《小麦白粉病菌的越冬温度阈值和早春病害预测及病菌孢子的田间传播研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
密级：论文编号：中国农业科学院学位论文小麦白粉病菌的越冬温度阈值和早春病害预测及病菌孢子的田间传播研究ＰａｔｈｏｇｅｎＯｖｅｒｗｉｎｔｅｒｉｎｇＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＴｈｒｅｓｈｏｌｄａｎｄＥａｒｌｙＳｐｒｉｎｇＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔＰｏｗｄｅｒｙＭｉｌｄｅｗａｎｄｔｈｅＤｉｓｐｅｒｓａｌｏｆＡｅｒｉａｌＣｏｎｉｄｉａｏｆＢｌｕｍｅｒｉａｇｒａｍｉｎｉｓｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉｉｎＷｈｅａｔＦｉｅｌｄｓ博士研究生：刘伟指导教师：周益林研究员申请学位类别：农学博士专业：植物病理学研究方向：植物病害流行与监测培养单位：植物保护研究所研究生院２０１８年６月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文小麦白粉病菌的越冬温度阈值和早春病害预测及病菌孢子的田间传播研究PathogenOverwinteringTemperatureThresholdandEarlySpringPredictionofWheatPowderyMildewandtheDispersalofAerialConidiaofBlumeriagraminisf.sp.triticiinWheatFields博士研究生：刘伟指导教师：周益林研究员申请学位类别：农学博士专业：植物病理学研究方向：植物病害流行与监测培养单位：植物保护研究所研究生院2018年6月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationPathogenOverwinteringTemperatureThresholdandEarlySpringPredictionofWheatPowderyMildewandtheDispersalofAerialConidiaofBlumeriagraminisf.sp.triticiinWheatFieldsPh.D.Candidate：LiuWeiSupervisor：ProfessorZhouYilinMajor：PlantPathologySpecialty:EpidemicandMonitoringofPlantDiseaseJune2018 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研宂所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名；时间Ｉ今关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留：中国农业科、使用学位论文的规定，即，学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阋可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。〕妇研究生签名：表斤时间來月－导师签名：ｖＨ时间？＾月吨 中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表基于潜臺的小麦白粉病早春预测和病菌孢子的田间传财乂Ｉ＿梯模型研宄产论文作者刘伟专业研究方向植物病害流行指导教师周益林培养单位（研究所、中心）植物保护研究所姓名职称单位专业签名硕导口ｊ评博导口＂＂＂ｊ硕导口阋．人硕聂己博导口—？＿＿，刘西莉教授口中国农业大学植物病理学｜马占鸿教授中国农业大学植物病理学ｇｉｔ杨文香教授河北农业大学植物病理学—答中国作物麵理学ｔｏ忠ＳＳ總—￣——＾１－３＿硕导□中国科学院ｉｔ传与发ｍｍｍｘ＼±％＾Ｗ博賊冑生辧研飯＃＼ｒ委娜月涯＝中国农业大学员—中国＝作物鄉硕导口博导□会议记录（秘书）王凤涛论文答辩时间地点０２０１８．５．２４，植物保护研究所国家生物安全中心报告厅 摘要本文对小麦白粉菌低温越冬阈值进行了研究，并采用Real-timePCR技术对不同年度不同小麦生态区田间秋苗叶片中潜伏侵染的白粉菌量进行了定量检测，并对田间病害进行了监测，分析了秋苗田间分子病情指数（MDX）、冬季气象因素与小麦白粉病早春病情指数（DX）间的关系，采用病菌孢子捕捉器对小麦白粉菌孢子的田间传播进行了研究。取得的主要结果如下：本研究首次通过田间试验发现小麦白粉菌可以在北京市延庆永宁镇、张山营镇，河北省万全县、张北县越冬，越冬病情指数与1月下旬平均空气温度或地表温度（最冷旬）、1月（最冷月）月均空气温度或地表温度相关性较好，相关性达到显著水平，且越冬病情指数与地表温度的相关性好于其与空气温度的相关性；建立了空气温度或地表温度的1月下旬平均温度、1月月均温度与越冬病情指数的关系模型，由此计算出小麦白粉菌越冬的最低旬平均空气温度和地表温度阈值分别为-14.6℃和-13.7℃，最低月平均空气温度和地表温度阈值分别为-13.4℃和-12.4℃。北京房山，河南林州、巩义，陕西眉县、岐山县等早春田间自然发病田块内病害的分布型为聚集分布，而河北廊坊人工接菌的田块内2014年病害呈聚集分布，2015年呈随机分布，2建立了小麦白粉病的早春田间调查理论抽样模型：N=(1.47/x+0.60)/D；同时还明确了以上地区秋苗上病菌潜伏侵染量的田间分布型均为聚集分布，并建立了秋苗上病菌潜伏侵染菌2量分子检测的理论抽样模型：N=(1.73/x+0.99)/D。在北京房山，河南林州、巩义，陕西眉县、岐山县等自然发病地区，Real-timePCR检测出的潜育中心与发病中心大部分吻合，在人工接种的河北廊坊地区，感病品种‘京双16’种植区检测出的潜育中心与田间发病中心的吻合度好于中抗品种‘众麦2号’种植区。每个采样地区的田间DX与MDX、1-3月份的平均空气温度均存在显著相关性，由此建立了基于MDX（x）的小麦白粉病早春预测模型：y=686.29x-0.75（R²=0.7336,P=0.0008）,并建立了基于MDX（x1）和1-3月份平均温度（x2）的小麦白粉病早春预测模型：y=713.45x1+0.1767x2-1.64（R²=0.8014,P=0.0176），可以用来预测小麦白粉病早春的发生和流行。2015-2017年连续3年采用定容式孢子捕捉器在水平方向上对距菌源中心不同距离处的孢子进行捕捉，结果发现距菌源中心不同距离处的孢子捕捉量与风向存在正相关性，而且各孢子捕捉量之间存在极显著相关性，随着距离增加，相关系数呈减小趋势；当菌源中心病情指数较低时，孢子传播量较低，当田间病情指数达到17.72时，白粉菌分生孢子即可传播到距菌源中心北侧64m处，但在距菌源中心北侧和东侧20m、40m、60m处的孢子捕捉量之间存在显著差异。距菌源中心北侧0m、2m、4m、8m、16m、32m和64m处各孢子捕捉量值与传播距离存在对数关系，建立了基于孢子捕捉量（y）与传播距离（x）的关系模2型:lny=-0.96ln(x+1)+7.93（R=0.9769,P<0.001），可以用来描述孢子捕捉量与传播距离的关系，为病菌孢子捕捉器在小麦白粉病监测中的应用奠定了基础。小麦白粉病菌越冬温度阈值的确定、田间秋苗潜伏侵染菌源量和早春病害调查抽样技术的建立、早春病害预测预报模型的组建以及田间病菌孢子传播规律的研究，为小麦白粉病的监测、预测预报及其防控提供了依据。III 关键词：小麦白粉菌，越冬，Real-timePCR，预测，孢子捕捉IV AbstractThetemperaturethresholdforover-winterofBlumeriagraminisf.sp.tritici(Bgt)wasstudied,Real-timePCRmethodwasusedtoquantitativelydetectthelatentinfectionlevelofBgtinwheatleaveswhichsampledfromdifferentwheatgrowingareas,andfielddiseasewasmonitored.Therelationshipbetweenmoleculardiseaseindex(MDX),wintermeteorologicalfactorsandearlyspringdiseaseindex(DX)ofwheatpowderymildewwasanalyzed.ThedispersalofconidiaofBgtintheairwasstudiedbyBurkardvolumetricsporesamplers.Themainresultsareasfollows:ThefirsttimefoundBgtcanover-winteratZhangbeiandWanquanCityinHebeiProvince,YongningtownandZhangshanyingtowninBeijing.ThecorrelationbetweendiseaseindexofBgtafteroverwinterandlateJanuaryaveragetemperature(thecoldesttendays)ormonthlyaveragetemperatureofJanuary(thecoldestmonth)ofairtemperatureandsurfacetemperaturewererelativelymuchbetter,thecorrelationbetweensurfacetemperaturewithdiseaseindexwasbetterthanthatbetweenairtemperaturewithdiseaseindex.TherelationshipmodelbetweenlateJanuaryaveragetemperatureormonthlyaveragetemperatureofJanuaryofairtemperatureandsurfacetemperaturewasestablished,thetemperaturethresholdoftendayaveragetemperatureormonthlyaveragetemperatureofairtemperatureandsurfacetemperatureofwheatpowderymildewforover-winterwere-14.6℃and-13.7℃,-13.4℃and-12.4℃,respectively.ThefielddistributionofwheatpowderymildewinnaturalinfectionfieldsinFangshan,Linzhou,Gongyi,MeixianandQishanCitiesinearlyspringwasaggregatedistribution,forartificialinoculationfieldsinLangfangCitywasaggregatedistributionin2014,andrandomdistributionin2015,thefieldsurveysamplingmodelofwheatpowderymildewwasestablished:2N=(1.47/x+0.60)/D;Atthesametime,itwasalsoclarifiedthatthefielddistributionofpathogenlatentinfectionsofautumnwheatseedlingsintheaboveareaswasaggregatedistribution,andsamplingmodelofmoleculardetectionofpathogenlatentinfectionwasestablished:N=2(1.73/x+0.99)/D.ThelatentinfectioncentersoffieldsintheautumndetectedbyReal-timePCRalmostcoincidedwithfielddiseasecentresofnaturalinfectionfieldsinthespring,inartificialinoculationfieldsofLangfangCity,theconsistencyofdiseaseindexcentersandthelatentinfectioncenterswhichdetectedin‘Jingshuang16’plantingfieldwasbetterthanin‘Zhongmai2’plantingfield.TheDXwasextremelysignificantlycorrelatedtoMDXofeachsamplingfieldsinthedifferentregions,andwasalsosignificantlycorrelatedwiththemeanairtemperatureofJanuarytoMarch,earlyspringpredictionmodelofwheatpowderymildewwasconstructedbasedonMDX(x):y=686.29x-0.75(R²=0.7336,P=0.0008),andalsopredictionmodelbasedonMDX(x1)andthemeanairtemperatureofJanuarytoMarch(x2)wasconstructed:y=713.45x1+0.1767x2-1.64(R²=0.8014,P=0.0176),boththetwomodelscanbeusedtopredicttheoccurrenceandepidemicofwheatpowderymildewinearlyspring.ThedispersalofconidiaofBgtintheairwasstudiedbyBurkardvolumetricsporesamplersfrom2015to2017,ThenumberofBgtsporescapturedbyeachsporetrapwaspositivelyV significantlycorrelatedwitheachother,andpositivelycorrelatedwithwinddirection,withthedistanceincreased,thecorrelationcoefficientsshowedadecreasedtrend;thenumberofcapturedsporeswaslowduringtheearlyoccurrencephaseofwheatpowderymildew,however,theBgtsporescouldbecapturedfrom64mawayfromthenorthoreastofthepathogensourcecenterwhenthediseaseindexreached17.72.Inthesamedirection,thereexistedsignificantdifferencesbetweenthenumberofsporeswhichcapturedfrom20m,40mand60mawayfromthepathogensourcecenter.Therewasalogarithmicralationshipbetweenthedispersaldistanceandthesporenumberscapturedfrom0m,2m,4m,8m,16m,32mand64mawayfromnorthofthepathogensourcecenter,therelationshipmodelbasedonthecapturedsporenumbers(y)andthe2dispersaldistance(x)wasestablished:lny=-0.96*ln(x+1)+7.93(R=0.9769,P<0.001),themodelcanbeusedtodescribetherelationshipbetweenthenumberofcapturedsporeswiththedispersaldistance,Itlaidafoundationfortheapplicationofsporetrapperinwheatpowderymildewmonitoring.TheaboveresultsofthedeterminationofoverwinteringtemperaturethresholdofBgt,theestablishmentofsamplingtechniquesofearlyspringdiseaseinvestigationorpathogenlatentinfectionsofautumnwheatseedlings,theestablishmentofearlyspringdiseasepredictionmodel,thedispersalofaerialconidiaofBgtinwheatfields,allprovidedatheorybasisforthemonitoring,predictionandcontrolofwheatpowderymildew.Keywords:Wheatpowderymildew,Overwinter,Real-timePCR,Prediction,SporetrapVI 