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分类号：密级：公开学号：2013207012单位代码：10759石河子大学博士学位论文新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究学位申请人郭开发向本春教授指导教师赵思峰教授申请学位门类级别农学博士学科、专业名称园艺学研究方向园艺植物有害生物防治所在学院农学院中国·新疆·石河子2016年6月 分类号：密级：公开学号：2013207012单位代码：10759石河子大学博士学位论文新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究学位申请人郭开发向本春教授指导教师赵思峰教授申请学位门类级别农学博士学科、专业名称园艺学研究方向园艺植物有害生物防治所在学院农学院中国·新疆·石河子2016年6月 IdentificationtoPathogensofWoodsCanker,GeneticDifferentiationResearchtoitsMainSpeciesValsamaliandRapidDetectiontoPrimaryInfectionSourceofV.maliinXinjiangADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofAgricultureByGuoKai-fa(PreventionandControlforHorticultualPest)DissertationSupervisor:Prof.XiangBen-chunandProf.ZhaoSi-fengJune,2016 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。：系＇研究生签名、你时间：年以月厶曰使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。及’：时间研究生签名‘治：年Ｗ月ｄ曰导师签名：时间：年６月／曰七￥ 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究摘要目的：为了明确新疆防护林和经济林上腐烂病菌的种类，并了解主要种Valsamali的致病力分化及遗传多样性情况，以确定该菌能否在不同林木寄主上相互侵染和传播，同时采用分子检测技术确定腐烂病菌在新疆苹果园和香梨园的初次侵染来源。最终为新疆林木腐烂病的防治提供理论和技术支持。方法：从17种新疆常见的农田防护林和果树上采集林木腐烂病病样，采用常规组织分离法对样品进行分离，通过接种离体枝条试验测定各分离株的致病性；采用形态学与ITS、β-Tubulin序列分析相结合的方法，对新疆林木腐烂病菌种类进行鉴定；采用离体枝条接种法和ISSR方法对新疆林木腐烂病主要种Valsamali的致病性分化和遗传多样性进行研究；针对4种已报道的林木腐烂病菌的β-Tubulin基因设计种特异性引物，对苹果园与香梨园中林木腐烂病菌的存在状况进行快速检测。结果：1、从新疆17种林木寄主植物分离得到281个腐烂病菌株，分离菌株全为无性型。通过形态学特征、ITS序列、β-Tubulin基因序列将这些分离株鉴定为5个种，分别为：Valsamali(无性型：Cytosporamali)、Valsasordida（无性型：Cytosporachrysosperma）、Valsamacolica（无性型：Cytosporaschulzeri）、Leucostomaniveum（无性型：Cytosporanivea）和Cryptosphaeriapullmanensis（无性型：Cytosporinapullmanensis）。其中Valsamali、Valsasordida两种腐烂病菌分别是危害新疆经济林和防护林的主要种。2、对新疆经济林木腐烂病主要种V.mali致病性分化进行研究，V.mali主要菌落颜色有三种：白色、乳白色和淡黄色，白色菌株的生长速率快于乳白色和淡黄色，淡黄色菌株的生长速率最慢，腐烂病菌V.mali的最适pH值为5~6，最适温度在20~30℃。乳白色和淡黄色菌株的致病力强于白色菌株。在致病力分化测定中，新疆腐烂病菌V.mali主要以中等致病力和弱致病力为主，没有发现强致病力菌株。新疆苹果树腐烂病菌V.mali存在致病力分化现象。3、通过对新疆不同地理区域苹果树腐烂病V.mali种群遗传多样性的分析表明，不同地理区域种群的Nei’s（1973）基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I）均达到了H>0.2，I>0.4，表明新疆苹果树腐烂病菌V.mali具有丰富的遗传多样性。对不同地理区域种群遗传结构的分析表明，各自然种群内的不同分离株之间的遗传变异是腐烂病菌最主要的变异来源。通过UPGMA方法构建了新疆苹果树腐烂病菌V.mali不同自然种群遗传关系的聚类分析，聚类分成南疆和北疆2个大的类群，聚类分析发现同一地理区域种群的不同自然种群可分布于不同的聚类群中，说明V.mali遗传亲缘关系与地理来源没有明显的相关性。I 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究4、建立了一种新疆林木腐烂病菌的PCR快速检测方法，设计的4对种特异性引物分别可对4种腐烂病菌V.mali,V.sordida,L.niveum,V.malicola检测到144bp、180bp、240bp和324bp的条带，检测灵敏度可达到为10pg/mL。5、对39份腐烂病发生严重的库尔勒香梨园样品进行检测，其的7份样品中检测到了V.mali，占所检测样品的17.95%；对33份腐烂病发生严重的阿克苏苹果园样品进行检测，在其中的19份样品中检测到了V.mali，占所检测样品的57.58%。而V.sordida,L.niveum,V.malicola在香梨园和苹果园均未检测到。检测结果表面修剪枝条、果树树体、果园土壤、园外寄主林木等均可能是新疆苹果和香梨腐烂病菌的越冬场所和初侵染源。结论：引起新疆林木腐烂病的病原菌有5个种，其中V.mali是引起经济林腐烂病的主要种，V.sordida是危害新疆防护林的主要种。经济林主要种V.mali以中等致病力和弱致病力为主，无强致病力菌株，存在致病力分化现象且主要以种群内变异为主。建立了4种林木腐烂病菌的快速检测方法，检测结果表明修剪枝条、果树树体、果园土壤、园外寄主林木等均可能是新疆苹果和香梨腐烂病菌的越冬场所和初侵染源。关键词：新疆；林木腐烂病；病菌鉴定；苹果树腐烂病菌；致病分化；快速检测；初侵染源II 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究AbstractObject:InordertoclarifythepathogenspeciesofwoodscankerofshelterbeltandeconomicforestsinXinjiangandclarifypathogenicitydifferentiationandgeneticdiversityofitsmainspeciesValsamali.Meantimes,forconfirmtheprimarysourceofinfectionofcankerpathogeninappleandkorlapearorchardinXinjiang.Finally,thereresultswereusedtoguidewoodscankermanagementinXinjiang.Methods:CankersamplesofwoodwerecollectedandisolatedbytissueisolationinXinjiang,andpathogenicityofthesepathogenweredeterminatedaccordingtoKoch’srule.Theseisolateswereidentifiedbymeansofthemorphologicalfeaturesofculture,18SrDNA-ITSandβ-Tubulingenesequencesanalysis.PathogenicityandgeneticdifferentiationofmainspecieValsamaliweredetectedinvitroshootinoculationandISSRmethods;Basedonβ-TubulinsequenceoftheValsagenus,specificprimersweredesigned,andarapidPCRassayfordetectiontheprimarysourceofinfectionofcankerpathogeninappleandkorlapearorchardinXinjiang.Result:1.Atotalof281isolateswereobtainedfromwoodscankercomefrom17kindsofhostsinXinjiang,allisolatesareanamorph,andpathogenicityoftheseisolatedweretestedaccordingtoKoch’srule.Theseisolateswereidentifiedas5species,theyareValsamali(anamorph:Cytosporamali),Valsasordida（anamorph:Cytosporachrysosperma）,Valsamacolica（anamorph:Cytosporaschulzeri）,Leucostomaniveum（anamorph:Cytosporanivea）andCryptosphaeriapullmanensis(anamorph:Cytosporinapullmanensis)respectively..TheV.maliandV.sordidaaremainpathogensofeconomicforestandshelterforest,respectively.2.PathogenicitydifferentiationofthemainspecieV.maliwerestudied.ThecolorofV.maliarewhite,milk-whiteandyellow.Thegrowthratesofwhitestrainswerefasterthanmilk-whiteandyellowstrains,butgrowthratesofyellowstrainsweretheslowest.TheoooptimumgrowthconditionsofV.maliistemperature20Cto30CandpH5topH6.Milk-whiteandyellowstrainshadstrongerpathogenicitythanwhitestrains.ThepathogenicityofV.malistrainsweremediumandweak,nostrongpathogenicitystrainsinpathogenicitytest.PathogenicitydifferentiationofV.maliwasobservedinXinjiang.3.TheresultsofgeneticdiversityofdifferentgeographicalgroupsshowedthatNei’s(1973)genediversityindex(H)andShannon’sinformationindex(I)werebothhigherthan0.2and0.4,respectively,whichindicatedthatthegeneticdiversityofV.maliinXinjiangwasI 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究considerablyabundant.Theresultsofpopulationgeneticstructureofdifferentgeographicalgroupsshowedthatthegeneticvariationwithinthepopulationswasthemainsourceofgeneticvariation.ThedendrogrambasedonISSRmarkersrevealedthatdifferentnaturalpopulationsweregroupedintotwoclustersbyUPGMA.PopulationsofV.maliweregroupedintoSouthXinjiangandNorthXinjiang.Thepopulationsbelongedtothesamegeographicalgroupscouldbeclusteredintodifferentclusters,whichindicatedthattherewasnosignificantcorrelationbetweenthegeneticrelationshipsandtheirgeographicaloriginals.4.ArapidPCRassayfordetectionofwoodsValsacankerwasdevelopedinXinjiang.Fourpairsofspecies-specificprimerscouldbeusedtoamplifiy144bp,180bp,240bp,and324bpDNAfragmentsfromV.mali,V.sordida,L.niveumandV.malicola,respectively.Andthedetectionsensitivitywas10pg/mL.5.ResultsofdetectionofprimaryinfectionsourceofValsacankershowedthatamong39samplesfromseriouscankerinKorlapearorchard,thespeciesofV.maliwasdetectedin7samples,whichhadaproportionof17.95%;therewere33samplesofseriouscankerinAksuappleorchard,19samplesweredetectedinV.maliandtheproportionwas22.94%.V.sordida,L.niveum,V.malicolainpearorchardandappleorchardwerenotdetected.Testresultsdemonstratedthatpruning,treestissues,soilsamples,woodsoutsidetheorchardmaybeoverwinteringsitesandprimaryinfectionsourceofappleandkorlapearorchardinXinjiang.Conclusion:Atotlaof5cankerpathogenscomefrom17woodswereidentifiedandV.maliisthemainpathogencausingcankerofeconomicforest,andV.sordidaisthemainspeciecausingcankerofshelterforestinXinjiang.ThepathogenicityofV.maliwasmediumandweakstrains,nostrongpathogenicitystrains.differentiationamongthepathogenicityofV.maliwaspresentedinXinjiang.ArapidPCRdetectiontechniquewasdevelopedfordetectionoffourspeciesValsacankerinXinjiangandthedetectresultsshowthatpruning,treestissues,soilsamples,woodsoutsidetheorchardmaybeoverwinteringsitesandprimaryinfectionsourceofappleandkorlapearorchardinXinjiang.Keywords:Xinjiang;Woodcanker;pathogenidentification;Valsamali;Pathogenicdifferentiation;Rapiddetection;PrimaryinfectionsourceII 