小分子化合物（mitoxantrone+dihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型（HSV-1）作用及其机制初探

《小分子化合物（mitoxantrone+dihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型（HSV-1）作用及其机制初探》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

：２８５学校代码：１０卑硕士学位论文細、考，ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶ（专业学位）ＩＩ／小分子化合物（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅｄｉ丨ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）抗人单纯－疱疹病１型（ＨＶ１）作及其制初毒探Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｈｅｒｅｍｅｘｍｐｓｓｉｐｌｖｉｒｕｓｂｙｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ＾ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅａｎｄｉｔｓｒｅｌｉｍｉｎａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｐｙ—研究生姓名指导教师姓名专业名称急诊医学研究方向抗病毒药物所在院部苏州大学附属第一医院论文提交日期２０１７年５月 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探中文摘要小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探中文摘要单纯疱疹病毒是人类常见的一种传染病，任何年龄段都易感。疱疹病毒感染可导致各种各样的临床表现，单纯疱疹病毒1型常导致皮肤粘膜和器官的感染；单纯疱疹病毒2型常导致生殖器感染和生殖器疱疹。严重者甚至可以引起患者死亡。目前，临床主要使用阿昔洛韦、更昔洛韦等药物进行治疗，但是其耐药性近年来不断增多。此研究的目的是寻找新型的抗病毒化合物，希望其对之后临床治疗药物的开发和改造具有指导作用。我们筛选了购自Sigema公司的小分子化合物文库，获得了能有效抑制HSV-1介导的细胞程序性坏死的小分子化合物米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）。发现它具有较好的抗HSV作用，并且对细胞没有明显的毒性。较低浓度的MD（3μM）对病毒滴度就有较强的抑制作用，通过带GFP标签的HSV-1病毒实验，我们可以看见经过MD预处理的细胞几乎观察不到病毒荧光。无论在人源细胞还是鼠源细胞中，MD都能有效的抑制病毒蛋白。另外，MD也能抑制对病毒的早期基因及晚期基因的表达十分重要的病毒蛋白ICP27。同时，病毒复制相关基因（UL5,UL8,UL9,UL42,UL52）也能被抑制。通过实验我们发现，MD在体外可以有效的抑制病毒感染并且具有光明的成药前景，但是其作用机制作需要更多的实验加以探索。【关键词】单纯疱疹病毒；抗病毒；米托蒽醌二盐酸盐作者：黄强指导老师：徐峰I 英文摘要小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探InhibitionofhumanherpessimplexvirusbymitoxantronedihydrochlorideanditspreliminarymechanismAbstractHerpessimplexvirustype-1(HSV-1)andHSV-2aremajorcausesoforal-labialandurogenitallesions,respectively.SevereinfectionsofHSVareassociatedwithlife-threateningdiseases.TherearesomeantiviralmedicationswithactivityagainstHSV-1andHSV-2,however,theincidenceofdrugresistanceisincreasing.Theaimofourstudywastoidentifynewanti-HSVcompound(s)withpotentialusefordrugdevelopment.Wescreenedachemicallibraryofaround1000compoundsforinhibitorsofHSV-1-inducedcelldeath.Thisscreenledtotheidentificationofmitoxantronedihydrochloride(MD)withpotentprotectionagainstHSV-1-induceddeathoftheinfectedcells.Interestingly,additionof~3μMMDinbothhumanandmousecellsresultedinastronginhibitionofHSV-1titer.TreatmentofMDshowedremarkablereductionofGFPsignalintensityinthecellsinfectedwithGFP-labeledHSV-1.Moreover,MDefficientlyblockedtheexpressionlevelsofbothHSV-1andHSV-2proteinsinvariouscells.Notably,MDsignificantlyinhibitedtheexpressionofimmediate-earlygeneICP27,whichisessentialfortheexpressionofearlyandlateviralgeneproducts.Consistently,transcriptionalexpressionofgenesregulatingHSVreplicationsuchasUL5,UL9,UL29,UL30,UL42andUL52weresignificantreducedinthepresenceofMD.OurstudyrevealedthatMDhaspotentantiviralactivityagainstbothHSV-1andHSV-2throughadirectorindirectinhibitionoftheessentialimmediateearlygeneICP27.Therefore,MDhaspotentialforuseinthedevelopmentofanti-HSVtherapy.However，theprecisemechanismsstillrequirefunherinvestigation．Keywords：Herpessimplexvirustype-1;Antivirus;mitoxantronedihydrochlorideWrittenby：QiangHuangSupervisedby：FengXuII 目录前言....................................................................................................................................1材料与方法............................................................................................................................3一、材料............................................................................................................................31.病毒和细胞系..............................................................................................................32.主要试剂......................................................................................................................33.主要仪器......................................................................................................................44.主要抗体及细胞因子..................................................................................................5二．方法............................................................................................................................61.主要试剂的配置..........................................................................................................62.主要试验方法..............................................................................................................8正文..................................................................................................................................121.抗HSV-1的小分子化合物的筛选..............................................................................122.在鼠源细胞中米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）对HSV-1的抑制作用..................................................................................................................................132.1MD影响了HSV-1的复制和蛋白表达................................................................132.2MD抑制了病毒的滴度.........................................................................................132.3在病毒入侵细胞后，MD仍有抗病毒作用........................................................133.