目录第一章引言................................................................................................................11.1小麦白粉病概述..............................................................................................11.1.1小麦白粉菌的侵染过程........................................................................11.1.2小麦白粉病的危害................................................................................11.1.3小麦白粉病的发生规律........................................................................21.1.4病害田间分布型....................................................................................21.1.5小麦白粉病的预测预报........................................................................31.1.6小麦白粉病的防治................................................................................41.2Real-timePCR技术在植物病害监测和预测中的应用.................................41.2.1Real-timePCR的基本原理...................................................................51.2.2土壤中植物病原菌的Real-timePCR定量检测.................................51.2.3寄主组织内植物病原菌的定量研究....................................................61.2.4空气中植物病菌孢子的定量研究........................................................71.3基于孢子捕捉技术的空气中病原菌孢子浓度和传播距离的监测..............81.3.1玻片捕捉技术........................................................................................81.3.2旋转胶棒捕捉技术和移动式孢子捕捉技术........................................81.3.3定容式孢子捕捉技术............................................................................91.3.4利用孢子捕捉技术监测空气中病原菌孢子浓度................................91.3.5利用孢子捕捉技术监测病菌孢子的传播距离..................................101.3.6风向和风速与孢子释放的关系..........................................................111.4研究内容和拟解决的关键问题....................................................................111.4.1研究内容..............................................................................................111.4.2拟解决的关键问题..............................................................................111.5本研究的目的和意义....................................................................................12第二章小麦白粉病菌越冬温度阈值的研究..........................................................13VII 2.1材料与方法....................................................................................................132.1.1供试材料和仪器..................................................................................132.1.2试验方法..............................................................................................132.1.3数据分析..............................................................................................142.2结果与分析....................................................................................................152.2.1小麦白粉菌越冬后发病情况...............................................................152.2.2小麦白粉菌越冬的空气温度阈值变化..............................................152.2.3小麦白粉菌越冬的地表温度变化......................................................182.2.4小麦白粉菌越冬的温度参数与病情之间的相关关系......................212.2.5小麦白粉菌的越冬温度阈值..............................................................212.3讨论................................................................................................................22第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测..........................................243.1材料与方法....................................................................................................243.1.1试验材料..............................................................................................243.1.2主要试验仪器及设备..........................................................................243.1.3主要生化试剂及配制..........................................................................243.2试验方法........................................................................................................253.2.1小麦白粉菌孢子粉的收集与保存......................................................253.2.2供试材料DNA提取...........................................................................253.2.3DNA浓度的测定.................................................................................263.2.4白粉菌引物Real-timePCR扩增和标准曲线制作...........................273.2.5小麦引物Real-timePCR扩增和标准曲线制作...............................273.2.6田间取样..............................................................................................283.2.7数据分析..............................................................................................293.3结果与分析....................................................................................................293.3.1小麦白粉病早春田间调查的理论抽样模型......................................293.3.2小麦白粉病分子检测的理论抽样模型..............................................30VIII 3.3.3小麦白粉菌和小麦叶片的标准曲线..................................................313.3.4小麦白粉菌潜伏期侵染菌源量和田间病害的分布..........................323.3.5基于MDX的小麦白粉病早春预测..................................................433.3.6基于MDX和气象因素的小麦白粉病早春预测..............................443.4讨论................................................................................................................45第四章小麦白粉菌分生孢子田间传播的定量研究..............................................474.1材料与方法....................................................................................................474.1.1供试材料和仪器..................................................................................474.1.2试验方法..............................................................................................474.1.3数据分析..............................................................................................484.1.4模型的检验..........................................................................................484.2结果与分析....................................................................................................484.2.1距菌源中心不同距离处孢子捕捉量与冠层风的关系......................484.2.2距菌源中心不同距离处孢子捕捉量之间的关系..............................504.2.3小麦白粉病菌源中心病情与距菌源中心不同距离处孢子捕捉量的变化趋势........................................................................................................524.2.4距菌源中心相同方向不同距离处孢子捕捉量之间的比较..............544.2.5小麦白粉菌分生孢子最大单日捕捉量与传播距离的关系..............544.3讨论................................................................................................................56第五章全文结论......................................................................................................585.1小麦白粉菌低温越冬阈值的研究................................................................585.2基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测............................................585.3小麦白粉菌分生孢子田间传播距离的定量研究........................................58参考文献......................................................................................................................59附录..............................................................................................................................69致谢..............................................................................................................................79作者简历......................................................................................................................80IX 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称BgtBlumeriagraminisf.sp.tritici小麦白粉菌DXDiseaseindex病情指数MDXMoleculardiseaseindex分子病情指数WSWindspeed风速WDWinddirection风向X 中国农业科学院博士学位论文第一章引言第一章引言小麦白粉病是由布氏白粉菌小麦专化型Blumeriagraminisf.sp.tritici侵入寄主表皮细胞引起的气传性病害，在世界范围内广泛发生，目前已成为我国20多个省（市）小麦生产上的重要病害之一。20世纪70年代以前小麦白粉病仅在我国西南地区的云、贵、川等省的一些山区发病较重，70年代后期其发生范围和面积不断扩大，已由西南地区迅速扩展到江淮、黄淮和西北等主要小麦产区，直至东北的辽宁、吉林和黑龙江等春麦区。例如，1980年小22麦白粉病全国发生面积为220万hm，1981年为312万hm，1990和1991年全国白粉病大发生，两年发病面积达到1980年和1981年两年发病面积的2.5倍，虽然加大了对该病的防治力度，仍分别损失14.38亿和7.7亿kg（刘万才等，1998），上世纪九十年代前该病害在2我国发生面积每年基本处于600万~900万hm的高水平（刘孝坤，1989）。在国外，在病害发生的一般年份，小麦减产可达5%~10%，严重年份能达到13%~34%（Musaevetal，1993；Leathetal，1989）。1.1小麦白粉病概述1.1.1小麦白粉菌的侵染过程小麦白粉病是由布氏白粉菌小麦专化型Blumeriagraminisf.sp.tritici引起的（何家泌等，1998）。小麦白粉菌的无性态分生孢子（conidiospore）首先随气流落到宿主小麦的表皮细胞上，然后萌发长出初生芽管（primarygermtube）将白粉菌的孢子黏着在宿主植物表皮上，然后初生芽管的末端长出附着胞（appressorium），附着胞的下方长出的侵入栓（penetrationpeg）穿透植物的细胞壁进入表皮细胞，在成功进入表皮细胞以后，白粉菌很快形成吸器（haustorium）以便吸收营养，同时向寄主小麦体外长出菌丝。菌丝上着生分生孢子梗，在分生孢子梗上产生成串的卵圆形的、单胞、无色的分生孢子，分生孢子随气流传播形成新的菌源中心（李洪连等，2001；何家泌等，1998）。1.1.2小麦白粉病的危害小麦白粉菌在小麦的各个生长阶段都可侵染危害，主要侵染小麦叶片，但严重时茎秆和穗等部位也发病。小麦白粉病的发病规律是先在田间出现菌源中心，然后白粉菌通过气流进行传播，由菌源中心随风向向全田扩展。小麦植株的下部叶片先出现孢子堆，随着小麦的生长，上部叶片也逐渐出现孢子堆。小麦白粉菌在侵染寄主的早期阶段不显症，经过一定时间潜伏侵染后，才开始表现出褪绿斑，逐渐从褪绿斑处长出白粉状霉层，霉层中初生薄细丝状的菌丝，菌丝上产生无性的分生孢子。严重时病斑连成片，叶片表面布满白色粉状霉层，霉层厚度可达2mm左右。受病菌侵染后小麦叶片由褪绿变为发黄乃至枯死。在小麦生育后期，白粉状霉层上出现黄褐色至黑褐色的有性态闭囊壳，小麦白粉菌以有性态闭囊壳越夏，进入下一阶段的侵染循环继续侵染危害（何家泌等，1998）。小麦白粉菌侵染小麦植株后，发病严重时会造成病株矮而弱，不抽穗或抽出的穗短而小1 中国农业科学院博士学位论文第一章引言等，对小麦的灌浆也产生较大影响，易造成小麦籽粒形成空粒、瘪粒、甚至腐烂，千粒重随之下降（王晓宇等，2012）。据相关报道，白粉病对小麦造成的产量损失在0～45%之间，因年份、地理位置、栽培条件、气候条件和小麦品种的不同而异（周益林等，1992）。1.1.3小麦白粉病的发生规律小麦白粉菌是一种专性寄生菌，只能在活的寄主组织上生长发育（盛宝钦等，1995）。小麦收获期主要在六月份左右，环境温度一般偏高，而小麦白粉菌的活性受温度的影响较大，在该病害的侵染循环中，小麦白粉菌通过在冷、凉地区的越夏度过不良环境，或者通过小麦病残体上混杂的闭囊壳完成越夏（石鹏皋，1983）。越夏后的初侵染源侵染小麦秋苗后，在合适的环境条件下通过再侵染引起秋苗发病，由于冬季温度较低，小麦白粉菌在温度偏高的地区以分生孢子形态在小麦茎基部或者底部叶片越冬，或者以菌丝体潜伏在寄主组织中越冬（杜秀蓂，1983）。吴明藻等（1984）对小麦白粉菌的越夏进行了调查，在贵州省的东部及南部地区，小麦白粉菌可在海拔高度300~400m的温度较低的地区越夏，在海拔高度为800~1000m的山区也可完成该病菌的越夏。李伯宁（2008）利用地理信息系统和地统计学，以温度为主要气象因子，对我国小麦白粉菌的越夏区域和越冬区域进行了区划，发现云南、贵州、四川、甘肃、陕西、河南和河北等的山区或冷凉地区可完成小麦白粉菌的越夏，同时对小麦白粉菌的越冬界限进行了研究，并对以上地区的越夏越冬区域进行了验证。1.1.4病害田间分布型通过病害的田间分布型可以了解病害的传播规律以及该病害在田间的分布情况，研究病害的田间分布型对于抽样设计、数据转换、损失估计、以及流行规律的认识，都具有重要意义，而且还可以通过分布型看出病原物种群的空间动态，掌握其发生规律，为病情调查提供理论抽样数据，指导病害预测和防治（肖悦岩，1998）。