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究目录摘要.............................................................................................................................................IAbstract......................................................................................................................................I目录.........................................................................................................................................III第一章文献综述......................................................................................................................11.1林木主要病虫害及其影响.............................................................................................11.1.1新疆林业发展现状...................................................................................................11.1.2林木病虫害种类及其影响.......................................................................................31.1.3林木腐烂病的发生和危害.......................................................................................71.1.4林果腐烂病发生规律...............................................................................................91.1.5林木腐烂病的防治.................................................................................................111.2林木腐烂病菌分类.......................................................................................................121.2.1形态学分类.............................................................................................................121.2.2分子生物学分类.....................................................................................................131.3腐烂病菌致病力差异研究...........................................................................................151.4腐烂病菌遗传多样性研究...........................................................................................161.4.1遗传多样性研究意义.............................................................................................161.4.2遗传多样性研究方法和技术.................................................................................171.5腐烂病菌初侵染源检测...............................................................................................221.6本研究的目的和意义...................................................................................................241.6.1研究意义.................................................................................................................241.6.2技术路线.................................................................................................................25第二章新疆主要林木腐烂病菌鉴定....................................................................................262.1材料与方法...................................................................................................................262.1.1材料.........................................................................................................................262.1.2方法.........................................................................................................................272.2结果与分析...................................................................................................................302.2.1新疆不同林木寄主种类及分离病菌数量统计.....................................................30III 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究2.2.2防护林腐烂病病原菌分离培养结果.....................................................................312.2.3经济林腐烂病病原菌分离鉴定结果.....................................................................342.2.4致病性测定结果.....................................................................................................392.2.5腐烂病菌不同种形态学特征.................................................................................402.2.6代表菌株分子生物学鉴定.....................................................................................442.3讨论与结论...................................................................................................................492.3.1讨论..........................................................................................................................492.3.2结论.........................................................................................................................50第三章新疆林木腐烂病菌主要种V.mali致病力分化研究..............................................513.1材料与方法...................................................................................................................513.1.1材料.........................................................................................................................513.1.2方法.........................................................................................................................523.2结果与分析...................................................................................................................533.2.1不同来源V.mali培养性状观察............................................................................533.2.2最适pH测定..........................................................................................................543.2.3最适温度测定.........................................................................................................543.2.4不同寄主来源V.mali在苹果、香梨致病性测定...............................................553.2.5同一寄主来源腐烂病菌V.mali在不同林木寄主上致病性测定.......................563.3讨论与结论...................................................................................................................573.3.1讨论.........................................................................................................................573.3.2结论.........................................................................................................................58第四章新疆林木腐烂病主要种V.maliISSR遗传分析....................................................594.1材料与方法...................................................................................................................594.1.1材料.........................................................................................................................594.1.2方法..........................................................................................................................614.1.2.1试验菌株菌丝体获得...........................................................................................614.1.2.2DNA提取.............................................................................................................614.1.2.3试验引物..............................................................................................................614.1.2.4ISSR-PCR反应体系及程序................................................................................61IV 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究4.1.2.5数据统计和分析..................................................................................................624.2结果与结论...................................................................................................................624.2.1不同来源苹果树腐烂病V.maliISSRPCR结果.................................................624.2.2V.mali的不同地理区域种群的群体遗传分析......................................................644.2.3V.mali不同地理区域种群的群体遗传结构与分化..............................................654.2.4苹果腐烂病V.mali的聚类分析...........................................................................654.3讨论与结论...................................................................................................................664.3.1讨论.........................................................................................................................664.3.2结论.........................................................................................................................67第五章林木腐烂病菌快速分子检测方法研究....................................................................685.1材料和方法...................................................................................................................685.1.1供试菌株.................................................................................