在人源细胞中米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）对HSV-1的抑制作用..................................................................................................................................143.1MD对HSV-1的抗病毒作用................................................................................153.2在病毒入侵细胞后，MD仍有抗病毒作用........................................................164.米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）对HSV-1的抑制作用的机制..........................................................................................................................................194.1MD对NF-κB信号的活化没有影响....................................................................194.2MD对ERK、Akt信号的活化没有影响.............................................................19 4.3MD抑制了病毒早期基因的表达.........................................................................20讨论..................................................................................................................................23小结..................................................................................................................................26参考文献..............................................................................................................................28综述：单纯疱疹病毒的研究进展及展望......................................................................30参考文献..........................................................................................................................34攻读学位期间公开发表论文..............................................................................................36缩略词表..............................................................................................................................37致谢..................................................................................................................................38 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探前言前言疱疹病毒是双股线性DNA病毒，含有包膜，可以感染人类及多种动物，是目前已知感染人类种类、数量最多的一类病毒。疱疹病毒科包括110多种病毒，其中有9[1]种被发现可以感染人类。HSV-1是疱疹病毒家族的典型代表。疱疹病毒具有特征性的外形，由一个二十面体衣壳组成的外壳，内部含有线性DNA基因组，共编码70[2,3]个各异的蛋白质，最外层由脂质双层包裹，这些脂质双层由病毒编码的糖蛋白修饰。疱疹病毒感染可以导致多种临床表现，单纯疱疹病毒Ⅰ型主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，主要引起颜面疱疹、疱疹性角膜炎和单纯疱疹病毒性脑炎等多种疾病，可形成永久性角膜浑浊甚至失明，严重病例甚至导致死亡；单纯疱疹病毒Ⅱ型常导致腰部以下部位感染，引起生殖器疱疹和粘膜感染，常发生在免疫力底下的人群中。HSV进入宿主后可以发生潜伏感染，在一定的条件刺激作用下，由潜伏状态转入增殖性状态，导致许多疱疹感染性疾病的反复发作，给患者生活造成困难，同[4]时对临床治疗构成了挑战。HSV-1的复制机制：最初，病毒借助脂质包膜上的糖蛋白与敏感细胞表面的相应受体结合，使其可以吸附于细胞膜上，然后，其包膜与细胞膜互相融合进而使核衣壳可以进入细胞质；之后，通过连接酶将线性基因组的两个黏性末端粘合，这些连接酶来自宿主，病毒DNA自身环化形成环状；在复制早期，病毒基因组以双向或θ这两种方式(θreplication)进行复制，这样可以产生许多环状子代DNA，到复制后期，DNA以滚环复制(Rollingcirclereplication，也称σ复制)的方式进行合成，大量线性多拷贝基因组串联体（未成熟DNA）形成首尾相连结构，它们是组装的最佳底物；在DNA包装信号的的引导下这些底物进行组装。组装结束后，核内的核衣壳移位至细胞浆，并通过出芽方式释放至细胞外，蛋白质被膜和脂质包膜将核衣壳包裹，从而形成成熟病毒颗粒。总之，HSV的增殖过程包括吸附、穿入、脱衣壳、DNA复制、转录、翻[5,6]译、蛋白质合成、核衣壳组装和病毒的释放等许多环节。包膜糖蛋白(Glycoproteins，gP)是抗原决定簇，分布于病毒颗粒表面，是包膜病毒表面脂质双层膜的重要构成成分。至今，已经被发现并给予命名的HSV-1包膜糖蛋白共有l2个，它们在病毒的感染及复制过程中发挥着重要作用。病毒感染至少需1 前言小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探要四种糖蛋白：D（gD）、B（gB）、H（gH）和L（gL）的协同作用。这四种蛋白不仅在病毒进入细胞的过程中发挥重要作用，同时，也介导宿主对病毒的免疫应答，是体液免疫和细胞免疫的标靶。[7]最近的研究表明，HSV-1感染可以激活小鼠体内RIP3依赖性的程序性坏死，这种激活坏死的途径是不依赖于TNFR，TLR3和DAI，同时也可以诱导RIP3/MLKL[8,9]信号途径介导的坏死。ICP6直接与RIP3和RIP1发生交互作用，ICP6对RIP1的亲和力远高于RIP3，使得ICP6-RIP1-RIP3的形成比ICP6-RIP3-RIP3快。在人源细胞[10]中，ICP6可以通过RHIM结构域来抑制TNF诱导的细胞凋亡。HSV-1在鼠源细胞中的繁殖效率低于在人源细胞中。ICP6在鼠源细胞中可以诱导细胞凋亡，但是在人源细胞中却不行，这可能与两者RHIM结构域的差异有关。疱疹病毒的免疫逃避随着宿主获得性免疫的变化而不断变化，它是病毒的古老功能。为了逃避细胞免疫和体液免疫，单纯疱疹病毒已经进化出了多种免疫逃避机制。了解机体对HSV的先天性和获得性免疫应答，对HSV的预防和治疗有重要帮助。目前，我们对HSV的免疫反应的理解还十分有限，并不足以解决临床和基础学科问题。有关人类逆转录病毒和肿瘤免疫学的研究产生了许多新的技术和实验方法，这对我们研究HSV的免疫提供了便利和帮助。全球范围内，约90％的人感染过单纯疱疹病毒。HSV-1的感染更加普遍，在美国有65％的人被发现存在HSV-1的抗体。目前临床主要使用阿昔洛韦、更昔洛韦等作为单纯疱疹病毒感染的一线用药，它们是腺苷类似物，可以作为底物与脱氧腺苷竞争性结合DNA聚合酶，使病毒的DNA链停止延长，从而抑制了病毒的复制效率。但是对此类药物耐药的菌株越来越多，并且它们也会产生一些严重的副作用，如神经毒性及肾毒性。因此我们必须寻找新的抗病毒药物来帮助人们抵抗病毒的威胁。我们筛选了Sigma公司的一些小分子化合物文库，发现了一种可以抑制HSV-1引起的细胞坏死的小分子化合物米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride），并且对细胞的生长没有明显毒性。我们初步研究了它的抗病毒活性及抗病毒机制，希望对之后临床治疗药物的开发和改造提供一些参考。2 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探材料与方法材料与方法一、材料1.病毒和细胞系非洲绿猴肾细胞（Vero）和小鼠成纤维肉瘤细胞（L929）来自ATCC。HSV-1在Vero细胞中扩增获得。2.主要试剂1)三（羟甲基）氨基甲烷(Tris-Hcl)购自Amerso公司2)29:1甲叉双丙：丙烯酰胺购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司3)ProteinLadder购自Fermentas公司4)磷酸盐缓冲液购自Sigma公司5)LipofectamineRNAiMAXReagent购自invitrogen公司6)焦油紫购自Sigma公司7)胎牛血清购自GIBCO公司8)蛋白酶抑制剂购自Roche公司9)甘氨酸购自Amerso公司10)氯化钾购自国药集团化学试剂有限公司11)Na2HPO4购自Sigma公司12)D-葡萄糖购自Sigma公司13)HEPES购自Sigma公司14)TritonX-100购自Sigma公司15)CellTiter-Glo试剂盒购自Promega公司16)β-glycerol-phosphate购自Sigma公司17)L-谷氨酰胺购自GIBCO公司18)20%SDS(十二烷基磺酸钠)购自Sigma公司19)z-VAD购自Bachem公司20)2-巯基乙醇购自Sigma公司3 材料与方法小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探21)免疫组化试剂盒购自基因科技（上海）有限公司22)TEMED购自Sigma公司23)RevertAidFirstStandSynthesisKit购自Thermo公司24)甲醇购自国药集团化学试剂有限公司25)QuickStartBradford1xDyeReagent购自Bio-Red公司26)甘油购自Sigma公司27)二甲亚砜（DMSO）购自Sigma公司28)DMEM培养基购自Thermo公司29)胰酶购自GIBCO公司30)TRIZOLReagent购自lifetechnologies公司31)苯甲基磺酰氟购自Sigma公司32)过硫酸铵购自Sigma公司33)氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司34)氯化钙购自Sigma公司3.