王家和（2003）应用种群空间动态分析原理对蚕豆枯萎病病株的田间分布型进行了研究，确定蚕豆枯萎病病株的田间分布呈聚集分布。同时其对田间调查的取样法进行了研究，初步认为蚕豆枯萎病的田间取样适合采用平行线取样法。彭建强等（1991）对发病末期的大豆花叶病的田间分布型进行了初步研究，研究发现大豆花叶病病株的田间分布型与发病率有关，在发病率低于10%时，病株呈聚集分布，在发病率较高的情况下，病株呈随机分布。柴兆祥等（2004）研究表明，采用Z字型、五点式、对角线和棋盘式4种抽样方法都适合当归线虫病的抽样调查，认为五点取样最方便，除此之外用7种判别指标对当归线虫病的田间分布型进行判断，发现其呈聚集分布。朱建兰等（2006）研究发现红地球萄萄霜霉病病株的田间分布型呈聚集型分布，同时对平行线、“W”字型、“Z”字型等抽样方法进行了比较，结果发现红地球萄萄霜霉病病株的田间取样方法适合采用平行线法。Madden等（1995）研究也发现葡萄霜霉病病株空间分布型为聚集分布。常彭阳等（1992）对姜瘟病的田间分布型进行研究，发现姜瘟病呈聚集分布，当病株率高于75%时，呈均匀分布，但在极少数发病比较严重的田块，病株率在60%左右时，其呈随机分布，对其抽样方法进行了比较分析，研究结果表明平行线法、棋盘式和“Z”字型取样法都比2 中国农业科学院博士学位论文第一章引言较可靠。对取样点大小的研究发现，大豆菌核病（Boland，1988）、生菜菌核病（Marois，1985）的病害发生率均符合负二项分布，且田间病害的发生程度主要取决于接种浓度。Almeida等（1994）对由烟草条纹病毒引起的大豆芽枯病的田间分布进行研究，结果表明，大豆的播种时间对病害的田间分布具有一定的影响，早播田初期病害的田间分布型呈随机分布，后期呈聚集分布；晚播田病株则一直呈随机分布。Sposito等（2007）对巴西柑橘黑斑病空间分布型进行了研究，研究发现受黑斑病病原菌侵染的果树呈点状聚集分布，且分布最大半径范围24.7m。刘逸卿等（1984）、甘国福等（1999）对小麦白粉病的田间分布进行了研究，研究结果表明适当的取样方法应结合病害的田间分布型来确定，发病初期田间分布型趋于聚集分布，发病后期则趋于均匀分布。而小麦灌浆以前是该病发生的早中期，是预测预报的重点时期，也是防治该病害的重点时期。对这一时期的小麦白粉病应该采用“Z”字取样法或其它多点取样法进行田间调查。小麦白粉病为典型的气传病害，病原菌随风传播，受气象和地理条件影响较大，流行因素比较复杂，现在仍凭经验对小麦白粉病进行田间调查取样，准确性较低。因此，研究小麦白粉病的田间分布型可以了解其空间动态，为该病害的预测和防治提供依据。1.1.5小麦白粉病的预测预报要实现植物病害的有效防控，病害的预测预报是防控决策的重要依据（李光博等，1990；曾士迈，1994）。小麦白粉病的发生流行所需要的条件主要包括感病的小麦品种、充足的菌源、适宜的环境等。而适宜的环境主要包括合适的温度、湿度、日照时间、雨水、风等。环境条件的变化直接影响小麦白粉病的初侵染、再侵染、小麦白粉菌的循环及流行速度。小麦白粉病的预测预报模型的建立主要与上述环境因子有关。肖志强等（2008）对我国陇南山区小麦白粉病的流行程度进行了预测预报，发现小麦白粉病的发生流行与降水量和温度有一定的相关关系，建立的模型预测准确性较高。苏祥瑶等（1988）对小麦白粉病的发生流行进行了建模，模型中以温度和湿度为主要影响因子，依据综合生长速率原理构建了大田小麦白粉病发生流行的动态模拟模型。王丽（2012）对我国冬小麦小麦白粉病发生流行与环境因子的关系进行了研究，认为在小麦生长的整个生育期内，总日照时数的减少可以增加病害的发生面积，并提出了小麦白粉病发生流行环境因子等级动态变化预测预警模型。邵振润等（1996）通过研究分析明确了黄淮海小麦白粉病流行区影响病害流行的关键因子是大面积种植小麦品种的感病程度、冬季的平均气温（11月上旬−2月中旬）或越冬菌量、春季的降雨日数（4月上−5月上旬）或日照时数（4月中−5月上旬）、小麦生长后期（5月中下旬）的平均气温，在此基础上，建立了病害流行终期、春季始病期时间、初春病害和春季流行速率的预测模型。Beest等（2008）利用英国1994−2002年气象数据建立经验模型来定性预测病害流行和定量预测病害严重度，对小麦白粉病来说4−6月的温度、湿度和降雨是主要的模型参数。Liu等（2015）连续5年通过对小麦白粉病的时空动态监测研究表明，3-4月份的气象因素与病情指数高度相关。闫小珍等（2010）研究发现3月份的气温和降水量对小麦白粉病的发生有重要影响。在小麦白粉病的预测预报研究方面，也有不少研究者利用对小麦白粉病的预测预报采用数理统计方法（曹克强等，1994；刘万才等，1996）、模糊数学理论（左占民等，2003）、神经网络模型方法（于钊等，2010；蔡煜东1995）、灰色系统理论分析（么奕清等，2000；孙3 中国农业科学院博士学位论文第一章引言立民等，1994；宫锡鸿等,2008）等，可以对小麦白粉病的发生流行程度进行早期、中期、晚期或者短期与长期预测预报。1.1.6小麦白粉病的防治小麦白粉病可对小麦造成比较大的经济损失，对该病的防治主要通过选育抗病品种和使用化学药剂（Wolfe，1984）。目前已正式命名的小麦抗白粉病基因80个（徐晓丹，2017），还有一些临时定名的小麦抗白粉病基因，为实现小麦白粉病抗原多样化奠定了基础。这些抗病基因中，如Pm12、Pm13、Pm18、Pm20、Pm21仍为当前对白粉菌优势生理小种有效且利用较多的抗病基因，但由于小麦白粉菌具有传播范围广、繁殖速度快、变异快、毒性强等特点，且大面积长期种植单一抗病品种极易对病原菌群体造成选择压力，使其相应的优势小种毒性频率上升，导致原有抗病品种丧失抗病性而引起小麦白粉病的大规模暴发，给小麦生产带来巨大损失（陈企村等，2004）。如Pm6、Pm8等基因在我国已基本丧失抗性，而且Pm4a、Pm4b在我国各主要麦区的毒性频率呈快速上升趋势（曹乃倩等，2007；王振花，2017）。因此，现阶段我国还是以化学农药为主结合其他措施作为防治该病害的主要措施。世界上已经有六种不同类型的杀菌剂应用于禾谷类白粉病的防治中，我国用于防治小麦白粉病的药剂中三唑类杀菌剂占总药剂种类的90%以上。由于小麦白粉菌毒性变异较快，且在条件合适的地区10天之内即可产生一代，并可以快速繁殖产生大量孢子，而药剂多为三唑类杀菌剂，这样大面积单一长期使用，有利于抗药性白粉菌株的存活，最终使得白粉菌菌株逐渐产生抗药性。马志强等（1996）早在1996年就发现，山东沿海地区小麦白粉菌菌株开始呈现对三唑酮不同倍数的抗药性，近年来通过监测白粉菌对三唑酮的抗性，结果表明小麦白粉菌抗药性呈上升趋势，平均抗性频率最高可达52.26倍，平均抗性频率最低也达到了16.08倍，均处于中高抗的水平（夏烨等，2005；曹学仁等，2008；杨璐，2013；史倩倩，2014）。因此，在小麦白粉病的防治中，许多研究者已开始选用其他药剂或者与其他药剂混用和交替使用，杨开等（2017）利用86%十三吗啉OL对小麦白粉病进行防治研究，结果发现86%十三吗啉OL有效用量分别为15g、20g时，田间防效分别达到54.50%和53.46%,防效好于20%三唑酮EC50g的防效。刘怀坤等（2016）研究发现25%吡唑醚菌酯悬浮剂每次每公顷有效成分用量为150~225g时，对田间小麦白粉病防效可达80%以上。孙光忠等（2016）利用1%蛇床子素水乳剂研究田间小麦白粉病的防治效果,结果发现该药剂的防效可达80.90%~89.83%。刘2福海等（2017）研究发现用复配药剂40%丙硫·戊唑醇SC每667m用量40~50mL时,田间小麦白粉病的平均防治效果可达94.9%~98.2%。曹远银等（2017）筛选得到了小麦白粉病的生防菌拟诺卡氏菌属TMG-8菌株。近年来复配药剂、生防药剂、生物源药剂以及一些其他非三唑类药剂逐渐用于小麦白粉病的防治研究中，同时利用新的小麦白粉病检测技术，可以对小麦白粉病防治药剂的合理选用和使用提供有效依据。1.2Real-timePCR技术在植物病害监测和预测中的应用Real-timePCR技术是在PCR反应的基础上发展而来的，利用传统的PCR技术不能对4 中国农业科学院博士学位论文第一章引言待测目的基因进行准确定量，而实时荧光定量PCR技术是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量或定性分析。近年来该技术发展迅速并广泛应用于各学科的科学研究和生产实践之中，除在医学检测与诊断、食品安全检测、环境检测、分子生物学研究等方面应用较多之外，也为病害的研究提供了先进的技术支持。用传统植物病害流行学调查方法无法或很难获取病菌的潜伏侵染量，而此技术的发展可以在分子层面对处于潜伏期的病原菌进行定量，进而对病害的发生流行进行早期预测，最终对病害的防治提供依据。1.2.1Real-timePCR的基本原理1996年开发出来的Real-timePCR技术是以荧光共振能量转移原理为基础，完成靶标核酸的定量检测。其原理是在Real-timePCR反应中引入荧光报告基团和荧光淬灭基团，随着PCR反应的进行，扩增的目的基因不断累积，导致荧光信号也等比例增加，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图（吴静等，2007），达到定量测定靶标DNA的目的。定量分析中用到Ct值，C即循环数，t即为荧光阈值，每个模板对应的Ct值与该模板浓度相应的初始量的对数值成线性关系，初始浓度越小，定量得到的Ct值越大。通过对初始浓度的模板DNA按倍数稀释成系列浓度所得的Ct值做一元线性回归，根据回归模型计算检测样品中的DNA含量（周成江等，2007）。虽然常规PCR技术已广泛应用于病害检测研究中，但由于只能检测病原菌的有或无，不能对其准确定量，在植病流行学中的应用受到一定的限制。如Zeng等（2009）根据小麦白粉菌的ITS序列而设计的bgt-F/R特异性引物，在Nested-PCR技术中只能用于检测叶片中是否含有小麦白粉菌及叶片中病原菌的潜伏侵染率；Calderon等（2002）对油菜中的病原菌Leptosphaeriamaculans和Pyrenopezizabrassicae进行了检测；Wang等（2008）对潜伏在小麦叶片中的小麦条锈菌进行了检测，但都没有对叶片中潜伏期的菌量进行定量。而实时荧光定量PCR不仅可以检测是否含有潜伏病原菌，还可以实时监测PCR进程，对靶标基因进行准确定量，并且具有操作简单，灵敏度高，可重复性强，特异性高等优点。可在较大浓度范围内对目的基因片段进行定量分析，并可同时对大量样品进行分析，极大缩短处理时间，节约劳动成本，还可同时获得大量的有用数据。除此以外，Real-timePCR大大降低了因易污染而造成假阳性等结果的缺陷（Bǒhm等，1999；Schena等，2004）。因此，Real-timePCR技术的发明，大大地改变了流行学家的思路和研究视野，目前已在植物病害流行学的定量研究领域中得到了应用。1.2.2土壤中植物病原菌的Real-timePCR定量检测常规的土壤中病原菌定量首先需要大量筛选出土壤中的病原菌，然后进行分离培养，通过对分离得到的土壤病原菌进行形态特征观察，最终根据经验确定目标病原菌的量，这不仅工作量大，而且容易产生操作误差或者因鉴别错误而产生鉴定误差。Real-timePCR可以直接对土壤中含有目标病原菌的DNA进行特异性定量检测，从而检测出土壤中病原菌的含量。5 中国农业科学院博士学位论文第一章引言陈巧云（2011）通过荧光定量PCR方法对土壤样品中的烟草青枯病菌的数量进行了定量研究，同时也对烟草根际微生物的动态变化进行了分析，研究结果可为烟草青枯病菌的生物防治提供理论基础。实时荧光定量PCR技术可以大大提高病原菌的定量效率，Filion等（2003）在2小时内可同时完成对土壤中菜豆腐皮镰孢菌、丛枝菌根真菌的定量工作。Lees等（2002）利用实时荧光定量PCR技术定量检测出了马铃薯和土壤中造成马铃薯溃疡病和黑痣病的立枯丝核菌AG-3的DNA含量。Cullen等（2001）建立了土壤中马铃薯银腐病菌（Helminthosporiumsolani）孢子浓度的Real-timePCR检测技术。实时荧光定量PCR在其他土壤病原菌的定量检测中也得到广泛应用，炭疽病菌（Colletotrichumcoccodes）、粉痂病菌（Spongosporasubterranea）和皮斑病菌（Polyscytalumpustulans）等已有相关报道，而且在黄曲霉（Aspergillusflavus）、寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）等研究上也进行了Real-timePCR检测（Cullen等，2002；vandeGraaf等，2003；Lees等，2009；Luo等，2009）。因此，可以利用Real-timePCR解决传统流行学中较难解决的问题，更好地为病害的预测预报服务。1.2.3寄主组织内植物病原菌的定量研究利用Real-timePCR技术可以直接对寄主组织内病原菌DNA的含量进行定量，从而可以用来准确检测潜伏侵染的病原菌量。Min等（2002）用荧光染料SYBRGreen定量检测了在不同时期侵染的水稻稻瘟病菌的生物量，并且分析了病原菌致病性和寄主抗性的关系。Winton等（2002；2003）通过Real-timePCR技术用两个不同荧光标记的TaqMan探针同时对寄主和病原菌Phaeocryptopusgaeumannii的DNA含量进行定量检测，可以指导该病菌的早期预测。魏琪等（2010）根据马铃薯环腐病菌的16SrRNA的保守序列设计了特异性引物和探针，建立了马铃薯环腐病菌的TaqManReal-timePCR检测体系，实现了马铃薯中环腐病菌的微量（潜伏期）检测。潘阳等（2016）建立与开发了基于Taqman探针的双重荧光定量PCR技术，并同时对处于潜伏侵染阶段的小麦条锈菌DNA和小麦DNA进行了准确定量，用此方法对采自于两个不同地区的田间样本进行了检测，分析数据得到的分子病情指数(MDI)与之后的田间发病程度基本一致。Brouwer等（2003）还利用实时荧光定量PCR技术同时检测Alternariabrassicicola、Erwiniacarotovora、Pseudomonassyringar、Botrytiscinerea、Peronosporaparasitica等5种病原菌，并定量检测在拟南芥中潜伏侵染的这5种病原菌含量的变化动态，可以提前获知这5种病原菌的发生情况（Brouwer等，2003）。闫佳会等（2011）利用Real-timePCR定量检测了小麦条锈菌的潜伏侵染量，结果发现甘肃甘谷和北京上庄等6个试验小区内的分子病情指数和田间调查病情指数存在极显著的相关关系。Sanzani等（2012）在对潜伏侵染的B.cinerea早期检测时发现，荧光定量PCR系统可以检测到人工接种的葡萄果实上潜伏侵染的菌源量最低阈值为单个分生孢子，并且当果实中侵染的B.cinereaDNA浓度达10fg时，即可被检测到。潘娟娟等（2012）建立了小麦条锈菌的荧光定量PCR早期定量测定方法，在小麦上接种条锈菌之后的不同时间进行取样，对小麦叶片组织中的小麦条锈菌进行了定量，研究发现，在接种小麦条锈菌12h后，可在小麦叶片内检测到潜伏侵染的条锈菌，且小麦叶片中潜伏侵染的小麦条锈菌的含量与时间有一定的关系，随时间呈指数增长。王倩等（2016）设计了马铃薯早疫病菌茄链格孢（Alternariasolani）的特异性引物，建立了Real-timePCR检测方法，利用此方法可成功检测出叶片和土壤中潜伏侵染的早疫病菌。朱致翔等6 中国农业科学院博士学位论文第一章引言（2016）根据山核桃干腐病病菌茶麋子葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea的EF1α基因设计了特异性引物，建立了Real-timePCR检测方法用于病原菌潜伏侵染的定量检测。张克瑜等（2017）利用特异性引物和TaqMan探针对玉米叶片中潜伏侵染的多堆柄锈菌进行Real-timePCR检测，建立了基于MDI-AUDPC的病害预测模型。结果与实际病情指数有明显的相关性。Sikdar等（2014）设计了Phacidiopycniswashingtonensis和Sphaeropsispyriputrescens的特异性引物，建立了Real-timePCR方法检测苹果中潜伏侵染的病原菌，在接种后6h即可检测出病原菌。Luo等（2017）建立了Real-timePCR方法定量检测由6种真菌引起的核果和坚果腐烂病的感病水平，发现在16d的潜育期内PCR的检测值存在一定变化，此方法可高效准确地定量检测6种病原菌的潜伏侵染。以上这些研究均表明，利用荧光定量PCR可定量检测潜伏侵染菌源量，从而使病菌的潜伏侵染菌源量作为预报参数成为现实。传统鉴定寄主抗病性主要是通过温室测定和田间病圃测定完成的，但由于受其他病原菌和人为误差的影响，容易造成一定的偏差，而利用Real-timePCR技术可以检测获知目的病原菌的潜伏菌源量，通过潜伏菌源量的多少可以直接判断出寄主抗病性的高低（骆勇，2009；马占鸿，2010）。Gayoso等（2007）应用Real-timePCR检测不同茄科植物辣椒、番茄等寄主中侵染的大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）含量，结果表明，抗病品种中含有的病原菌潜伏侵染量要少于感病品种，且发病严重程度相对较低。Hietala等（2003）利用Real-timePCR对挪威云杉中潜伏侵染的Heterobasidionannosum菌进行了早期检测，结果发现两种不同抗性品种的寄主内病原菌含量存在较大的不同。Real-timePCR技术在植物种子中的病原菌检测方面也有相关的研究报道。McNeil等（2004）利用Real-timePCR对小麦种子内潜伏侵染的网腥黑粉病菌（Tilletiacaries）检测时发现，当每粒种子被一个腥黑穗病菌孢子潜伏侵染时即可通过荧光定量PCR检测到，并建立了单粒种子中小麦网腥黑粉菌孢子数与DNA量的关系模型。1.2.4空气中植物病菌孢子的定量研究对于气传性病害来说，可通过获取田间孢子数量的多少来预测病害未来的发生趋势，目前最常用的方法是孢子捕捉法。传统的方法是将捕捉到的孢子在显微镜下观察计数，此方法费时费力，而且由于全靠人眼判断识别，容易造成孢子识别时引起差异，Real-timePCR技术可以大大降低这些误差。近年来Real-timePCR技术在空气中病菌孢子的数量和浓度监测方面也逐渐开始应用。Luo等（2007）利用Real-timePCR监测到的核果褐腐菌（Moniliniafructicola）孢子浓度与用传统显微计数方法获得的孢子浓度结果相对应，这充分说明了实时荧光定量PCR可以对空气中病原菌进行定量研究。Kaczmarek等（2009）利用Real-timePCR技术对孢子捕捉器捕捉到的油菜黑胫病菌释放的子囊孢子数进行研究，结果与传统的显微计数方法正相关，并且在孢子浓度较低的情况下，实时定量PCR技术准确性优于传统显微计数方法。Karolewski等（2012）同样利用实时定量PCR技术对空气中油菜Pyrenopezizabrassicae病菌子囊孢子进行了定量检测，结果表明传统显微计数到的孢子数和荧光定量PCR技术得到的DNA量之间存在极显著的正相关性。Rogers等（2009）利用Real-timePCR估算得到空气中每个油菜菌核病菌的子囊孢子含有的DNA量为0.35pg。