量、叶绿素含量、含水量的比较。表4-1不同甜瓜材料相对叶绿素含量、叶绿素含量、含水量的比较及方差分析Table4-1Differentmelonmaterialsrelativechlorophyllcontent，chlorophyllcontent，watercontentofthecomparisonandanalysisofvariance材料相对叶绿素含量材料叶绿素含量材料含水量(%)编号（SPAD值）编号(mg/g)编号WaterMaterialRelativeMaterialChlorophyllMaterialcontentnumberchlorophyllnumbercontentnumbercontentT1(MR)68.01±3.94aT1(MR)2.34±0.17aT2(MR)91.39%±0.006aT8(MR)58.31±2.73bT8(MR)2.11±0.25abT12(S)90.26%±0.003abT2(MR)56.57±1.81bcT13(S)2.00±0.37abT13(S)90.23%±0.012abT9(MS)56.19±3.03bcT2(MR)1.92±0.36abT9(MS)89.12%±0.010abcT13(S)54.34±2.37cT9(MS)1.76±0.32bT1(MR)88.25%±0.001bcT12(S)50.52±3.84dT12(S)1.58±0.06bT8(MR)87.61%±0.026c注：a、b、c、d为0.05水平的显著性差异Note:a,b,c,dshowthe0.05leveldifferenceofthelabel.叶绿素和水是植物进行光合作用和新陈代谢的重要物质，植物叶绿素含量的高低能间接反映出光合作用的强弱及抗逆性的大小，而水的含量可以反映出植物新陈代谢的强弱。从表4-1可以看出多数中抗与感病材料之间的含水量并没有显著性差异。叶绿素的测定中，但抗性指数最高的T1叶绿素含量最高为2.34mg/g，抗性指数最低的T12的叶绿素含量最低为1.58mg/g，二者之间存在显著性差异。中抗材料T1、T8、与感病材料T12、T13的相对叶绿素(SPAD)值有显著性差异，抗性指数最高的T1相对叶绿素含量（SPAD）值最高为68.01，抗性指数最低的T12的相对叶绿素含量最低为50.52。抗性指数高的材料相对叶绿素含量普遍较高，如T1抗性指数为0.70（MR）、T8抗性指数为0.43。抗性指数低的材料相对叶绿素含量普遍较低，如T12抗性指数为0.06（S）、T13抗性指数为0.17（S）。22 4.2.2不同甜瓜材料可溶性蛋白、游离氨基酸、总糖含量的比较表4-2不同甜瓜材料可溶性蛋白、游离氨基酸、总糖含量的比较及方差分析Table4-2Differentmelonmaterialssolubleprotein,freeaminoacid,totalsugarcontentofthecomparisonandanalysisofvariance材料可溶性蛋白含量材料游离氨基酸含量材料总糖含量编号（mg/g）编号（mg/g）编号（mg/g）MaterialSolubleMaterialFreeaminoacidMaterialTotalsugarcontentnumberproteincontentnumbercontentnumberT13(S)44.62±0.94AT9(MS)79.26±0.57AT13(S)11.70±0.15AT1(MR)42.06±1.87AT1(MR)73.51±0.10BT2(MR)10.19±0.22BT9(MS)37.94±0.20BT2(MR)65.05±0.38CT12(S)10.10±0.14BCT2(MR)34.48±0.27CT13(S)59.98±0.48DT1(MR)9.45±0.19CT12(S)32.30±0.27CT12(S)56.66±0.38ET8(MR)7.33±0.15DT8(MR)28.26±0.06DT8(MR)54.56±0.47FT9(MS)7.17±0.20D注：A、B、C、D、E、F为0.01水平的显著性差异标号Note:A,B,C,D,E,Fshowedthe0.01leveldifferenceofthelabel植物可溶性蛋白含量是一个重要的生理生化指标。