主要仪器1)4度离心机购自Thermo公司2)NC膜购自Millipore公司3)倒置显微镜购自OLYMPUS公司4)精密pH计购自DENVER公司5)TS-8S摇床购自Qilinbeier公司6)低速离心机购自中科创新股份有限公司7)0.22µm滤膜购自Millipore公司8)PCR仪购自Thermo公司9)-80度冰箱购自Thermo公司10)-30度冰箱购自Thmermo公司11)二氧化碳恒温培养购自Thmermo公司12)洗片机（MedicalX-rayProcessor102）购自KODAK公司13)6孔细胞培养板购自Thermo公司4 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探材料与方法14)96孔细胞培养板购自Thermo公司15)10cm细胞培养板购自Thermo公司16)电转膜槽购自天能公司17)电子天平购自SHIMADZU公司18)垂直电泳槽购自天能公司19)恒温水浴锅购自精宏公司20)医用X射线胶片（X-OMAT）购自KODAK公司21)生物安全柜购自Thermo公司22)流式细胞分选仪（FACSAriaIII）购自BD公司23)凝胶成像仪购自伯乐公司24)Nanodrop2000购自Thermo公司25)核酸蛋白分析仪购自Becman公司26)漩涡震荡仪购自与海门市其林贝尔仪器有限公司4.主要抗体及细胞因子1)Anti-GBantibody购自Abcam公司2)Anti-β-actinantibody购自Sigma公司3)Anti-mouseCYLDantibody（437700）购自CellSignaling公司4)Anti-mouseMLKLantibody自王晓东实验室5)Anti-ICP27antibody购自Abcam公司6)辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体购自Sigma公司7)辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠抗体购自Sigma公司8)Anti-flagantibody购自Sigma公司9)Anti-p-IκBαantibody购自CellSignaling公司10)抗HSV-1ICP6多克隆抗体利用ICP6N端15个氨基酸的多肽制备11)IFN-β购自PBL公司12)MBP购自Sigma公司5 材料与方法小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探二．方法1.主要试剂的配置1）磷酸盐缓冲液（1XPBS）PBS粉末购于Sigma公司，用时将其溶解于超纯水中，然后混合均匀制备成为1XPBS液体，过滤后通过高温高压灭菌，4度保存备用。2）10XSDS-PAGE电泳缓冲液SDS10gTRIS30.3g甘氨酸144.1g按重量依次称取相应药品后，加去离子水溶解后将其定容为1L，室温避光保存。使用前加去离子水稀释成1XSDS-PAGE电泳缓冲液后使用。3）10X转膜缓冲液Tris38g甘氨酸180g按重量依次称取相应药品后，加去离子水溶解后将其定容为1L，室温避光保存。使用前加去离子水稀释成1X转膜缓冲液后使用。4）1X转膜缓冲液10X转膜缓冲液100ml无水甲醇200ml加去离子水定容至1L。5）1XPBST缓冲液在10XPBS缓冲液中加入Tween，使其终浓度为10%，即为10XPBST。使用前加去离子水稀释为1XPBST。6）4XSDS-PAGE上样缓冲液1MTris(PH=6.5)20mlGlycerol40ml20%SDS(Sigma)40ml2%溴酚蓝（乙醇溶解）1ml按体积依次量取相应药品，混合均匀，分装至每管1mL体积，使用前加入200μLβ-6 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探材料与方法巯基乙醇，100度或沸水浴加热5至10分钟，使蛋白充分变性。7）细胞裂解液Tris-Hcl（PH8.0）20mM20mlNacl150mM30ml1%TritonX-10010ml1%甘油100mlDTT0.5mM1mlNa3VO41mM1mlβ-glycerol-phosphate5.4g按体积依次量取相应药品后，加去离子水充分溶解，定容至1L，分装至每管1mL体积，4度保存备用。8）抗体稀释液称取一定量的脱脂牛奶粉末，用PBST稀释至5%的浓度。9）3%结晶紫称取3g结晶紫颗粒，用70%酒精溶解，定容至100ml。室温保存。10）DMEM完全培养基在DMEM培养基中加入胎牛血清，配置为含10%血清的DMEM，并依次加入一定终浓度的青霉素（160U/mL），链霉素（160μg/mL）和谷氨酰胺200（μM），4度储存备用。11）10XHBS缓冲液（100mL）NaCl8gD-glucose1gKCl0.37gHEPES5gNa2HPO4250.8g按重量依次称取相应药品，加去离子水溶解后定容至100mL，4度储存备用。12）2XHBS缓冲液(20mL)15mL去离子水中加入4ml的10XHBS，充分混合，使用1MNaOH调节PH至7.05-7.10之间，加去离子水定容至20mL，在超净台中用0.22μM的滤膜过滤，4度储存。7 材料与方法小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探13）2.5MCaCl2的配置称取3.67gCaCl2，在超净台中通过0.22μM的滤膜过滤后，4度储存备用。14）小分子化合物的溶解用微量电子天平称取一定质量的小分子化合物固体粉末，用DMSO溶解为所需浓度。15）BMDM培养基的配置15cm的细胞培养皿中铺入成纤维细胞L929，使细胞的密度为1*103个/ml，每皿加入10%FBS的DMEM培养基30-40mL。7-10天后收集培养基上清，将上清通过0.22µm的滤器过滤，-20度保存。2.主要试验方法1）细胞总RNA的提取、反转录总RNA的提取：去除培养皿中的培养基，加入1mLTrizol裂解细胞，室温放置5分钟；加氯仿（三氯甲烷）200μL，加盖后剧烈摇晃20秒，室温静置3分钟；然后，4度离心，10000RPM，15分钟；离心后看见分成三层，将上层水层移至另一干净的EP管，加0.5mL异丙醇上下颠倒混合，室温静置10分钟；4度离心，10000RPM，10分钟；弃上清，用75%的酒精洗涤沉淀；4度，7500RPM，离心5分钟；弃上清，空气中干燥，后加20μLDEPC水溶解；LDEPC水调零，通过Nanodrop2000测定RNA浓度和纯度。RNA的OD260/OD280值在1.8-2.0之间视为纯度较高，若比值偏低说明杂质较多，可能有残留的蛋白质。2）反转录：按RNA反转试剂盒使用说明5×PrimeScriptBuffer2μLPrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μLOligodTPrimer0.5μLRandom6mers0.5μL上述体系加入总RNA5μg，补RNaseFreeddH2O至10μL。于37度水浴中加热15分钟，之后于85度水浴加热5秒以终止反应。8 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探材料与方法3）TNF-α重组蛋白的制备纯化将TNF-α基因添加入pET-28a表达载体上，添加的方法为分子克隆法。将200ng重组质粒与商品化BL21感受态混合均匀，并且放置在冰上30分钟。将感受态放入42度水浴锅一分钟，然后放入冰上两分钟。将感受态加入到LB培养基中，培养基的体积为500μL，在37度摇床中摇1小时。取出涂板，在37度培养箱过夜培养。第二天，挑取平板上的单克隆，加到LB培养基中，培养基体积为3mL，在摇床中过夜。第三天在上述培养基中取液1-2.5mL新的LB培养基，培养基体积为100ml，在37度培养箱过夜培养，以此扩菌。第四天，将上述培养基加入至新的LB培养基，使其比例为1:100，在37度摇床中摇1小时。之后开始测其OD值（wavelength=600nm），每15分钟测一次，大约测8次后，当其OD值达到0.6-0.8之间时，加入0.3mMIPTG，摇床中室温（25度）摇4小时。摇菌后，4000RMP离心十五分钟，加入30mLbufferA。以40%强度，20sOFF，15sON超声条件，超声12分钟。取部分悬液检测沉淀和上清中蛋白的表达情况，将余下的液体，12000g，4度，离心3分钟。离心后取上清。与此同时，用20mLbufferA漂洗GST-Beads3次。取上清与Beads孵育过夜。孵育过夜后，将上清通过柱子过滤，此时蛋白应该全部结合在Beads上了，再使用bufferA液体漂洗Beads三遍。用Elutionbuffer与Beads孵育2h后，取出Elution，加入预先在PBS中泡过夜的透析袋内，这样可以去除洗脱液中的Glutathione。次日，取出Elution，测浓度，并用0.22μm滤器过滤后，分装储存于-80度冰箱，待用。4）荧光病毒拍照将带有GFP标签的HSV-1（MOI=2）加入待感染的宿主细胞，6到8小时后，使用荧光显微镜观察、拍照、分析。5）细胞存活率检测9 材料与方法小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探本研究使用Promega公司的Celltiterglo试剂盒来检测细胞存活率，该试剂盒的原理是通过检测细胞内ATP水平从而反映细胞存活率。使用时，加20μL该试剂加入96孔板中，摇床上摇晃5分钟，随后静置10分钟，用多功能酶标仪检测化学发光（Luminescence）来指示细胞存活率。6）免疫荧光实验将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的24孔板中；待细胞接近长成单层后取出盖玻片，用PBS漂洗三次，加4%多聚甲醛固定细胞，室温静置10分钟，之后再用PBS漂洗三遍；加入0.1%的Ttiton-100进行通透处理，室温静置10分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；加入3%BSA封闭一小时，用PBS漂洗3遍，每次5分钟；4度过夜孵育一抗(稀释比例1：1000)；次日PBS漂洗3遍后加入荧光二抗(稀释比例1：500)，室温避光孵育1.5小时；PBS漂洗三遍，每次5分钟，加DAPI(稀释比例1：2000)，室温静置10分钟，滴加封片剂一滴，封片；使用共聚焦显微镜观察、拍摄图片。7）HSV-1病毒扩增将vero细胞种于10cm皿中，待细胞贴壁并长到80%-90%后，换为2ml培养基，并将HSV-1病毒液（MOI=2）加入培养皿中，每隔15分钟摇晃混合培养皿，摇晃8次，置于培养箱中培养，看到明显的CPE后，刮板刮下细胞，收集细胞和培养基的混合物，-80度冰箱冷冻收集到的混合物，之后取出室温解冻，反复冻融三次破坏细胞壁使病毒释放，2000rmp离心5分钟，取上清，分装备用。8）细胞及组织中病毒滴度的检测将HSV-1（MOI=2）加入待感染的宿主细胞，6到8小时后，刮板刮下细胞，收集细胞和培养基的混合物，-80度冰箱冷冻收集到的混合物，之后取出室温解冻，反复冻融三次破坏细胞壁使病毒释放，2000rmp离心5分钟，取上清，分装至EP管。提前一天在96孔板铺Vero细胞，密度次日能达到90%为宜，一般8000/孔；用含2%FBS的DMEM培养基对收集的病毒上清进行倍比稀释并且混合均匀；弃去准备好的96孔板中的培养基，每孔加入100微升病毒稀释液，十字交叉法10 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探材料与方法混匀，放入37度培养箱中培养36-48小时；3%结晶紫染色，显微镜下对病毒噬斑进行计数，数出不同稀释浓度的病毒噬斑数，将病毒噬斑数除以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。9）统计学分析每次实验重复三次以上，以T-test分析对照组与实验组的差异性。本实验中细胞存活率都以数据平均水平+标准偏差表示。