另外，结合孢子捕捉技术和荧光定量PCR技术，Schweigkofler等（2004）定量检测了空气中松树脂溃疡病菌（Fusarium7 中国农业科学院博士学位论文第一章引言circinatum）的孢子浓度并分析了其季节变化动态；Carisse等（2009）定量检测了葱鳞葡萄孢菌（Botrytissquamosa）的孢子浓度。因此，利用Real-timePCR技术不仅可以用来准确监测空气中病菌孢子的浓度，而且省时省力。1.3基于孢子捕捉技术的空气中病原菌孢子浓度和传播距离的监测小麦白粉病属多循环气传性病害，分生孢子随气流传播是引起田间、邻近区域甚至远距离处寄主发病和流行的主要原因，研究发现许多病原菌的孢子可以通过气流近距离传播到同一地块处，也可以远距离传播到不同大洲的寄主植株上（Brown和Hovmøller，2002）。因此，研究空气中病菌孢子的短距离传播范围，对于预测病害的发生流行程度和指导制定田间防治策略具有重要意义。空气中病菌孢子浓度是病菌孢子传播距离预测预报的直接依据，而通过孢子捕捉技术即可获得病菌孢子浓度。1.3.1玻片捕捉技术玻片捕捉孢子的方法是最早使用的孢子捕捉技术，主要方法就是将涂有粘附剂的载玻片安放在田间病菌孢子扩散区域，玻片上的粘附剂将孢子粘附住，然后统计粘附在玻片上的孢子数量，该方法是使用简单、而且成本最低的孢子捕捉方法，但易受降雨、风等影响，可以提供一定量有效信息，对于那些需要多监测点、大面积范围内的连续监测，玻片捕捉孢子是最合适的方法，这种方法在农业植保监测部门应用较为广泛。如杨新美等（2003）利用玻片法对油菜菌核病菌产生的子囊孢子传播距离进行研究，发现在距菌源中心50m处还可以捕捉到子囊孢子。傅俊范等（2011）利用玻片法对捕捉到的稻曲病菌（Ustilaginoideavirens）孢子与气象因素分析，发现稻曲病分生孢子飞散动态与积温和降雨均呈极显著正相关关系。韩建（2012）利用玻片法建立了苹果树腐烂病病菌孢子气流传播距离和孢子量的关系模型。马海霞（2013）等利用玻片法对白菜黑斑病病菌孢子飞散动态及其传播量进行了研究，分别建立了孢子捕捉量与传播高度、传播距离的关系模型。杜占涛等（2013）利用玻片法对果园内的苹果树腐烂病菌（ValsamaliMayabeetYamadavar.mali）进行捕捉，结果发现分生孢子周年均可在树冠高度以内扩散传播，且在2-6月为主要传播期。1.3.2旋转胶棒捕捉技术和移动式孢子捕捉技术旋转垂直胶棒孢子捕捉技术和移动式孢子捕捉器捕捉技术相对应用较少，尤其国内在这两方面少有研究报道。旋转垂直胶棒孢子捕捉技术缺点是费用相对较高，而且捕捉表面因容易产生过饱和而影响捕捉效率，空气中孢子的大小、浓度及捕捉时期也是影响捕捉效率的主要原因。利用旋转垂直胶棒孢子捕捉器对病原菌孢子监测研究在国外仅有少量报道，如Inch等（2005）发现可以利用Rotorod捕捉器监测到空气中小麦赤霉病菌的子囊孢子及大型的分生孢子，根据监测到的子囊孢子量和分生孢子量分析了它们各自的季节性变化动态。移动式孢子捕捉技术吸收了玻片法和旋转垂直胶棒孢子捕捉器的一些设计特点，但其收集效率要比玻片法和旋转垂直胶棒孢子捕捉器高得多，甚至可达99%。移动式捕捉器主要安8 中国农业科学院博士学位论文第一章引言装在汽车上，汽车的移动距离或者范围即是该捕捉器的捕捉范围，因此可以人为设定捕捉区域或者捕捉范围，可以较好地满足取样范围和代表性，提高取样效率，降低工作量。在国内，周益林等（2007）首次发现白粉病发病盛期利用移动式孢子捕捉器所捕获到的孢子量与田间病情显著相关，这说明移动式捕捉器捕捉技术在监测田间小麦白粉菌上具有一定应用价值。1.3.3定容式孢子捕捉技术定容式孢子捕捉技术最主要的优势就是设定好时间周期，捕捉盘就能够按设定的速度转动，单位时间内空气中的孢子就被粘附在捕捉器内部的条带上，然后对捕捉带进行划分，统计每部分捕捉带上粘附的孢子数量，即可根据孢子捕捉量计算出单位时间内空气中病菌孢子浓度。定容式孢子捕捉器是将孢子吸进捕捉仓内然后粘附到捕捉仓内的捕捉条带上，这样可以大大避免捕捉仓外面降雨和风速等气象因素对捕捉效率的干扰；而且该捕捉器可以定容吸入捕捉仓内的空气体积，通过对时间周期的设定，还可以避免捕捉带表面的过饱和现象，而玻片法和旋转胶棒捕捉法很难避免这种过饱和现象，移动式孢子捕捉器由于主要用于病原菌孢子的取样或者定性监测，不能对生长季节内田间病原菌数量持续监测，因此，定容式孢子捕捉器目前应用最为广泛。如Aylor（1993）分别利用Rotorod捕捉技术和定容式孢子捕捉技术对空气中苹果黑星病菌的子囊孢子进行捕捉，结果发现Rotorod的捕捉效率是Burkard捕捉效率的0.4倍。1.3.4利用孢子捕捉技术监测空气中病原菌孢子浓度利用孢子捕捉器监测空气中病菌孢子浓度的研究已有较多报道，早在1952年时就有关于利用孢子捕捉器对空气中病菌孢子取样的报道（闫征远，2016）。在对捕捉器捕捉到的孢子进行统计时，常规的方法就是对整个粘附着孢子的捕捉带挨个视野进行观察计数，这样需要花费大量时间统计孢子数量。Molina等（1996）和Melinda（1999）建立了检查单一的纵向移动或者检查12个横向移动显微镜目镜来统计孢子数量的方法，这两种方法只需统计每个条带的部分视野内的孢子，就可以按照比例计算得出相应的捕捉带上的孢子数量，大大减少工作量。Hirst（1953）利用Hirst孢子捕捉器对空气中苹果黑星病菌进行了研究。Browning等（1970）认为空气中累积孢子量的变化与病害发展曲线相对应。Sutton等（1979）利用孢子捕捉技术对果园内苹果白粉病菌产生的分生孢子浓度进行研究，发现空气中苹果白粉菌分生孢子浓度在中午过后达到峰值，且分生孢子浓度与风速、空气温度、相对湿度、太阳辐射等气象因素有一定相关性。Channon研究发现大麦白粉病菌田间空气中孢子浓度的峰值与田间白粉病严重度有一定的对应关系（Channon，1981）。Drinkall等（1983）利用孢子捕捉技术分别对空气中病原菌Synchytriumpsophocarpi孢子的季节性变化和日变化动态进行了分析。Tadesse和Hundie（2009）利用Burkard捕捉器对秆锈病菌田间产生的夏孢子浓度的变化动态进行监测，空气中夏孢子浓度在10月份或者11月份至第二年的1月较高。Granke和Hausbeck（2011）研究发现葫芦霜霉病菌（Pseudoperonosporacubensis）产生的孢子浓度在8:00-13:00之间出现高峰值，而且空气中孢子浓度与温度呈正相关关系，与湿度呈负相关关系。Cao等（2015）利用捕捉到的白粉菌分生孢子浓度结合气象因素建立了白粉病发生的9 中国农业科学院博士学位论文第一章引言累积logit模型，其中白粉菌分生孢子浓度是最重要的影响因子。刘伟等（2016）、闫征远等（2017）进一步分析并建立了不同小麦品种间白粉菌分生孢子浓度与田间病情的关系模型，在‘京双16’种植区孢子浓度与病情指数存在线性关系，而在‘众麦2号’种植区孢子浓度与病情存在指数关系。谷医林等（2018）利用孢子捕捉技术对甘谷县地区的小麦条锈菌夏孢子进行监测，并与气象因素进行相关性分析，结果发现甘谷县地区春季夏孢子在南山地区和北山地区之间的变化趋势有一定相似性,而且这两个地区均是在5-6月份孢子浓度达到最高值。1.3.5利用孢子捕捉技术监测病菌孢子的传播距离利用孢子捕捉技术可以直接捕捉到距菌源中心不同距离处的分生孢子量，从而可以实现对病菌孢子的传播距离进行定量分析。Meredith（1966）利用孢子捕捉器对空气中大蒜紫斑病病菌（Alternariaporri）孢子进行研究，并分析了该病菌孢子的传播规律。景耀等（1989）对马尾松疱锈病的锈孢子研究发现，在飞散高峰期,锈孢子在水平方向的传播距离为25m,垂直方向的扩散距离为5m。Burt（1998）等研究表明，子囊孢子可以远距离传播，而分生孢子主要近距离传播或者在植被水平传播。油菜白斑病菌（Mycosphaerellacapsellae）所产生的子囊孢子在空气中能够远距离传播，但是分生孢子却只能随雨水飞溅等进行短距离传播（Inman等，1999）。Mondal等（2003）发现随着高度的增加和离菌源中心距离的增大，空气中柑桔黄斑病菌（Mycosphaerellacitri）子囊孢子的捕捉量减少。Holb和Heijne（2004）研究发现，空气中苹果黑星病菌子囊孢子的孢子浓度距菌源中心越进，孢子浓度越大，距菌源中心距离增加，则子囊孢子浓度降低，在距菌源中心21m处可以捕捉到大量孢子，而在距菌源中心45m处捕捉到的孢子浓度则大大降低，仅为菌源中心处孢子浓度的0.1倍。Guo等（2005）利用Burkard定容式孢子捕捉器可以捕捉到空气中距离菌源中心25m处油菜黑胫病病菌（Leptosphaeriamaculans）所产生的子囊孢子。Gamliel-Atinsky等（2009）则利用孢子捕捉技术对芒果园内畸形病菌（Fusariummangiferae）所产生的孢子进行研究，并分析了该病菌在果园内的传播动态。马海霞等（2013）对白菜黑斑病病菌孢子飞散动态及其传播量进行了研究，结果发现顺风条件下，病菌孢子一代即可传播5~6m，在一个生长季节里黑斑病病菌孢子能够传播到3km外。Chandeliera等（2014）研究结果认为空气中白蜡灰枯病菌分生孢子的传播距离基本在50m范围以内；但在50m以外不排除有少数孢子可以传播到更远的距离处侵染寄主，Chandeliera等还发现在菌源中心上方，距地面0.5m处的孢子捕捉量要明显高于距地面3m处的孢子捕捉量，这也从一定程度上印证了Sutton和Jones（1976）的研究结果。Rieux等（2014）在香蕉黑条叶斑病菌（Mycosphaerellafijiensis）发生一代期间测量病害发生程度，并沿着菌源中心辐射状向外八个方向最远达1000m安装了共272个捕捉装置，来监测子囊孢子和分生孢子传播距离，结果发现，分生孢子传播事件很少发生，仅在一个方向传播了12.5m，而且研究还发现，捕捉到的子囊孢子与风频率没有显著相关性，而分生孢子与风频率有极显著相关性。曾士迈对小麦条锈病菌远程传播、传播距离以及传播距离模型预测进行了研究，得出了传播距离与菌量的关系（曾士迈，1963；1985；1988）。随着孢子捕捉技术的发展，利用孢子捕捉器可以直接捕捉到距菌源中心不同距离处的分生孢子量，从而达到对传播距离进行定量分析的目的。10 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.3.6风向和风速与孢子释放的关系风速和风向对孢子释放的影响较为复杂，但已有较多报道。Aylor（1999）认为风向和风速可以通过改变孢子的释放和传播速率从而对植物病害的发生程度产生影响。Aylor和Lukens（1974）认为有利于小麦白粉菌孢子释放的风速范围在0.6~2.0m/s之间，但是田间小麦冠层内主要以阵风为主，而且风速较大。Xu等（1995）研究发现苹果白粉菌的孢子时浓度与时平均风速呈正显著相关关系。Ryley和Chakraborty（2007）研究发现高粱麦角病菌田间分生孢子的日释放高峰对应着该时段平均风速的最高值，平均风速在1.4~3.4m/s之间。在田间条件下，病害倾向于顺着风向进行扩散传播（Willocquet和Clerjeau，1998），Gregory（1968）认为顺风向上的感病植株一般情况下会多于逆风向上的感病植株，在顺风向和逆风向上容易产生不同的病害梯度，且该病害梯度容易受风向稳定性的影响，若风向不稳定，则会削弱该病害梯度。同样在较长时间跨度内风向处于不稳定性状态，则病菌孢子可以随风向向各个风向传播，导致各个风向传播的菌源量之间差异较小，最终造成病害由菌源中心向四周扩展；反之，当风向稳定时，病菌孢子会随风向向一个方向集中传播，导致病害向某一方向集中扩展。Holb等（2004）对苹果黑星病病菌孢子的释放、田间病害梯度与风向之间的关系进行研究，结果发现80%的孢子主要随大西洋气流向西和西南方向传播。1.4研究内容和拟解决的关键问题1.4.1研究内容（1）分析不同地区小麦白粉菌越冬后病情与空气温度参数和地表温度参数的关系，明确小麦白粉菌的越冬温度阈值。（2）采用Real-timePCR技术分别对不同小麦生态区田间人工接种地块、或田间自然发病地块的田间秋苗未显症小麦叶片进行检测，第二年调查早春小麦白粉病病情，并实时监测这些采样点越冬期田间的关键气象因子。（3）分析秋苗潜伏侵染菌源、以及早春病害发生的田间空间分布规律，明确早春病害以及潜伏侵染菌源的田间分布型，建立相应的抽样技术（抽样调查方法和最适样本数）。（4）根据所获得的小麦白粉病秋苗田间初始菌量（分子病情指数）、小麦白粉病早春实际发病情况和冬季田间气象资料，建立小麦白粉病早春预测模型。（5）采用病菌孢子捕捉器收集菌源中心不同距离田间空气中白粉菌分生孢子，定量研究小麦白粉病菌的田间传播规律。1.4.2拟解决的关键问题（1）明确小麦白粉菌的越冬温度阈值。（2）明确秋苗菌源和早春病害的田间空间分布型和抽样技术。（3）明确影响早春病害流行的关键因子。（4）建立基于病菌潜伏侵染量（MDX）和关键气象因子的小麦白粉病早春预测模型。11 中国农业科学院博士学位论文第一章引言（5）建立小麦白粉菌分生孢子田间传播距离与孢子捕捉量间的关系模型。1.5本研究的目的和意义小麦白粉病菌的越冬最低阈值温度研究比较少。本研究于2015-2016、2016-2017连续两年度分析小麦白粉病越冬试验点的温度因子，明确小麦白粉病的越冬温度阈值，为了解病害的越冬范围提供依据。本课题组研究生郑亚明（2010）已开发出了小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的Real-timePCR检测技术，这为在小麦白粉病的预测预报研究中引入病菌潜伏侵染菌源量作为预测早春白粉病发生的参数提供坚实的基础。因此本研究利用Real-timePCR技术对田间小麦白粉病重要流行阶段潜伏侵染菌源量进行多年多点监测，结合影响病害流行关键气象因子，建立此病害的早期预测预报模型，同时明确病菌潜伏侵染和病害发生的分布型和抽样技术，为小麦白粉病准确预测和防治决策服务。关于利用定容式孢子捕捉器对空气中小麦白粉菌分生孢子传播距离和传播量的关系的研究鲜有报道，本研究于2015-2017三个小麦生长季节，采用定容式孢子捕捉器，在水平方向对距菌源中心不同距离处进行孢子捕捉，分析孢子捕捉量与传播距离的关系，建立基于空气中白粉菌分生孢子捕捉量的病菌孢子传播距离模型，此研究结果将为定量研究小麦白粉菌的田间传播梯度奠定基础。12 中国农业科学院博士学位论文第二章小麦白粉病菌越冬温度阈值的研究第二章小麦白粉病菌越冬温度阈值的研究小麦白粉病菌越冬是小麦白粉病流行过程中的重要阶段，而越冬后的菌量是直接影响春季小麦白粉病发生和流行强度的重要因子，病菌越冬存活率主要受冬季气温和湿度的影响。冬季温度高、雨雪较多或土壤湿度大有利于病菌越冬；反之则越冬率低。待第二年春季环境条件适宜时，越冬后的菌源开始产生分生孢子，引起病害在春季发生和流行（刘孝坤，1989；刘万才和邵振润，1994；何家泌和何文兰，1998）。吴明藻等（1984）调查发现当贵阳地区1月平均气温在5℃左右、最低气温-8℃左右时，白粉菌停止扩展，并以菌丝体形式在麦苗脚叶上进行越冬。张志德等（1993）报道在12月下旬陕西关中地区的小麦白粉菌停止扩展，以菌丝在茎基部叶鞘上越冬。国外对小麦白粉菌越冬也有部分报道，但多集中于越冬形式上（Gorlenko，1940；Turner，1956；Padalino，1970）。李伯宁初步以我国小麦白粉病越冬的北界最冷月均温为-6℃线附近，划定了小麦白粉病越冬的最北界限可沿唐山－密云－昌平－房山－涞水－易县－平山－太原－介休－临汾－宜川—黄陵－庆阳－平凉－陇西－宕昌－松藩－黑水－马尔康－康定－稻城－德钦，此线以南、以东的地区小麦白粉病能够在当地越冬（李伯宁，2008），但对于小麦白粉菌能够越冬的最低温度阈值，目前未见到文献报道。近年来，小麦白粉病发生流行范围和程度有加重趋势，这可能与白粉菌越冬有重要关系。本研究将重点分析小麦白粉病越冬试验点的温度因子，明确小麦白粉病菌越冬的温度阈值，为以后的春季田间调查和春季病害的预测提供依据。2.1材料与方法2.1.1试验材料和仪器越冬试验区所种小麦品种为‘京双16’（高感白粉病），接种菌株为小麦白粉菌混合菌种，由中国农业科学院植物保护研究所小麦白粉病组提供。XR-440便携式温度记录仪（美国培德国际有限公司）。2.1.2试验方法试验于2015-2016、2016-2017连续两个生长季节在北京延庆县永宁镇和张山营镇、河北省廊坊市、张家口市万全县和张北县五个试验点进行（表2.1）。2015年10月5-6日分别于这五个试验点种植感病品种‘京双16’，各地点种植面积均为20m²，按照正常种植密度2（120kg/hm）播种，行距25cm。各试验点小麦长至一心一叶期时（2015年10月21-22日），将温室内繁殖好的带有混合菌的盆栽苗接种于各种植点，延庆永宁镇、延庆张山营镇、张家口万全县、廊坊市等试验点分别接菌6盆（该年度张家口张北县由于大雪封山未接菌）。2016年播种时间为9月29-30日，播种量和面积与2015年一致，10月14-15日将温室内提前繁殖好的带菌苗种于各试验点内，每个试验点接种6盆。于下一年小麦拔节期对各试验区13 中国农业科学院博士学位论文第二章小麦白粉病菌越冬温度阈值的研究进行病害调查，每个试验点调查100茎，分级标准参照改进后的“0~9”级法进行，并计算病情指数（DiseaseIndex，DI）。其中，i为发病级数，ni为发病级数为i的病株数。每个试验点播种完成后安放XR-440便携式温度记录仪，记录试验点空气中、地表面、地下5cm的温度，每小时记录一次，持续记录直至调查结束。表2.1试验区信息汇总Table2.1Summaryoftheexperimentlocations种植面2015年接2016年接地区纬度经度海拔（m）积（m²）菌量（盆）菌量（盆）河北省廊坊市广阳区39.50°116.61°3002066北京市延庆永宁镇40.31°116.09°4902066北京市延庆张山营镇40.31°115.58°5202066河北省张家口万全县40.45°114.37°8262066河北省张家口张北县41.20°115.21°160820-62.1.3数据分析利用XR-440便携式温度记录仪自带的软件读取每年度各个试验点内每小时的空气、地表面、地下5cm的温度，并根据表2.2计算各试验点相应的最低温、负积温、地积温、日积温、≤-6℃积温、≤-8℃积温、≤-10℃积温等温度参数。表2.2各种温度参数的意义Table2.2Summaryofthetemperatureparameters温度参数计算方法最低日均温11月至次年2月份最低日平均温度上旬均温每个月1-10日的平均温度中旬均温每个月11-20日的平均温度下旬均温每个月21-30日的平均温度月均温每个月的平均温度负积温冬季12月至次年2月零下的日平均温度的累加≤-6℃积温某一段时间内逐日平均气温≤-6℃持续期间日平均气温的总和≤-8℃积温某一段时间内逐日平均气温≤-8℃持续期间日平均气温的总和≤-10℃积温某一段时间内逐日平均气温≤-10℃持续期间日平均气温的总和14 中国农业科学院博士学位论文第二章小麦白粉病菌越冬温度阈值的研究2.2结果与分析2.2.1小麦白粉菌越冬后发病情况通过对各试验点内小麦白粉菌越冬后病害发生情况调查发现（表2.3），两年度北京延庆区永宁镇、张山营镇，河北省廊坊市广阳区，张家口万全县、张北县等地区均有不同程度的病害发生，病情指数在4.4~30.2之间，说明这五个试验点内小麦白粉菌均可越冬，且2017年发病程度重于2016年发病程度。