许多可溶性蛋白构成植物中酶的重要组成部分，参与细胞生理生化反应。与植物的生长发育、抗病性、抗逆性密切相关。从表4-2可以看出某些不同抗性材料的可溶性蛋白含量存在极显著性差异，但与抗性的高低无关。氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质分解产物种类之一在植物的生长发育过程中，游离氨基酸含量的变化与组织生理代谢密切相关。游离氨基酸的测定中，所有材料之间均呈现及显著性差异，也与抗性的高低无关。糖是植物生命活动中重要的能源物质，也间接反映出呼吸作用的强弱。表4-2中抗性指数最高的材料T1总糖含量为9.45mg/g与抗性指数最低的材料T12总糖含量为10.10mg/g没有极显著性差异。含糖量最高的材料T13、T2与含糖量最低的材料T8、T9都有感病和抗病材料。因此，可溶性总糖含量的高低也与材料的抗病和感病无关。4.2.3不同甜瓜材料总酚、类黄酮含量的比较表4-3不同甜瓜材料总酚、类黄酮含量的比较及方差分析Table4-3Differentmelonmaterialstotalphenolandflavonoidscontentofthecomparisonandanalysisofvariance材料编号总酚含量（mg/g）材料编号类黄酮含量（mg/g）MaterialnumberTotalphenolcontentMaterialnumberFlavonoidscontentT12(S)4.51±0.49AT12(S)0.36±0.014AT9(MS)4.39±0.20AT13(S)0.34±0.007ABT13(S)4.29±0.13ABT9(MS)0.34±0.007ABT2(S)3.90±0.10BCT2(MR)0.31±0.007BT1(MR)3.64±0.06CT1(MR)0.27±0.001CT8(MR)2.76±0.02DT8(MR)0.24±0.007D注：A、B、C、D、E、F为0.01水平的显著性差异标号Note:A,B,C,D,E,Fshowedthe0.01leveldifferenceofthelabel.植物中大量存在着酚类物质和类黄酮类等植物次生代谢产物，它们与植物的成熟衰老过程、组织褐变、抗逆性和抗病性代谢等作用密切相关。从表4-3中可以看出；抗性23 指数最高的材料T1总酚和类黄酮含量分别为3.64mg/g、0.27mg/g与抗性指数最低的材料T12总酚和类黄酮含量分别为4.51mg/g、0.36mg/g存在极显著性差异。总酚和类黄酮含量较低的材料T1、T2、T8均属于抗病材料，而总酚和类黄酮含量较高的材料T9、T12、T13均属于感病材料。多数中抗材料与感病材料之间总酚与类黄酮含量存在极显著性差异。抗性高的甜瓜材料总酚和类黄酮含量普遍较低，抗性低的甜瓜材料总酚和类黄酮含量普遍较低。4.3讨论本章内容在通过苗期细菌性果斑病抗性鉴定的基础上，筛选了6份抗病、感病甜瓜材料作为研究对象。研究比较了不同抗性材料叶片中含水量、可溶性蛋白、总糖、游离氨基酸、叶绿素含量、总酚和类黄酮含量含量等生理指标的差异。本试验结果表明：不同甜瓜材料叶片中含水量、可溶性蛋白、总糖、游离氨基酸含量虽然有显著差异性，但是抗病、感病材料之间并没有规律性。而相对叶绿素含量、总酚和类黄酮含量有一定的规律性。抗病材料活体植株叶片中叶绿素含量普遍较感病材料中的叶绿素含量高。而抗性指数高的材料叶片中总酚和类黄酮含量普遍较抗性指低的材料含量低。[56]可溶性糖、可溶性蛋白是植物细胞内进行生理生化反应的重要物质。毛健民等研究表明烟草感染花叶病毒病后，可溶性蛋白及可溶性糖含量明显降低。感病品种高于对照，接种的高于对照。并认为病原菌侵染能够诱导寄主产生病原相关蛋白，认为这种蛋白与抗病性表达有很大的相关性。而糖作为植物进行呼吸作用和新陈代谢的种物质，[57]以及对各种抗病因子起着重要影响。Lylesp等研究发现小麦秆锈病属于高糖病害并认为植物高糖可以抑制病原菌细胞降解酶活性或抑制细胞降解酶的合成并且寄主细胞可[58]以利用糖合成抑菌物质。周博如等通过大豆细菌性疫病发现，接种后的感病可溶性糖含量明显降低，而抗病品种可溶性糖含量明显增加。