11 正文小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探实验结果1.抗HSV-1的小分子化合物的筛选单纯疱疹病毒是人类常见的一种传染病。单纯疱疹病毒1型主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，主要引起颜面疱疹、疱疹性角膜炎和单纯疱疹病毒性脑炎等多种疾病，可形成永久性角膜浑浊甚至失明，严重病例甚至导致死亡；单纯疱疹病毒2型主要感染腰部以下粘膜，引起生殖器发炎和疱疹，常发于癌症或其他慢性病应[11]用各种免疫抑制剂的病人中。目前，临床主要使用阿昔洛韦、更昔洛韦等药物进行[12]治疗，但是其耐药性近年来不断增多。我们筛选了从Sigma公司购买的小分子化合物文库，发现米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）具有较好的抗HSV作用（图1A），并且对细胞没有明显的毒性（图1B）。我们通过实验进一步检测了MD的半数抑制浓度IC50为0.86μM（图1C）。ABC图1抗HSV-1的小分子化合物的筛选12 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探正文(A)米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）化学结构式。(B)用不同浓度的MD预处理L929细胞一个小时，后添加Ⅰ型疱疹病毒（HSV-1）感染（MOI=2）16小时。通过ATP来检测细胞生存率。(C)用不同浓度的MD预处理L929细胞一个小时，后添加PBS或Ⅰ型疱疹病毒（HSV-1）感染（MOI=2）16小时。通过ATP来检测细胞生存率。（若无特殊说明，本文中HSV-1添加量均为MOI＝2）2.在鼠源细胞中，米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）对HSV-1的抑制作用2.1MD影响了HSV-1的复制和蛋白表达我们使用了带GFP标签的HSV-1病毒株感染预处理的细胞8小时后，通过观察病毒的荧光强度来直观的反映病毒复制水平。我们可以看到，经过MD预处理的细胞几乎观察不到病毒荧光，而病毒可以在DMSO预处理的细胞中大量复制（图2A）。[13]ICP6是病毒核糖体大亚基蛋白，GB是病毒的胞膜糖蛋白，介导病毒包膜与细胞膜[14]融合、病毒穿入和胞间扩散,引发病毒循环复制过程。所以我们可以通过免疫印迹实验检测ICP6和GB的蛋白表达水平，来指示病毒的复制水平。我们可以看见，MD抑制了病毒蛋白ICP6、GB的表达，且浓度越高，抑制效果越强（图2B）。因此，我们可以得出结论，MD可以抑制HSV-1的复制和蛋白表达。2.2MD抑制了病毒的滴度病毒感染宿主细胞后，由于介质的限制，释放的病毒只能通过最初感染的细胞向四周扩散蔓延。通过多个病毒复制增殖周期，便形成一个局限性细胞病变区域，此即病毒蚀斑。为了进一步研究MD对HSV-1的抑制作用，我们用DMSO和MD分别预处理细胞，然后感染HSV-1病毒，6小时后收集细胞及其上清，通过反复冻融使病毒[15]颗粒释放，通过噬斑形成实验计数病毒噬斑个数，从而比较两组中病毒滴度的差异。结果显示，MD预处理后的病毒滴度明显降低（图2C）。2.3在病毒入侵细胞后，MD仍有抗病毒作用病毒首先吸附细胞并侵入细胞内部，然后利用细胞内的原料合成自身复制所需要[6]的物质，将病毒DNA转运到细胞核中复制，最后裂解细胞，释放病毒。以上任何一个过程被阻断，都会影响病毒的复制。MD的抗病毒作用是否仅仅是阻断了病毒侵13 正文小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探入细胞的过程？病毒侵入细胞后，MD的抗病毒效应还能发挥作用吗？我们将MD在病毒感染前或者病毒感染后加入L929细胞，24小时后，通过ATP来检测细胞生存率。我们发现，在受病毒感染4小时后，MD仍有一定的抗病毒作用（图2E）。为了进一步探索MD的抗病毒机制，我们先用HSV-1感染L929细胞，当病毒浸入宿主细胞后（约1-2小时），我们将含有病毒的培养基更换为含有DMSO或MD的正常培养基，约6小时后通过免疫印迹实验检测细胞裂解液中ICP6和GB的蛋白表达水平，我们可以看见，MD仍然可以抑制病毒蛋白ICP6、GB的表达，随着病毒感染时间的增加，DMSO组的病毒蛋白含量会持续增高，但MD组中仍几乎检测不到病毒蛋白（图2D）。这些结果表明，在HSV-1侵入细胞后，MD仍具有抗病毒作用。ABC14 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探正文DE图2在鼠源细胞中，MD对HSV-1的抑制作用（A）将相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，分别用DMSO及MD预处理细胞一个小时，然后分别将带GFP标签的HSV-1病毒感染宿主细胞8小时，使用倒置荧光显微镜观察。（B）将相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，分别用DMSO及不同浓度的MD预处理细胞一个小时，将HSV-1病毒加入宿主细胞，感染6小时，通过细胞裂解液裂解细胞从而提取蛋白，通过特异性抗体，使用蛋白免疫印迹检测GB及ICP6蛋白的含量，从而分析病毒蛋白表达水平。（C）相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，分别用DMSO及MD预处理细胞一个小时，加入HSV-1病毒，感染宿主细胞6小时后，收集细胞上清及细胞，反复冻融3次使病毒颗粒释放，收集上清，梯度稀释后感染Vero细胞，3%结晶紫染色，显微镜下对病毒噬斑进行计数。（D）相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，加入HSV-1病毒，感染宿主细胞1小时，去除含有病毒的培养基，PBS洗一遍，分别换成含有DMSO或MD的普通培养基，再培养6小时。通过细胞裂解液裂解细胞从而提取蛋白，通过特异性抗体，使用蛋白免疫印迹检测GB及ICP6蛋白的含量，从而分析病毒蛋白表达水平。（E）在病毒感染前或者病毒感染细胞后加入MD，24小时后，通过ATP来检测细胞生存率。3.在人源细胞中，米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）对HSV-1的抑制作用3.1MD对HSV-1的抗病毒作用[16]人类是HSV-1的天然宿主，我们使用癌细胞株HeLa来检测MD在人源细胞中的抗病毒作用。将带GFP标签的HSV-1病毒株感染预处理的细胞8小时后，观察到经过MD预处理的细胞几乎观察不到病毒荧光，而病毒可以在DMSO预处理的细胞中大量复制（图3A）。同时通过免疫印迹实验检测ICP6和GB的蛋白表达水平，15 正文小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探可以看见，MD抑制了病毒蛋白ICP6、GB的表达，且浓度越高，抑制效果越强（图3B），随着感染时间的延长，DMSO组的病毒蛋白含量会持续增高，但MD组中仍几乎检测不到病毒蛋白（图3D）。此外，我们用DMSO和MD分别预处理细胞，然后加入HSV-1病毒感染宿主细胞，6小时后收集细胞及其上清通过反复冻融使病毒释放，收集上清，梯度稀释感染Vero细胞，3%结晶紫染色，显微镜下对病毒噬斑进行计数，计算出每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)，从而比较两组中病毒滴度的差异。结果显示，MD预处理后的病毒低度明显降低（图3C）。3.2在病毒入侵细胞后，MD仍有抗病毒作用在上述的试验中我们发现，在鼠源细胞中，在病毒入侵细胞后，MD仍有抗病毒作用。那么，在人源细胞中，是否也同样如此呢？我们先用HSV-1感染HeLa细胞，当病毒浸入宿主细胞后（约1-2小时），我们将含有病毒的培养基更换为含有DMSO或MD的正常培养基，约6小时后通过免疫印迹实验检测细胞裂解液中ICP6和GB的蛋白表达水平，我们可以看见，MD仍然可以抑制病毒蛋白ICP6、GB的表达，随着病毒感染时间的增加，DMSO组的病毒蛋白含量较对照组明显增加，但MD组中仍几乎检测不到病毒蛋白（图3F）。我们也检测了病毒侵入细胞后MD对病毒低度的影响。先用HSV-1感染HeLa细胞，当病毒浸入宿主细胞后（约1-2小时），我们将含有病毒的培养基更换为含有DMSO或MD的正常培养基，6小时后收集细胞及其上清通过反复冻融使病毒释放，收集上清，梯度稀释感染Vero细胞，3%结晶紫染色，显微镜下对病毒噬斑进行计数，计算出每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)，从而比较两组中病毒滴度的差异。结果显示，MD组的病毒低度明显降低（图3E）。这些结果表明，在HSV-1侵入细胞后，MD仍具有抗病毒作用。这与在鼠源细胞中的结果是一致的。16 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探正文ABCPFU/mL)5Plaguetiter(x10HeLaDE15***1050DMSOMD17 正文小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探F图3在人源细胞中，MD对HSV-1的抑制作用（A）将相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，分别用DMSO及MD预处理细胞一个小时，然后分别加入带GFP标签的HSV-1病毒，感染宿主细胞8小时，使用倒置荧光显微镜观察细胞感染情况。（B）将相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，分别用DMSO及不同浓度的MD预处理细胞一个小时，加入HSV-1病毒，感染宿主细胞6小时，通过细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，再通过特异性抗体，使用蛋白免疫印迹方法检测GB及ICP6蛋白的含量，从而分析病毒蛋白表达水平。（C）相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，分别用DMSO及MD预处理细胞一个小时，加入HSV-1病毒，感染宿主细胞6小时后，收集细胞上清及细胞，反复冻融3次使病毒颗粒释放，收集上清，梯度稀释感染Vero细胞，3%结晶紫染色，显微镜下对病毒噬斑进行计数。（D）将相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，用DMSO或MD预处理细胞一个小时，加入HSV-1病毒，感染宿主细胞6或8小时，通过细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，再通过特异性抗体，使用蛋白免疫印迹方法检测GB及ICP6蛋白的含量，从而分析病毒蛋白表达水平。（E）相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，加入HSV-1病毒，感染宿主细胞1或2小时，去除含有病毒的培养基，PBS洗一遍，分别换成含有DMSO或MD的普通培养基，再培养6小时，收集细胞上清及细胞，反复冻融3次使病毒颗粒释放，收集上清，梯度稀释感染Vero细胞，3%结晶紫染色，显微镜下对病毒噬斑进行计数。（F）相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，加入HSV-1病毒，感染宿主细胞1小时，去除含有病毒的培养基，PBS洗一遍，分别换成含有DMSO或MD的普通培养基，再培养6小时。通过细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，再通过特异性抗体，使用蛋白免疫印迹方法检测GB及ICP6蛋白的含量，从而分析病毒蛋白表达水平。