................................685.1.2DNA提取及PCR扩增...........................................................................................705.1.3特异性引物设计.....................................................................................................705.1.4特异性引物的特异性检测.....................................................................................705.1.5特异性引物灵敏度检测.........................................................................................715.2结果与分析...................................................................................................................715.2.1特异性引物的设计.................................................................................................715.2.2特异性引物的检测.................................................................................................725.2.3特异性引物灵敏度检测.........................................................................................745.3讨论与结论...................................................................................................................755.3.1讨论..........................................................................................................................755.3.2结论..........................................................................................................................75第六章新疆苹果园及香梨园腐烂病菌初侵染源检测........................................................766.1材料与方法...................................................................................................................766.1.1材料.........................................................................................................................766.1.2方法.........................................................................................................................776.2结果与分析...................................................................................................................786.2.1林果植物材料和土壤样品DNA提取..................................................................78V 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究6.2.2库尔勒香梨园腐烂病初侵染源检测.....................................................................796.2.3阿克苏苹果园腐烂病初侵染源检测.....................................................................806.3讨论与结论...................................................................................................................816.3.1讨论.........................................................................................................................816.3.2结论.........................................................................................................................82第七章全文总结....................................................................................................................837.1结论...............................................................................................................................837.1.1新疆主要林木腐烂病病原菌种类鉴定.................................................................837.1.2新疆林果腐烂病菌主要种V.mali致病性分化研究.............................................837.1.3新疆林木腐烂病菌主要种V.maliISSR遗传分化..............................................837.1.4林木腐烂病菌快速分子检测方法建立.................................................................847.1.5新疆林木腐烂病初侵染源检测.............................................................................847.2特色和创新....................................................................................................................847.2.1研究特色.................................................................................................................847.2.2研究创新.................................................................................................................847.3存在问题........................................................................................................................85参考文献..................................................................................................................................86附图1新疆林果腐烂病的危害症状.....................................................................................97附图2腐烂病菌V.mali致病性分化...................................................................................98致谢........................................................................................................................................99作者简介................................................................................................................................100VI 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究第一章文献综述1.1林木主要病虫害及其影响1.1.1新疆林业发展现状新疆位于我国西北部，地处欧亚大陆中心位置，新疆南疆属干旱暖温带气候区，北疆属干旱中温带气候区。新疆地跨纬度较大，东西横跨23个经度，南北跨越17个纬度，新疆地形地貌多样，有山地、平原、戈壁、沙漠、盆地、河流、湖泊等组成。新疆62的土地面积为1.66×10km，占全国陆地总面积的1/6，其中农林牧可利用的土地面92积约为0.69×10hm，占我国农林牧可利用面积的1/10，而且新疆地区约有近亿亩的后备土地有待开发利用，这也为新疆农林业发展和开展农林规模化农业生产提供了广阔的资源和空间。然而，新疆地区山地、戈壁、沙漠等不易开发利用的土地占总土地面积的3/4，仅有1/4的土地面积适宜农林生产，土地面积对农林生态建设造成了严重阻碍；新疆地区远离海洋，降水量少、水资源严重短缺且分布不均、水资源利用效率低等问题较为严重；新疆地区大风、沙尘暴、低温霜冻、寒潮、冰雹、高温等灾害性天气频频发生，对农林生态环境改善不利；新疆经济建设发展相对落后、农林建设队伍相对薄弱，农林建设资金较为缺乏，农林人员的科研水平和科研技术比较落后，这些因素严重制约了新疆地区农林建设、生态环境建设工作的持续健康发展（刘颖，2015）。新疆林业主要是由天然林和人工林组成，其中人工林主要由防护林和经济林组成。新疆天然林主要分布在天山、阿尔泰山、昆仑山三大山脉，同时还有大面积的胡杨林，新疆南疆塔里木盆地的胡杨林是我国面积最大、分布最广的天然胡杨林，面积达3.832×10km。近几十年，由于塔里木河下游缺水断流、人为砍伐破坏等因素，南疆胡杨林6293面积逐渐缩小。新疆地区天然林面积约为6.67×10hm，蓄积为3.67×10m，分别占森林面积、蓄积的86.32%和82.09%（师戈里，2013）。天然林有丰富的物种种类和生物多样性。在天山林区主要树种为方枝柏（Sabinasaltuaia）、天山云杉（Piceaschrenkiana）、天山桦（Betulatianschanica）、西伯利亚落叶松（LarixsibiricaLedeb）、山柳（Salixdepressa）、欧洲山杨（Populustremula）、天山花楸（Sorbustianschanica）等树种；在阿尔泰山林区，主要有西伯利亚冷杉（Abiessibirica）、西伯利亚落叶松（LarixsibiricaLedeb）、西伯利亚云杉（Piceaobovata）、白桦（Betulaplatyphylla）、雪松（Cedrudeodara）、西伯利亚红松（Pinussibirica）、欧洲山杨（Populustremula）、白杨（Populusspp.）、疣皮桦（Betulaverrucosa）、小叶桦（Betulamicrophylla）等树种；在昆仑山林区1 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究主要是白杨（Populusspp.）、云杉（Picea）、圆柏（Sabinachinensis）等树种。天然林是92主要的木材生产基地，新疆林业用地面积约有0.11×10hm，活立木总蓄积量为3.67×9310m，新疆森林面积和林木蓄积量在全国均排名第13位；同时天然林也是新疆主要的生态屏障，天然林不但具有满足社会对森林资源的多种需求，而且具有涵养水源、保持水土、保障江河安澜、保持生物多样性、国土生态安全等功能，具有十分重要而广泛的意义。新疆天然林无论从植被分布、树种种类、林层结构，还是从植被种类、动物分布、微生物构成，都具有比人工林无可比拟的社会优势和生态优势（普建明，2002）。但是新疆天然林面积较小，加之新疆干旱缺水、土地贫瘠、盐碱化等自然因素，新疆的自然生态也十分脆弱，保护天然林建设势在必行。52422015年底，新疆当年造林面积约为1.49×10hm，其中经济林3.86×10hm，42522用材林面积为0.8×10hm，防护林1.06×10hm，薪炭林612hm(新疆统计年鉴，2015)。截止2014年底，新疆自治区政府通过实施全区林业重点生态工程，对新疆地区农田、农村、城市构建防护林，初步建成以绿洲内部农田防护林、绿洲外缘大型防风固沙防护林（来景刚，2014）。在全疆绿洲边缘、外围营造大型防风固沙绿色防护林带林52带，封育恢复和发展天然人工林，在绿洲边缘造林面积超过5.8×10hm；对全疆73个县(市)的城市边缘大力营造人工城市防护林网，在城市内构建森林公园、森林城市，42在城市周边荒山荒地绿化，造林面积约为5×10hm，建立起美丽城市的绿色防护林网；同时在全疆7761个行政村庄，大力发展绿化工程，在村庄道路、公共绿地、河渠、农田四周等开展绿化，大力种植杨树、柳树、榆树等防护林，在行政村庄累计绿化面积42近6×10hm，构筑了新疆美丽新村庄绿色林带。林果种植面积、年产量和产值在新疆逐年增长。目前在环塔里木盆地、伊梨河谷、天山北坡等建成苹果、香梨、核桃、红枣、杏、葡萄、枸杞等高效林果基地，目前，森林旅游、生态旅游、休闲度假、林业产值、花卉种植等产业规模不断拓展。新疆瓜果驰名中外，著名的哈密大枣、库尔勒香梨、库车小白杏、阿克苏苹果等一大批在全国较有名气，特色林果产品品牌建设成效显著。多年来，新疆自治区及兵团党委、政府努力把发展特色林果业产业作为一项重要的政策，鼓励和支持农民发展特色林果产业。把新疆特色林果产业当做振兴新疆农林经济发展、增加出口创汇、实现优势资源转换战略的一626项重要内容。目前，新疆林果总面积已达到1.47×10hm，果品总产量突破7.00×10t、总产值超350亿元。特色林果产业已经成为引领新疆农民增收的支柱性产业。2013年农民约有1100元的收入来自林果业，人均林果收入增加180元以上。林果业发展较早的县市，农民人均收入的40%~50%来自于林果业，林果业发展较快的县市超过80%（牛金辉，2015）。特色经济林在新疆不断增加的同时，也存在不少的问题，基地建设水平低、林果产业结构不合理、科技管理水平低、市场营销能力弱等均影响新疆林果产2 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究业的健康发展。1.1.2林木病虫害种类及其影响1.1.2.1国外林木病虫害种类72德国森林总面积约为1.11×10hm，森林覆盖率为33.3％。德国森林的主要树种有橡树(Quercuspalustris)、榉树(Zelkovaschneideriana)、欧洲赤松(Pinussylvestris)、栎树（Quercusspp.）云杉(Piceaasperata)、冷杉(Abiesfabri)、松树（Pinus）等。主要森林病虫害有板栗疫病（Cryphonectriaparasitica）、松枯梢病(Sphaeropsissapinea)、悬铃木干枯病(Ceratocystisfimbriata)、叶锈病(Melampsoraspp.)、腐烂病(Valsaspp.)、小蠹(Scolytidaespp.)、大栗鳃金龟(Melolonthahippocastanimongolica)、松毛虫(Dendrolimus63sp.)