没有接种的健康植株中感病品种可[59]溶性总糖比抗病的高。而陈厚德过大麦植株白粉病的研究认为可溶性糖与抗病性并没有关系。本次试验也得出了在未接种的情况下甜瓜植株抗病性与叶片中可溶性蛋白和可溶性糖含量并没有关系。叶绿素是植物进行光合作用的重要指标，叶绿体中含有很多光合作用所必须的光合24 色素，植物对光能的吸收和转化也离不开叶绿素。自然状态下活体植株中叶绿素含量的高低更能反应出植株光合作用的强弱，甜瓜植株的抗性越强可能净光合作用就越强，叶[60]绿素含量越高。同一份材料正常叶片叶绿素含量可能较病叶的高。孙冬梅等研究结果表明病叶的叶绿素含量下降，影响了光合作用能力，使光合强度下降，导致叶片糖分贮[61]存下降。张克清研究表明，在淹水环境条件下植株叶片的叶绿素含量显示呈逐渐下降趋势。[62]酚类化合物是由寄主所形成的容易氧化的物质，也是木质素合成的前提。张慧君对不同抗（感）白粉病甜瓜品种叶片蜡质、类黄酮、总酚含量进行了测定，表明抗性越强的品种蜡质含量越高。中抗品种的类黄酮和总酚含量较大幅度高于其他品种。而丁谦[63]等研究结果表明苗期抗感白粉病甜瓜品种中类黄酮、总酚含量很难有规律性，但有较大的差异。近年来多种实验研究表明，植物所表现出的抗病性更多的是病原物侵染寄主后诱导产生防御机制所表现的后天抗病性，包括过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及酚类化合物的变化。25 第5章不同甜瓜材料形态结构的观察与分析植物表面是病原菌的最初接触的结构，也是防止病菌浸染到细胞内部第一道屏障。研究植物叶片表面结构包括气孔大小和密度、上表皮细胞和下表皮细胞厚度、栅栏组织和海绵组织厚度以及角质层等固有的先天性形态结构对于植物的抗病性具有重要的意义。为了更好的研究甜瓜材料未受细菌侵染时，抗病、感病材料之间固有的组织结构之间的差异。本研究同样从25份甜瓜材料中筛选6份不同抗性材料分别进行显微和电镜观察，为甜瓜育种、果斑病的防治提供初步探索性的理论依据。5.1材料与方法5.1.1供试材料根据苗期和离体果实抗性鉴定结果筛选出T1、T2、T8，T9、T12、T13共6份不同抗性材料叶片作为观察对象，筛选出T2、T4、T8、T9、T20共5份材料以果皮为观察对象，供试的材料均为自交系。5.1.2实验设计实验材料的准备同第2章，在伸蔓期结束（45d）时，以上述6份不同抗性材料为对象，选取生长势相同、节位相近、健康完整的植株叶片做显微及电镜观察。在育苗温室待幼苗长到5-6片真叶时选取T1、T8共2份材料节位相近健康叶片用FAA固定液保存并做切片观察。选取材料T2、T4、T8、T9在幼果期（授粉后8—11d）和膨大期(授粉后20—22d)左右两个时期的果实上切取(0.7cm×0.5cm×0.5cm)果皮用FAA固定液（70%乙醇89ml+冰乙酸5ml+40%甲醛5ml）保存并做切片观察。选取T4、T13、T20共3份材料在授粉后15d后切取果实果皮做电镜观察。5.1.2.1甜瓜叶片绒毛及气孔等显微观察和测定将采取的甜瓜叶片用蒸馏水浸泡备用，用光学显微镜观察。在10倍物镜下用十字[64]交叉尺测定叶片相近部位的厚度，在40倍物镜下测定绒毛的长度，采用撕取法撕取叶片相近部位的上表皮和下表皮并进行观察气孔的密度即随机选择5个视野在交叉尺刻26 度内计算气孔的个数，并测量气孔的长度和宽度。5.1.2.2甜瓜材料叶片及果皮石蜡切片观察将固定好的甜瓜材料的叶片和果皮进行逐级脱水、透明、浸蜡、再脱蜡、复水和染色（固绿番红染液）等一系列步骤后进行制片，最后在光学显微镜下观察拍照，随机观察并测定5个视野下并叶片显微结构中上表皮、下表皮、栅栏组织、海绵组织及叶片的厚度。计算叶片组织结构紧密度(CTR)和叶片组织疏松度(SR)。紧密度（CTR）=栅栏组织厚度/叶片厚度×100%（5-1）疏松度（SR）=海绵组织厚度/叶片厚度×100%（5-2）5.1.2.3甜瓜材料叶片及果皮电镜观察2将供试材料叶片和果皮切成0.3cm左右的小片，经过乙醇和丙酮溶液的初步处理，用戊二醛进行固定，固定好的样品用磷酸缓冲液漂洗，再经过不同梯度乙醇逐级脱水，最后进行临界点干燥和金属镀膜，最后用扫描电镜进行观察并拍照。