18 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探正文4.米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）对HSV-1的抑制作用的机制4.1MD对NF-κB信号的活化没有影响前面的数据可以说明MD可以抑制HSV-1在人源细胞和鼠源细胞中的复制。那么，MD是通过何种机制抑制HVS-1的复制的呢？我们需要通过实验进一步分析。[17]NF-κB信号的活化对HSV-1在宿主细胞中的复制非常重要，MD是否是影响了NF-κB信号的活化从而抑制了HSV-1的复制？HSV-1的感染可以诱导NF-κB信号的活化，当细胞受到刺激时IκBα发生磷酸化，NF-κB被释放进而入核，结合启动子原[18]件并诱导病毒复制及包装所需的相关基因转录。为了验证MD是否是影响了NF-κB信号的活化，我们使用MD及DMSO分别预处理HeLa细胞，之后将TNF-α加入预处理的细胞从而激活NF-κB信号的活化，用细胞裂解液裂解细胞提取蛋白，通过蛋白免疫印迹检测磷酸化的IκBα，从而反应MD对NF-κB信号的活化的影响。我们可以看见，在DMSO预处理的细胞中，TNF-α激活IκBα的磷酸化，同样的，TNF-α也激活了MD预处理细胞中IκBα的磷酸化，且两组中磷酸化的IκBα的表达量基本相同（图4A）。这说明MD对NF-κB信号的活化没有影响。为了更直观的表明上述结论，我们使用了免疫荧光的方法来观察NF-κB的亚基P65在活化过程中的入核现象。和前面一样，我们将TNF-α加入用MD及DMSO分别预处理HeLa细胞，然后使用荧光抗体标记相应抗原。我们发现，在MD及DMSO处理的细胞中，P65都进入了细胞核（图4G）。进一步验证了MD对NF-κB信号的活化没有影响。这些结果表明，MD并非通过影响了NF-κB信号的活化从而抑制了HSV-1的复制。4.2MD对ERK、Akt信号的活化没有影响[19]细胞中存在许多中信号通路，其中ERK、Akt信号通路参与了细胞因子的产生。MD对NF-κB信号的活化并没有影响，那么，它是否是影响了NF-κB信号的活化从而抑制了HSV-1的复制呢？我们使用MD及DMSO分别预处理HeLa细胞，之后将EGF加入预处理的细胞从而激活ERK、Akt信号通路，用细胞裂解液裂解细胞提取蛋白，通过蛋白免疫印迹检测磷酸化的ERK、Akt，从而反应MD对ERK、Akt信号的活化的影响。我们可以看见，在MD及DMSO处理的细胞中，ERK或者Akt都发生了磷酸化，且表达量基本相同（图4C、B）。这说明MD对ERK、Akt信号的活化19 正文小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探没有影响。4.3MD抑制了病毒早期基因的表达我们已经发现MD对NF-κB、ERK、Akt信号的活化没有影响，并且可以抑制病毒的蛋白，那么，MD能否在转录水平抑制病毒基因的表达呢？我们使用MD及DMSO分别预处理细胞，之后将HSV-1加入预处理的细胞，从细胞中提取总RNA，再逆转录为cDNA，通过定量PCR的方法检测病毒基因的表达。我们发现，病毒早期基因（ICP0,ICP22,ICP27,ICP47）被明显抑制（图4D），同时，病毒复制相关基因（UL5,UL8,UL9,UL42,UL52）也被抑制（图4E），也可抑制晚期基因ICP6、GB（图4F）。这些结果表明，MD能在转录水平抑制病毒基因的表达。ABCD20 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探正文EFG图4米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）对HSV-1的抑制作用的机制（A）将相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，用DMSO或MD预处理细胞一个小时，加入TNF-α，使其浓度为100ng/ml，室温15分钟，通过细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，再通过特异性抗体，使用蛋白免疫印迹方法检测磷酸化的IκBα蛋白的表达水平。（B、C）将相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，用DMSO或MD预处理细胞一个小时，加入EGF，使其浓度为150ng/ml，室温15分钟，通过细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，再通过特异性抗体，使用蛋白免疫印迹方法检测磷酸化的ERK（C）、Akt（B）蛋白的表达水平。（D、E、F）将相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，用DMSO或MD预处理细胞一个小时，然后再感染HSV-1病毒4小时后，提取细胞内mRNA并进一步反转相应的cDNA。通过定量PCR的方法检测病毒早期基因（D）、复制相关基因（E）、晚期基因的表达（F）。21 正文小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探（G）将相同数量的细胞铺在6孔板上，待细胞贴壁后，用DMSO或MD预处理细胞一个小时，加入TNF-α，使其浓度为100ng/ml，室温15分钟，通过免疫荧光方法，用绿色荧光标签的抗体染P65蛋白，DAPI染细胞核，通过荧光共聚焦显微镜观察拍摄。22 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探讨论讨论单纯疱疹病毒I型(HerpesSimplexVirustype1，HSV-1)属疱疹病毒科α亚科。它的基因组为双链线性DNA，共编码70个各异的蛋白质，完整病毒由核心、衣壳、被[20]膜及囊膜组成。病毒表面脂质双层膜中含有负责病毒感染和进入宿主细胞的的糖蛋白。病毒首先吸附并进入宿主细胞，病毒DNA自身环化并进行复制，将形成的单拷贝基因组装填人预先装配好的前衣壳空壳内形成核衣壳，之后核衣壳获得蛋白质被膜[21]和脂质包膜，成长为成熟病毒颗粒。单纯疱疹病毒1型主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，可导致疱疹、传染性单核细胞增多症、围产期感染、脑炎等多种疾病，甚至引发肿瘤。全球范围内，约90％的人感染过单纯疱疹病毒。HSV-1的感[22]染更加普遍，在美国有65％的人被发现存在HSV-1的抗体。目前临床主要使用阿昔洛韦、更昔洛韦等作为单纯疱疹病毒感染的一线用药，它们是腺苷类似物，可以作为底物与脱氧腺苷竞争性结合DNA聚合酶，使病毒的DNA链停止延长，从而抑制[23]了病毒的复制效率。但是对此类药物耐药的菌株越来越多，并且它们也会产生一些[24]严重的副作用，如神经毒性及肾毒性。因此我们必须寻找新的抗病毒药物来帮助人们抵抗病毒的威胁。HSV感染可以诱发强烈的先天性免疫应答。宿主对HSV的免疫包括非特异性免疫，如巨噬细胞和天然杀伤细胞；和特异性免疫，如体液免疫和细胞免疫。动物研究表明，巨噬细胞、干扰素和天然杀伤细胞对限制HSV的初发感染非常重要，而体液免疫和细胞免疫在控制病毒的复发方面非常重要。感染HSV后，宿主首先一过性出现IgM抗体,随后产生IgG和IgA抗体，它们持续存在。在感染后二至六周，中和抗体和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）抗体出现，并在宿主的一生中持续存在。然后，依次出现针对糖蛋白gB，gC，gD，gE，gG1，gG2和ICP4的抗体。宿主对病毒特异性多肽抗体并不能防止HSV复发。原发性或复发性HSV的组织病理学特征反映了病毒介导的细胞死亡和相关的炎症反应。病毒感染引起细胞膨胀，核变性，常发生在上皮细胞中。细胞丢失完整的质膜并形成多核巨细胞。随着细胞裂解，表皮和真皮层之间出现含有大量病毒的透明液体（称为囊泡）。囊泡液含有细胞碎片，炎症细胞，通常是多核巨细胞。疤痕很少见。23 讨论小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探当涉及粘膜时，囊泡被浅层溃疡所取代。我们筛选了Sigma公司的一些小分子化合物文库，发现了一种可以抑制HSV-1引起的细胞坏死的小分子化合物米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride），并且对细胞的生长没有明显毒性（图1B）。MD对病毒的抑制呈现浓度依赖性（图1B），在人源及鼠源细胞中，可以抑制病毒蛋白的表达（图2B、图3B）及病毒低度（图2C、图3C）。通过对被带绿色荧光标签病毒感染的细胞的观察，我们可以直观的感受到MD对病毒的抑制作用（图2A、图3A）。无论是先感染病毒后使用MD处理（图3F）还是先经过MD预处理在感染病毒（图3B），MD对病毒均有抑制作用。这说明即使在病毒进入宿主细胞后，MD仍对病毒有抑制效果。NF-κB的激活导致细胞因子和生长因子的合成。在人源细胞和小鼠细胞中，NF-κB的激活需要活化的PKR。该蛋白质驻留在细胞中并被干扰素和双链RNA激活。活化的PKR可以磷酸化翻译起始因子2的α亚基（eIF-2α）。eIF-2α-P会抑制蛋白质合成。活化的PKR可被视为对感染的初始反应，病毒已经发展出许多不同的策略来阻止其激活。实际上，HSV-1晚期基因：US11，其在早期表达时阻断PKR的活化。HSV已经形成了完整的机制来处理PKR。哺乳类动物细胞中，与ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径，ERKs不仅可以磷酸化胞浆蛋白，而且可以磷酸化一些核内的转录因子如c-fos、c-Jun、Elk-1、c-myc和ATF2等，从而参与细胞增殖与分化的调控。另外，ERK还可以磷酸化ERKs通路的上游蛋白如NGF受体、SOS、Raf-1、MEK等，进而对该通路进行自身的负反馈调节。还有研究发现，ERKs可磷酸化胞浆内的细胞骨架成份，如微管相关蛋白MAP-1、MAP-2和MAP-4，参与细胞形态的调节及细胞骨架的重分布。活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞的功能。AKT通过下游多种途径对靶蛋白进行磷酸化而发挥抗凋亡作用。ATK激活IkB激酶(IKKα)，导致NF-κB的抑制剂IκB的降解，从而使NF-κB从细胞质中释放出来进行核转位，激活其靶基因而促进细胞的存活。此外，AKT能抑制蛋白水解酶caspase-9的活性而阻止凋亡级联反应的激活。HSV-1的感染可以诱导NF-κB信号的活化，ERK、Akt信号通路参与了细胞因子的产生，我们研究了MD对这些信号通路的影响，发现MD并不能影响这些信号通路的活化（图4A、B、C）。在感染的初始阶段，病毒通过它们的末端进入感觉神经元，通过逆转录将病毒基24 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探讨论因组转移到支配感染皮肤的感觉神经节中的神经元核。病毒在神经元中复制。在这个阶段，病毒无法被检测到，然而，基因组仍然潜伏于神经元中，它们可以周期性地重新激活恢复复制并产生感染性病毒。这种重新激活事件可能是“自发的”，但通常被认为是由于神经元或感染神经节所支配的区域的应激刺激引起的。潜伏期的维持阶段，HSV基因组在静止状态下可以终生保留。MD抑制病毒蛋白的表达（图2B、图3B），但是对上述信号通路却没有影响，那么，它是通过何种途径抑制病毒的呢？MD是一种DNA拓扑异构酶II抑制剂，广[25,26]泛用于治疗各种癌症，如急性骨髓性白血病和非霍奇金淋巴瘤。因此，我们假设MD是通过抑制了病毒的基因从而抑制了病毒。