表2.3各试验点小麦白粉病菌越冬后小区内发病情况Table2.3Diseaseindexandpercentofdiseasedplantsafteroverwinterofwheatpowderymildewindifferentsites20162017地区病情指数病株率（%）病情指数病株率（%）河北省廊坊市广阳区21.22230.229北京延庆永宁镇12.21121.926北京延庆张山营镇15.51419.419河北省张家口万全县0.2115.315河北省张家口张北县——4.442.2.2小麦白粉菌越冬的空气温度阈值变化由图2.1可以看出，两年度各试验点空气日平均温度有多天低于-10℃，最低空气日平均温度甚至低于-20℃以下。整体上两年度各试验点12月初至次年3月初空气日平均温度多数在0℃以下，因此选取12月−次年2月温度进一步分析小麦白粉菌越冬的空气温度阈值。15 中国农业科学院博士学位论文第二章小麦白粉病菌越冬温度阈值的研究YongningZhangshanyingWanquanZhangbeiLangfang20100（℃）-10-20Dailymeantemperature-30-401-Nov21-Nov11-Dec31-Dec20-Jan9-Feb1-Mar21-Mar10-AprYongningZhangshanyingWanquanZhangbeiLangfang15105（℃）0-5-10Dailymeantemperature-15-20-251-Nov21-Nov11-Dec31-Dec20-Jan9-Feb1-Mar21-Mar10-AprDate图2.1各试验点11月至次年3月底的日均空气温度变化范围（上：2015-2016；下：2016-2017）Fig.2.1ThedailymeantemperatureintheairfromNovember2015toMarch2016(top)andNovember2016toMarch2017(bottom)通过对两年度12月、1月、2月上旬、中旬和下旬的平均空气温度以及12月、1月、2月的月均空气温度分析发现（表2.4），北京延庆区永宁镇、张山营镇，河北省廊坊市广阳区，张家口万全县、张北县等地区的温度均在0℃以下，其中以1月中旬、下旬的平均空气温度或者1月的月平均空气温度较低，范围分别在-5.5℃至-18.6℃、-6.2℃至-21.1℃、-5.1℃至-18.0℃之间。同时本研究还发现（表2.5）北京市延庆区永宁镇、张山营镇，河北省廊坊市广阳区，河北省张家口万全县、张北县五个试验点12月初至次年2月底小麦白粉菌可以越冬的空气最低日平均温度为-20.5℃，负积温为-905.1℃，≤-6℃积温为-824.3℃，≤-8℃积温为-725.4，≤-10℃积温为-656.3℃。16 中国农业科学院博士学位论文第二章小麦白粉病菌越冬温度阈值的研究表2.4两年度不同时间段的平均空气温度参数汇总Table2.4Summaryoftheairtemperatureparametersin2015-2016and2016-2017seasons温度参数年度地点12月12月12月1月1月1月2月2月2月12月1月2月上旬中旬下旬上旬中旬下旬上旬中旬下旬均温均温均温廊坊市-2.2-4.7-5.6-2.9-5.5-6.6-4.2-2.8-0.1-3.3-9.1-2.7广阳区延庆永-10.-2.2-3.9-4.6-6.0-8.8-2.8-2.0-3.1-3.6-8.4-2.6宁镇32015-延庆张-2.1-3.6-4.2-5.9-8.7-9.9-2.7-1.5-2.4-3.3-8.2-2.22016山营镇张家口-10.-12.-10.-4.5-5.5-5.2-7.4-4.5-3.9-5.0-5.0-4.4万全县652张家口-14.-18.-21.-12.-12.-13.-18.-12.-7.1-8.1-9.2-8.2张北县06191307廊坊市-2.2-4.7-5.6-2.9-5.5-6.6-4.2-2.8-0.1-4.2-5.1-2.5广阳区延庆永-1.2-3.3-4.9-3.0-6.2-6.2-3.6-0.80.3-3.2-5.2-1.5宁镇2016-延庆张-1.9-4.4-5.9-3.7-6.3-6.8-4.0-1.30.7-4.1-5.6-1.72017山营镇张家口-2.1-3.6-6.4-3.4-8.7-7.9-5.1-1.4-0.6-4.1-6.7-2.5万全县张家口-14.-13.-11.-12.-7.9-7.8-11.1-8.4-7.2-7.6-9.0-8.9张北县8352表2.5两年度空气温度的积温参数汇总Table2.5Summaryoftheaccumulatedairtemperatureparametersin2015-2016and2016-2017seasons温度参数年度地点最低日均温负积温≤-6℃积温≤-8℃积温≤-10℃积温河北省廊坊市广阳区-15.39-465.6-338.2-229.5-193.7北京延庆永宁镇-19.4-445.8-286.9-180.4-83.52015-2016北京延庆张山营镇-18.2-418-271-153-81河北省张家口万全县-21.3-596.8-457.4-335.3-220.1河北省张家口张北县-31.5-1167.7-1124.2-1068.4-994.2河北省廊坊市广阳区-12.1-383.5-234.0-115.3-33北京延庆永宁镇-9.5-313-122.6-52.5-2016-2017北京延庆张山营镇-10.3-364.4-188.1-101.4-20.3河北省张家口万全县-12.7-412.2-258.8-174.3-55.9河北省张家口张北县-20.5-905.1-824.3-725.4-656.317 中国农业科学院博士学位论文第二章小麦白粉病菌越冬温度阈值的研究2.2.3小麦白粉菌越冬的地表温度变化由图2.2可以看出，两年度各试验点12月初至次年3月初地表平均温度多数在0℃以下，因此选取12月-次年2月温度进一步分析小麦白粉菌越冬的地表温度阈值。通过对两年度12月、1月、2月上旬、中旬和下旬的平均地表温度以及12月、1月、2月的月均地表温度分析发现（表2.6），北京延庆区永宁镇、张山营镇，河北省廊坊市广阳区，张家口万全县、张北县等地区的地表温度大部分在0℃以下，也是以1月中旬、下旬的平均地表温度或者1月的月平均地表温度较低，范围分别在-1.2℃至-10.7℃、-2.1℃至-10.8℃、-1.3℃至-9.6℃之间。同时本研究还发现（表2.5）北京市延庆区永宁镇、张山营镇，河北省廊坊市广阳区，河北省张家口万全县、张北县五个试验点12月初至次年2月底小麦白粉菌可以越冬的地表最低日平均温度、负积温、≤-6℃积温、≤-8℃积温、≤-10℃积温分别为-12.6℃、-811.9℃、-715.9℃、-543.3.3℃、-302.1℃。18 中国农业科学院博士学位论文第二章小麦白粉病菌越冬温度阈值的研究YongningZhangshanyingWanquanZhangbeiLangfang1510（℃）50-5Dailymeantemperature-10-151-Nov21-Nov11-Dec31-Dec20-Jan9-Feb1-Mar21-Mar10-AprYongningZhangshanyingWanquanZhangbeiLangfang1510（℃）50-5Dailymeantemperature-10-151-Nov21-Nov11-Dec31-Dec20-Jan9-Feb1-Mar21-Mar10-AprDate图2.2各试验点11月至次年3月底的日均地表温度变化范围（上：2015-2016；下：2016-2017）Fig.2.2ThedailymeanlandsurfacetemperaturefromNovember2015-March2016(top)andNovember2016-March2017(bottom)19 中国农业科学院博士学位论文第二章小麦白粉病菌越冬温度阈值的研究表2.6两年度不同时间段的平均地表温度参数汇总Table2.6Summaryoftheaveragesurfacetemperatureparametersin2015-2016and2016-2017seasons温度参数年度地点12月12月12月1月1月1月2月2月2月12月1月2月上旬中旬下旬上旬中旬下旬上旬中旬下旬均温均温均温廊坊市0.50.0-0.8-2.3-3.7-4.7-2.4-0.3-0.5-0.1-3.6-1.1广阳区延庆永-1.3-1.9-2.9-3.8-5.8-7.3-2.3-0.1-0.7-2.1-5.7-1.1宁镇2015-延庆张-1.0-2.8-3.4-4.7-5.4-7.4-2.8-0.9-2.2-2.4-5.9-1.92016山营镇张家口-10.-3.8-5.0-5.2-6.8-8.0-5.4-4.4-4.3-4.7-8.3-4.7万全县0张家口-0.60.1-0.4-1.4-3.8-4.4-4.7-3.5-4.2-0.3-3.2-4.1张北县廊坊市1.4-0.1-0.6-0.5-1.2-2.1-1.3-0.41.00.2-1.3-0.3广阳区延庆永-1.1-2.9-4.2-2.9-5.1-4.7-2.8-1.00.7-2.8-4.3-1.2宁镇2016-延庆张-4.3-5.5-7.2-6.1-8.2-8.6-6.2-3.6-1.8-5.7-7.6-4.02017山营镇张家口-2.0-3.3-5.0-4.1-7.1-6.7-4.7-2.8-1.9-3.5-6.0-3.2万全县张家口-10.-10.-10.-6.4-8.0-8.6-7.2-8.0-6.3-7.7-9.6-8.2张北县780表2.7两年度地表温度的积温参数汇总Table2.7Summaryoftheaccumulatedsurfacetemperatureparametersin2015-2016and2016-2017seasons温度参数年度地点最低日均温负积温≤-6℃积温≤-8℃积温≤-10℃积温河北省廊坊市广阳区-6.7-157.5-6.7--北京延庆永宁镇-12.2-276-86.3-39.9-23.62015-2016北京延庆张山营镇-11.8-316.2-96.8-30.8-22.3河北省张家口万全县-13-555.5-313.9-181.5-56.8河北省张家口张北县-5.2-264.4---河北省廊坊市广阳区-3.0-70.5---北京延庆永宁镇-7.3-262.9-52.7--2016-2017北京延庆张山营镇-11.6-528.9-346.1-193-96.2河北省张家口万全县-8.9-391.7-162.5-25.6-河北省张家口张北县-12.6-811.9-715.9-543.3-302.120 中国农业科学院博士学位论文第二章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测2.2.4小麦白粉菌越冬的温度参数与病情之间的相关关系对2016-2017年度不同时间段内空气平均温度参数、地表平均温度参数与病害的越冬病情指数进行相关性分析，结果发现（表2.8），小麦白粉病的病情指数与1月中旬、1月下旬的旬均空气温度、1月月均空气温度显著相关；与12月上旬、中旬、下旬，1月上旬、中旬、下旬，2月上旬、下旬、中旬以及12月的平均地表温度、1月的平均地表温度、2月的平均地表温度均存在显著相关关系。整体上，空气温度和地表温度的1月中旬、1月下旬旬均温及1月月均温相对较低，且与病情指数的相关性相对较高；地表温度与病害越冬病情指数的相关性好于空气温度与病害越冬病情指数的相关性。表2.82016-2017年度小麦白粉菌越冬后的病情指数与平均温度参数之间的相关关系Table2.8Correlationbetweendiseaseindexofwheatpowderymildewandairtemperature,surfacetemperaturein2016-201712月12月12月1月1月1月2月2月2月12月1月2月参数上旬中旬下旬上旬中旬下旬上旬中旬下旬均温均温均温空气0.790.670.860.860.93*0.88*0.850.660.820.790.90*0.79温度地表0.90*0.91*0.88*0.88*0.94*0.92*0.94*0.94*0.95*0.90*0.92*0.95*温度*表示相关性达显著水平，下同。同时对2016-2017年度空气温度或地表温度的最低日均温、负积温、≤-6℃积温、≤-8℃积温分别与病情指数做相关分析发现（表2.9），仅12月-次年2月份的土壤温度的负积温与病情指数显著相关。表2.92016-2017年度小麦白粉菌越冬的病情指数与不同积温参数之间的相关关系Table2.9Correlationbetweendiseaseindexofwheatpowderymildewandaccumulatedairtemperature,accumulatedsurfacetemperaturein2016-2017参数最低日均温负积温≤-6℃积温≤-8℃积温空气温度0.780.830.810.82土壤温度0.860.94*--2.2.5小麦白粉菌的越冬温度阈值选取1月下旬旬均温（最冷旬）和1月月均温（最冷月）建立模型来分析小麦白粉菌越冬的空气温度和地表温度阈值（表2.10），所建模型均达到显著的拟合效果，由模型可以计算出小麦白粉菌越冬的空气温度和地表温度的最低旬均温分别为-14.6℃和-13.7℃、最低月均温分别为-13.4℃和-12.4℃。21 中国农业科学院博士学位论文第二章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测表2.102016-2017年度平均空气温度和地表温度参数与小麦白粉病越冬病情的关系模型Table2.10Diseaseestimationmodelsbaseonaverageairtemperatureandsurfacetemperatureparametersin2016-20172参数参数模拟方程RF值P值1月下旬DI=2.83x+41.290.7710.140.0499空气温度1月均温DI=2.84x+380.8112.720.03761月下旬DI=2.57x+35.140.8415.580.0290地表温度1月均温DI=2.75x+34.050.8516.570.0267本研究还建立了2016-2017年12月-2月地表温度的负积温（x）与小麦白粉菌越冬病情（y）的关系模型：DI=0.03x+31.41（R²=0.8875，P=0.0166）根据该模型可以计算出小麦白粉菌越冬的地表累积负积温阈值为-1047℃。2.3讨论本文涉及的五个试验地点除河北省廊坊市还种小麦以外，北京延庆永宁镇、张山营镇和河北张家口万全县、张北县等地区已基本不再种植冬小麦，而且这些地区所处纬度分别为40.31°、40.31°、40.45°、41.20°，位置偏北，冬季温度较低，因此选取这些地区进行小麦白粉菌越冬阈值的研究。通过两年度试验发现，北京市延庆县永宁镇、张山营镇，河北省张家口市万全县、张北县，河北廊坊五个试验点内小麦白粉病都有不同程度发生，表明在这些地区小麦白粉菌均可越冬。李伯宁（2008）以我国小麦白粉病越冬的北界最冷月均温为-6℃线附近，推断小麦白粉菌越冬的最北界限为沿唐山－密云－昌平－房山－涞水－易县以南地区，但对于小麦白粉菌能够越冬的低温阈值，目前未见到文献报道。本研究首次发现小麦白粉病菌完全可以在该界限以北的张家口市的万全县、张北县越冬，而且，河北省万全县、张北县最冷月1月份的月均温低于-6℃，这说明小麦白粉菌越冬空气温度阈值要低于前述报道。两年度各试验点每年12月初至次年3月初空气温度、地表温度日均温多数在0℃以下，因此本研究选取12月-次年2月温度分析白粉菌越冬温度阈值。小麦白粉菌越冬存活率主要受冬季气温和湿度的影响，尤以温度影响最大。小麦白粉菌越冬已有部分研究报道（吴明藻等，1984；张志德等，1993），前人大部分关于白粉菌越冬的研究，基本上是基于空气温度，而有研究者提出，冬季地面冰冻或者降雪覆盖，有利于病菌越冬（刘孝坤，1989；刘万才和邵振润，1994；何家泌和何文兰，1998），本研究所选五个试验点冬季温度较低，尤其张家口万全县、张北县冬季容易降雪覆盖，因此地表温度可能更能代表白粉菌越冬温度实际情况。结果发现整体上小麦白粉菌越冬后的病情指数与地表温度的平均温度参数相关性较好，这说明地表温度的各项平均温度参数可能更好地代表小麦白粉菌的真实越冬情况；另一方面，通过对四个试验点地表温度分析发现，2016-2017年度延庆永宁镇、张山营镇，张家口万全县、22 中国农业科学院博士学位论文第二章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测张北县四个试验点的地表最低温度分别为-12.9℃、-16.0℃、-13.4℃、-14.0℃，而空气最低温度分别为-16.2℃、-20.4℃、-21.2℃、-30℃，地表最低温度要远高于空气最低温度，而且各种温度参数也远高于空气温度参数，这主要是由地面冰冻或者降雪覆盖引起，尤其是张北地区地表土壤最低温度要比空气最低温度高-16℃，降雪覆盖大大增高了地表温度，有利于白粉菌越冬，使白粉菌越冬的实际极限温度低于基于空气温度推断的极限温度，此时地表温度更接近于小麦白粉菌越冬的真实温度，因此，研究白粉菌越冬温度阈值，地表温度有重要参考意义。本研究发现1月下旬旬均温和1月份的月均温相对较低，且与越冬病情指数相关性较好，因此分别建立了1月下旬旬均空气温度或地表温度、1月月均空气温度或地表温度与越冬后病情指数的关系模型，据此可以初步计算出小麦白粉菌越冬的最低旬均空气温度为-14.6℃，最低旬均地表温度为-13.7℃，最低月均空气温度为-13.4℃，最低月均地表温度为-12.4℃。有研究表明，经田间秋季低温锻炼的不同抗寒性的小麦品种其耐冰冻温度范围大约为-8℃~-22℃，改良品种一般在-12℃幼苗开始死亡，-13℃~-14℃开始大量死苗（董玉琛，2000）。本研究中，张北县在2015-2016年度死苗率60%，2016-2017年度死苗率20%，说明小麦苗已基本接近所能承受的极限温度，但2016-2017年度在小麦苗内潜伏侵染的白粉菌却依然能够越冬，这从一定程度上证明了前人提出的只要田间冬小麦冻不死，小麦白粉菌即可越冬的说法（个人交流），当然这只是一个初步结果，还要进一步印证研究。关于小麦白粉菌越冬的研究工作开展较早，主要集中在20世纪90年代以前，且相关研究报道较少，主要结论都是基于传统田间调查方法和多年个人经验得出。本研究同样利用传统调查方法对五个地区小麦白粉菌越冬的空气温度、地表温度进行研究，仅选用了对白粉菌越冬影响最大的温度因子，在今后的研究中，为了准确了解小麦白粉菌越冬情况，还应包括湿度、当年的降雪和降雨情况、小麦品种抗冻性等其他因子，结合现代分子生物学技术如Real-timePCR等，明确小麦白粉菌潜育越冬部位、越冬菌源量、低温和品种抗冻性对白粉菌存活的影响，为小麦白粉菌越冬以及早春白粉病的预测预报提供理论依据。23 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测小麦白粉菌在小麦秋苗期往往处于潜伏状态而不表现症状，而秋苗期菌源量的高低，是第二年田间小麦白粉病早春发生强度的主要依据，春季小麦白粉病发生的早晚以及扩散强度，不仅取决于菌源的多少，还与冬季的气候条件有关（刘孝坤，1989）。