5.2结果与分析5.2.1不同甜瓜材料叶片组织结构相关数据的分析表5-1不同甜瓜材料叶片相关数据方差分析Table5-1Differentmelonmaterialbladerelateddataanalysisofvariance材料编号下表皮气孔上表皮气孔气孔保卫细胞绒毛长度（um）叶片厚度(mm)Material数目（个数）数目（个数）长度（um）LengthofVillousLeafthicknessnumberLowerstomasUpperstomasstomataguardcellT123.50±1.70ab18.10±1.88b24.50±2.09ab202.00±28.41a0.47±0.021aT225.20±2.28a13.10±0.74c26.00±4.18ab184.50±21.89a0.44±0.026abT823.90±1.75ab21.80±1.64a27.00±2.09a184.00±17.90a0.40±0.044bT921.10±4.10b19.60±2.16ab23.00±2.73b197.50±16.30a0.45±0.04abT1220.80±2.02b20.20±2.49ab25.50±2.09ab175.00±25.00a0.40±0.049bT1321.50±2.78b20.20±2.49ab25.50±2.09ab170.00±25.43a0.42±0.046b注：a、b、c为0.05水平显著性差异标号Note:a,b,c,dshowthe0.05leveldifferenceofthelabel.气孔和绒毛是叶片表面重要的结构，气孔是植物进行蒸腾作用的重要出口也是光合和呼吸作用气体交换的通道。而绒毛有拒水作用同时可以减少表皮对病菌的接触。从表5-1可以看出抗病、感病材料之间下表皮气孔和下表皮气孔数目没有显著性差异。但中抗材料T1、T2、T8普遍比感病材料T12、T13的下表皮气孔数目多，而上表皮气孔数目感病材料普遍较多。抗性最高材料T1气孔保卫细胞为24.50um，抗性最低的T12气孔长度为25.50um，长度之间并没有显著性差异。对于6份材料绒毛长度之间也没有显27 著性差异，且标准差较大，可以看出即使是同一份材料绒毛的长度也有很大的差距没有规律性。多数材料之间叶片厚度之间也没有显著性差异，但多数中抗材料叶片厚度普遍比感病材料叶片厚，抗性最高材料T1叶片最厚为0.47mm，抗性最低的材料T12、T13叶最薄分别为0.40mm和0.42mm，两者之间叶片厚度具有显著性差异。5.2.2T1、T8甜瓜材料叶片切片观察及相关数据分析上表皮上表皮栅栏海绵组织组织下表皮栅栏组织下表皮海绵组织图5-1T1甜瓜材料叶片结构图5-2T8甜瓜材料叶片结构Fig.5-1bladestructureofT1melonmaterialFig.5-2bladestructureofT8melonmaterial表5-2T1、T8甜瓜材料叶片相关数据方差分析Table5-2T1andT8melonmaterialsbladerelateddataanalysisofvariance材料编号上表皮厚度（um）下表皮厚（um）栅栏组织厚度（um）海绵组织厚度（um）MaterialUpperepidermisLowerepidermisPalisadetissueSpongytissuethicknessnumberthicknessthicknessthicknessT115.82±0.27a10.70±1.00a26.33±1.79a52.46±0.21aT815.86±0.24a11.43±1.27a24.19±0.17a47.47±3.11a叶片厚度（um）紧密度CTR(%)疏松度SR（%）ThicknessofleafTightnessFractionvoidT1102.60±3.80A25.64±0.007a51.84±0.027aT890.18±1.47B26.68±0.003a52.61±0.027a注：a为0.05显著性水平，A、B为0.01显著性水平Note:Ashowthe0.05significancelevel,aandbshowthe0.01significantlevel.