我们检测了病毒的早期基因（ICP0,ICP22,ICP27,ICP47），发现它们能被MD抑制（图4D），同时，病毒复制相关基因（UL5,UL8,UL9,UL42,UL52）也被抑制（图4E），对晚期基因（ICP6、GB）也有抑[27]制效果（图4F）。ICP4可以诱导HSV基因的转录，其功能依赖于与DNA的特异[28]性位点的结合。MD可以抑制病毒的复制，但是我们通过荧光定量PCR检测发现，MD不能抑制ICP4基因的表达，我们认为它可能干扰了ICP4与DNA的特异性位点的结合过程。总之，MD可以抑制病毒对宿主细胞的感染，同时也抑制了病毒基因的表达，但是对NF-κB、ERK、Akt信号通路并没有影响。通过上述研究，我们可以得出结论，MD在体外可以有效的抑制病毒感染并且具有光明的成药前景。HSV感染的免疫生物学机制非常复杂。细胞免疫和体液免疫在对HSV感染的免疫应答中都很重要，但是不断的进化为病毒提供了逃避宿主免疫系统的手段，既保持潜伏期又允许间歇性再激活疾病。病毒的逃避机制限制了被动抗体免疫治疗在HSV感染的治疗中的疗效。病毒的感染是个非常复杂的过程，包括吸附、穿入、生物合成、组装、成熟及释放等多个步骤，影响它复制循环的任一环节，都有可能对另一环节产生影响。我们仅选择了其中的部分环节进行研究，对其他环节的影响有待进一步实验。影响病毒复制的信号通路也有许多，我们也仅对其中一些进行了探讨。MD可能是抑制DNA拓扑异构酶II从而对病毒的繁殖产生抑制，但是这个观点需要进一步的实验证实。总之，MD在体外可以有效的抑制病毒感染并且具有光明的成药前景，但是其作用机制作需要更多的实验加以探索。25 小结小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探小结我们筛选了1000多个小分子化合物，发现了一种可以抑制HSV-1引起的细胞坏死的小分子化合物米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride），并且对细胞的生长没有明显毒性。通过实验我们发现，MD在体外可以有效的抑制病毒感染并且具有光明的成药前景，但是其作用机制作需要更多的实验加以探索。1.抗HSV-1的小分子化合物的筛选单纯疱疹病毒是人类常见的一种传染病。目前临床主要使用阿昔洛韦、更昔洛韦等作为单纯疱疹病毒感染的一线用药。但是对此类药物耐药的菌株越来越多。我们筛选了Sigma公司的一些小分子化合物文库，发现了一种可以抑制HSV-1引起的细胞坏死的小分子化合物米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride），并且对细胞的生长没有明显毒性。我们进一步检测了MD的半数抑制浓度IC50为0.86μM2.在鼠源细胞中，米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）对HSV-1的抑制作用MD抑制了病毒蛋白ICP6、GB的表达，且浓度越高，抑制效果越强。因此，我们可以得出结论，MD可以抑制HSV-1的复制和蛋白表达。病毒感染宿主细胞后，由于介质的限制，释放的病毒只能通过最初感染的细胞向四周扩散蔓延。通过多个病毒复制增殖周期，便形成一个局限性细胞病变区域，这就称为病毒蚀斑。结果显示，MD预处理后的病毒低度明显降低。我们将MD在病毒感染前或者病毒感染后加入L929细胞，24小时后，通过ATP来检测细胞生存率。我们发现，在受病毒感染4小时后，MD仍有一定的抗病毒作用。这些结果表明，在HSV-1侵入细胞后，MD仍具有抗病毒作用。3.在人源细胞中，米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）对HSV-1的抑制作用人类是HSV-1的天然宿主，我们使用癌细胞株HeLa来检测MD在人源细胞中的抗病毒作用。将带GFP标签的HSV-1病毒株感染预处理的细胞8小时后，观察到经过MD预处理的细胞几乎观察不到病毒荧光。MD也抑制了病毒蛋白ICP6、GB的表达，且浓度越高，抑制效果越强，同时，MD也能使病毒滴度明显降低。在HSV-126 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探小结侵入细胞后，MD依然可以抑制病毒蛋白、降低病毒滴度，仍具有抗病毒作用。这与在鼠源细胞中的结果是一致的。4.米托蒽醌二盐酸盐（mitoxantronedihydrochloride）对HSV-1的抑制作用的机制HSV-1的感染可以诱导NF-κB信号的活化，ERK、Akt信号通路参与了细胞因子的产生，我们研究了MD对这些信号通路的影响，发现MD并不能影响这些信号通路的活化。通过定量PCR的方法检测病毒基因的表达。我们发现，病毒早期基因（ICP0,ICP22,ICP27,ICP47）被明显抑制，同时，病毒复制相关基因（UL5,UL8,UL9,UL42,UL52）也被抑制，也可抑制晚期基因ICP6、GB。这些结果表明，MD能在转录水平抑制病毒基因的表达。27 参考文献小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探参考文献1.Eizuru,Y.,Developmentofnewantiviralsforherpesviruses.AntiviralChemistry&Chemotherapy,2003.14(6):p.299-308.2.闻玉梅,医学分子病毒学及其应用.1995:上海医科大学出版社.3.黄文林,分子病毒学.2006.4.Rebora,A.,Life-threateningcutaneousviraldiseases.ClinicsinDermatology,2005.23(2):p.157-163.5.金奇,医学分子病毒学.2001:科学出版社.6.Mettenleiter,T.C.,Buddingeventsinherpesvirusmorphogenesis.VirusResearch,2004.106(2):p.167-180.7.HuangZ,WuSQ,LiangY,etal.RIP1/RIP3bindingtoHSV-1ICP6initiatesnecroptosistorestrictviruspropagationinmice[J].CellHost&Microbe,2015,17(2):229-242.8.Guo,H.,etal.,Herpessimplexvirussuppressesnecroptosisinhumancells.CellHost&Microbe,2015.17(2):p.243-251.9.Huang,etal.,RIP1/RIP3bindingtoHSV-1ICP6initiatesnecroptosistorestrictviruspropagationinmice.CellHost&Microbe,2015.17(2):p.229.10.Wang,X.,etal.,DirectactivationofRIP3/MLKL-dependentnecrosisbyherpessimplexvirus1(HSV-1)proteinICP6triggershostantiviraldefense.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2014.111(43):p.15438-43.11.WhitleyRJ,R.B.,Herpessimplexvirusinfections.Vol.357(9267)2001,lancet.1513-1518.12.Frobert,E.,etal.,Genotypicdetectionofacyclovir-resistantHSV-1:Characterizationof67ACV-sensitiveand14ACV-resistantviruses.AntiviralResearch,2008.79(1):p.28-36.13.Guo,H.,etal.,HerpesSimplexVirusSuppressesNecroptosisinHumanCells.CellHost&Microbe,2015.17(2):p.243-251.14.黄涛严华,单纯疱疹病毒包膜糖蛋白的结构及功能研究.微生物学免疫学进展,2009(3):p.59-62.28 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探参考文献15.Spear,P.G.B.Roizman,Proteinsspecifiedbyherpessimplexvirus.V.Purificationandstructuralproteinsoftheherpesvirion.JournalofVirology,1972.9(1):p.143-59.16.Torres,L.,T.OrtizQ.Tang,EnhancementofHerpesSimplexVirus(HSV)InfectionbySeminalPlasmaandSemenAmyloidsImplicatesaNewTargetforthePreventionofHSVInfection.Viruses,2015.7(4):p.2057-73.17.Morton,E.R.J.A.Blaho,HerpessimplexvirusblocksFas-mediatedapoptosisindependentofviralactivationofNF-kappaBinhumanepithelialHEp-2cells.JournalofInterferon&CytokineResearch,2007.27(5):p.365-76.18.Hayden,M.S.,SignalingtoNF-kappaB.Genes&Development,2004.18(18):p.2195.19.Hao,Z.,etal.,DistincteffectsofknockingdownMEK1andMEK2onreplicationofherpessimplexvirustype2.VirusResearch,2010.150(150):p.22-7.20.Wagner,E.K.,Thereplicationofherpesviruses.AmericanScientist,1974.62(5):p.548.21.Bataille,D.A.L.Epstein,Herpessimplexvirustype1replicationandrecombination.Biochimie,1995.77(10):p.787-795.22.Xu,F.,etal.,Seroprevalenceandcoinfectionwithherpessimplexvirustype1andtype2intheUnitedStates,1988-1994.JournalofInfectiousDiseases,2002.185(8):p.1019-1024.23.Englund,J.A.,etal.,HerpesSimplexVirusResistanttoAcyclovir:AStudyinaTertiaryCareCenter.AnnalsofInternalMedicine,1990.112(6):p.416-22.24.Revankar,S.G.D.M.Markovitz,Deliriumassociatedwithacyclovirtreatmentinapatientwithrenalfailure.ClinicalInfectiousDiseases,1995.21(2):p.435-6.25.Shenkenberg,T.D.D.D.V.Hoff,Mitoxantrone:ANewAnticancerDrugwithSignificantClinicalActivity.AnnalsofInternalMedicine,1986.105(1):p.67-81.26.Marsoni,S.,etal.,Clinicaldrugdevelopment:ananalysisofphaseIItrials,1970-1985.CancerTreatmentReports,1987.71(1):p.71-80.27.Watson,R.J.J.B.Clements,Characterizationoftranscription-deficienttemperature-sensitivemutantsofherpessimplexvirustype1.Virology,1978.91(2):p.364-79.28.Purifoy,D.J.K.L.Powell,DNA-bindingproteinsinducedbyherpessimplexvirustype2inHEp-2cells.JournalofVirology,1976.19(2):p.717-31.29 综述小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探综述：单纯疱疹病毒的研究进展及展望摘要：本文综合阐述了单纯疱疹病毒所引起的疾病及流行病学现状，分析了病毒的感染和病理生理方面的研究，抗病毒治疗及疫苗开发方面的进展，对单纯疱疹病毒的治疗和未来的研究方向作出了展望。