等。以小蠹虫对德国林业造成危害最大，1990年导致1.00×10m以上的立木遭风折致死（FAO,2012）。72103日本的森林面积为2.515×10hm，占土地面积67%，森林蓄积为4.9×10m。主要树种是柳杉(Crytomeriajaponica)、扁柏(Chamaecyparis)、落叶松（Larixspp.）、榉树(Zelkovaschneideriana)、麻栎（Quercusacutissima）、赤松(Pinusdensiflora)、黑松（Pinusthunbergii）等。松材线虫病(Bursaphelenchusxylophilus)是日本最主要的林业病害之一，对日本的林业建设造成严重的损害。松材线虫病在1905年日本九州岛长崎首次发现危害松树。该病害现已经分布日本各林区。现在日本受害松树林面积约为总松林面积的6325%，年木材损失约达1.00×10m。分析松材线虫病在日本流行并危害严重的原因主要是：（1）气候条件，日本适宜的环境气候为松材线虫病的发生和流行创造了条件；（2）日本种植松树品种单一化，主要的松树品种是：赤松(Pinusdensiflora)、落叶松（Larixspp.）、黑松（Pinusthunbergii）、马尾松（Pinusmassoniana）和硫球松（Pinuluchensiss）等，种植的松树品种对松材线虫病具有高度感病，从而导致松材线虫病在日本危害严重；（3）松材线虫的主要媒介昆虫是松墨天牛（Monochamusalternatus），松材线虫依靠松墨天牛成虫进行远距离传播，且松墨天牛传播松材线虫效率非常高，每头天牛平均携带15000条线虫，同时在日本，松墨天牛缺乏有效的天敌昆虫和有效的防治措施，使得松墨天牛数量急剧增加，从而导致松材线虫病在日本大面积流行（FAO,2006）。82113美国的森林资源面积为2.98×10hm，总蓄积量为2.473×10m，居世界第四位，森林覆被率为35%。美国的主要树种是北美黄杉（Pseudotsugamenziesii）、西黄松（Pinusponderosa）、松树（Pinus）、云杉(Piceaasperata)、冷杉(Abiesfabri)、栎树（Quercusspp.）。美国的病虫害种类包括：榆树荷兰病（Ceratocystisulmi）、栎树枯萎病（Ceratocystisfagacearum）、腐烂病(Valsaspp.)、松梭形锈病（Cronartiumquercuumf.sp.Fusiforme）、白松疱锈病（Cronartiumribicola）、大小蠹（Dendroctonusspp.）、舞毒蛾（Lymantria3 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究dispar）、花旗松毒蛾（Orgyiapsedotsugata）（FAO,2012）。92澳大利亚森林面积约1.494×10hm，这些森林覆盖澳大利亚19%的土地，其中92621.474×10hm为天然林，另有1.97×10hm为人造林。澳大利亚的森林极为独特和多样化，天然林主要是桉树林（Eucalyptus），其次为金合欢林（Acaciafarnesiana）和白千层林（Melaleucaleucadendra）。就人造林而言，52%栽培树种是辐射松（Pinupsradiata），另外48%则为桉树林（Eucalyptus）。澳大利亚林业病虫害包括桉树腐烂病（Valsaspp.）、松叶蜂(Diprionidae)、叶甲（Chrysomelidae）和金龟科（Scarabaeoidea）等。1.1.2.2国内天然林病虫害种类危害我国天然林主要病害有松材线虫病、松枯梢病、松疱锈病(Cronartiumspp.)、马尾松赤枯病(PestalotiopsisfunereaDesm)、腐烂病、湿地松褐斑病(Lecunostictaacicola)等（张星耀等，2003）。松材线虫病，又称松树萎蔫病、松树枯萎病。主要危害黑松（Pinusthunbergii）、马尾松(Pinusmassoniana)、湿地松（Pinuselliottii）、落叶松（Larixspp.）油松(Pinustabulaeformis)等松属树种40余种，还危害冷杉属(Abies)、云杉属(Picea)等林木。松材线虫病主要造成树干薄壁细胞和上皮细胞的破坏和死亡，使得树木失水，蒸腾作用降低，最终死亡。松枯梢病，是世界性林木重大病害之一，在中国危害严重，遍布十余个省份。主要危害樟子松、落叶松、湿地松、马尾松等当年生新梢。在辽宁近10年来，松枯梢病引起樟子松栽培区成片死亡。在吉林、沈阳、湖北、江苏、福建、浙江造成松树林的大面积死亡。松疱锈病，已报道危害寄主有红松、新疆五针松、华山松、乔松、美国白松、樟子松、马尾松、黑松等多种林木植物。曾在黑龙江、吉林、辽宁、新疆、西藏等地危害严重。引起侧枝枯死、树冠破坏，最后整株死亡。腐烂病在世界范围内普遍存在，广泛发生，危害天然林树种主要是桉树、马尾松、桦树、樟子松等。危害我国天然林的虫害主要有大小蠹、松毛虫、美国白蛾(Hyphantriacunea)、松叶蜂科(Diprionidae)、天牛、圆蚧、透翅蛾等（张星耀等，2003）。松毛虫是我国森林最大食叶害虫之一，主要有27个种和亚种分布在全国25个省、市、自治区。松毛虫危害主要是幼虫期大量取食松树的针叶，导致松树生长减弱或死亡。据不完全统计，我国每年62松毛虫危害发生面积约为2.67×10hm，而防治面积约为发生面积的1/2，对我国松树林造成不可估计的损失。大小蠹危害的寄主林木种类很多，包括松属、云杉属、黄杉属、冷杉树、落叶松、油松和樟子松等针叶林木。主要以成虫和幼虫在林木寄主韧皮部和木质部间钻蛀坑道取食危害，危害长势衰弱的大径立木。曾在我国山西、陕西、河南、河北、湖北等地发生面积数万公顷。松叶蜂在我国已知危害林业的约有32种，有11种严重危害林业，可被称为“爆发种”。松叶蜂科昆虫主要以幼虫取食松树、云杉、油杉和柏树等树种的针叶。调查显示在我国松叶蜂的大爆发周期一般为10~20年，通常持续时间在2~4年，个别情况下持续时间会延长。初步调查研究，在云南地区松叶蜂危害4 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究42严重，危害面积约1.33×10hm。松叶蜂幼虫取食针叶，导致林木几乎无针叶，或针叶残缺，严重影响林木的光合作用、生长发育，最终导致部分针叶林枯死。天牛科害虫，天牛科害虫种类较多，分布较广、传播迅速、食性杂等特点，危害树木种类较多。在我国各省市、自治区均有分布。成虫啃食树皮和嫩枝且传播病害，主要以幼虫在树体内蛀食危害，危害近地面主干及地下部根系。严重时导致树木枯死。1.1.2.3国内防护林病虫害种类国内防护林的树种主要是杨树、榆树、柳树、国槐等。目前防护林主要的病害以杨树溃疡病和杨树腐烂病最为严重。杨树溃疡病是一种树木枝干病害，有几十种病原真菌、细菌引起，症状多种多样，严重影响杨树生长甚至导致死亡。其中葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）引起的溃疡病分布范围最广，寄主最多，研究最深入。溃疡病危害的树种主要是白杨派、青杨派、大叶杨派、黑杨派及欧美杨等在内的200多个杨树种、杂交种及无性种。该病害对柳树、刺槐、核桃、苹果、杏、梅等多种果树进行危害。杨树因生长快、适应强等特点，是我国主要的防护林树种之一，腐烂病是防护林最主要的病害之一，在我国及世界范围内，普遍存在，广泛发生。杨树腐烂病危害树种繁多，约有500多种林木寄主报道。在我国杨树种植区均有杨树腐烂病的危害，直接威胁着我国的生态环境建设和用材林基地建设。在我国防护林的虫害主要有青杨天牛（Saperdapopulnea）、光肩星天牛（Anoplophoraglabripennis）、桑天牛（Aprionagermari）、云斑天牛（Batocerahorsfieldi）、杨干象（Cryptorrhynchuslapathi）、十斑吉丁虫（Melanophiladecastigma）、芳香木蠹蛾东方亚种（Cossuscossusorientalis）等蛀干类害虫，主要以幼虫或成虫蛀食树干韧皮部和木质部形成虫道，轻者致使树木生长缓慢，重者导致树木枯死，使得木材失去利用价值。食叶害虫主要以杨叶甲（ChrysomelapopuliLinnaeus）、杨潜叶甲（Zeugophlorascutellaris）、白杨透翅蛾（Parathrenetabaniformis）、春尺蠖（Apocheimacinerarius）、大青叶蝉(Cicadellaviridis)为主。春尺蠖主要是幼虫进行危害，在全国各地均有发生，也是新疆地区的防护林带主要害虫之一。该虫在4月份开始危害，发生期比较早，主要危害杨树、柳树、榆树等防护林木的叶芽和树叶，同时也可以在苹果、香梨等经济林木进行危害。春尺蠖幼虫取食量非常大，常暴食将叶片和嫩芽取食干净，吐丝结网影响林木光合作用。老熟幼虫离开树体，主要在树干周围的土壤中化蛹，危害严重的林带蛹的数量可达上百头（张海波等，2006）。1.1.2.4国内经济林病虫害种类经济林病害种类繁多，按照危害部位大致可分为果实病害、叶部病害、枝干病害和根部病害。（1）果实病害：果实病害主要影响果实的外观及营养价值，造成严重的经济损失。在新疆林果园，危害严重的有苹果和梨果实轮纹病、霉心病、疫霉、病褐腐病，5 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究苹果苦痘病和痘斑病、锈果病，梨黑星病、梨储藏期黑斑病，核桃炭疽病、黑斑病、核桃仁霉烂病等，杏主要有果斑病，裂果病及贮藏期果实霉烂，大枣果实病害主要有黑斑病、缩果病、枣蒂腐病、枣烂果病等。轮纹病是危害苹果和梨发生较严重的病害之一，一般果园发病率在20%~30%，严重果园可达50%以上，造成严重的经济损失，同时轮纹病菌还交叉侵染桃、杏、核桃等多种果树。黑星病是危害梨树的重要病害，使得果实外观较差，失去商业价值。黑星病在国内是一种应该严格控制的危害性病害。近几年来随着果树品种的调整和套袋技术，在农业生产上，果实病害发生不是十分严重。但在新疆果园中，近年来枣果实病害缩果病、裂果病、黑斑病等发生较为严重（赵娜等，2011）。核桃黑斑病发生也较为严重，已成为病害研究的热点（韩敏等，2015）。（2）叶部病害：在新疆林果园，已报道的引起叶部病害和果树病害种类较多。包括苹果和梨锈病、白粉病、黑星病、黄叶病、小叶病、黑斑病、黄化病等，叶部病害发生后导致叶片枯黄、叶片脱落，不仅影响树体的光合作用、还削弱树势降低树体的抗病能力，诱发枝干及根部病害的发生，而且直接降低果园产量和果品，对果农造成严重的经济损失。褐斑病、黑星病、锈病、白粉病、黄化病等成为苹果和梨种植区的主要叶部病害。黑斑病、枣疯病、枣锈病是新疆枣园主要的叶部病害（李晓军等，2004；潘青华，2002；俞飞飞等，2006）。真菌性穿孔病，细菌性穿孔病，黄化综合症，褪绿卷叶病是新疆杏树主要的病害（蒋萍等，2012）。核桃叶斑病和炭疽病是新疆核桃主要的两种叶部病害（韩敏等，2015）。（3）枝干病害：枝干病害主要包括腐烂病、枝干轮纹病、干腐病、干枯病、木腐病等。腐烂病是新疆林木主要的枝干病害之一。腐烂病菌不仅危害苹果树、香梨树、核桃等经济林木，还危害杨树、榆树、胡杨、柳树等防护林木。腐烂病在我国各地区均有发生，在杨树上是危害最大的枝干病害之一。主要侵染树势较弱的树干中部和下部，严重时导致林木死亡。（4）根部病害：主要的根部病害有苹果和香梨的根朽病、白绢病、园斑根腐病和根癌病。虽然根部病害种类不多，报道较少，但危害较为严重，根部病害发病后，树体地上部表现为树体生长衰弱、生长缓慢，枝条节间缩短，叶片变小并且发黄，易落叶，发芽迟，落叶早等特点，严重时局部或全树枯死。经济林木的害虫按照危害部位有叶部害虫、枝干害虫和果实害虫。叶部害虫主要有春尺蠖、蚧科、螨类等，春尺蠖幼虫主要在早春危害果树的嫩叶、嫩芽及花蕾，影响叶片、花、果实的生长发育。且春尺蠖危害寄主植物种类较多，在枣树、苹果、香梨等均可以取食危害。蚧科害虫在新疆普遍发生，初孵化的若虫主要在嫩叶及叶脉两旁趋势危害，后转移到枝条，危害严重时树体遍布虫体，严重影响果树产量与品质。螨类目前是新疆果园主要的虫害之一，主要以成螨和若螨危害，在果园树体的叶片、花蕾、幼果等部位均有不同程度的危害。总之，腐烂病在新疆天然林、防护林和经济林均有发生，且防护林和经济林发生较6 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究为严重，已对新疆的林业生态造成严重危害。1.1.3林木腐烂病的发生和危害1.1.3.1国外林木腐烂病的发生和危害在中国、日本等报道腐烂病发生危害十分严重，同时在俄罗斯、美国、加拿大、伊朗、英国等地区在不同林木寄主上也产生危害。腐烂病最先在日本苹果树发现，而后在日本林木寄主进行传播。日本东北部、北海道在1910～1925年间曾大面积发生流行腐烂病，对日本林业造成了严重的损失。1972年腐烂病在北海道大面积流行，该病的发生面积约占栽培面积的95%，许多日本北海道果园濒于毁灭（Kobayashi,1970）。1970年，哈萨克斯坦苹果园腐烂病发生危害严重，果园病株率达90％。同年在美国新墨西哥州，苹果园腐烂病发病严重，发病率达85%。华盛顿州在1928年腐烂病发生大爆发。同年，苏联卡扎克斯坦发生树皮溃疡病，溃疡病达90%。腐烂病菌除了危害苹果，也侵染香梨、山楂、海棠、桃、李等蔷薇科植物，主要在果树的主干、主枝、侧枝、分叉处等多个部位危害，轻者造成主干、主枝枯死，同时影响果实的品质和产量。重者全株枯死，甚至毁园。Adams报道了在南非地区本地树种和引进树种腐烂病发生严重，分离得到13~14种已知的腐烂病病原菌和3~4种独特的病原菌。这些病原菌主要危害桉树、苹果树、松属、杨科、李属、杨柳科植物（Adamsetal.,2006）。1.1.3.2国内林木腐烂病的发生和危害国内腐烂病主要分布在东北、华东、华中、华南、华北和西北地区（高克祥，1995）。我国在1915年曾从日本引进苗木到辽宁地区，1916年在辽宁省南部地区发现果园苹果树腐烂病症状，随后在1948年、1960年、1975年、1985年造成大面积流行，造成大面积死亡（高克祥，1995；陈策，1987）。腐烂病在我国各地均有不同程度的发生危害，腐烂病在我国危害十分严重。我国是苹果、香梨生产的主要种植区，对苹果、香梨腐烂病的调查和研究较为深入。2002年对陕西渭北旱塬果园腐烂病进行调查，部分果园的发病率达到了10％，而管理不善的果园发病率达到了30%~50%，腐烂病严重影响了陕西省苹果树生长发育和苹果产量和品质（辛选民，2002）。2003年，杜宏奎（2003）对陕西省礼泉苹果树腐烂病进行调查，苹果树腐烂病发病率10%以上。王磊等（2005）在2005年对陕西省关中地区苹果园腐烂病进行普查，调查显示陕西省关中地区果园均有腐烂病的发生，发病率最高的达到了92％，腐烂病已严重影响了陕西省苹果产业的发展。王金友（2006）对陕西省陕北地区苹果腐烂病危害情况进行了详细调查，结果表明苹果树腐烂发病率在近几年区呈迅速增加趋势。在陕北地区选择有代表性的富士苹果园进行病害调查发现，腐烂病病株率超过了30%。另据报道，陕西和甘肃为我国苹果主产7 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究区，该地区腐烂病普遍发生且危害严重，在发病较为严重的果园进行调查，腐烂病病株率为30%左右，发生严重果园病株率在70%~80%，许多发生严重的果园需要挖除病株，重新补种苹果树苗，造成果园果树残缺不全，园相不整齐（汪景彦，2006）。通过国家苹果产业技术体系网络系统，我国苹果树腐烂病发病率近年来发生有逐年加重的趋势。在我国陕西、山西、甘肃、新疆等10个苹果主产区随机选择147个果园，进行苹果树腐烂病发生情况和防治情况调查。调查结果显示果园腐烂病总体发病率达52.7%。随着树龄的增大，腐烂病发病率也逐渐增高，4~10a树龄果树发病率为26.8%，11~17a树龄果树发病率为54.0%（曹克强等，2009）。同时调查发现，我国苹果树腐烂病在不同省份、不同果树品种，存在差异，但差异不明显（李志军等，2013）。1.1.3.3新疆林木腐烂病的发生和危害当前新疆林果基地建设处于管理水平比较低端、粗放阶段。在修剪、浇水、施肥、打药等农事标准和管理过程中操作不到位、不规范。导致部分果园管理质量较差及经济效益也不高，从而导致果园内病虫害发生严重。果园早春和冬季修剪病枝等不及时清理出果园，造成病原菌在果园内越冬，等到第二年气温条件适合的情况下，病原菌继续侵染果园内林木植物。同时如果果园内种植林果种类繁多，病原菌存在交叉侵染，也加重了腐烂病在果园的危害。新疆是林木腐烂病发生最严重的地区之一。刘振坤（1979）对新疆核桃树腐烂病的发生情况进行调查，腐烂病在阿克苏地区发生较为严重，发病率高达100%。2005年对兵团第二师塔里木垦区果园腐烂病进行调查，平均发病率达50%（刘江红等，2005）。吴芳等（2012）对库尔勒市香梨园腐烂病发生情况调查，腐烂病危害严重的果园病株率高达100%，腐烂病严重影响库尔勒香梨产业。而克热曼（2006）在2003~2005年对克拉玛依市区林木病虫害进行了普查，城市防护林杨树、柳树、榆树、沙枣树、国槐、白蜡树、卫矛等均有不同程度的危害，腐烂病在杨树上发生程度最严重。2015年在新疆喀什地区叶城县、和田地区，腐烂病在核桃树和枣树发生十分严重，部分重病园发病率在70%~90%之间，部分果园发病发生十分严重，腐烂病已对南疆经济林木生产和发展造成严重损失（岳朝阳等，2015）。