材料T1的抗性指数为0.70，抗性最高。T8的抗性指数为0.43，抗性较低。抗性指数之间有显著性差异。从图表5-2可以看出2份材料之间上、下表皮平均厚度均没有显著性差异，栅栏组织、海绵组织平均厚度也没有显著性差异，疏松度与紧密度之间同样没有显著性差异。但两者之间平均叶片厚度有极显著性差异。T1叶片平均厚度为102.60mm，T8的平均叶厚为90.18mm。28 5.2.3不同抗性材料叶片和果皮的电镜观察绒毛绒毛图5-3抗病、感病材料T1、T12在100倍电镜下的绒毛分布Fig5-3ThedistributionoffluffofT1andT12under100timeselectronmicroscopy(seem)气孔气孔图5-4抗病、感病材料T1、T12在500倍电镜下气孔分布Fig5-4ThedistributionofstomataofT1andT12under500timeselectronmicroscopy(seem)气孔气孔图5-5抗病、感病材料T1、T12在2000倍电镜下气孔形态Fig5-5TheshapeofstomataofT1andT12under2000timeselectronmicroscopy(seem)图5-6抗病、感病材料T4、T20在100倍电镜下果实表皮形态Fig5-6TheshapeoffruitskinofT4andT20under100timeselectronmicroscopy(seem)29 皮孔皮孔图5-7抗病、感病材料T4、T20在500倍电镜下果实表皮气孔形态Fig5-7TheshapeoffruitepidermislenticelsofT4andT20under500timeselectronmicroscopy(seem)外果皮层外果皮层图5-8抗病、感病材料T4、T20在150倍电镜下外果皮纵切面形态Fig5-8TheshapeofpercarplongitudinalsectionofT4andT20under150timeselectronmicroscopy(seem)根据所拍下的电镜图可以看出，抗病、感病甜瓜材料叶片之间绒毛的分布和形态、气孔的分布和形态并没有差异。但抗性的高低可能与单位面积气孔的数目有关。在果实鉴定抗性方面，材料T4的抗性指数最高为0.76属于中抗级别，T20的抗性指数最低为0.19属于感病级别。二者之间的果实表皮和外果皮形态并没有差异，但根据图5-7可以看出在相同视野下T4材料果实表面皮孔的数目较T20的多。30 5.2.4不同甜瓜材料不同时期的果实表皮切片观察外表皮层外表皮层AB外表皮层外表皮层CD图5-9抗病及感病材料幼果期果皮组织结构A、B分别为抗病材料T4、T9，C、D分别为感病材料T2、T8。Fig5-9ThefruitskinorganizationstructureofresistantandsusceptiblematerialsinyoungstageAandBrespectivelyresistantmaterialT4,T9,CandDrespectivelysusceptiblematerialT2,T8外表皮层外表皮层EF外表皮层外表皮层GH图5-10抗病及感病材料果实发育期果皮组织结构E、F分别为抗病材料T4、T9，G、H分别为感病材料T2、T8。Fig5-10ThefruitskinorganizationstructureofresistantandsusceptiblematerialsindevelopingstageAandBrespectivelyresistantmaterialT4andT9,CandDrespectivelysusceptiblematerialT2andT8注：幼果期为授粉后8-11d，膨大期为授粉后20-22dNote:Theyoungfruitstagewasafterpollination8-11days,LF:Thedevelopingfruitstagewasafterpollination20-22days.31 根据果实发育不同时期的离体接种抗性鉴定结果，筛选出抗病材料T4、T9和感病材料T2、T8共4份材料做电镜观察。