Real-timePCR技术具有特异性强、灵敏度高、定量准确等优点，可以实现对小麦白粉病重要流行阶段内潜伏侵染的菌源量进行定量监测（郑亚明，2010），结合影响病害流行关键气象因子，建立该病害的早春预测预报模型，同时明确病菌潜伏侵染和病害发生的分布型和抽样技术，为小麦白粉病准确预测和防治服务。3.1材料与方法3.1.1试验材料小麦品种‘京双16’（高感白粉病）、‘众麦2号’（中抗白粉病），小麦白粉菌混合菌株（本实验室提供），各试验点田间采样叶片。3.1.2主要试验仪器及设备研钵、台式高速离心机（Eppendorf公司）、Real-timePCR仪（ABI7500）、电泳仪（北京六一仪器厂）、凝胶成像仪（Bio-Rad）、超净工作台、光照培养箱、超低温冰箱、常规PCR仪（Biometra公司）、FastPrep-24振荡仪、微量光吸收检测仪NanoDrop（ND-2000）、水浴锅、Milli-Q超纯水仪。3.1.3主要生化试剂及配制（1）0.5MEDTA（pH8.0）的配制：将186.1g的EDTA溶解于蒸馏水中，然后用NaOH溶液调节pH到8.0，用定容瓶定容到1000ml，高温高压灭菌备用。（2）1MTris-HCl（pH8.0）的配制：将12.11g的Tris溶解于蒸馏水中，用盐酸调节pH到8.0，用定容瓶定容到100ml，高温高压灭菌备用。（3）0.8%CTAB的配制：称取2.5gD-山梨醇、1gN-十二烷基氨酸、0.8gCTAB、4.7gNaCl和0.8gEDTA于烧杯内，添加10ml配制好的pH为8.0的1MTris-Cl，加入蒸馏水溶解，最后定容至100ml，调节pH到8.0，高温高压下灭菌备用。（4）氯仿。（5）异丙醇：提前放置于-20℃备用。（6）无水乙醇。（7）70%乙醇配制：将70ml的无水乙醇加入30ml蒸馏水。（8）OMEGA试剂盒。（9）TransStartTopGreenqPCRSuperMix(+DyeII)。24 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测（10）水-琼脂培养基的配制：将琼脂粉5g加入到1000ml蒸馏水中，加热溶解之后，添加0.1%苯并咪唑溶液60ml。3.2试验方法3.2.1小麦白粉菌孢子粉的收集与保存试验前期需要收集小麦白粉菌孢子粉，收集到的孢子粉进行DNA提取，然后制作小麦白粉菌DNA的标准曲线。小麦白粉菌孢子粉的收集工作主要在温室内进行，收集方法如下：（1）在超净工作台上，将小麦白粉菌接种到无菌试管苗内。（2）将接完菌种的试管苗置于16℃~20℃的温室中培养，用于繁菌。（3）在直径15cm的花盆中播种‘京双16’，并用相应直径的玻璃罩罩住，玻璃罩顶端罩上5层纱布以隔离杂菌。然后移至温室中培养6~8d，使麦苗长成第一片叶完全展开的无菌苗。（4）在超净工作台内将试管内繁殖好的带有菌种的管苗置于玻璃罩口，用镊子轻轻地敲打试管壁，同时慢慢移动试管，使孢子均匀散落在小麦叶片上。（5）18℃~20℃温室中培养4~5d，直到小麦叶片长出褪绿斑。（6）在超净工作台中，挑选带有褪绿斑的小麦叶片剪成叶段，整齐摆放在含有60μg/ml苯并咪唑的琼脂培养基的培养皿上，并且使可见褪绿斑的叶面朝上。（7）将带有叶片的培养皿在18℃光照培养箱中培养5~7d，直到分生孢子完全长出。（8）然后在超净工作台中，将摆有小麦叶片的培养皿倒扣在硫酸纸上，用镊子轻轻敲打培养皿底部，使分生孢子抖落在硫酸纸上。（9）将孢子粉收集于2.0ml冻存管中。（10）保存在-20℃的冰箱中备用。3.2.2供试材料DNA提取利用OMEGA试剂盒提取小麦白粉菌孢子粉的DNA，步骤如下：（1）65℃水浴ElutionBuffer（EB），10~20min。（2）取新的HBDNA结合柱（blue）装在收集管里，吸取200μlGPS至栓子中。（3）室温放置2~5min（4min）。（4）室温下12000×g离心2min。（5）倒弃收集管中废液，将栓子重新置于收集管中备用。（6）25mg孢子加入3颗玻璃珠，再加600μlSFG1，再加RNAase4μl，最大速度涡旋震荡20s。（7）65℃水浴15min，期间颠倒混匀2~3次。（8）加210μlSFG2，最大涡旋速度震荡15s，冰浴3min，12000×g离心10min。（9）小心地将上清液吸入OH柱中。（10）立即在10000×g下离心2min。25 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测（11）将滤液小心地吸入一新的1.5ml离心管中，尽量不要吸到杂质。（12）加1.5倍体积的SFG3，最大速度涡旋振荡15s。（13）吸650μl上层液于HB栓中，置于2ml收集管中，10000×g离心1min，弃下液，留管。（14）重复13，弃下液，留管。（15）将栓子置于一新收集管中，加入650μlSpwwashBuffer，10000×g离心1min，弃下液，留管。（16）加650μlSpwwashBuffer，10000×g离心1min，弃下液，留管。（17）最大速度离心2min。（18）将栓移至于1.5ml新离心管中，加50μl事先预热的ElutionBuffer，然后室温放置2~4min，10000×g离心1min。利用0.8%的CTAB分别提取无菌小麦叶片的DNA和田间采样叶片的DNA，步骤如下：（1）将提前配制好的0.8%的CTAB提取缓冲液置于65℃水浴锅中预热30min，将2.0ml离心管编号，待用。（2）将每个采样点的叶片放入研钵中，倒入液氮后快速研磨。（3）将研磨好的样品转入准备好的2.0ml离心管中，加入1ml65℃预热好的0.8%CTAB提取缓冲液，再加入400μl氯仿，然后将离心管反复颠倒混匀。（4）然后将离心管放入65℃水浴30min，期间每10min轻轻摇匀一次。（5）水浴完成后再冰浴20min。（6）冰浴完成后在17949×g离心机内离心20min。（7）吸取上清液700μl到一新的1.5ml离心管中，然后加入400μl氯仿，反复颠倒混匀，静置3min。（8）17949×g转速下离心10min。（9）吸取上清液500μl到一新的1.5ml离心管中，加入500μl异丙醇（-20℃），缓慢颠倒数次。（10）-20℃冰箱内静置20min。（11）然后17949×g转速下离心20min，完成后小心倒去上清液。（12）加入400μl70%乙醇进行冲洗，将离心管底部的沉淀弹起，充分洗涤，10621×g离心5min。（13）重复第12步2次，然后将酒精倒掉，晾干。（14）加入100μlddH2O，4℃溶解DNA过夜。置于-20℃保存备用。3.2.3DNA浓度的测定利用微量光吸收检测仪NanoDrop（ND-2000）测定白粉菌DNA、无菌小麦叶片DNA浓度，并记录OD260/OD280、OD260/OD230的值，然后对DNA进行不同浓度的稀释，采用曾晓葳等（2009）、郑亚明（2010）报道的白粉菌特异性引物Bgt-F/Bgt-R，小麦特异性引物Wheat-F1/R1进行Real-timePCR检测。26 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测Bgt-F:5'-AAGCTATGCGGAACTTCGTTT-3'；Bgt-R:5'-TAAGGAGTTTTGGCAAGTCCC-3'；Wheat-F1:5′-CAACCACTCTCAACGGGAA-3′；Wheat-R1:5′-TCAAAGGTCATAATGCCAGC-3′。3.2.4白粉菌引物Real-timePCR扩增和标准曲线制作-2（1）将小麦白粉菌DNA浓度稀释到1×10μg/μl，然后10倍浓度梯度稀释，使浓度梯-2-7度分别为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg（即范围为1×10~1×10μg/μl），每个浓度用引物Bgt-F/Bgt-R进行Real-timePCR扩增，重复3次，然后根据Ct值和白粉菌DNA浓度的对数值制作标准曲线。（2）Real-timePCR反应体系：TransStartTopGreenqPCRSuperMix(+DyeII)10μl引物Bgt-F（浓度5μM）0.8μl引物Bgt-R（浓度5μM）0.8μl模板2μlddH2O6.4μl总体积20μlReal-timePCR反应程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，59℃退火20s，72℃延伸34s，45个循环，在每个循环的延伸阶段（72℃）同步多次收集荧光。3.2.5小麦引物Real-timePCR扩增和标准曲线制作（1）将提取的‘京双16’叶片的DNA稀释到100ng/μl，然后10倍梯度稀释，使浓度-4-8梯度分别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg（即浓度范围为1×10~1×10mg/μl），每个浓度3个重复，每个浓度用引物Wheat-F1/Wheat-R1进行Real-timePCR扩增，重复3次，然后根据Ct值和小麦DNA浓度的对数值制作标准曲线。（2）Real-timePCR反应体系：TransStartTopGreenqPCRSuperMix(+DyeII)10μl引物Wheat-F1（浓度5μM）0.8μl引物Wheat-R1（浓度5μM）0.8μl模板2μlddH2O6.4μl总体积20μlReal-timePCR反应程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，65℃退火延伸34s，40个循环，在每个循环的退火延伸阶段（65℃）同步多次收集荧光。27 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测3.2.6田间取样（1）自然发病区采样：于小麦白粉病不同发生流行区的河南巩义和林州、陕西的眉县和岐山县、北京的房山选取有代表性的小麦田块作为采样点（表3.1），在小麦的分蘖期（GS22）进行田间采样。北京房山分别于2013年12月9日和2014年12月9日进行采样，河南巩义分别于2013年12月27日和2015年1月11日进行采样，河南林州分别于2013年12月25日和2015年1月10日进行采样，陕西岐山县、眉县分别于2013年12月28日和2014年12月6日进行采样。所有田块均采集小麦的第一片叶，每个田块设90个小区，每个小区采10张叶片作为一个样品提取DNA，每个田块共90份DNA样品，然后分别进行小麦白粉菌及小麦的Real-timePCR扩增。（2）人工接种区采样：2013年12月20日和2014年12月18日在中国农业科学院植物保护研究所农场小麦试验田（2013年10月7日播种小麦，11月19日接种白粉菌；2014年10月9日播种，11月17日田间人工接种小麦白粉病菌）进行采样（表3.1），分别从‘京双16’种植区和‘众麦2号’种植区采样，每个种植区采集120个样，共240个样，每个样点采集10片叶，采取的叶片提取DNA，分别进行小麦白粉菌及小麦的Real-timePCR扩增。（3）采样点病害调查：冬季采样之后，于第二年早春对病害进行调查（表3.1）。河北廊坊分别于2014年4月29日和2015年4月22日进行调查；北京房山分别于2014年5月2日和2015年5月4日调查；陕西眉县分别于2014年4月17日和2015年4月17日进行病害调查；河南巩义分别于2014年4月15日和2015年4月12日调查；河南林州分别于2014年4月13日和2015年4月11日调查。由于采样时每个点采10片叶，所以每点相对应地调查10茎小麦，将该点10个调查数据利用“九级法”即可计算得到该采样点对应的病情指数（DiseaseIndex，DI）。其中，i为发病级数，ni为发病级数为i的病株数。表3.1采集地信息汇总Table3.1Summaryofthesamplingspotinthisstudy采样地点采样时间采样量调查时间河北廊坊2014-12-182402015-4-22北京房山2014-12-11902015-5-4陕西眉县2014-12-6902015-4-17河南林州2015-1-10902015-4-11河南巩义2015-1-11902015-4-12河北廊坊2013-12-202402014-4-29北京房山2013-12-9902014-5-2河南林州2013-12-25902014-4-13河南巩义2013-12-27902014-4-15陕西岐山2013-12-28902014-4-1728 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测3.2.7数据分析（1）小麦白粉菌DNA与小麦DNA的量通过各自标准曲线计算获得，计算分子病情指数（MDX），MDX与病情指数（DX）的相关关系通过SAS统计软件的CORR程序进行分析，同一地块不同小区取样的MDX和调查病情指数DX的田间分布情况应用SURFER软件（GoldenSoftware,Surfer8.0）进行作图分析。基于MDX、MDX和气象因素的小麦白粉病早春预测模型通过SAS软件的REG程序进行回归分析。（2）利用田间病害调查数据计算每个田块病害的聚集度指标（扩散系数C、丛生指数I、CA指标、聚集性指标m*/m），采用Iwao的m*-m回归分析法分析病害的分布格局，采用Iwao的理论抽样数模型确定不同情况下的最适理论抽样数，建立此病害的田间取样技术。2（3）模型精度主要是通过估算值与实测值的回归系数（R）和均方根误差RMSE(RootMeanSquareError)来验证。RMSE计算公式为：n2(Yy)iii1RMSEn式中：Yi，yi分别为估算值和实测值。3.3结果与分析3.3.1小麦白粉病早春田间调查的理论抽样模型根据表中各测度指标参数可以看出（表3.2），在北京房山，河南林州、巩义，陕西眉县、岐山等田间自然发病地块，每个田块病害的聚集度指标I和CA均大于0，m*/m和C均大于1，表明早春小麦白粉病在田间发生呈聚集分布；在人工接菌的河北廊坊地区，在2014年度‘京双16’种植区和‘众麦2号’种植区早春小麦白粉病发生呈聚集分布，而2015年则呈随机分布。表3.2小麦白粉病早春发生的田间分布型Table3.2Spatialdistributionpatternofwheatpowderymildewindifferentfields地区年度xs²m*Im*/mCAC分布型房山20150.951.851.900.941.990.991.94聚集分布林州201415.74230.2529.3713.631.870.8714.63聚集分布林州201511.51103.5219.507.991.690.698.99聚集分布巩义201414.57249.6530.7116.142.111.1117.14聚集分布巩义20151.572.492.160.591.380.381.59聚集分布岐山20140.360.390.450.091.250.251.09聚集分布眉县201523.14239.1032.479.331.400.4010.33聚集分布廊坊京双16区20149.9829.4511.931.951.200.202.95聚集分布廊坊众麦2号区20141.421.591.550.121.090.091.13聚集分布廊坊京双16区20155.152.964.720.420.920.080.58随机分布廊坊众麦2号区20151.951.331.63-0.320.84-0.160.68随机分布29 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测采用Iwao(1977)提出的m*−m回归分析法即m*=α+βx得到：m*=0.47+1.60xα=0.47＞0表明个体间相互吸引，分布的基本成分为个体群；β=1.60＞1，也表明小麦白粉病田间分布为聚集分布。应用Iwao(1977)的理论抽样原理，建立理论抽样模型:22N=t[(α+1)/x+β－1]/D式中，N为最适抽样数，D为允许误差，t为概率保证值(实际调查中t=1），x为平均病情指数，α、β为m*=α+βx直线回归方程的常数。然后求出小麦白粉病田间发生的理论抽样模型:2N=(1.47/x+0.60)/D根据Iwao统计方法，在允许一定误差值（设D=0.05、0.1、0.15、0.2）的前提下，应2用理论抽样数模型N=(1.47/x+0.60)/D，即可求得田间小麦白粉病不同发病程度与不同精度要求下应抽取的理论抽样数（表3.3），可以看出随着田间病情指数的增大，抽样数减少；允许误差越大，抽样数越小。表3.3早春小麦白粉病田间调查的理论抽样数Table3.3Theoptimumsamplingnumberofwheatpowderymildewforfielddiseaseinvestigation病情指数允许误差0.10.515102040501000.05612014168283582992692552522460.115303542078975676463610.15680157924033302828270.238389522219171616153.3.2小麦白粉病分子检测的理论抽样模型根据表中各测度指标参数可以看出（表3.4），在北京房山，河南林州、巩义，陕西眉县、岐山县等田间自然发病地块，每个采样田块检测到的分子病情指数的聚集度指标I和CA均大于0，m*/m和C均大于1，表明潜伏侵染的小麦白粉菌呈聚集分布。采用Iwao(1977)提出的m*−m回归分析法即m*=α+βx得到：m*=0.73+1.99xα=0.73＞0表明个体间相互吸引，分布的基本成分为个体群；β=1.99＞1，也表明小麦白粉病的分子病情指数为聚集分布。应用Iwao(1977)的理论抽样原理，建立理论抽样模型:22N=t[(α+1)/x+β－1]/D式中，N为最适抽样数，D为允许误差，t为概率保证值（实际调查中t=1），x为平均分子病情指数，α、β为m*=α+βx直线回归方程的常数。然后求出小麦白粉病用于分子检测的理论抽样模型:2N=(1.73/x+0.99)/D30 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测表3.4小麦秋苗潜伏侵染白粉菌的田间分布型Table3.4SpatialdistributionpatternandparametersofBgtoflatentinfectionindifferentfields地区年度xs²m*Im*/mCAC分布型房山20152.6723.8310.597.913.962.968.91聚集分布林州20141.424.013.241.822.281.282.82聚集分布林州20151.161.451.410.251.210.211.25聚集分布巩义20142.4610.365.673.212.301.304.21聚集分布巩义20157.7792.8218.7210.942.411.4111.94聚集分布岐山20141.969.795.964.043.052.055.00聚集分布眉县20152.4011.676.263.862.611.614.86聚集分布廊坊京双1620141.663.842.971.311.790.792.31聚集分布廊坊众麦2号20146.2037.8011.305.041.810.816.04聚集分布廊坊京双1620155.7528.209.653.911.680.684.91聚集分布廊坊众麦2号20153.5112.015.932.421.690.693.42聚集分布根据Iwao统计方法，在允许一定误差值（设D=0.05、0.1、0.15、0.2）的前提下，应2用理论抽样数模型N=(1.73/x+0.99)/D，即可求得用于小麦白粉病分子检测的在不同发病程度与不同精度要求下应抽取的理论抽样数（表3.5）。