在阿勒泰地区，腐烂病危害人工造林种植的北京杨、俄罗斯杨、新疆杨、速生杨等杨树种类，发病率可达90%以上（革命古丽·马吉提，2014）。腐烂病已经对新疆特色林果产业的发展构成了重大的威胁和损失，如果对病情不加以控制，会对新疆林果产业的发展造成不可估量的损失。吴芳（2012）调查新疆库尔勒香梨腐烂病与香梨优斑螟之间危害特点，发现两者均能够独立危害香梨树，没有严格的依赖关系；两者共同为害香梨树时有一定促进作用。同时新疆冬季时间较长，且较为寒冷，使得新疆经济林、防护林及天然林树体容易遭受冻害，受冻树体已被腐烂病侵染，次年易发生病害（吴玉霞等，2012）。目前腐烂病轻8 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究者造成树体枝条枯死，树势衰弱，严重者造成大片林木死亡。有效防治林木腐烂病已成为新疆发展特色林果、人工林和天然林过程中迫切需要解决的问题。1.1.4林果腐烂病发生规律我国地域面积广阔，各地的气候条件和林木种类差异较大，因此腐烂病在各地的危害情况也不一致。腐烂病菌在各地的侵染时期略有差异，但基本的侵染发病规律相似。腐烂病菌全年均可以侵染寄主林木。每年12月至翌年4月是腐烂病的发病盛期，1~4月是病菌集中侵染时期，在春夏，随着林木植物叶片生长进入生长季，树体生长较快，抗病力逐渐增强，发病减弱，病害扩展停止，发病盛期随即结束。乔金玲（2009）对新疆香梨腐烂病的发生规律进行调查，认为香梨腐烂病在新疆每年发生两次，有两个发病高峰期，分别是春季和秋季发病严重，以春季发病最多，危害最为严重。腐烂病的发病症状是发病初期在树皮上呈现不规则性或圆形斑点，水渍状湿腐，病斑逐渐增大。用手压下病部稍下陷，酒糟味浓。发病后期，病斑表面产生小突起，突破树皮表皮，露出黑色小粒点，为腐烂病菌的子实体。当遇雨水天气时，黑色小粒点中溢出黄色或红色卷须状分生孢子角。随后腐烂病病斑逐渐干缩下陷，病健交界处明显（范瑛阁，2010）。腐烂病是一种弱寄生菌，研究发现在健康的枝条中也能分离到腐烂病菌，当树势较强时，腐烂病菌隐藏在树体组织内休眠；当树体长势衰弱时，腐烂病菌开始扩展引发病害。如冻害、营养缺乏、寄主抗性、环境恶化、管理水平、干旱缺水等都能引起或加重林木腐烂病的发生。气象因子：气象因子变化和腐烂病的发生有十分密切关系，温度过高或过低不仅影响树体的生长发育，也影响腐烂病原菌的活动。调查发现如果早春升温快、低温持续时间长，在促进树体提早生长发育的同时，也为腐烂病病原菌的活动提供了适宜的温度、环境和营养供应。如果在夏季出现长时间干旱天气，苹果树的生长发育受到抑制，树体的抗病能力减弱，容易使得腐烂病菌侵染引发病害。因而在春季雨水适中的季节，苹果树腐烂病发生最轻；在夏季干旱季节，苹果树腐烂病一般发生比较严重（赵书华等，2008）。臧睿在研究苹果树腐烂病菌V.mali不同生物学特性时，结果表明温度对V.mali分生孢子器产生有较大影响，但最适温度都在20～25℃。温度和湿度对离体接种枝条的发病率有显著影响，病原菌接种枝条侵染的最佳温度是20～25℃，随着相对湿度的增大，离体接种枝条发病率也越高（藏睿等，2007）。刘伟（2014）对苹果树腐烂病菌V.mali不同的生长季节中病斑扩展情况进行研究，在不同季节人工接种V.mali从扩展为可见病斑（病斑径向扩展5mm）所需的时间不同，其中春季扩展所需平均时间为7.7d；夏季扩展为可见斑的时间平均为10.2d；秋季扩展为可见斑所需时间最长为12.5d。9 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究原因可能是春季时，苹果树经过冬季低温、冬眠等因素，树势较弱，腐烂病侵染较容易、病斑扩展较快。随着苹果树生长发育及浇水、施肥、施药等措施，苹果树树势逐渐增强，腐烂病病斑扩展减缓。冻害：新疆寒冷的天气对腐烂病的发生有一定的影响，林木发生冻害时，导致腐烂病发生加重。新疆冬季气温比较低，持续时间较长，导致果树修剪部分、叶芽、花芽处受冻组织坏死，腐烂病菌在春季容易侵染受冻树体，或是潜伏病菌容易因树势衰退而快速蔓延扩展，引起腐烂病大流行发生。这是造成新疆果园腐烂病流行的主要原因（李辉等，2005）。树体低温冻害后，树体内生理生化指标发生变化，植物体内的细胞代谢被严重破坏。低温冻害引发和加剧了植物膜脂过氧化作用，膜脂过氧化会导致植物细胞膜系统损伤，其产物丙二醛扩散，破坏植物体内多种新陈代谢反应（曾超西等，1991）。在试验中，将2～5a树龄健康苹果离体枝条经快速冷冻处理后，在适合的试验条件下观察到发生腐烂病症状，证实了无腐烂症状的苹果枝条同样带菌的观点（景学富等，1994）。加之后期管理不善，如树体负载重，肥水投入不够，为腐烂病的发生埋下了隐患。树势、树龄及树枝方位：树势的强弱、树龄的大小以及树枝的方位与腐烂病的发生均有一定的影响。一般来说，树势弱的林木，腐烂病侵染容易病害发生严重；生长健壮树势强的果树发病轻。张王斌等（2006）研究苹果树树势与腐烂病的危害时也得出同样的结论。在调查苹果园树龄和腐烂病严重程度关系时，1～10a树龄的果园，腐烂病发生轻，11a~15a以上树龄果园，腐烂病发病较重，大于15a树龄的果园，腐烂病发生最严重。对新疆库尔勒香梨腐烂病的发生规律进行调查也发现，幼年期和初果期树龄的果园，腐烂病发生程度较轻；11a生以上树龄的果园腐烂病发生较重（郭开发等，2016）。在果树的南面或西南面冻害发生重于其他方位，腐烂病发生也最为严重。其主要原因是晚冬和早春树体向阳的方位温差较大。在日出时，南部迅速解冻，日落时迅速冻结，冻结和解冻相互交替，如此反复循环造成树体组织受到冻死或伤害，受冻树体易因腐烂病菌的侵染而发病。树体发病不仅和自然因素有关，还和寄主植物的抗病能力有关。当树体衰弱或抗病能力下降时，病菌快速侵染或树体内潜伏病菌借机便可在寄主组织中快速繁殖扩展，引起树体发病。树体水分：水分不仅参与植物体内各种新陈代谢、促进植物对营养物质的吸收，还参与植物体内有机物的合成，调节植物体温，参与植物抗逆等发挥重要的作用。新疆属于干旱、半干旱地区，高温、低温、冷害、冻害、盐碱等逆境环境较多，这些逆境环境均影响植物体内水分代谢平衡，导致植细胞因脱水、缺水而引起水分亏缺（王伟，1998）。陈策等以树皮充水度作为苹果树体含水量的指标，用离体枝条接种腐烂病菌研究树皮充水度与抗病斑扩展能力，结果证实树皮充水度与病斑愈伤能力有关系。在相同温度下，树皮充水度和枝条病斑愈伤能力呈现正相关，树皮充水度高抗扩展能力强；当树皮充水10 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究度80%以上有利于树皮愈伤周皮的形成，树皮充水度低于70%时则失去愈伤能力（陈策，1980）。管理水平：果农管理果园水平与果树长势有直接关系，果园管理水平影响着果园病虫害的发生情况。果园管理水平较好，腐烂病发病轻，而果园管理水平较为粗放，腐烂病发生较为严重。调查发现，在果园中无残枝败叶，卫生较好，腐烂病发生较轻，而在果园中残枝败叶堆积或者清除不彻底，腐烂病发病较重（张王斌等，2006）。果园的管理水平主要包含果园卫生、修剪枝条、疏花疏果等，这些因素会影响果树树势、病原菌传播、越冬场所等；果树负载量大，营养消耗增大，从而导致树势衰弱，使得腐烂病菌容易侵染；同时在秋季不及时清扫果园残枝败叶、修剪病枝等，这些为病原菌的藏匿和侵染提供适宜条件，当树势衰弱时容易引起病菌侵染、传播，使腐烂病在果园流行。导致腐烂病流行的因素还包括果园土壤类型、施肥、林木品种等，王金友调查发现病疤重犯也是腐烂病流行的一个重要因素。随着时间推移，腐烂病病斑数量逐渐增加，病疤重犯逐年增多，调查发现盛果期苹果树一般发病重犯块数占30%～80%。病疤木质部带菌引起的重犯病疤所占比例最高，其次是疤边树皮被外来病菌侵染发病。在果园中病疤木质部内腐烂病菌可存活时间较长，最长达到5a，其中1a~3a树龄病疤带菌率较高，刮治后1a~3a之间病斑木质部所带病菌致病能力较强，接种枝条后发病率达80%以上。因此在防治措施中重视伤口愈合，更应通过促进伤口愈合来防治腐烂病（王金友等，1985）。1.1.5林木腐烂病的防治林木腐烂病的防治主要以提高树势为主并结合化学防治、物理防治、生物防治为辅的综合防治措施。化学防治：化学药剂是防治腐烂病的重要方法，目前国内外对苹果、香梨腐烂病化学防治研究较为深入。随着防治腐烂病药剂的数量和种类不断发展，多种高效、低毒、低残留防治苹果和香梨腐烂病的新农药、新剂型不断出现，防治效果得到明显提高。同时对化学药剂剂型、使用时间、使用方法等不断创新，并取得一定成果。樊民周（2005）选择两种化学药剂对苹果树腐烂病菌毒力进行比较，发现内吸性低毒杀菌剂12.5%的速保利可湿性粉剂对苹果树腐烂病菌的抑菌效果较好，是40%福美砷的1.12倍。张王斌（2005）选择一种高分子聚合物乳液，和一种在水中有稳定性的植物激素合成了一种PND的无公害伤口愈合剂，通过对苹果树腐烂病伤口愈合率进行调查，愈合率达到了59.1%。低毒和无公害的新农药及新剂型出现，为腐烂病的防治和无公害农业生产提供了新的途径和方法。郭开发等选择多种方法防治新疆库尔勒香梨腐烂病时，发现增施有机肥可有效提高树势，从而减低了发病率；对病斑刮治后涂抹43%好力克200倍液可11 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究有效防治香梨腐烂病的发生（郭开发等，2016）。物理防治：果树腐烂病采用刮除法、糊泥法等物理措施防治果园中腐烂病的发生和病斑的扩展。试验选择腐烂发病率达90%的27a生苹果园内，选择扩刮法进行物理防治腐烂病，扩刮的病疤复发率为2.1%，未扩刮的复发率是26.8%。经测定，扩刮部位皮层内的酚类化合物明显增多，防治试验取得了良好的效果。（赵静芳，1982）。刮皮防病的主要作用有：（1）减少树体带菌量；（2）刺激树体，增强树体的抗病力；（3）更新树皮，可以减少腐烂病菌的潜伏场所和越冬场所（任秀奇等，2010）。生物防治：随着生活水平的提高，人们对农产品的要求也越来越高。化学防治产生的农药污染、农产品残留等和物理防治需要耗时、耗人、财力等不利因素，生物防治越来越受到重视，生物防治对环境无污染、安全、无残留，积极开发新的生物药剂防治腐烂病显得尤为重要。目前生物药剂主要是青霉菌和木霉菌防治腐烂病，木霉菌多种植物病原菌，目前报道可寄生18个属种的29种植物病原菌（乔宏萍等，2002）。辛雅芬（2005）筛选了一株螺旋毛壳菌（Chaetomiumspirale）ND35，室内对峙实验发现螺旋毛壳菌对腐烂病菌的菌丝生长有强烈的抑制作用。室外试验用ND35处理的苹果树枝条，其接种苹果腐烂病菌的发病率明显低于其它处理。1.2林木腐烂病菌分类林木腐烂病菌有性型为黑腐皮壳属真菌，属于子囊菌门（Ascomycota）、子囊菌纲（Ascomycetes）、腐皮壳目（Diaporthales）、黑腐皮壳科（Valsaceae）、黑腐皮壳属（Valsa）（Kirketal.,2008）。Ehrenberg（1818）首次对黑腐皮壳属的无性世代进行了描述，黑腐皮壳属的无性型为壳囊孢属（Cytospora），属于半知菌类（Deuteromycotina），球壳孢目(Sphaeropsidales)，球壳孢科（Sphaeropsidaceae)，壳囊孢属（Cytospora）。有性型黑腐皮壳属和无性型壳囊孢属是同一种微生物两种不同的存在形式。Cytospora真菌广泛存在于世界各地，目前已被描述的有550多个种，除少部分报道是植物内生菌外，其余种类危害多种针叶和阔叶林木的病原菌（Fotouhifaretal.,2010）。Cytospora属真菌分类鉴定主要依据病原物的寄主、菌落培养特征、分生孢子器、分生孢子、生物学等特性，但是不同林木植物、不同培养条件下菌落特征会发生很大变异，导致对Cytospora属真菌的鉴定准确度不高，出现很多的同种异名（Spielman,1985）。1.2.1形态学分类子囊菌门病原物鉴定主要以不同培养条件下的培养特征和子囊、子囊孢子类型等特征作为分类依据。而在自然环境或人工培养环境下，有些真菌不出现有性世代，常出现12 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究无性世代，无性世代真菌鉴定主要依靠分生孢子器形态、产孢方式、分生孢子形态等特征进行分类鉴定。黑腐皮壳属（ValsaFr.）主要特征为子囊壳埋生于子座中，孔口外露，有长颈伸出子座，由菌组织和基物混合而成；子囊棍棒状或圆筒状，子囊内有8个子囊孢子；子囊孢子单细胞，无色，微弯，香蕉形。黑腐皮壳属（ValsaFr.）所对应的无性型隶属于壳囊孢属（CytosporaEhrenb.）。Cytospora主要特征为子座埋生树皮的表皮或皮层下，有时外露，子座呈圆锥形或近圆形；分生孢子器着生在瘤状或球状子座内，分生孢子器变异大，单腔或由于内陷而成多腔，单个或多个独立腔室，单孔口或多孔口；分生孢子较小，香蕉状或腊肠形，无色。但是由于腐烂病菌主要以无性阶段造成危害，它的有性阶段在自然界较为少见，并且不同的寄主和环境对腐烂病菌种类的子座、分生孢子器和分生孢子的形态影响较大，而在人工培养基上又不易形成子座组织（Kobayashi,1970;Adamsetal.,2002）。早期Valsa和Cytospora的种类鉴定主要根据寄主的不同来命名，造成了很多异名，造成了Valsa属真菌分类的混乱（Adamsetal.,2005）。真菌的形态特征是遗传变异的体现。虽然环境、营养等条件会造成一些真菌形态特征发生变化。但是，形态特征仍可以反映真菌的生理、病理、遗传和生态等方面的差异。目前，依据培养性状、形态特征等仍是真菌鉴定、分类的主要手段和依据（张传博，2006）。真菌的形态分类方法较简单、快捷、操作容易，对标本质量要求不高。但是，由于壳囊孢属真菌及其有性型的形态特征易受环境、培养条件的变化发生变异，或者不同种类的该属真菌形态相近，都会影响壳囊孢属真菌形态学分类的准确性。1.2.2分子生物学分类1.2.2.1rDNA-ITS在分类中的应用核糖体基因转录间隔区ITS(InternalTranscribedSpace)，包括在真菌核糖体DNA（rDNA）上18S小亚基SSU和28S大亚基LSU基因之间的序列片段。有rDNA在基因组中以多拷贝串联重复的形式存在，由转录区和非转录区构成，转录区包括5S、5.8S、18S、28SrDNA基因，这些基因由两个内部转录间隔区和基因间隔区（InterGenicSpaces,IGS）分开。5.8S、18S、28S的基因序列在不同的真菌种类中同源性较高，适合亲缘关系较远的类群之间的关系研究。而ITS和IGS区域基因序列具有广泛的多态性，因而适合较近亲缘关系类群之间的关系研究（陈剑山等，2007）。rDNA-ITS序列作为分子生物学研究中最常用的分子标记（Hortonetal.,2001）。Adams等利用rDNA-ITS序列对核果类腐烂病菌（Leucostoma）及近似属种类进行了研究，发现Leucostoma中存在从表型上很难区分的两个隐种，即Parapersooniisp.13 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究nov和L.curreyi(Nitschke)。Adams发现一些遗传上应划分到Diaporthe或者Phomopsis属的一些真菌，在形态学上更接近于壳囊孢的特征(Adamsetal.,2002)。另外，依据ITS序列能够揭示某些植物病原菌的起源，如两种疫霉杂交形成了欧洲桤树上的疫霉新种（Brasieretal.,1999）。1.2.2.2β-微管蛋白在分类中的应用微管存在于所有真核生物的细胞质，并且微管蛋白分子是迄今为止发现的最稳定的蛋白分子之一（翟中和等，2000）。它是一种具有极性的细胞骨架，由微管蛋白（Tubulin）和微管结合蛋白（MAPs）两大类蛋白组成。微管蛋白主要的组成为由α-微管蛋白和β-微管蛋白（Nogalesetal.,1998）。β-微管蛋白基因（β-Tubulin）是编码的β-微管蛋白的基因。翟中和认为微管蛋白分子可能是生物进化史上最为稳定的蛋白分子之一。由于β-Tubulin基因既有保守的外显子又有许多内含子，因此，β-Tubulin基因已经被广泛的用于真菌各级分类水平上的系统发育研究（翟中和等，2000）。郭开发对新疆塔里木河下游12株胡杨树腐烂病进行鉴定，依据β-Tubulin基因序列，将胡杨树腐烂病的病原菌鉴定为金黄壳囊孢C.chrysosperma，鉴定结果与形态学特征和ITS基因一致（郭开发等，2015）。苏春丽在对38个灵芝属菌株的β-Tubulin基因进行序列分析时发现，所测菌株划分为9个不同的类群，但总体上亲缘关系比较近，遗传距离较短（苏春丽等，2006）。1.2.2.3多基因联合分析法在真菌分类的应用近几年来，研究者逐渐认识到单基因的分析法，在微生物分类中存在着一些严重的不足之处，可靠性不高等问题。单基因分析法逐渐被多个基因联合分析法所代替（KullnigandGradinger,2002）。现在，多基因分析的方法已经逐渐成为真菌系统分类研究中的标准方法之一（Kepley,2009）。Slippers采用rDNA-ITS，β-Tubulin和EF-1α联合分析的方法，成功的将Botryosphaeriaaustralis和Botryosphaerialutea两个不同的种类区分，使得对苹果轮纹病菌的认识上升到了一个新的阶段（Slippers,2004）。Kepley通过rDNA-ITS和EF-1α基因相联合的办法，对美国科罗拉多州杨树（PopulustremuloidesMichx.）