通过以上果皮结构可以看出，同一份材料在果实发育前期与后期之间的果皮结构上有很大的变化。甜瓜表皮和气孔器等外表皮细胞共同发育构成了外果皮。发育前期表皮细胞初步形成致密的表皮层，随着果实发育，表皮细[65]胞纵向生长成为长条形，并含有木质素等填充物。到后期，外果皮层上形成较薄的角质层。果实发育期薄壁细胞进行分裂，细胞层逐渐加厚，细胞扩散膨大与横向伸长细胞共同构成上中果皮。同样随着果实发育下中果皮细胞迅速分裂膨大出现间隙形成了海绵组织和维管束共同构成了下中果皮。通过对比发育前期的果皮结构发现，感病材料T2、T8的外表皮层细胞松散排列并不紧密，而抗病材料T4、T9外表皮层细胞排列紧密有序。对比发育后期的果皮结构可以发现，抗病材料外表皮层厚度较感病材料厚。4份材料之间中果皮的结构并没有太大的差异。5.3不同甜瓜材料叶片和果实形态结构观察与分析表5-3甜瓜材料叶片相关形态生理显著性分析Table5-3Therelatedmorphologyandphysiologicalanalysistoleavesofmelons材料编号平均病情SPAD值叶绿素含量含水量可溶性蛋游离氨总酚类黄酮Material指数Relative（mg/g）（%）白（mg/g）基酸(mg/g)(mg/g)numberAveragechlorophyChlorophyllWaterSoluble(mg/g)TotalFlavonoidsdiseasellcontentcontentcontentproteinFreephenolcontentindexcontentaminocontentacidcontentT118.42Ce68.01a2.34a88.25%a42.06a73.51a3.64a0.27aT2、T8、33.33BdT935.30Bd57.02b1.93ab89.37%a33.56a66.29a3.68a0.29a40.96BcT12、T1351.54Aa52.43c1.79b90.24%a38.46a58.32a4.40a0.35a58.13Ab材料编号平均病情总糖含量下表皮上表皮气孔长度绒毛长叶片厚Material指数（mg/g）气孔数(个)气孔（个）（um）度(um)度(mm)numberAverageTotalLowerUpperLengthLengthLeafdiseasesugarstomasstomasStomataofthicknessindexcontentVillousT118.42e9.45a20.80a18.10a24.50a202a0.47aT2、T8、33.33dT935.30d8.23a23.40a18.16a25.33a188.67a0.43ab40.96cT12、T1351.54b10.90a21.15a20.20a25.50a172.50.41b58.13ab注：A、B、C为0.01水平显著性差异;a、b、c、d、e为0.05水平显著性差异，各指标均为同类各指标的平均值Note:A、B、Cwere0.01levelsdifference;a、b、c、d、ewere0.05levelsdifference，Alltheindexesfortheaverag.32 表5-3可以看出不同材料苗期病情指数也有很大的差异性，将没有极显著性差异的材料分成一类，可分为3类。中抗材料T1平均病情病情指数分别与T2和T8和T9共3份材料的平均病情指数具有极显著性差异，与感病材料T12、T13的病情指数具有极显著性差异，多数材料病情指数间具有显著性差异。相关形态生理指标之间，病情指数最低的材料T1与病情指数最低的材料T12、T13之间SPAD值、叶绿素含量、绒毛长度和叶片厚度同样具有显著性差异，病情指数低的材料较病情指数低的材料叶绿素含量高，绒毛长、叶片厚，其他形态生理指标均没有显著性差异。5.4讨论叶片表面这些结构包括覆盖于表皮细胞上的蜡质和角质层、表皮细胞壁的结构、气孔和皮孔以及能阻止病原物扩展的由厚壁细胞组成的植物组织，它们共同构成了固有的防御结构。叶片和果实表面的蜡质可以形成天然的防水层，从而可以减少真菌和细菌在其表面萌发或繁殖。而叶片表面的绒毛可以减少病原菌接触侵染的机会。