随着分子病情指数的增大，抽样数减少，允许误差越大，抽样数越小。表3.5小麦白粉病菌潜伏侵染量分子检测的理论抽样数Table3.5TheoptimumsamplingnumberofBgtformoleculardetection允许分子病情指数误差0.10.515102040501000.057316178010885344654314134104030.118294452721341161081031021010.158131981215952484646450.2457111683329272626253.3.3小麦白粉菌和小麦叶片的标准曲线-2-7将提取的小麦白粉菌孢子粉的DNA10倍浓度梯度稀释，使浓度范围为1×10~1×10μg/μl（即浓度分别为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg），利用引物Bgt-F/Bgt-R制2作标准曲线，标准曲线为：y=-0.3242x+3.3907（R=0.9927,P<0.0001），如图3.1所示。-4-8将无菌小麦叶片的DNA浓度梯度稀释，使浓度为1×10~1×10mg/μl（100ng、10ng、1ng、2100pg、10pg），利用引物Wheat-F1/Wheat-R1制作标准曲线为：y=-0.3037x+1.6521（R=0.9966,P<0.0001）（图3.1）。其中x表示Real-timePCR的Ct值，y表示DNA浓度的对数值。31 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测0-3-1-4y=-0.3037x+1.6521y=-0.3242x+3.39072-22R=0.9966R=0.9927-5-3-4-6-5LogconcentrationLogconcentration-7-6-8-7-8-91015202530351518212427303336CtCt图3.1小麦白粉菌和小麦叶片的Real-timePCR扩增标准曲线（左：小麦白粉菌；右：小麦叶片）Fig.3.1StandardcurveofprimerpairsofBgt-F/Bgt-R(left)andWheat-F1/Wheat-R1(right)3.3.4小麦白粉菌潜伏期侵染菌源量和田间病害的分布本研究利用SURFER软件（GoldenSoftware,Surfer8.0）分别对不同年度、不同小区病害调查的病情指数（DX）和取样的分子病情指数（MDX）的田间分布情况作图分析。2013-2014年度河南省林州市采样结果表明，所采样品的MDX田间分布有5个潜育侵染中心（图3.2，右），其中4个潜育中心位于图的上半部分，另一个潜育程度较轻，位于图的右下方。田间DX的分布（图3.2，左）测到了5个发病中心，位置与利用Real-timePCR检测到的潜育中心基本吻合。对MDX与DX进行相关性分析，发现MDX与DX具有极显著相关性，相关系数为0.8679，P<0.0001。线性回归分析结果（图3.3）表明，田间病情指数DX2与MDX的关系模型为：y=580.27x+2.10，R=0.5925，P<0.0001。25252020480.09151542360.083010100.0624180.0451250.026000.520.51.52.5图3.22013-2014年度河南省林州市小麦白粉病DX与MDX的田间分布（左：DX，右：MDX）Fig.3.2FielddistributionofDXandMDXofBgtinLinzhou,HenanProvincein2013-2014(Left:DX,Right:MDX)32 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测70y=580.27x+7.48412R=0.592560504030Diseaseindex2010000.020.040.060.080.10.12Moleculardiseaseindex图3.32013-2014年河南省林州市地区小麦白粉病DX与MDX的回归分析Fig.3.3LinerregressionofDXandMDXofBgtinLinzhou,HenanProvincein2013-20142014-2015年度河南省林州市采样结果表明，所采样品MDX田间分布有7个不同程度的潜育中心。最严重的在图的最下方（图3.4右），其次还有6个潜育程度较轻的潜育中心，其中有4个分布在图的中间部分，另外两个分布在图的上部。田间实际调查获得的DX分布表明有7个发病中心（图3.4左），最严重的两个发病中心位于图的最下方，发病较重（DX为30~40），这两个发病中心只有一个被Real-timePCR测到其潜伏侵染量较大。另外6个发病中心发病程度均低于35，其潜育程度也被Real-timePCR相应地检测到。对MDX与DX进行相关性分析，发现MDX与DX具有极显著相关性，相关系数为0.8521，P<0.0001。线性回归分析结果（图3.5）表明，田间病情指数DX与MDX的关系模型为：y=715.96x+3.18，2R=0.7260，P<0.0001。252520201515450.06400.05103510300.04250.0320550.0215100.015000.51.52.50.52图3.42014-2015年河南省林州市小麦白粉病DX与MDX的田间分布（左：DX，右：MDX）Fig.3.4FielddistributionofDXandMDXofBgtinLinzhou,HenanProvincein2014-2015(Left:DX,Right:MDX)33 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测60y=715.96x+3.18250R=0.7264030Diseaseindex2010000.010.020.030.040.050.060.07Moleculardiseaseindex图3.52014-2015年度河南省林州市地区小麦白粉病DX与MDX的回归分析Fig.3.5LinerregressionofDXandMDXofBgtinLinzhou,HenanProvincein2014-20152013-2014年河南省巩义市采样结果表明，所采样品MDX在田间有3个潜育中心（图3.6右），最主要的潜育中心分布在图的最下方，其余的两个潜育中心较小，潜育也较轻。田间实际病情调查发现有1个大的发病区（图3.6左），该发病区内有3个相连的不同程度的发病中心，DX在40~60之间，该发病区正是被Real-timePCR测得的潜育中心。另外2个检测到的小潜育中心并未形成发病中心，田间轻微发病。对MDX与DX进行相关性分析，发现MDX与DX具有极显著相关性，相关系数为0.8679，P<0.0001。线性回归分析结果（图23.7）表明，田间病情指数DX与MDX的病情指数关系模型为：y=506.39x+2.10，R=0.7532，P<0.0001。202018181616141412127210100.12640.18568480.0864060.063244240.0416220.0280.51.52.500.51.52.50图3.62013-2014年度河南省巩义市小麦白粉病DX与MDX的田间分布（左：DX，右：MDX）Fig.3.6FielddistributionofDXandMDXofBgtinGongyi,HenanProvincein2013-2014(Left:DX,Right:MDX)34 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测8070y=506.39x+2.09912R=0.7532605040Diseaseindex302010000.020.040.060.080.10.12Moleculardiseadeindex图3.72013-2014年河南省巩义市小麦白粉病DX与MDX的回归分析Fig.3.7LinerregressionofDXandMDXofBgtinGongyi,HenanProvincein2013-20142014-2015年河南省巩义市采样结果表明，整体上所采样品MDX在田间有6个不同程度的潜育中心（图3.8右），最主要的4个潜育中心分布在图的中间部分，其余的两个潜育中心较小，潜育也较轻，分别在图的上方和下方。田间实际病情调查发现有3个大的发病区（图3.8左），每个发病区内都有2~3个相连的不同程度的发病中心，DX在4~7之间，这3个发病区基本与Real-timePCR测得的潜育中心一致。另外两个检测到的小潜育中心并未形成发病中心，田间轻微发病。对DX与MDX进行相关性分析，发现DX与MDX具有极显著相关性，相关系数为0.8088，P<0.0001。线性回归分析结果（图3.9）表明，田间病情指2数DX与分子病情指数MDX的关系模型为：y=131.84x+0.5432，R=0.6542，P<0.0001。25252020151570.0460.0325101040.02430.0165520.0081000.51.52.50.51.52.5图3.82014-2015年河南省巩义市小麦白粉病DX与MDX的田间分布（左：DX，右：MDX）Fig.3.8FielddistributionofDXandMDXofBgtinGongyi,HenanProvincein2014-2015(Left:DX,Right:MDX)35 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测8y=131.84x+0.543227R=0.6542654Diseaseindex321000.010.020.030.040.05Moleculardiseaseindex图3.92014-2015年河南省巩义市小麦白粉病DX与MDX的回归分析Fig.3.9LinerregressionofDXandMDXofBgtinGongyi,HenanProvincein2014-20152013-2014年陕西省岐山县采样结果表明，整体上所采样品MDX在田间有多个不同程度的潜育中心（图3.10右），最主要的2个潜育中心分布在图的中间和中下部，其余的8个潜育中心较小，潜育也很轻，分别在图的中上方和底部。田间实际病情调查发现有1个大的发病区和1个小的发病中心（图3.10左），大发病区内有5个相连的的发病中心，另一个发病中心在图的左下角，DX均在1~2.5之间，发病较轻，这几个发病中心基本与Real-timePCR测得的潜育中心一致，只有中间一个未被Real-timePCR完全检测到。其他检测到的小潜育中心田间轻微发病。对DX与MDX进行相关性分析，发现DX与MDX具有极显著相关性，相关系数为0.7454，P<0.0001。线性回归分析结果（图3.11）表明，田间病情指数DX与分2子病情指数MDX的关系模型为：y=148.09x+0.0685，R=0.5557，P<0.0001。25252020151520.01510101.60.0120.0091.2550.0060.80.0030.400.5200.51.52.5图3.102013-2014年度陕西省岐山县小麦白粉病DX与MDX的田间分布（左：DX，右：MDX）Fig.3.10FielddistributionofDXandMDXofBgtinMeixian,ShaanxiProvincein2013-2014(Left:DX,Rght:MDX)36 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测2.5y=148.09x+0.06852R=0.555721.51Diseaseindex0.5000.0020.0040.0060.0080.010.0120.0140.016Moleculardiseaseindex图3.112013-2014年陕西省岐山县小麦白粉病DX与MDX的回归分析Fig.3.11LinerregressionofDXandMDXofBgtinQishan,ShaanxiProvincein2013-20142014-2015年度陕西省眉县采样地块表明，整体上所采样品MDX在田间有3个不同程度的潜育中心（图3.12右），分别分布在图的左上角、中下部和下部。田间实际病情调查发现有5个发病中心（图3.12左），有3个大发病中心位于图的中间和中上部，DX在30~50之间，严重的小区能达到50~60，一个发病中心在图的中下部，发病较轻，另一个发病中心在图的底部，DX在10~40之间。这几个发病中心只有在最上部和最下部的两个与Real-timePCR测得的潜育中心一致，其他的发病中心未被Real-timePCR检测到。对DX与MDX进行相关性分析，发现DX与MDX具有极显著相关性，相关系数为0.7879，P<0.0001。线性回归分析结果（图3.13）表明，田间病情指数DX与分子病情指数MDX的关系模型为：2y=228.51x+8.766，R=0.6208，P<0.0001。2222202018181616141412121010600.1785080.1640660.1230440.0820220.0410000.51.52.50.51.52.5图3.122014-2015年度陕西省眉县小麦白粉病DX与MDX的田间分布（左：病情指数，右：MDX）Fig.3.12FielddistributionofDXandMDXofBgtinMeixian,ShaanxiProvincein2014-2015(Left:DX,Right:MDX)37 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测y=228.51x+8.766502R=0.6208403020Diseaseindex10000.050.10.150.2Moleculardiseaseindex图3.132014-2015年陕西省眉县小麦白粉病DX与MDX的回归分析Fig.3.13LinerregressionofDXandMDXofBgtinMeixian,ShaanxiProvincein2014-20152014-2015年北京市房山区采样地块表明，整体上所采样品MDX在田间有多个不同程度的小的潜育中心（图3.14右），分别分布在图的各个部位。田间实际病情调查发现有5个发病中心（图3.14左），DX在1~6.5之间，这5个发病中心与Real-timePCR测得的潜育中心基本相对应，其他测得的潜育中心在田间轻微发病或者不发病。对DX与MDX进行相关性分析，发现DX与MDX具有极显著相关性，相关系数为0.6188，P<0.0001。线性回归分析结果（图3.15）表明，田间病情指数DX与分子病情指数MDX的关系模型为：2y=172.58x+0.4892，R=0.3829，P<0.0001。2525202015156.50.016106100.01550.01240.0093550.00620.0031000.51.52.50.51.52.5图3.142014-2015年北京市房山区小麦白粉病DX与MDX的田间分布（左：DX，右：MDX）Fig.3.14FielddistributionofDXandMDXofBgtinFangShan,Beijingin2014-2015(Left:DX,Right:MDX)38 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测7y=172.58x+0.489226R=0.3829543Diseaseindex21000.0050.010.0150.02Moleculardiseaseindex图3.152014-2015年北京市房山区小麦白粉病DX与MDX的回归分析Fig.3.15LinerregressionofDXandMDXofBgtinFangShan,Beijingin2014-20152013-2014年度河北省廊坊市中国农业科学院植物保护研究所实验基地‘京双16’采样区地块表明，整体上所采样品MDX在田间有6个不同程度的潜育中心（图3.16右），分别分布在图的中上部和中下部。田间实际病情调查发现有6个发病中心（图3.16左），DX在10~20之间，其中5个发病中心与Real-timePCR测得的潜育中心基本一致，仅最底部发病中心未被检测到。对DX与MDX进行相关性分析，发现DX与MDX具有极显著相关性，相关系数为0.7757，P<0.0001。线性回归分析结果（图3.17）表明，田间病情指数DX与2MDX的病情指数关系模型为：y=214.85x+6.408，R=0.6017，P<0.0001。1818161614141212310.11010250.0988200.0766150.0541040.0350.0122002424图3.162013-2014年河北省廊坊市‘京双16’种植区内小麦白粉病DX与MDX的田间分布（左：DX，右：MDX）Fig.3.16FielddistributionofDXandMDXofBgtin‘Jingshuang16’plantingareainLangfang,HebeiProvincein2013-2014(Left:DX,Right:MDX)39 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测40y=214.85x+6.408235R=0.6017302520Diseaseindex15105000.020.040.060.080.10.12Moleculardiseaseindex图3.172013-2014年河北省廊坊市‘京双16’种植区内小麦白粉病DX与MDX的回归分析Fig.3.17LinerregressionofDXandMDXofBgtin‘Jingshuang16’plantingareaintLangfang,HebeiProvincein2013-20142013-2014年度河北省廊坊市中国农业科学院植物保护研究所实验基地‘众麦2号’采样结果表明，整体上所采样品MDX在田间有13个不同程度的潜育中心（图3.18右）。田间实际病情调查发现只有2个发病中心（图3.18左），DX在3~9之间，第1个大发病中心位置处Real-timePCR只检测到轻度潜育，第二个小发病中心与Real-timePCR测得的潜育中心基本一致，而其他检测到的潜育中心基本轻微发病或者未发病。对DX与MDX进行相关性分析，发现DX与MDX具有极显著相关性，相关系数为0.3742，P<0.0001。线性回归分析结果（图3.19）表明，田间病情指数DX与分子病情指数MDX的关系模型为：2y=67.92x+0.9710，R=0.1401，P<0.0001。虽然存在极显著相关性，但相关系数较低。