关键词：单纯疱疹病毒；病理生理；感染；抗病毒疱疹病毒科(Herpesviridae)是线状双链DNA病毒，它含有包膜，自然界中普遍存在，目前约有100种已被发现或鉴定。用过病毒的理化性质、生物学特性的不同，疱疹病毒被分成α、β、γ三个亚科。此外，还有大量病毒未进行分类。单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirus，HSV)属于α疱疹病毒亚科，病毒感染可以导致多种临床表现，HSV-1常导致颜面疱疹、疱疹性角膜炎和单纯疱疹病毒性脑炎等多种疾病，以及中枢神经系统的感染，部分也可感染外生殖器；HSV-2常导致外生殖器疱疹，部分也可造成口腔感染，更易见于免疫力低下者，如新生儿及孕妇。HSV可以造成妊娠妇女流产，甚至导致胎儿先天畸形和智力低下，新生儿常通过产道感染HSV-2，其中约40%～60%感染后出现高热、呼吸困难和中枢神经系统病变，60%～70%严重患儿甚至死亡，后遗症率可达到95%。HSV进入人体的途径主要为呼吸道(主要鼻咽部)、口腔、眼、生殖器粘膜以及破损皮肤，人群普遍易感，在人群中的感染率超过90%，其中很大一部分病毒在体内为潜伏状态，不表现出明显的临床症状，可维持数年以致终生。单纯疱疹病毒的形态及基因结构：病毒核心、蛋白质衣壳、内膜和包膜由内到外构成病毒颗粒，病毒中心有一段大小约152kb的线性双链DNA基因组。长、短两个单一序列(Uniquesequences)共同组成HSV-1基因组，这两个基因组共含有75个ORF。82%的基因信息位于长单一序列(Uniquelongsequences，UL)，这些信息编码58个基因；约18%的基因信息存在于短单一序列(Uniqueshortsequences，US)，这些信息编[1]码l3基因。HSV-1潜伏－再激活过程：HSV感染的免疫生物学机制非常复杂。细胞免疫和体液免疫在对HSV感染的免疫应答中都很重要，但是不断的进化为病毒提供了逃避宿主免疫系统的手段，既保持潜伏期又允许间歇性再激活疾病。感染HSV后，HSV可在感染者中持续存在，这与其逃避宿主防御的机制有关，HSV逃避宿主免疫的方30 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探综述式如下：①HSV不需进入细胞外环境而可直接在细胞间传播；②HSV通过在神经节细胞内进行潜伏，可逃避巨噬细胞、自然杀伤细胞及干扰素的杀伤作用等宿主的自然防御。潜伏相关转录体(latencyassociatedtranscript,LATs)家族包括主要LATs和非主[2,要LAT。LAT具有使HSV潜伏建立、维持和激活等多种作用。LA具有抗凋亡功能3][4,5]。最近的研究发现LAT通过编码microRNA执行抗细胞凋亡功能。HSV-1的复制机制：病毒首先借助脂质包膜上的糖蛋白吸附并进入宿主细胞，其次，通过连接酶将线性基因组的两个黏性末端粘合，从而使病毒DNA自身环化并进行复制，将形成的单拷贝基因组装填人预先装配好的前衣壳空壳内形成核衣壳，蛋白[6]质被膜和脂质包膜将核衣壳包裹，从而形成成熟病毒颗粒。末端酶一般由大、小两个亚基组成，又称组装蛋白(Packagingprotein)，小亚基(Terminasesmallsubunit)的作用主要是稳定和增强大亚基活性，两个亚基共同作用促进dsDNA病毒的组装过程。目前有研究发现当人巨细胞病毒末端酶小亚基UL89存[7]在时，其大亚基UL56的ATP酶活性可提高30%。单纯疱疹病毒包膜糖蛋白：包膜糖蛋白是抗原决定簇，位于病毒颗粒表面，是有包膜病毒表面脂质双层膜的重要组成成分。目前，有12个单纯疱疹病毒包膜糖蛋白已被发现或鉴定，其中大部分具有重要功能。gG包膜蛋白常被作为型特异性的首选，[8]由于它能诱发B细胞发生特异性免疫反应。有文献报道，gH促进病毒与细胞融合[9]。病毒感染至少需要四种糖蛋白：D（gD）、B（gB）、H（gH）和L（gL）的协同作用。这四种蛋白不仅在病毒进入细胞的过程中发挥重要作用，同时，也介导宿主对[10,11]病毒的免疫应答，是体液免疫和细胞免疫的标靶。单纯疱疹病毒与疾病：HSV感染由于宿主的年龄和免疫力不同，产生多种不同的临床表现。大多数表现为潜伏感染，没有明显的临床表现。它们常由于压力、劳累和免疫力低下等因素被激活。原发性和复发性HSV感染都可以导致皮肤损伤。皮肤损伤之前通常有前驱症状，例如发烧和感觉异常、淋巴结肿大、肌肉酸痛、食欲不振和头痛。三叉神经痛与单纯疱疹病毒感染：原发性三叉神经痛(primarytrigeminalneuralgia,PTN)目前仍没有明确的病因，其发病机制也不十分清楚，近来许多研究提示它可能与单纯疱疹病毒(HSV)的潜伏有关。在感染的初始阶段，病毒通过它们的末端进入感觉神经元，通过逆转录将病毒基因组转移到支配感染皮肤的感觉神经节中的神经元31 综述小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探核。病毒在神经元中复制。在这个阶段，病毒无法被检测到，然而，基因组仍然潜伏于神经元中，它们可以周期性地重新激活恢复复制并产生感染性病毒。这种重新激活事件可能是“自发的”，但通常被认为是由于神经元或感染神经节所支配的区域的应激刺激引起的。潜伏期的维持阶段，HSV基因组在静止状态下可以终生保留。当机体免疫力下降，HSV可以再次被激活，导致神经系统的慢性炎症，神经节是神经元的膨大部分，它可以成为嗜神经病毒潜伏感染的场所，同时也是病毒再激活和复制的[12]物质基础。Ecker等认为，PTN是一种离子通道病，它的病因为感受伤害刺激的有[13]髓神经元受到了HSV的潜伏感染。Ferrante等发现，在初次感染HSV-1后，其中70%患者的外周神经节可以发现病毒感染，这表明在三叉神经根区粘连的蛛网膜内可以存在HSV-l的潜伏。脑梗死与单纯疱疹病毒感染：国外有研究阐述了HSV感染在动脉粥样硬化及冠心病（ceonaryarterydesease,HCD）发病中的作用，CHD患者血清HSV-1IgG抗体水[14][15]平高于正常人，在人的AS斑块内发现完整的HSV-1、HSV-2。粥样斑块是脑梗的一个重要病因，有研究表明，HSV感染脑梗死组与正常对照组比较有明显的差异[16]性。心房颤动与单纯疱疹病毒感染：最近的研究表明，HSV感染与房颤的发生相关[17]。可能的机制有（1）系统性炎症反应：HSV进入人体后由于各种逃避机制，通常[18]不能被免疫细胞特异性清除，常在神经细胞中潜伏从而导致慢性持续性感染。（2）心肌局部炎性浸润：有研究发现，孤立性房颤患者的心肌常发生细胞坏死、裂解，活[19]检可见心肌细胞周围出现单核细胞和淋巴细胞主的炎性细胞浸润。这一改变与[20]HSV感染性心肌炎的病理改变相符。妊娠与单纯疱疹病毒感染：单纯疱疹病毒感染较易感染处于免疫抑制状态妊娠妇[21]女。妊娠期妇女常处于内分泌紊乱、免疫力低下的状态，这时孕前潜伏在其他部位的HSV病毒被激活，胎儿被经生殖道黏膜或随血液循环进入胎盘的病毒感染。新生儿出生后由于HSV感染严重者可能因呼吸窘迫、休克、弥散性血管内凝血障碍（DIC）或脑炎死亡，存活儿也可能导致智力障碍、视觉及运动缺陷等后遗症。孕妇早期、中期HSV病毒对胎儿的损害程度远大于晚期。受感染的新生儿病毒感染三周后出现HSV特异性的IgM抗体，其浓度在两到三个月内迅速增加，部分新生儿在感染后一年仍能检测到。在大多数新生儿感染中，IgG抗体在三到四周后可以被检测到。受感32 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探综述染的新生儿体内绝大数为病毒表面糖蛋白gB和gD的特异性抗体，其在新生儿的免疫中起重要作用。研究表明，预防新生儿疱疹有赖于妊娠晚期孕妇HSV的防治。单纯疱疹病毒的治疗：疱疹病毒的免疫逃避随着宿主获得性免疫的变化而不断变化，它是病毒的古老功能。为了逃避细胞免疫和体液免疫，单纯疱疹病毒已经进化出了多种免疫逃避机制。了解机体对HSV的先天性和获得性免疫应答，对HSV的预防和治疗有重要帮助。目前，我们对HSV的免疫反映的理解还十分有限，并不足以解决临床和基础学科问题。有关人类逆转录病毒和肿瘤免疫学的研究产生了许多新的技术和实验方法，这对我们研究HSV的免疫提供了便利和帮助。目前临床主要使用阿昔洛韦、更昔洛韦等核苷类似物作为单纯疱疹病毒感染的一线用药，但是对此类药物耐药的菌株越来越多，并且它们也会产生一些严重的副作用，如神经毒性及肾毒性。已有的核苷药物不能完全满足临床需求。近年来发现多种天然[22]药物如多糖、皂苷等也具有抗单纯疱疹的作用。传统的中医组方药的抗HSV效果显著，具有广阔的前景。HSV感染可以诱发强烈的先天性免疫应答。宿主对HSV的免疫包括非特异性免疫，如巨噬细胞和天然杀伤细胞；和特异性免疫，如体液免疫和细胞免疫。动物研究表明，巨噬细胞、干扰素和天然杀伤细胞对限制HSV的初发感染非常重要，而体液免疫和细胞免疫在控制病毒的复发方面非常重要。感染HSV后，宿主首先一过性出现IgM抗体,随后产生IgG和IgA抗体，它们持续存在。在感染后二至六周，中和抗体和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）抗体出现，并在宿主的一生中持续存在。然后，依次出现针对糖蛋白gB，gC，gD，gE，gG1，gG2和ICP-4的抗体。宿主对病毒特异性多肽抗体并不能防止HSV复发。最近20年，对HSV-致病机制、HSV基因及蛋白功能、宿主免疫反应均进行了深入研究，为预防性及治疗性疫苗的研发提供了理论基础。按疫苗组分及作用机制的不同，HSV疫苗可分为灭活全病毒疫苗、减毒活疫苗、复制缺陷疫苗、亚单位疫苗、多肽疫苗、活载体疫苗和DNA疫苗；按疫苗预期目的又可分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗的目标是在未感染人群中预防的感染，而治疗性疫苗的目标是减轻已感染人群的病症严重程度及防止HSV相关疾病的复发。糖蛋白亚单位疫苗是研究最为成熟的HSV-2疫苗形式，已被证明具有较[23]高的安全性，并可激发高水平的中和抗体水平。33 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探参考文献[1]BATAILLED,EPSTEINAL.Herpessimplexvirustype1replicationandrecombination[J].Biochimie,1995,77(10):787-95.[2]INMANM,PERNGGC,HENDERSONG,etal.RegionofHerpesSimplexVirusType1Latency-AssociatedTranscriptSufficientforWild-TypeSpontaneousReactivationPromotesCellSurvivalinTissueCulture[J].JournalofVirology,2001,75(8):3636-46.