上得到的壳囊孢属（Cytospora）真菌进行了系统分类研究，证明在常见的病菌种类之外，还发现该属的另外一个新种也可以引起杨树腐烂病（Kepley,2009）。臧睿以rDNA-ITS，β-Tubulin和EF1α三个基因序列和联合基因序列数据集为基础，通过MP、ML和BI三种系统分析法，明确了我国苹果树腐烂病菌的三个种类组成，即V.maliMiyabeetYamada，V.malicolaZ.Urb和V.persoonii（=Leucostompersoonii）。而V.mali种下又可以划分为两个不同的变种，即V.malivar.mali和V.malivar.pyri，其中V.malivar.mali是我国苹果树腐烂病最主要的致病菌（臧睿，2012）。杜琴以形态14 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究学结合rDNA-ITS，β-Tubulin和EF1α三个基因序列对12种新疆主要林木上采集腐烂病样并分离获得149株腐烂病菌分离株，确定引起新疆林木腐烂病菌鉴定为三个种：C.schulzeriSacc.&P.Syd(有性型V.malicola)、C.chrysoperma(有性型V.sordida)和C.sacculus（Schwein.）Gvrit(有性型V.ceratosperma)。其中C.sacculus为新疆林木腐烂病菌的优势种，占总分离数的95.97%（杜琴，2013）。随着分子生物学和生物进化理论知识的不断发展和完善，真菌的分类研究工作鉴定将会变的越来越准确。特别是一些通过形态学手段不易鉴定的真菌，通过多基因联合的方法及形态特征等，将会对微生物的分类地位的确定变的越来越准确和可靠。1.3腐烂病菌致病力差异研究冯惠中等（1988）对苹果树腐烂病菌致病力进行研究，结果表明分别用梨和苹果树腐烂病菌孢子悬浮液接种梨和苹果树枝条，两种腐烂病菌在与其来源相同的寄主上的致病力较强，但它们在田间自然条件下不能互相侵染，即使在室内经过处理的离体枝条上，它们对不同寄主的致病力也不同。陆燕君对苹果树腐烂病菌V.mali致病力进行研究，结果表明对梨和苹果树腐烂病菌进行室外活体接种，梨树腐烂病菌接种梨枝条和苹果树腐烂病菌接种苹果枝条均可以发病，但是交互接种均不发病；进行室内离体枝条接种则无论相对应接种还是交互接种均可以发病（陆燕君，1992）。郑仙蓉研究结果表明梨树腐烂病菌除危害梨树外，还可以危害柳、苹果、国槐、桃、杨树、核桃、桑等多种植物（郑仙蓉，1988）。臧睿等依据菌落颜色将采自陕西的苹果树腐烂病菌V.mali划分为三个类群（黄褐色、乳白色和灰褐色类群），分别用这三种类群的苹果树腐烂病菌接种秦冠和红富士两个苹果品种的离体枝条，根据病斑面积的调查结果，发现黄褐色类群的致病力强于其它两种类群（臧睿等，2007）。王娟对河北省苹果树腐烂病V.mali不同菌株进行致病力研究发现，河北省各地区苹果树腐烂病菌V.mali菌落颜色分为7个类群，主要为浅黄色和黄色；不同分离株在菌丝生长速率和菌丝疏密程度上也存在较大差异，其中70.5%的菌株生长速率为中等，57.52%的菌株气生菌丝发达；不同颜色菌株的致病力有显著差异，在菌丝生长速率接近的情况下，浅黄色和黄白色菌株致病力较强；V.mali菌落颜色相同而菌丝生长速率不同的菌株间致病力也有显著差异，且致病力强弱与生长速率呈正相关；菌落菌丝疏密程度对V.mali菌株致病力的影响不明显（王娟等，2013）。张美鑫等（2013）对我国梨树腐烂病V.malivar.pyri致病力进行测定发现，来源于我国14省市5个梨系统的91份梨树腐烂病菌株在不同梨品种上的致病力均存在显著性差异，但同一菌株在5个梨品种上的症状表现有一定差异。根据各供试菌株在不同梨品种上的综合致病力强弱可将其划分为3个类型，其中强致病力菌株16份，占15 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究17.6%，中致病力菌株70份，占76.9%，弱致病力菌株5份，占5.5%。来源于不同地区和梨系统的V.malivar.pyri菌株之间其致病类型的分布比例存在明显的差异，这种差异可能与其梨系统的抗病性相关。试验证实了我国梨树腐烂病菌存在强、中、弱三种类型，以中等致病力菌株为优势群体。韦洁玲对我国苹果园腐烂病病菌种内致病性分化研究结果表明：V.malicola（占总分离株3.3%）种内致病力没有明显分化；而我国腐烂病菌优势种V.ceratospermasensuKobayashi（占总分离株96%）致病力分化明显，致病力强的褐色类群的菌株约占96%，白色菌株致病力中等，黑色菌株致病力弱；供试的约60个褐色类群菌株之间病斑大小有差异，经方差分析大部分菌株之间的差异不显著。腐烂病致病力分化与菌株的地理来源没有明显的相关性，各地均可以发现致病力强弱不同的菌株。同时试验通过接种离体枝条发现，V.ceratospermasensuKobayashi种下的Ca分支均分离自苹果树，在苹果树上的致病力强，在梨树上致病力中等；而Cp分支，无论分离自梨树还是苹果树，分支内的各菌株致病力无明显差异，均表现在苹果枝条致病力中等，在梨枝条致病力强。V.malicola在苹果树和梨树上均表现为弱致病力（韦洁玲，2009）。孔利等对新疆林木腐烂病主要种V.ceratosperma致病力分化研究认为，不同寄主来源的V.mali菌株存在明显的致病性差异，其对原分离寄主枝条的致病力最强，对其他寄主枝条的致病力较弱。果胶酶活性、菌丝生长速率以及毒素产生种类及数量是造成不同寄主来源V.ceratosperma致病力差异的主要原因（孔利等，2016）。唐骏煜等认为梨树腐烂病菌V.ceratosperma均能使梨树、苹果树、核桃树、枣树及作为防护林的沙枣树、杨树、柳树等感病。在不同寄主叶片上产生病斑扩展速度和菌落颜色存在差异性。在苹果和梨树枝条形成产孢器并产生黄色和橘黄色分生孢子角，结果表明腐烂病V.ceratosperma对不同寄主的致病性存在一定差异（唐俊煜等，2015）。1.4腐烂病菌遗传多样性研究1.4.1遗传多样性研究意义群体遗传学是应用统计学和数学方法，研究物种群体的遗传结构及其进化演变规律的学科（吴小芹，2000）。群体是遗传学研究最基本的单位。植物病原真菌群体遗传学，主要研究植物病原真菌群体的遗传结构及其进化演变规律，并用统计学和数学的方法研究群体中的基因型的频率和基因频率，以及基因频率和基因平衡的影响因素，并由此来探讨植物病原真菌的进化演变过程（李川等，2003）。腐烂病菌群体遗传结构的研究，具有十分重要的意义。（1）有利于认识腐烂病菌群体遗传的多样性，可以明确腐烂病菌群体是否具有丰富的基因型以及其基因型分布情16 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究况；（2）有利于认识腐烂病菌群体遗传结构的特征和进化演化进程；（3）有助于揭示寄主基因型在腐烂病菌毒性变化中所起到的选择作用；（4）可以为抗腐烂病品种的合理布局提供重要的理论指导（宋培玲，2011；王宗华等，1998）。研究结果表明，遗传结构越复杂的病原真菌群体，越容易适应复杂的环境，越容易克服寄主的抗病基因，使寄主“丧失”抗病性。1.4.2遗传多样性研究方法和技术1.4.2.1随机扩增片段长度多态性RAPD随机扩增片段长度多态性，即RAPD（RandomAmplifiedPolymorphismDNA），是由Williams（1990）和Welish（1990）发展的一种基于PCR的遗传标记技术。RAPD标记是以PCR为基础，以一系列随机排列的碱基顺序核苷酸单链为引物（一般为8-10bp），对试验对象的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，检测扩增DNA片段的多态性（王洪振等，2016；姜自锋等，2002；孙广宇等，2003）。RAPD标记的优点主要是方法简单，操作容易，可以对无任何背景的物种进行多态性分析，一套引物可对多种物种进行多态性分析等（王洪振等，2016；甘丽萍等，2004；姜自锋等，2002；赵国屏等，2002）。但是，此方法也有一定的缺点，主要是PCR扩增产物电泳后，具有相同迁移率的条带是否具有序列同源性不易判断，RAPD试验重复性比较差，可比性较差，RAPD是显性遗传，杂合子和纯合子无法区分（傅明洋，2009；姜自锋等，2002）。自RAPD方法被报道以来，这种方法已经被广泛的应用于各种病原菌群体遗传的研究之中。吴小芹（2006）利用RAPD标记方法对来自于中国、英国、美国、智利和南非的23株松树枯梢病菌（SphaeropsissapineaDyko&Sutton）的遗传距离进行研究分析，试验选择了12条引物共扩增出135个RAPD谱带，其中多态性位点率96.3%。聚类分析表明这23株菌株可以分为三个类群，来自智利的菌株与其它菌株的亲缘关系较远。王娟（2013）对我国河北省苹果树腐烂病菌V.mali遗传多样性采用RAPD分析表明，采集分离的44株菌株共产生89条谱带，并且均为多态性条带，多态性位点率为100%。应用NTSYS2.1软件对所得到的RAPD图谱进行聚类分析，以遗传距离0.72为阈值，所有的菌株可划分为7个遗传群体，结果表明河北省苹果树腐烂病菌具有丰富的种内遗传多样性。这种群体划分与地理来源并无直接关系。1.4.2.2限制性片段长度多态性RFLP限制性片段长度多态性，即RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）。原理是限制性核酸内切酶可切断DNA双链上特异的碱基序列，在同源染色体的相应的17 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究DNA片段，用限制性内切酶消化后，就会产生长度不同的酶切片段，然后用标记好的DNA探针与其杂交，就可以显示出基因组DNA的组成差异。RFLP标记的优点是具有遗传的专一性、稳定性、共显性等，不受显隐性关系、环境条件和发育阶段的影响（邓俭英等，2005；周宇爝，2009）。RFLP标记的缺点为试验步骤繁琐，周期长，试验费用高。片段较多，工作量较大，后期分析困难。检测中需要使用放射性同位素，对人体也有一定的伤害（王洪振等，2016；邓俭英等，2005；周宇爝，2009）。因此，一般情况下，在应用RFLP分析时，多采用其他分子标记方法联合使用，以求分析结果准确可靠。肖江涛（2011）采用探针PS127558对来自黑龙江、新疆和内蒙古等5个大豆疫霉菌地理群体的133个菌株的采用RFLP标记方法进行遗传多样性分析，共得到25条杂交带，其中多态性条带为24个，占96%。黑龙江群体和新疆、内蒙古群体间遗传相似度较高。黑龙江群体遗传结构的高度复杂，而新疆和内蒙古菌株的群体遗传结构则比较简单，分别有88.2%和100%的菌株聚类于同一聚类组，且均有超过58%的大豆疫霉菌株和部分黑龙江菌株指纹图谱完全相同。Shannon's多样性指数也表明黑龙江大豆疫霉病菌群体的遗传多样性最为丰富。李惠民选择细菌通用引物扩增水稻根际微生物的16SrDNA基因片段，并建立基因克隆文库，随后用限制性内切酶HhaI进行了PCR-RFLP分型，分别得到113个和110个酶切类型，采用多样性指数和优势细菌聚类比对方法对试验结果进行分析统计，结果表明，根际水稻土细菌的种属多样性指数、丰富度指数、均匀度指数比非根际土略高；在水稻根际土和非根际土中的优势细菌种群分别有3种具有完全相同的酶切类型，其余间存在一定的差异（李慧民，2000）。秦旭升选择一对特异性引物对南瓜疫霉菌（Phytophthoracapsici）和疫霉属（Phytophthora）部分真菌和常见土传真菌12个种的14个菌株的18SrDNA进行PCR扩增，并用4种限制性内切酶EooRⅠ、HaeⅢ、HhaⅠ、HinfⅠ对PCR扩增产物进行酶切分析，建立了南瓜疫霉菌的PCR-RFLP检测程序。运用该PCR-RFLP检测程序对染病南瓜植株进行检测，成功地在南瓜植株发病茎病健交界处、发病叶病健交界处、发病果病健交界处、接种P.capsici24h的叶和接种P.capsici12h的茎上快速、准确地检测到了南瓜疫病菌的存在（秦旭升等，2003）。1.4.2.3扩增片段长度多态性AFLP扩增片段长度多态性，即AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism），即扩增片段长度多态性，这项技术是由荷兰科学家Zabeau和Vos于1995年等首次发展起来的一种检测DNA多态性的方法（Vosetal.,1995）。AFLP技术的基本原理是：对基因组酶切片段进行选择性扩增。具体是利用限制性内切酶切割基因组DNA形成酶切位点不同、分子量大小不等的随机性酶切片段，然后在其两端接上双链人工接头，形成18 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究接头的酶切片段，可以作为PCR扩增时的DNA模板。特异性片段经变性、退火和延伸周期性的循环而被扩增，长度不同的扩增片段即多态性片段则可通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进行检测（林剑伟等，2008；李珊等，2003）。AFLP标记技术具有可靠性好、重复性高、检测效率高；DNA的用量较少，多态性丰富等优点（林剑伟等，2008；高军，2002）。AFLP标记的缺点提取DNA的纯度要求较高，内切酶的质量要求高。而且，试验费用昂贵等。邹亚飞选用25对EcoRI和MseI引物组合对41株棉花黄萎病菌（Verticilliumdahliae）进行AFLP扩增，筛选到两对引物E64/M53和E49/M65，能分别从棉花黄萎病菌非落叶型菌系中扩增到433bp和110bp的特异性条带，而将非落叶型菌系和落叶型菌系快速区分开来（邹亚飞等，2003）。段会军利用RAPD、ISSR和AFLP三种分子标记技术对50株西瓜枯萎病菌株进行了遗传多样性分析。结果表明，21个RAPD引物、21个ISSR引物和21对AFLP引物分别对供试西瓜枯萎病菌株扩增出113、134和389条带，三种分子标记的遗传相似系数比较一致，三种分子标记方法可揭示西瓜枯萎病菌的遗传变异特点。但是三种分子标记的聚类分析结果存在一定差异，其中RAPD类群与生理小种和地理来源之间均不存在明显关系，而AFLP和ISSR类群与生理小种之间存在一定相关性，与菌株的地理来源关系不明显（段会军等，2008）。付洁（2010）采用AFLP分子标记技术对苹果黑星病菌进行遗传多样性分析，利用筛选出的25对AFLP引物对来自我国陕西兴平和旬邑的46株苹果黑星病菌，构建了遗传聚类分析图。结果表明，在相似系数为0.68的水平，46个菌株被划分为2个类群：第Ⅰ大类由全部的旬邑嘎啦、旬邑富士和兴平嘎啦采集菌株组成；第Ⅱ大类由全部的旬邑秦冠、旬邑红星、兴平红星、兴平秦冠采集菌株组成。遗传多样性结果表明陕西兴平和旬邑两地的苹果黑星病菌遗传多样性与地理位置无明显相关性，而与其苹果树寄主品种间存在一定的相关性。1.4.2.4序列相关扩增多态性SRAP序列相关扩增多态性，即SRAP（Sequence-RelatedAmplifiedPolymorphism），是由美国加州大学蔬菜作物系的Li和Quiros（2001）最早提出。这种分子标记的方法基于PCR扩增，其主要原理为：应用特殊设计的引物对开放阅读框ORFs（OpenReadingFrames）进行扩增，正向引物（F-Primer）主要是对外显子进行特异性的扩增；反向引物（R-Primer）主要是对内含子区域、启动子区域进行特异性的扩增（史倩倩等，2011；黄龙花等，2011；柳李旺等，2004）。SRAP标记由于稳定性和重复性好，共显性好，易测序和开发成本较低的优点，近年来，已经在多种植物的种质资源分析，遗传图谱的构建和重要性状基因的标记方面，发挥了重要的作用（史倩倩等，2011；王洪振等，2016；梦宪婷等，2009）。李正力（2011）19 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究试验从150对SRAP引物中，筛选出对苹果树腐烂病菌V.mali遗传多态性好的SRAP引物24对，对来自我国苹果产区的120株苹果树腐烂病菌的遗传多态性进行了研究，其研究结果认为：苹果树腐烂病菌具有一定的遗传多样性，这种遗传多样性与地理纬度等因素具有一定的相关性。1.4.2.5简单重复序列SSR简单重复序列，即SSR（SimpleSequenceRepeat），因为短串联重复序列广泛的存在于真核生物基因组的编码区和非编码区中，但其重复的次数在不同个体之间存在差异，因此，大多数的短串联重复序列具有多态性，可以做为一个重要的遗传标记方法广泛的应用于各种物种的遗传差异分析。SSR标记的优点是：检测容易，重复性好、多态性丰富；共显性遗传（程小毛等，2011；陈长卿，2008）。但是SSR的缺点为是引物的通用性比较差，需要多次杂交筛选；并且需要测序，工作量巨大，需要耗时较长，试剂消耗较大；需要大量资金支持试验（程小毛等，2011；董艳玲，2005）。孙鑫垚（2010）对陕西省苹果轮纹病原菌多样性进行分析，SSR分析结果显示，在100%的遗传相似性水平上，供试菌株中B.dothidea种分为20个种群，每个种群包括1∼6个菌株，在50%的相似性水平上，分为两个类群，说明B.dothidea种内存在显著的遗传差异，和病原菌的地理分布没有相关性，和寄主表现出一定的相关性。