关于植物抗病[66]性与叶片结构组织关系多有报道，康立功等研究结果表明番茄叶片蜡质含量与角质层[67]厚度与芝麻病有关，蜡质含量越多、角质层越厚的品种，其抗性就越强。景岚等通过向日葵品种叶片组织结构与抗锈病的关系发认为抗病品种叶片厚度明显高于感病品种，且抗病品种栅栏组织厚度、细胞结构紧密度高也高于感病品种。但气孔的大小、形态、[68]密度均与抗病性无关。关于甜瓜叶片，郑耘等研究甜瓜叶片结构与白粉病的关系研究结果表明叶片表面刚毛数、气孔数与抗病性无相关性。关于甜瓜果斑病，翟艳霞等研究哈密瓜品种与细菌性果斑病的关系结果表明抗病品种叶片单位面积气孔数量多于感病品种，而气孔形态、大小与抗病性大小无关，抗病品种平均绒毛长度比感病品种的长，且密度大于感病品种。本实验通过显微结构初步观察表明：抗病材料叶片普遍比感病材料的叶片厚，且具有显著性差异。抗病、感病甜瓜材料叶片之间绒毛的分布和形态、气孔的分布和形态并没有差异。中抗材料下表皮气孔数目普遍比感病材料的多，而上表皮气孔数目感病材料普遍较多。但多数材料之间气孔密度并没有差异性，抗性的高低可能与单位面积气孔的数目有关。通过切片观察比较抗性差异较大2份材料发现二者之间上下表皮厚度、栅栏和海绵组织厚度、紧密度和疏松度并没有显著性差异，但叶片厚度同33 样具有极显著性差异。叶片厚度是否与抗果斑病相关，还需要有待证实。关于甜瓜果实的果斑病抗性鉴定及抗性大小与果皮组织结构的关系国内鲜有研究报道。相关研究认为甜瓜果实裂纹期致腐病原真菌潜伏侵染的主要时期，裂纹是潜伏侵染的主要部位和通道。通过本次电镜和切片观察外果皮组织，抗病材料果皮表面单位视野皮孔数目比感病材料的数目多，外表皮层厚度也比感病材料的厚度厚。关于叶片和果实组织结构与甜瓜抗细菌性果斑病的关系的研究需要更多的抗源材料和抗病品种作为观察对象，才能得到可靠的结论。目前普遍认为病原菌侵染后诱导产生代谢防御机制导致相关酶活性与酚类化合物等生理生化的变化是甜瓜植株所表现抗性差异的重要因素。34 第6章结论（1）通过对25份（编号为T1～T25）不同甜瓜材料，其中自交纯系材料20份（T1～T20），杂交一代材料5份（T21～T25）用苗期喷雾接种法进行果斑病抗性鉴定。结果，筛选出了T1、T4、T11等中抗材料8份，中感材料8份，T6、T12、T13等感病材料9份。没有免疫和高抗材料。另外，田间植株表现病害的T12、T13、T20等材料均属于中感或感病级别。供试的甜瓜材料中，材料T1与T4苗期抗病指数最高，T1材料来源于皇后×韩国甜瓜后代自交系，T4材料来源于欧洲甜瓜×哈密瓜后代自交系。感病材料基本来源于哈密瓜自交系或新疆地方品种，新疆地方品种均属于中感或感病级别。关于果斑病抗性遗传方面，抗、感材料及其杂交一代苗期病情指数并没有表现出明显的遗传规律，说明果斑病遗传由多基因控制的数量遗传性状。（2）采用喷雾接种法对不同时期25份甜瓜材料幼果期和膨大期进行果斑病抗性鉴定。结果：筛选出了11份中抗材料，5份中感材料，9份感病材料。没有筛选出免疫和高抗材料。材料T4、T10、T6综合抗病指数最高，均达到0.7以上，在两次鉴定中均表现稳定的较高的抗性，可以作为抗病性育种研究材料。材料T2、T23、T24综合抗病指数最低。T6、T9等5份材料的幼果期抗性指数均高于膨大期，T3、T8等材料7份材料后期抗性指数均高于前期。（3）综合25份不同甜瓜材料苗期和两个不同时期果实对果斑病的抗性指数，结果表明：同一份材料叶片与果实对果斑病的抗性表现并不一致。叶片对果斑病抗性高的材料，果实却感病，如T1、T2。果实对果斑病抗性高的材料，苗期却感病如T6、T16。供试材料中同一份材料果实生长的不同时期对细菌性果斑病抗性差异也较大，如材料T3、T11。T4和T10材料综合抗性最高，T10材料来源于哈密瓜自交系后代，果实的抗病性较高。T4属于欧洲甜瓜×哈密瓜自交系后代，肉质脆甜可口，可以优先考虑作为抗病育种的材料。（4）根据苗期抗性鉴定及田间观察鉴定结果筛选出6份不同抗性材料作为测定对象，分别测定叶片中可溶性蛋白、总糖、游离氨基酸、总酚、类黄酮、叶绿素、含水量。结果表明：不同甜瓜材料叶片中含水量、可溶性蛋白、总糖、游离氨基酸含量虽然有显35 著差异性，但是与抗病、感病材料无关。而相对叶绿素含量、总酚和类黄酮含量与抗感材料有关。