[3]AHMEDM,LOCKM,MILLERCG,etal.Regionsoftheherpessimplexvirustype1latency-associatedtranscriptthatprotectcellsfromapoptosisinvitroandprotectneuronalcellsinvivo[J].JournalofVirology,2002,76(2):717-29.[4]IGORJURAKMFK,JOSEPHC.MELLOR,ALISONL.VANLINT,FREDERICKP.ROTH,DAVIDM.KNIPE,DONALDM.COEN.NumerousConservedandDivergentMicroRNAsExpressedbyHerpesSimplexViruses1and2[J].JournalofVirology,2010,84(9):4659-72.[5]AMENMA,GRIFFITHSA.IdentificationandexpressionanalysisofherpesBvirus-encodedsmallRNAs[J].JournalofVirology,2011,85(14):7296-311.[6]YUXK,O'CONNORCM,ATANASOVI,etal.Three-DimensionalStructuresoftheA,B,andCCapsidsofRhesusMonkeyRhadinovirus:InsightsintoGammaherpesvirusCapsidAssembly,Maturation,andDNAPackaging[J].Journalofvirology,2003,77(24):13182-93.[7]HWANGJS,BOGNERE.ATPaseactivityoftheterminasesubunitpUL56ofhumancytomegalovirus[J].JournalofBiologicalChemistry,2002,277(277):6943-8.[8]STRICKL,WALDA.Type-specifictestingforherpessimplexvirus[J].ExpertReviewofMolecularDiagnostics,2004,4(4):443-53.[9]GIANNIT,MENOTTIL,CAMPADELLI-FIUMEG.Aheptadrepeatinherpessimplexvirus1gH,locateddownstreamofthealpha-helixwithattributesofafusionpeptide,iscriticalforvirusentryandfusion[J].JournalofVirology,2005,79(11):7042.[10]ReskeA,PollaraG,KrummenacherC,etal.UnderstandingHSV-1entryglycoproteins.[J].ReviewsinMedicalVirology,2007,17(3):205-215.[11]GIANNIT,PICCOLIA,BERTUCCIC,etal.Heptadrepeat2inherpessimplexvirus1gHinteractswithheptadrepeat1andiscriticalforvirusentryandfusion[J].34 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探JournalofVirology,2006,80(5):2216-24.[12]STEINERI,BENNINGERF.Updateonherpesvirusinfectionsofthenervoussystem[J].CurrentNeurologyandNeuroscienceReports,2013,13(12):1-7.[13]ECKERAD,ECKERAD.Thecauseoftrigeminalneuralgia[J].MedicalHypotheses,2004,62(6):1023.[14]LEINONENM,SAIKKUP.Evidenceforinfectiousagentsincardiovasculardiseaseandatherosclerosis[J].LancetInfectiousDiseases,2002,2(1):11-7.[15]ELLISRW.Infectionandcoronaryheartdisease[J].JournalofMedicalMicrobiology,1997,46(7):535-9.[16]杨兰,王晓鹏,陈俊敏,etal.人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒感染与脑梗死[J].脑与神经疾病杂志,2016,24(5):301-4.[17]李景业,刘少伟,李新,etal.单纯疱疹病毒感染与心房颤动的相关性研究[J].中国介入心脏病学杂志,2016,24(5):261-5.[18]SCHIFFERJT,MAYERBT,FONGY,etal.Herpessimplexvirus-2transmissionprobabilityestimatesbasedonquantityofviralshedding[J].JournaloftheRoyalSocietyInterface,2014,11(95):20140160.[19]FRUSTACIA,CHIMENTIC,BELLOCCIF,etal.Histologicalsubstrateofatrialbiopsiesinpatientswithloneatrialfibrillation[J].Circulation,1997,96(4):1180-4.[20]KOGAM,FUJIWARAM,ARIGAS,etal.CD8+T-LymphocytesInfiltratetheMyocardiuminFulminantHerpesVirusMyocarditis[J].FetalandPediatricPathology,2001,20(3):189.[21]董彦亮.妊娠期单纯疱疹病毒感染与不良妊娠结局[J].中国实用妇科与产科杂志,2011,27(8):572-6.[22]张全书,邱勇,谢燕妮,etal.天然药物治疗单纯疱疹病毒的研究进展[J].湖北民族学院学报:医学版,2016,33(4):78-81.[23]刘莉,于爱莲.单纯疱疹病毒2型疫苗的研究进展[J].泰山医学院学报,2009,30(10):804-8.35 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探攻读学位期间公开发表论文1.黄强,唐梅峰,陈都,徐峰.血栓弹力图联合格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分对脑外伤患者预后的预测价值[J].中华急诊医学杂志,2017,26(4):458-460.2.HouJ,ZhangZ,QiangH,etal.AntiviralactivityofPHA767491againsthumanherpessimplexvirusinvitroandinvivo[J].BmcInfectiousDiseases,2017,17(1):217.3.黄强,陈雄辉,唐梅峰,徐峰.脑外伤后亚低温治疗的研究进展.南通大学学报医学版（已接收）.36 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探缩略词表缩略词表英文缩写英文全称中文全称TTNF-α肿瘤坏死因子DDMSO二甲基亚砜PBSPhosphaticbufferedsolution磷酸盐缓冲液FBSFetalbovineserum胎牛血清IFN-βInterferon-β干扰素-βSDSSodiumdodecylsulphate十二烷基磺酸钠BSABullSerumAlbumin牛血清白蛋白APSImmunoprecipitation过硫酸铵NF-κBNuclearfactor-κB核因子-κBPCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应MDmitoxantronedihydrochloride米托蒽醌二盐酸盐HSVHerpesSimplexVirus单纯疱疹病毒GBGlycoproteinB胞膜糖蛋白BLATslatencyassociatedtranscript潜伏相关转录体PTNprimarytrigeminalneuralgia原发性三叉神经痛HCDceonaryarterydesease冠状动脉粥样硬化性心脏病37 致谢小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探致谢光阴荏苒，三年的研究生活即将结束，三年的学习生活使我受益匪浅，既感受到了临床分秒必争的工作状态，使自己的医学基础知识和临床实践活动相结合；也体会到了科研的魅力和艰辛，掌握了基本的实验操作和方法。经历大半年时间，毕业论文终于完稿，回首大半年来收集、整理、思索、停滞、修改直至最终完成的过程，我得到了许多的关怀和帮助，现在要向他们表达我最诚挚的谢意。首先，我要深深感谢我的导师徐峰主任。我深深的感受到了徐峰主任渊博的专业知识、出色的临床技能、严谨的科研态度、脚踏实地的工作作风。他为人谦和，平易近人，对待病人耐心细致。能成为他的学生是我莫大的荣幸！临床工作中，从最初的叩开医学之门到现在对常见病的熟练诊治，都离不开恩师的悉心培养。在他孜孜不倦的教导下，我的专业水平有了一定的提高。在论文的选题、搜集资料和写作阶段，都倾注了极大的关怀和鼓励。同时徐主任在生活上给予我无微不至的关怀，使我的学业得以顺利完成。同时，感谢苏州大学唐仲英血研所何苏丹教授在我课题进行中对我的帮助，何老师干练的实验操作，渊博的专业知识，敏锐的分析能力，都令我钦佩。在她的指导下让我可以少走弯路顺利完成实验。她严谨的治学态度以及活跃的科研思维将永远是我日后科研之路上的榜样。研究生的培养离不开科室的支持，衷心感谢徐峰主任，感谢急诊外科吴思荣主任、汪智卿主任、丁礼主任、肖接承主任、凌伟华主任、包龙主任、王军主任、孙正杰、韩非、张继刚、杨鹏、陈雄辉、吴昊、张尚武、步涨、代守前、张有斌、王亮等老师对我在临床轮转学习中的带教和帮助，尤其感谢丁礼主任在我临床工作和思维方面给予的指导和启发；感谢急诊内科各位老师；感谢急诊科童本沁、唐兆芳、王玉宇、李小勤、孙思思、张秋芳等护士长老师，以及她们所带领的护士团队。感谢路鑫、于璐、何磊磊、潘赟、郭艳霞、卢香琼、吴彬彬、张大龙、韩玉、唐梅峰、高宇、卢凡、刘伟臣、贾圣洁等师兄姐弟妹在学习工作和生活中给予的真诚帮助。感谢我的父母，是你们支持可以让我毫无顾虑的顺利完成三年的硕士生涯，感谢你们三年来对我的理解，你们的理解是我不断前进的动力和精神支柱。学生生涯即将38 小分子化合物（mitoxantronedihydrochloride）抗人单纯疱疹病毒1型作用及其机制初探致谢结束，我将会用接下来几十年的时间报达你们三十年来对我的恩情，很荣幸能成为你们的儿子，相信在你们的支持下，今后的路会越走越好。最后，我要感谢参与我论文评审和答辩的各位老师，他们给了我一个审视几年来学习成果的机会，让我能够明确今后的发展方向，他们对我的帮助是一笔无价的财富。我将在今后的工作、学习中加倍努力，以期能够取得更多成果回报他们、回报社会。再次感谢他们，祝他们一生幸福、安康！黄强2017年4月20日于苏州大学39 苏州大学硕士学位论文（专业学位）．：．产ＶＪ■－■：苏州大学研究生院统．印制；：Ｍ＾＾