徐志军等（2015）利用72对多态性SSR引物对57份具有不同青枯病抗性的花生品种进行遗传多样性分析，57份花生品种遗传相似系数为0.4978~0.9607，平均系数为0.7038。在遗传相似系数为0.69处，参试花生品种聚类为2个类群，与品种的青枯病抗性鉴定结果和品种的植物学类型基本一致，花生抗病品种之间的遗传差异大于感病品种之间的差异。1.4.2.6简单重复序列区间扩增ISSR简单重复序列区间扩增，即ISSR（Inter-SimpleSequenceRepeat），该项技术是由Zietkiwicz（1994）等创建的一种新型的分子标记方法。ISSR技术的分子生物学基础主要是在真核生物基因组内存在的大量的串联的简单重复序列，如：(GTC)n、(GTG)n、(GA)n、(AG)n、(AC)n等。ISSR以广泛存在的简单重复序列本身为靶标设计引物，以位于反向排列于SSR之间的DNA序列为基础进行PCR扩增（赵谦等，2007；朴红梅等2007）。ISSR分子标记的优点，ISSR标记通常为显性遗传，具有很好的稳定性和重复性；操作简单迅捷，成本较低，适合大样本量研究；多态性的检测灵敏高效。（Kantetyetal.,1995；林杰君等，2012；张玉星等，2009；吕翔，2011）。对物种的遗传多样性进行分析和评估是ISSR技术最广泛的用途之一。目前，该项技术已经在各种植物、植物病原真菌的多样性检测中发挥了重要作用，鉴定了一批重要20 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究的植物种质资源，明确了一些重要病原真菌的群体遗传特性，为优质品种的选育、病害的有效防治奠定了重要的理论基础。肖荣凤等（2015）为了明确尖孢镰刀菌不同寄主及专化型菌株遗传差异性和亲缘关系，利用ISSR分子标记技术对来源于不同寄主(专化型)及地理分布的43个菌株进行了遗传多样性分析。供试的15条引物通过ISSR-PCR扩增，共扩增出147条条带，其中多态性条带为144条，平均多态性条带达98%。43个菌株的聚类结果表明，各菌株间的遗传相似系数为0.67~0.97，且遗传多样性与其寄主种类和地理来源没有明显的相关性。赵国芳（2003）应用ISSR分子标记技术，对我国梨属的主要栽培品种的基因组进行遗传分析，筛选得到的11条引物在供试的52个品种中共扩增出193个位点，其中多态性位点182个，多态性位点百分率为94.3%，表明我国梨属的主要栽培品种存在较高遗传多性样。刘娟等采用ISSR技术对新疆野杏种质资源的遗传多样性和亲缘关系进行研究发现，22条引物共扩增出465条多态性条带，多态性位点百分率为99.49%，同时研究结果表明新疆野杏种质资源的遗传变异主要来自于居群内（86.43%），少部分来自于居群间（13.57%）。各居群中霍城居群和新源居群亲缘关系最近，遗传分化程度小，新源居群和巩留居群间亲缘关系最远，遗传分化程度大（刘娟等，2015）。藏睿等对中国苹果树腐烂病V.mali遗传多样性进行分析，筛选得到11条ISSR引物，通过对PCR优化后，选择的11条引物共扩增稳定的条带共129个位点。在供试的87个陕西苹果树腐烂病菌分离株中，119个位点为多态性位点，多态性位点百分率为92.25%；在126个中国苹果树腐烂病菌分离株中，129个位点均为多态性位点，多态性位点百分率为100%。对陕西和全国不同地理区域种群遗传多样性的分析表明，不同地理区域种群的Nei’s（1973）基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I）均达到了H>0.2，I>0.3的水平，表明我国的苹果树腐烂病菌V.mali具有丰富的遗传多样性。通过聚类分析也发现来自于同一地理区域种群的不同自然种群可分布于不同的聚类群中，说明各个自然种群之间的遗传亲缘关系与其地理来源之间并没有明显的相关性。对中国不同地理区域种群内不同自然种群的UPGMA聚类分析发现，苹果树腐烂病菌种群的遗传分布与其所处地理纬度位置之间具有一定的关系，但是这种关系非常微弱（藏睿，2012）。Zhou（2001）应用ISSR指纹分析方法区分了葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）的多个种类以及相关的真菌，它们用5条ISSR引物对10个葡萄座腔菌不同种类的51个分离株的亲缘关系和遗传特性进行了研究分析，ISSR-PCR扩增总共产生了大小范围为200bp到1650bp的扩增条带171条，扩增结果的聚类分析也表明B.dothidea和B.ribis是完全不同的种类，而B.parva虽然和B.ribis的近缘关系较近，但是其还是分属于不同的分枝，B.mamane虽然和葡萄座腔菌属的其它的种类具有相似的形态特征和近似的ITS序列，但是其仍然是一个独立的种。他们的研究结果表明ISSR分子标记21 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究分析方法是鉴别研究形态特征和ITS序列相似，且通过一般的形态鉴定难于鉴定的丝状真菌的有力工具。目前，ISSR技术已在品种鉴定、遗传作图、以及不同个体遗传多样性和亲缘关系的研究领域被广泛的应用。但由于ISSR属于显性标记，其对解决交配系统、计算杂合度和父系分析等问题上效果欠佳（李海生，2004）。因此，在研究中最好结合其它的标记技术，综合分析才会得到比较准确、可靠的结果。另一方面，虽然，ISSR引物的设计简单，通用性强，往往一套引物就可以被应用多种研究对象的分析，但是，针对每一种具体的研究对象，还是需要对众多的引物进行大量的筛选，而这种筛选不仅需要耗费大量的时间，同时还会消耗许多试剂，使研究成本增高。但是，这些“瑕疵”于其优点相比是微乎其微的，相信随着自动化技术和荧光探针的发展，ISSR引物的筛选将会越来越简单，ISSR的应用将会越来越广泛。1.5腐烂病菌初侵染源检测腐烂病是一种跨年份枝干病害，冬季以菌丝体、分生孢子器及分生孢子、子囊壳及子囊孢子在田间病株和病残体上越冬。其发病高峰出现在秋季和春季果树休眠期前后。病斑中的病原物可存活4年左右，同一块腐烂病斑释放孢子的能力可持续一年半之久（王金友，2006；侯明生等，2006）。腐烂病菌孢子主要借风雨传播，每年5~8月是发病高峰期，9月上中旬病部逐渐停止扩展，产生分生孢子器，并出现大量分生孢子角（李辉等，2005）。腐烂病菌寄生性比较弱，一般只能从伤口侵入已经死亡的皮层组织，但也能从叶痕、果柄痕和皮孔侵入。侵入伤口包括冻伤、机械伤、修剪伤和日灼等，其中以冻伤和修剪伤口最有利于腐烂病菌的侵入，带有死树皮的伤口最容易被侵染导致发病（Dearnessetal.,1934；Heltonetal.,1961；Kepleyetal.,2000；Lukezicetal.,1965）。腐烂病菌除了在冻伤、修剪等伤口处和已死亡的组织中生存扩展外。还可以大量的在落皮层中生存扩展。落皮层一般在9月中旬开始形成，10月上旬逐渐变色死亡。落皮层是腐烂病菌潜伏越冬的重要场所，是腐烂病主要菌源地。熊智采用通径系数法对苹果腐烂病的越冬场所进行分析，苹果腐烂病的越冬场所主要是上年发病未经防治的病斑，其次是上年发病经刮治处理再度扩展的病斑，地表病残枝的病原对越冬后的侵染的间接作用也是不可忽视的（熊智等，2000）。果树腐烂病菌具有潜伏特性。菌丝和分生孢子可以在树体内长期存活而不表现出腐烂症状（Billsetal.,1996；Fisheretal.,1993）。早春树液流动时开始传播危害，在分生孢子器成熟，雨水天气时使得湿度较大时，陆续长出分生孢子角，产生大量淡黄色的分生孢子，进行多次侵染危害，直至越冬前停止侵染。尤以春季为重（王成祥等，2012）。病菌侵入后，首先在侵入点潜伏生存，树势健壮，抗病力强时，腐烂病菌就不能进一步22 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究扩展致病，进行长期潜伏。当树体或局部组织衰弱，抗病力降低时，潜伏菌丝便扩展致病。病菌在扩展时，首先病菌产生有毒物质杀死侵入点周围的活细胞，而后才能向周围扩展，致使树皮坏死腐烂。目前，对腐烂病的检测和鉴定主要依据子座组织、分生孢子器、腔室的大小、数量、形状，和排列方式等（Adamsetal.,2002）。虽然，这些方法能对腐烂病菌的检测能起到一定的作用，但是由于这些传统的方法需要耗费大量的人力和时间，而且，由于这些鉴定的指标容易受到寄主和环境条件的影响，从而使病原菌的检测准确率相对不高(Adamsetal.,2005)。有报道指出苹果树腐烂病菌存在潜伏侵染的现象，即外表看似健康的植物组织上也有腐烂病菌的存在(陈策，2009)。传统的病原菌鉴定方法，对这种无症状的潜伏侵染现象很难发挥应有的作用，因此，采取更为先进的分子检测技术，以期快速、准确、可靠的检测出藏匿在各种各样寄主组织中腐烂病菌是十分必要的。20世纪90年代以来，随着PCR技术不断的在各个领域应用，大大的促进了相关学科的发展。伴随着PCR进入植物病理学研究领域，使得对植物病原物的检测、鉴定的方法更为准确。目前，采用PCR方法检测植物病原物，无论是真菌、细菌、病毒、线虫等，已经成为植物病理学的一种基础的鉴定和检测方法。自White首次设计出ITS引物对真菌ITS区段进行扩增以来，应用ITS引物对病原真菌进行鉴定和检测的报道越来越多(Whiteetal.,1990)。Zang（2012）依据腐烂病菌rDNA-ITS的特异序列，设计种特异性引物VmF/R，VmcF/R，VpF/R，区分苹果树-1腐烂病菌V.malivar.mali,V.malicola,V.persoonii，检测灵敏度达到100fg·μL。王璠（2012）设计了桃流胶病F.aesculi的特异性引物。在β-Tubulin基因序列区域设计了一个正向引物FaF，与非特异性反向引物Bt2b组成引物对，特异性的扩增桃流胶病菌F.aesculi基因组DNA，得到一条大小为322bp条带。参与检测的20个F.aesculi都能扩增出该条带，其它两种桃流胶病菌L.theobromae和D.seriata及桃树和其它植物上的其它属真菌显示为阴性。引物FaF/Bt2b的灵敏度为浓度1pg/μL的基因组DNA。陈长卿根据大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae）的ITS的特异性区段设计了一对能够检测大豆疫霉病菌的特异性的引物PS1/PS2，这对引物可以成功的区分出多种同属疫霉属的不同种类的病原菌，而且，对病原菌的有着较高的灵敏度，PCR扩增所能达到的最低模-5板检测剂量为10ng/μl，对带菌土壤的检测剂量也达到了0.05个卵孢子/克土壤(陈长卿，2008)。唐建辉根据GenBank中已知的Colletotrichum属的24个种的ITS序列，经分析比较设计出一对引物CY1/CY2，这对引物可以从西瓜炭疽病菌（C.orbiculare）和菜豆炭疽病菌（C.lindemuthianum）中扩增出一条442bp的条带，而其他的炭疽病菌扩增显示阴性，从而将这两种病原物易于和其它的炭疽菌区分(唐建辉等，2006)。郑小波利用大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae）、苜蓿黄萎病菌（VerticilliumabloatrumReinke23 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究&Berth）和小麦印度腥黑穗病菌（TilletiaindicaMitra）ITS基因序列的特异性区段，设计出可以快速、准确的检测这三种重要真菌病害的检测试剂盒，使得对这些病害的检测时间快速的缩短、准确性也提高（郑小波等，2005）。Nicolas利用种特异性的引物，成功的从杨树上检测到了三种壳针孢属（Septoria）病原菌的存在（Nicolasetal.2005）。目前，人们已经利用PCR技术成功的检测出了大豆疫霉（王立安等，2004），冬生疫霉（张海峰等，2008），红掌胶孢炭疽病菌（邢红梅等，2008），苹果黑星病菌（夏明月，2009）等多种植物病原真菌病害。1.6本研究的目的和意义新疆具有自然资源丰富和生态环境极端脆弱的双重特点，这里土壤瘠薄、盐渍化土壤分布面积广，气候干燥加上冬季寒冷，使苹果、香梨、枣树、杏、核桃、巴旦木等特色林果和杨树、柳树、榆树、海棠果等绿化林及农田防护林腐烂病发生非常普遍，腐烂病常造成树势衰弱，林木生长缓慢，严重者造成大批林木死亡，给农田防护林及特色林果发展造成严重影响。由于对新疆主要林木腐烂病菌的种类及其遗传多样性缺乏系统、科学的认识，现有的各种防治方法不能有效防治各种林木腐烂病的发生，引进、培育和评价抗腐烂病的林木资源因无法确定抗病目标而难以实施。1.6.1研究意义目前，由于对于引起腐烂病的病原菌的分类地位还不清楚，与其近缘属种的关系还不十分明确，特别是新疆地区林果种类较多，腐烂病病原菌更加复杂。杜琴早期对新疆部分林木腐烂病菌进行鉴定，认为新疆林木腐烂病病原菌种类主要有三种：C.schulzeriSacc.&P.Syd(有性型V.malicola)、C.chrysoperma(有性型V.sordida)和C.sacculus（Schwein.）Gvrit(有性型V.ceratosperma)。其中C.sacculus为新疆林木腐烂病菌的优势种，占总分离树的95.97%（杜琴，2013）。更大范围的采集新疆林木腐烂病样品，对腐烂病病原菌进行鉴定及后期腐烂病菌研究具有重要意义。由于腐烂病菌具有潜伏侵染特性，树木受感染后早期不表现症状，待树势衰弱后开始扩展并导致腐烂病发生，此时防治为时已晚。若能在果园枯枝落叶以及树皮上提前检测到腐烂病菌的存在，并在其蔓延扩散前进行预防，可有效提高林木腐烂病的防治效果。但是腐烂病检测采用传统分离方法费时费力，且对潜伏侵染部位以及新感染部位分离效果不佳，基于腐烂病菌β-Tubulin序列分析的PCR检测技术则更为有效和准确。设计特异性引物，建立针对新疆林木腐烂病菌快速、准确的PCR检测技术，以便为新疆林木腐烂病菌的早期监测和防治提供技术支持。24 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究因此，本研究的主旨在于通过形态学特征和多基因联合的方法，对新疆林木腐烂病的种类组成进行系统的分类研究，明确新疆林木腐烂病的种类和组成。统计发现新疆经济林木腐烂病菌的主要种为苹果树腐烂病V.mali，苹果树腐烂病V.mali接种不同寄主林木上均可致病，但致病力不同。V.mali在新疆不同林木上存在致病力分化及致病性差异，初步的研究表明苹果树腐烂病菌分离株具有不同的遗传特性，并通过ISSR分析的方法，对新疆腐烂病主要种V.mali主要类群的遗传结构进行分析，以期为抗病育种工作的顺利开展奠定一定的理论基础。并以苹果树腐烂病菌V.mali的β-Tubulin区段，分别设计种特异性引物，并在此基础上建立起苹果树腐烂病菌的分子检测体系，以期为苹果树腐烂病的早期预测预报提供一定的技术支持，为进一步腐烂病的有效防治奠定基础。1.6.2技术路线新疆林木腐烂病菌采集、分离及相关标准菌株收集和苹果、香梨园病残体、树皮等采集林木腐烂病菌种类鉴定林木腐烂病快速检测技术经济林园农田防护林林木腐烂病菌初侵染源检测主要种V.mali致病性接种及表型差异分析主要种V.maliISSR分析明确新疆林木腐烂病菌的主要种类，明确主要种Valsamali遗传分化与致病力分化的关系及明确其腐烂病菌的初侵染源25 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究第二章新疆主要林木腐烂病菌鉴定52522013年底新疆当年造林面积1.67×10hm，其中防护林面积为1.11×10hm(新疆统计年鉴，2014)。杨树、沙枣、榆树、胡杨等乔灌木为新疆主要的防护林树种（艾吉62尔·阿不拉等，2015）。截止2013年底，新疆特色经济林果种植面积突破1.47×10hm，6总产量6.50×10t，产值450多亿元（牛金辉，2015）。特色林果产业作为新疆林业资源的重要组成部分，具有经济效益、社会效益和生态效益，在新疆这样一个气候条件恶劣、自然资源缺乏、生态环境等条件下大力发展特色林果业。不仅能够增加农民经济收入，还具有具有保持水土、防风固沙、维护绿洲生态安全等生态林所具有的重要社会作用，具有非常突出的经济效益、社会效益和生态效益。在新疆防护林和经济林建设中，林木腐烂病发生十分严重，对林业生产损失较大。新疆林木病虫害发生较为频繁。吴芳（2012）调查库尔勒香梨园腐烂病与香梨优斑螟的危害特点时，两者单独均可以危害香梨树，无严格依赖关系；两者共同为害香梨树时，对双方都有一定促进作用。且新疆冬季较为寒冷，林木树体容易遭受冻害，受冻树体在第二年易被腐烂病菌侵染而发生病害（吴玉霞等，2012）。赵绪生（2014）通过近50年我国苹果树腐烂病发生情况分析认为，腐烂病主要由树势衰弱、冻害、负载过重和忽视果园管理引起。本研究从新疆南北疆防护林和经济林广泛采集腐烂病样品，在实验室内进行分离获得分离物，并对分离获得的分离物进行致病力测定、形态学特征、ITS序列、β-Tubulin序列鉴定。从形态学和分子生物学角度对新疆经济林、防护林腐烂病病原菌的种类进行系统的探讨。2.1材料与方法2.1.1材料2.1.1.1腐烂病样品（1）经济林园：2012~2015年在新疆南北疆苹果、香梨、核桃、红枣、杏等经济林木上采集具有典型腐烂病症状的树皮及枯枝。采集样品的主要症状为：初期树皮表面有水渍状、略隆起病斑，具酒糟味；后期病斑失水干缩，形成黑褐色坏死病斑；干燥时病斑上出现有黑色凸出的黑点，在潮湿和雨后情况下，易产生黄色至红色的分生孢子角。