18181616141412121010100.0259880.02760.0156540.01340.005212002424图3.182013-2014年度河北省廊坊市‘众麦2号’种植区内小麦白粉病DX与MDX的田间分布情况（左：DX，右：MDX）Fig.3.18FielddistributionofDXandMDXofBgtinthe‘Zhongmai2’plantingareainLangfang,HebeiProvincein2013-2014(Left:DX,Right:MDX)40 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测8y=67.922x+0.97172R=0.1401654Diseaseindex321000.0050.010.0150.020.0250.03Moleculardiseaseindex图3.192013-2014年河北省廊坊市‘众麦2号’种植区内小麦白粉病DX与MDX的回归分析Fig.3.19LinerregressionofDXandMDXofBgtinthe‘Zhongmai2’plantingareainLangfang,HebeiProvincein2013-20142014-2015年河北省廊坊市中国农业科学院植物保护研究所实验基地‘京双16’采样结果表明，整体上所采样品MDX在田间有多个不同程度的潜育中心（图3.20右），分布在图的不同位置，田间实际病情调查发现有6个不同程度的发病中心（图3.20左），DX在3~9之间，这6个发病中心与Real-timePCR测得的潜育中心基本一致，有的发病中心可对应多个潜育中心。对DX与MDX进行相关性分析，发现DX与MDX具有极显著相关性，相关系数为0.5168，P<0.0001。线性回归分析结果（图3.21）表明，田间病情指数DX与分子病2情指数MDX的关系模型为：y=167.49x+4.1857，R=0.2671，P<0.0001。353530302525202015150.02490.02710100.01650.0123550.00810.004000.520.52图3.202014-2015年度河北省廊坊市‘京双16’种植区内小麦白粉病DX与MDX的田间分布（左：DX，右：MDX）Fig.3.20FielddistributionofDXandMDXofBgtin‘Jingshuang16’plantingareainLangfang,HebeiProvincein2014-2015(Left:DX,Right:MDX)41 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测y=167.49x+4.1857122R=0.26711086Diseaseindex42000.0050.010.0150.020.0250.03Moleculardiseaseindex图3.212014-2015年河北省廊坊市‘京双16’种植区内小麦白粉病DX与MDX的回归分析Fig.3.21LinerregressionofDXandMDXofBgtin‘Jingshuang16’plantingareainLangfang,HebeiProvincein2014-20152014-2015年河北省廊坊市中国农业科学院植物保护研究所实验基地‘众麦2号’采样结果表明，整体上所采样品MDX在田间有多个不同程度的潜育中心（图3.22右），主要分布在图的中部和中上部。田间实际病情调查发现有多个发病中心（图3.22左），DX在3~5之间，发病中心与Real-timePCR检测到的潜育中心大部分吻合，但有的发病中心可对应多个潜育中心。对DX与MDX进行相关性分析，发现DX与MDX具有极显著相关性，相关系数为0.5989，P<0.0001。线性回归分析结果（图3.23）表明，田间病情指数DX与MDX2的病情指数关系模型为：y=199.09x+1.2555，R=0.3587，P<0.0001。353530302525202050.01540.012151530.009101020.0065510.0030.5200.520图3.222014-2015年河北省廊坊市‘众麦2号’种植区内小麦白粉病的DX与MDX的田间分布（左：DX，右：MDX）Fig.3.22FielddistributionofDXandMDXofBgtinthe‘Zhongmai2’plantingareainLangfang,HebeiProvincein2014-2015(Left:DX,Right:MDX)42 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测6y=199.09x+1.255552R=0.358743Diseaseindex21000.0020.0040.0060.0080.010.0120.0140.016Moleculardiseaseindex图3.232014-2015年河北省廊坊市‘众麦2号’种植区内小麦白粉病DX与MDX的回归分析Fig.3.23LinerregressionofDXandMDXofBgtin‘Zhongmai2’plantingareainLangfang,HebeiProvincein2014-20153.3.5基于MDX的小麦白粉病早春预测将每年度河北廊坊，北京房山，河南巩义、林州，陕西眉县、岐山县等每个地区的白粉菌DNA量、小麦DNA量、MDX、DX分别取平均值，然后分别与DX做相关分析（表3.6），结果发现DX与白粉菌DNA含量和MDX极显著相关，相关系数分别为0.8099、0.8184，与小麦DNA含量无显著相关性。表3.6小麦白粉病病情指数与白粉菌DNA含量、小麦DNA含量、分子病情指数的相关性分析Table3.6CorrelationbetweendiseaseindexofwheatpowderymildewandtheamountofDNAofBgt,theamountofDNAofwheat,andmoleculardiseaseindexParameter白粉菌DNA量小麦DNA量MDXr=0.81r=0.48r=0.86DXP=0.0025P=0.1354P=0.0008建立基于MDX的小麦白粉病早春病害预测模型(图3.24)：y=686.29x-0.7462（R²=0.7336，F=24.78，P=0.0008），模型达到极显著拟合效果。进一步对DX的实测值和模型的拟合值的回归分析发现(图3.25)，小麦白粉病早春发病的观察值和实测值之间的回归系数（R²）为0.7336，均方根误差为10.14。43 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测18y=686.29x-0.7462216R=0.73361412108Diseaseindex642000.0050.010.0150.020.0250.03Moleculardiseaseindex图3.24基于MDX的小麦白粉病早春病害预测模型Fig.3.24PredictionmodelofwheatpowderymildewofearlyspringbasedonMDX18y=0.7336x+1.87512R=0.733615129Fittedvalue63005101520Observedvalue图3.25基于MDX所建小麦白粉病预测模型的实测值和估计值的比较Fig.3.25ComparisonofthefittedvalueandtheobservedvalueofdiseaseindexofwheatpowderymildewforthemodelsbasedonMDX3.3.6基于MDX和气象因素的小麦白粉病早春预测将每年度河北廊坊，北京房山，河南巩义、林州，陕西眉县、岐山县等每个地区的1月、2月、3月的空气温度、相对湿度、地表5cm土壤温度分别取平均值，然后分别与病情指数做相关分析（表3.7），结果发现1-3月的平均空气温度与田间病情指数显著相关，相关系数为0.8189；而1-2月的空气平均温度、平均相对湿度、平均土壤温度与田间病情指数无显著相关性。表3.7小麦白粉病病情指数与空气温度、空气相对湿度、土壤温度的相关性分析Table3.7Correlationbetweendiseaseindexofwheatpowderymildewandairtemperature,airrelativehumidity,andsoiltemperature1-2月均值1-3月均值参数空气空气相对土壤空气空气相对土壤温度湿度温度温度湿度温度r=0.80r=-0.72r=0.66r=0.82r=-0.71r=0.79病情指数P=0.0556P=0.1074P=0.1513P=0.0462P=0.1109P=0.06344 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测在相关性分析的基础上，选取1-3月的空气平均温度、MDX建立小麦白粉病的早春预测模型：y=713.45x1+0.1767x2-1.64（R²=0.8014，F=10.09，P=0.0176）其中y为病情指数，x1为MDX，x2为1-3月平均空气温度。模型达到极显著拟合效果，可以用于小麦白粉病的早春预测。3.4讨论本研究利用扩散系数C、丛生指数I、CA指标、聚块性指标m*/m等几个测度指标对北京房山，河南林州、巩义，陕西眉县、岐山县等田间自然发病地块以及河北廊坊人工接种地块的田间小麦白粉病分布型进行分析，发现自然发病地区的早春小麦白粉病在田间发生呈聚集分布，这主要是因为小麦是典型的气传性病害，越夏菌源是小麦秋苗发病的主要来源，田间早春发病主要是越夏菌源传播到秋苗，越冬之后条件合适时开始发病，逐渐成为次年的发病中心（刘孝坤，1989）。而在人工接菌的河北廊坊地区，由于田块内大面积接种白粉菌后，孢子随机扩散，侵染田间的小麦叶片，当孢子在田间扩散均匀时，第二年小麦白粉病呈均匀分布，反之，则呈聚集分布，因此本研究中发现，在2014年度‘京双16’种植区和‘众麦2号’种植区早春小麦白粉病在田间发生呈聚集分布，而2015年则呈随机分布。利用Iwao（1977）的理论抽样原理推导出了小麦白粉病田间发生的理论抽样模型，通过该模型可以计算出田间调查理论抽样数量，利用该模型可以避免因抽样数量不足而引起的试验误差，并可以用于指导田间病害调查取样数量。本研究通过对田间病情和Real-timePCR检测的潜伏侵染菌源量的分布发现，在自然发病地区（林州、房山、巩义、眉县、岐山）的田块内有明显的发病中心和潜伏侵染菌源中心，这直观上表现出自然发病地区的小麦白粉病在田间呈聚集分布，由各个地区的田间分布图可以看出，自然发病地区的发病中心或者菌源中心多位于田间地头或者地边上，这主要是因为地块周边自生麦苗上的越夏菌源孢子传播所致，田间周边传播量最多，田间内传播量少。通过对发病中心和Real-timePCR检测到的潜育中心对比分析发现，河南巩义、林州，陕西眉县、岐山县等地区检测到的潜育中心大部分与发病中心吻合，表明Real-timePCR检测可以用于指导田间发病中心的防治，针对潜育中心重点喷药；对于人工接菌的河北廊坊地区，‘京双16’种植区为高感白粉病种植区，所检测出的潜育中心多于发病中心，但基本与发病中心相吻合；而‘众麦2号’种植区为中抗白粉病种植区，尤其2014年检测到多个潜育中心，第二年却无相应的发病中心，表明品种抗性会有一定影响。整体上，不同地区不同田块内的MDX与DX均存在极显著相关性，但林州、巩义、眉县、岐山县等地区相关性较高，而房山、廊坊地区内的MDX与DX相关性较低，这主要与房山地区菌源量较少，发病较轻有关，廊坊地区可能受人工接种影响，田间侵染没有明显的梯度，尤其‘众麦2号’自身抗病性，使得田间发病较轻，导致MDX与DX相关性系数较小；另一方面北京房山、河北廊坊地区冬季温度较低，对潜伏侵染的菌源越冬也会产生一定影响。应用Real-timePCR技术建立标准曲线定量获得潜伏侵染菌源量的结果已得到大量应用（Brouwer等，2003；Gachon和Saindrenan，2004；Gayoso等，2007），郑亚明（2010年）建45 中国农业科学院博士学位论文第三章基于潜伏侵染菌源量的小麦白粉病早春预测立了小麦白粉菌潜伏侵染菌源量的Real-timePCR技术，本研究在此技术基础之上，利用Real-timePCR对不同田块内秋苗潜伏侵染的白粉菌进行定量，建立了基于MDX的小麦白粉菌早春预测模型，模型达到极显著拟合效果，可以用于小麦白粉病的早春预测。但小麦白粉病菌越冬后的菌量是直接影响春季小麦白粉病发生和流行强度的重要因子，病菌越冬存活率主要受冬季气温和湿度的影响（刘孝坤，1989；刘万才和邵振润，1994；何家泌和何文兰，1998）。而关于气象因素与田间病情关系的研究已有许多报道（曹克强等，1994；邵振润等，1996；Beest等，2008；闫小珍，2010；Liu等，2015），本研究也发现小麦白粉病的田间病情与1-3月的平均空气温度显著相关，建立了基于1-3月的空气平均温度和MDX的早春小麦白粉病预测模型，用来预测早春小麦白粉病的发生，以期更好地为指导病害防治服务。46 中国农业科学院博士学位论文第四章小麦白粉菌分生孢子田间传播的定量研究第四章小麦白粉菌分生孢子田间传播的定量研究小麦白粉病属多循环气传性真菌病害，病菌分生孢子随气流传播是引起田间、邻近区域甚至远距离寄主发病和流行的主要原因之一，因此，研究小麦生长季节空气中病菌孢子的传播距离和传播量，对于预测病害的发生流行程度和指导制定田间防治策略具有重要意义。随着孢子捕捉技术的发展，利用定容式孢子捕捉器可以直接捕捉到距菌源中心不同距离处的分生孢子量，从而达到对病菌传播距离和传播量进行定量分析的目的。关于利用定容式孢子捕捉器定量研究小麦白粉菌分生孢子传播距离和传播量的关系的研究鲜有报道，本研究于2015-2017年采用定容式孢子捕捉器，在水平方向上对距菌源中心不同距离处的孢子进行捕捉，分析不同方向和不同距离处孢子捕捉量之间以及孢子捕捉量与风速、风向、传播距离的关系，此研究结果为定量研究小麦白粉病田间传播梯度规律奠定基础。4.1材料与方法4.1.1供试材料和仪器菌源中心所种小麦品种为‘京双16’（高感白粉病），接种菌株为小麦白粉菌混合菌种，由中国农业科学院植物保护研究所小麦白粉病组提供。病菌孢子捕捉仪器为Sporewatch定容式孢子捕捉器（英国Burkard公司生产），气象数据收集装置为Dynamet科研级自动气象站（美国Dynamax公司生产），病菌孢子观察统计装置为奥林巴斯BX43生物显微镜（日本OLYMPUS公司生产）。4.1.2试验方法2015-2017年连续3年于中国农业科学院植物保护研究所廊坊中试基地（39.5°N，116.6°E）进行试验，分别于2014年10月15日、2015年10月13日和2016年10月13日2播种‘京双16’作为诱发中心，按照正常种植密度（120kg/hm）进行播种，种植行距为225cm，面积7m×5m=35m。为确保菌源中心的形成，分别于2015年3月23日、2016年3月24日和2017年3月22日将在温室内繁殖好的小麦白粉菌盆栽苗接种于诱发中心，每年接种20盆。诱发中心四周100m范围内设为空地，以排除外来菌源的影响。于每年4月15日安放孢子捕捉器。2015年安放4台，分别于诱发中心北侧和东侧20m（N1，E1）、40m（N2，E2）处各安放一台；2016年安放7台，于诱发中心处（M）安放一台，然后在诱发中心北侧和东侧20m（N1，E1）、40m（N2，E2）、60m（N3，E3）处各安放一台；2017年安放7台，于诱发中心处（M）安放一台，然后在诱发中心北侧2m、4m、8m、16m、32m、64m处各安放一台，三年度所有捕捉器的进气口距地面均为0.6m。之后每7天给捕捉器换鼓并获取鼓上的捕捉带，将吸附有孢子的捕捉带平均剪成7段，每段48mm代表1天，将捕捉带粘附在载玻片上，置于奥林巴斯显微镜（日本）下计数。每段按捕捉鼓移动方向检查8次，然后得出每日孢子捕捉量。安放孢子捕捉器后，每7天换一次47 中国农业科学院博士学位论文第四章小麦白粉菌分生孢子田间传播的定量研究鼓，换鼓的同时对菌源中心处的发病情况进行调查，共调查100茎，分级标准参照改进后的“0~9”级法进行，并计算病情指数（DiseaseIndex，DI）。其中，i为发病级数，ni为发病级数为i的病株数。4.1.3数据分析利用SAS（Version9.1）软件进行。其中空气中距菌源中心不同距离处各白粉菌分生孢子捕捉量之间的相关性以及各孢子捕捉量与气象因子的相关性分析采用CORR程序，用线性回归程序建立基于孢子捕捉量的分生孢子传播距离预测模型。4.1.4模型的检验2模型精度主要是通过估算值与实测值的回归系数（R）和均方根误差RMSE(RootMeanSquareError)来验证。RMSE计算公式为：n2(Yy)iii1RMSEn式中：Yi，yi分别为估算值和实测值。4.2结果与分析4.2.1距菌源中心不同距离处孢子捕捉量与冠层风的关系由图4.1看出三个生长季节内冠层日平均风速多数在0.5~2m/s之间，2015、2016两年度日平均风向多数在150°~250°之间，为东南风（135°）-南风（180°）-西南风（225°），2017年日平均风向在150°~250°之间的时间占捕捉时间的一半。由表4.1可以发现两年度距菌源中心不同距离处孢子捕捉量与风向和风速均为正相关，且在2015年距菌源中心北侧20m、40m处和2016年距菌源中心北侧20m、东侧20m处孢子捕捉量与风向显著正相关；2017年距菌源中心北侧不同距离处孢子捕捉量与风向正相关，与风速负相关（表4.2）。48 中国农业科学院博士学位论文第四章小麦白粉菌分生孢子田间传播的定量研究350WDWS3.530032502.520021501.5Winddirection(°)1001Windspeed(m.s−1)500.50023-Apr30-Apr7-May14-May21-May28-May4-Jun350WDWS3.530032502.520021501.5Winddirection(°)1001Windspeed(m.s−1)500.50019-Apr26-Apr3-May10-May17-May24-May31-May7-Jun350WDWS3.530032502.520021501.5Winddirection(°)1001Windspeed(m.s−1)500.50018-Apr25-Apr2-May9-May16-May23-May30-May6-JunDate图4.1廊坊地区2015-2017年日平均风速和日平均风向的变化动态（上：2015；中：2016；下：2017）Fig.4.1Dailymeanwindspeed(WS),winddirection(WD)inthegrowingseasonsofwheatinLangfangCityin2015-2017(up:2015;middle:2016;down:2017)49 中国农业科学院博士学位论文第四章小麦白粉菌分生孢子田间传播的定量研究表4.12015-2016年距菌源中心不同距离处孢子捕捉量与气象因素的关系Table4.1Correlationcoefficientsbetweendailyweatherfactorsandthenumberofsporescapturedfromdifferentdistancesawayfromthenorthoreastofthepathogensourcecenterin2015-201620152016ParameterN1N2E1E2N1N2N3E1E2E3WS0.280.0710.270.0580.260.170.210.220.040.13WD0.48*0.54*0.430.310.52*0.170.0360.45*0.150.11−1气象因子：WS=风速(ms)，WD=风向(°)，M、N1、N2、E1、E2分别表示距菌源中心北侧0m、20m、40m和东侧0m、20m、40m处的孢子捕捉量。相关系数显著性水平：0.01
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