甜瓜叶片抗性表现与叶片叶绿素含量呈正相关；与总酚和类黄酮含量呈负相关。（5）根据苗期和离体果实抗性鉴定结果分别筛选出6份和4份不同抗性材料，分别以叶片和果实为观察对象，采用显微和电镜技术对其显微组织结构进行观察。结果表明：抗病材料叶片普遍比感病材料的叶片厚，且具有显著性差异。抗病、感病甜瓜材料叶片之间绒毛的分布和形态、气孔的分布和形态并没有差异。中抗材料下表皮气孔数目普遍比感病材料的多，而上表皮气孔数目感病材料普遍较多。但多数材料之间气孔密度并没有差异性。通过切片观察比较T1和T8材料叶片结构发现二者之间上下表皮厚度、栅栏和海绵组织厚度、紧密度和疏松度并没有显著性差异，但叶片厚度同样具有极显著性差异。通过对比果实表皮结构初步发现，抗、感材料间果实表皮和外果皮形态并没有差异，但抗病材料果皮表面单位视野皮孔数目比感病材料的数目多。对比发育前期的果皮结构发现，感病材料T2、T8的外表皮层细胞松散排列并不紧密，而抗病材料T4、T9外表皮层细胞排列紧密有序。外表皮层厚度也比感病材料的厚。36 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图3-1幼果期离体果实接种细菌性果斑病菌不同级别的发病症状Fig.3-1ThesymptomsafterisolatedfruitinoculatedwithAcidovoraxcitrulliofdifferentlevelinyoungstage图3-2幼果期离体果实接种细菌性果斑病菌不同甜瓜材料的发病症状Fig.3-2ThesymptomsafterisolatedfruitinoculatedwithAcidovoraxcitrulliofdifferentmelonsinyoungstage图3-3膨大期离体果实接种细菌性果斑病菌不同级别的发病症状Fig.3-3ThesymptomsafterisolatedfruitinoculatedwithAcidovoraxcitrulliofdifferentlevelindevelopingstage图3-4膨大期离体果实接种细菌性果斑病菌不同甜瓜材料的发病症状Fig.3-4ThesymptomsafterisolatedfruitinoculatedwithAcidovoraxcitrulliofdifferentmelonsindevelopingstage42 图5-11显微镜下甜瓜叶片表皮气孔形态和分布Fig.5-11Thestomatamorphologyanddistributionofmelonleafepidermisunderthemicroscope图5-12显微镜下甜瓜叶片上的绒毛形态和分布Fig.5-12Thefluffmorphologyanddistributionofmelonleafunderthemicroscope43 致谢时间过得很快，研究生Ｈ年的生活即将结束，这Ｈ年来我需要感谢的人很多，首先向我尊敬的导师王惠林副教授致崇高的敬意和诚挈的感谢。从课题的最初构思到论文最后的撰写，整个过程都倾注了他们大量的精力和也血。感谢Ｈ年来在学习、工作和生活上都给予我很大的关怀和热情的帮助。对于事业不懈的追求、无私奉献精神，及严谨求实的科学态度、勤悬踏实的工作作风、高尚的人格都深深地影响和感染着我，令我受益匪浅。激励我在今后的王作岗位和人生道路上不断前进，踏实王作、刻苦钻研、多出成果。同时本论文的完成，也要特别感谢王叶均老师给予热情的指导和关杯。感谢新疆西域种业股份有限公司的张锻霞、田生元、刘也雨及公司的员工，为我提供良好的试验条件和无私的帮助，为我日常使用仪器提供了方便。还要感谢组培试验室的吴玉霞老师为我日常使用仪器提供了方便。论文完成期间，感谢师兄高强、许健和师姐李俊阁为我的试验提供的指导和帮助，感谢师妹万秀琴在整个试验过程中提供无私的帮助和支持。感谢宿舍同学在学习和生活上给予的帮助和关也，点点滴滴的感动是我难忘。一本论文的顺利完成，也要感谢我的父母多年来他们直不变的理解、关也和支持我的学习和生活，才使我能专注的学习和做试验，顺利完成硕±学业。，克服很多困难最后，再次向多来所有关也、支帮过、也。年持和助的老同学和亲友表示衷的感师谢４４