在林木分枝处和修剪处容易发现腐烂病典型症状，样品采集的寄主及分离物数量见表2-1。（2）防护林：2012~2015年在新疆南北疆杨树、柳树、槐树、沙枣、胡杨等防护26 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究林木上采集具有典型腐烂病症状的树皮及枯枝。采集样品的主要症状为：初期树皮表面有红褐色或黄褐色、水渍状的病斑，不规则；后期病斑失水干缩，形成黑褐色坏死病斑；干燥时病斑上出现有黑色凸出的黑点，在潮湿和雨后情况下，易产生黄色至红色的分生孢子角。在林木分枝处和修剪处容易发现腐烂病典型症状，样品采集的寄主及分离物数量见表2-1。2.1.1.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，加蒸馏水1000mL；马铃薯葡萄糖培养基（PD）：马铃薯200g，葡萄糖20g，加蒸馏水1000mL；水琼脂培养基（WA）：琼脂15g，加蒸馏水1000mL。2.1.1.3药品与试剂(1)1mol/LTris-HCI缓冲液(pH7.5)：121.1gTris碱溶解在800mL蒸馏水中，冷却至室温后，用浓HCl调节pH值，pH值调至7.5，用蒸馏水定容至1L，高压灭菌。(2)0.5mol/LEDTA缓冲液(pH8.0)：186.1g二水乙二胺四乙酸钠溶解在800mL蒸馏水中，在剧烈搅拌下，用10mol/LNaOH调至pH8.0，定容至1L，高压灭菌。(3)DNA提取液：200mMTrisHClpH7.5，250mMNaCl，25mMEDTA，0.5%SDS(4)TE缓冲液(pH8.0)：0.5mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.5mol/LEDTA(pH8.0)。(5)10xTBE贮存液：54gTris，27.5g硼酸，20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加蒸馏水定容至1L。电泳时使用0.5xTBE溶液。(6)EB溶液（10mg/mL）：10mg溴化乙锭溶解于1mL蒸馏水中，混匀后室温避光保存。EB为致畸剂，必须小心操作。2.1.1.4接种用枝条采集1a生健康新鲜的箭杆杨、新疆杨、柳树、胡杨、槐树、沙枣等防护林枝条，采集1a生健康新鲜苹果、香梨、红枣、核桃、杏等枝条经济林果园枝条，将枝条修剪成20cm小段，先用自来水冲洗，干燥后及时使用或放入4℃冰柜保鲜备用。2.1.2方法2.1.2.1腐烂病菌的分离采用常规组织分离法（方中达，1996）分离腐烂病病原菌。将病健交界处的树皮样品切成0.5mm大小，先用0.1%HgCl2浸泡1min，然后用无菌水冲洗、晾干，将样品放置在PDA培养基上，在光照培养箱26℃，培养2d后，挑取少量菌丝转新的PDA培养基上，待菌落长3d后在WA培养基上进行纯化培养，将纯化后获得的分离物保存在试管PDA斜面上，放置在4℃冰箱中储存备用。27 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究2.1.2.2腐烂病菌致病性测定采用离体枝条接种法进行致病性测定（韦洁玲等，2012）。致病性测定具体步骤为：（1）选取1a生健康新鲜的箭杆杨、新疆杨、柳树、胡杨、槐树、沙枣等防护林枝条；采集1a生健康新鲜苹果、香梨、红枣、核桃、杏等枝条经济林果园枝条，将枝条修剪成20cm小段；（2）枝条先用酒精进行表面擦拭后，在用1.0%HClO浸泡5min，最后用无菌水冲洗干净、风干后，用保鲜膜将保湿脱脂棉包裹枝条两端；（3）在PDA培养基上将分离株培养，置于28℃的培养箱中光暗交替培养3d后，菌落边缘打菌饼备用；（4）将离体树枝表皮烫伤后，挑取菌饼接种在烫伤部位，将带菌丝面紧贴在林木烫伤部位，并用保鲜膜包裹；（5）将接种后的枝条放入有灭菌滤纸保湿的托盘内，保鲜膜包裹托盘进行保湿，放置在光照培养箱在26℃下培养观察发病症状。每个菌株接种3个枝条，每个枝条接种2处。分别在接种后第4d、10d和第20d观察、记录离体枝条的发病情况，并对发病部位进行再分离。2.1.2.3病菌形态学鉴定2.1.2.3.1培养特性观察将供试菌株接种在PDA平板上，置于28℃的培养箱中光暗交替培养3d，每天观察供试菌株菌落形态、颜色、质地、菌丝生长等性状。2.1.2.3.2产孢体形态观察将离体枝条上诱导后形成的分生孢子器用刀片切片，横切和纵切尽可能薄的切片，置于含有无菌水的载玻片上，盖上盖玻片后，制成玻片在生物显微镜（ZEISSImager.M2）下观察纵、横切面的形态特征并测量分生孢子的大小，记录并照相（戴芳澜，1979；魏景超，1979；Adamsetal.,2005；Adamsetal.,2006）。2.1.2.4病菌分子鉴定2.1.2.4.1菌丝体培养将供试菌株分别接种于PDA平板上，置于28℃的培养箱中光暗交替培养3d。2.1.2.4.2基因组总DNA提取采用Edwards等（1991）的方法提取病原物基因组DNA，试验方法稍做改进，具体的方法如下：（1）刮取少量腐烂病菌丝体到1.5mL离心管中，加入DNA提取液500μL，用电动研磨棒进行研磨，研磨充分后，室温条件下静置2h；（2）静置结束后12000rpm离心6min后，移取上清液350μL至新的离心管中；（3）加入350μL的异丙醇，混匀后静置10min；28 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究（4）10000rpm离心10min，弃掉上清，加入70%的乙醇漂洗沉淀2~3次，8000rpm离心2min去除乙醇，干燥10min；（5）加入40μLTE溶液溶解后，-20℃保存备用。2.1.2.4.3rDNA-ITS,β-Tubulin基因的PCR扩增(Zangetal.,2012;Glassetal.,1995)PCR反应体系：PCRTaqMix12.5µL、10µmol/LITS1/Beta-2a1µL、10µmol/LITS4/Beta-2b1µL、基因组DNA0.5µL、ddH2O10µL至终体积为25µL。ITS片段的扩增：采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行rDNA-ITS的PCR扩增。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环；最后72℃延伸10min。反应完成后，10g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。β-Tubulin片段的扩增：采用引物bt-2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC、-3′）和bt-2b（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）进行β-微管蛋白序列的扩增。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环；最后72℃延伸10min。反应完成后，10g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。2.1.2.4.4PCR产物纯化采用切胶回收方法对PCR产物进行纯化，具体步骤为：（1）切下含目标条带的琼脂糖凝胶胶块，胶块切除尽量干净，按重量比1：3（即100mg胶加入300μL溶胶液）加入溶胶液PG；（2）55℃水浴，水浴期间不断振荡助溶，使胶块完全溶化；（3）将溶化溶液加入到收集管的吸附柱，同时加入200μLBufferPS，静置5min后，12000rpm离心2min，倒去废液，将吸附柱放入收集管；（4）向吸附柱内加入500μLBufferPG，静置5min后，12000rpm离心1min，倒去废液，把吸附柱再放入收集管中；（5）向吸附柱内加入600μLBufferPW，静置5min后，12000rpm离心1min，倒掉废液；（6）重复步骤5；（7）12000rpm离心2min，除去残余乙醇；（8）将吸附柱置于一新离心管中室温放置10min，使吸附柱内乙醇完全风干；（9）加入30μLBufferEB（BufferEBpH8.5，用前50℃预热）于吸附柱膜中心位置，静置10min；（10）12000rpm离心2min，离心管内即为纯化后DNA，贮存于-20℃备用。将纯化后的PCR反应产物送往北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。2.1.2.4.5rDNA-ITS，β-Tubulin基因序列分析及系统发育树构建29 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究将每个供试菌株测定获得的ITS，β-Tubulin序列在GenBank中用BLASTn程序分别下载同源序列。采用ClustalX2.0对序列进行比对（alignment），并用BioEdit7.0.1对数据组进行人工调整，删除差异较大的序列和两端不齐的碱基。使用MEGA5软件，采用邻接法（Maximumparsimony,MP）构建系统发育树，通过自举（bootstrap）对系统发育树进行检验，1000次重复。并全面分析系统发育树的各分支及分支中序列，确定分支所代表的真菌种类，从而鉴定出供试菌株的种类和组成。2.2结果与分析2.2.1新疆不同林木寄主种类及分离病菌数量统计新疆经济林和防护林上腐烂病的发生较为严重，从新疆南北疆共采集17种林木腐烂病样品，分离得到分离物321个。其中从梨树、苹果树、核桃树、枣树、杏树、扁桃等经济林林木采集样品获得分离物199个，从箭杆杨、新疆杨、胡杨、柳树、榆树等防护林等林木采集并分离获得分离物122个，见表2-1。表2-1新疆主要林木腐烂病菌分离结果Table2-1TheisolatedresultofpathogensofValsacankerinXinjiang分类寄主分离物数量ClassificationHostNumberoftheisolates经济林香梨Pyrus103砀山酥梨Pyrus12杏Prunusarmeniaca12枣Zizyphusjujube3核桃Juglans23苹果Malus41扁桃Amygdaluscommunis1李PrunusL1山楂Crataeguspinnatifida3防护林胡杨Populuseuphratica14箭杆杨PopulusnigraL.35榆Ulmuspumila9柳Salixmatsudana24桑Morusalba3国槐Sophorajaponica6沙枣Elaeagnusangustifolia4新疆杨PopulusalbaL.27共计17种32130 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究2.2.2防护林腐烂病病原菌分离培养结果新疆防护林主要造林树种有新疆杨、箭杆杨、柳树、榆树、胡杨、沙枣等。从新疆防护林分离得到122个分离物，其中108株是腐烂病菌株，得到的108株菌株全为无性型Cytospora属真菌。108个分离株经形态学和分子生物学鉴定为4种类型：C.chrysosperma（有性型：V.sordida）、C.mali(有性型：V.mali)、C.nivea（有性型：L.niveum）、C.pullmanensis(有性型：C.pullmanensis)。各菌种数量分别为84株、13株、3株和8株，分别占腐烂病菌菌株数量的77.78%、12.04%、2.78%和7.41%，鉴定结果说明引起新疆防护林腐烂病的主要种类是C.chrysosperma（有性型：V.sordida）。其中杨树上腐烂病菌鉴定为V.sordida、C.pullmanensis、V.mali和L.niveum4个种，共计59株，各种占比例为分别为81.36%、10.17%、5.08%和3.39%；在柳树上鉴定为V.sordida、C.pullmanensis、V.mali和L.niveum4个种，共计24株，所占比例分别87.5%、4.17%、4.17%、4.17%；在胡杨上鉴定出V.sordida、C.pullmanensis和V.mali3个种，共14株，所占比例分别是78.57%、7.14%和14.29%；在槐树和桑树分别分离得到6株和1株腐烂病菌，均为V.mali。表2-2新疆防护林腐烂病菌鉴定结果Table2-2TheidentificationresultofpathogensofshelterbeltscankerinXinjiang序号菌株编号寄主采集地点病原菌NumberStrainsHostOriginsPathogens128-Y1-1-1PopulusnigraL.新疆兵团第二师28团V.mali228-Y1-1-2PopulusnigraL.新疆兵团第二师28团V.mali3TMG-1PopulusalbaL.新疆兵团第二师29团V.sordida4TMG-2Salixmatsudana新疆兵团第二师29团V.sordida5TMG-3Populuseuphratica新疆兵团第二师29团V.sordida6TMG-4Elaeagnusangustifolia新疆兵团第二师29团V.sordida7TMG-5Populuseuphratica新疆兵团第二师29团V.sordida8TMG-6PopulusalbaL.新疆兵团第二师29团V.sordida9TMG-7PopulusalbaL.新疆兵团第二师29团V.sordida10TMG-8PopulusalbaL.新疆兵团第二师29团L.niveum11TMG-9Populuseuphratica新疆兵团第二师29团V.sordida12TMG-10Elaeagnusangustifolia新疆兵团第二师29团V.sordida1322T8L-Y1PopulusnigraL.新疆兵团第二师22团V.mali14YXX-GHSophorajaponica新疆巴州地区库尔勒市英下乡V.mali15HS-GH-1Sophorajaponica新疆巴州地区库尔勒市和硕县V.mali16HS-GH-2Sophorajaponica新疆巴州地区库尔勒市和硕县V.mali31 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究序号菌株编号寄主采集地点病原菌NumberStrainsHostOriginsPathogens17HS-GH-3Sophorajaponica新疆巴州地区库尔勒市和硕县V.mali18HS-1PopulusalbaL.新疆巴州地区库尔勒市和硕县V.sordida19HS-2Elaeagnusangustifolia新疆巴州地区库尔勒市和硕县V.sordida20YQ-1PopulusalbaL.新疆巴州地区库尔勒市焉耆县L.niveum2153-Y1-1PopulusnigraL.新疆兵团第三师53团V.sordida22KS-KU-Y1PopulusnigraL.新疆喀什地区喀什市V.sordida23KS-SMorusalba新疆喀什地区喀什市V.mali246T-GHSophorajaponica新疆兵团第一师6团V.mali256T-Y1PopulusnigraL.新疆兵团第一师6团V.sordida266T4L-LSalixmatsudana新疆兵团第一师6团V.mali276T-HYPopuluseuphratica新疆兵团第一师6团V.mali28132T-Y1-1PopulusnigraL.新疆兵团第八师132团V.sordida29132T-Y1-2PopulusnigraL.新疆兵团第八师132团V.sordida30132T-Y1-3PopulusnigraL.新疆兵团第八师132团V.sordida31SHY1PopulusnigraL.新疆石河子市V.sordida32SHZ-01PopulusalbaL.新疆石河子市西公园V.sordida33SHZ-04PopulusalbaL.新疆石河子市西公园C.pullmanensis34145-01PopulusalbaL.新疆兵团第八师145团2连V.sordida35145-03Salixmatsudana新疆兵团第八师145团2连V.sordida36SM-HYPopuluseuphratica新疆巴州塔克拉玛干沙漠V.mali37WY1PopulusnigraL.新疆乌鲁木齐市郊V.sordida38CY11PopulusnigraL.新疆昌吉地区昌吉市V.sordida39CY12PopulusnigraL.新疆昌吉地区昌吉市V.sordida40FY1PopulusnigraL.新疆昌吉地区阜康市V.sordida41MY1PopulusnigraL.新疆昌吉地区玛纳斯县C.pullmanensis42111-1PopulusnigraL.新疆兵团第六师111团V.sordida43111-2PopulusnigraL.新疆兵团第六师111团V.sordida44111-3PopulusnigraL.新疆兵团第六师111团C.pullmanensis45FCH-1PopulusnigraL.新疆兵团第六师芳草湖农场V.sordida46FCH-2PopulusnigraL.新疆兵团第六师芳草湖农场V.sordida47NY11PopulusnigraL.新疆兵团第十三师淖毛湖农场V.sordida48NY12PopulusnigraL.新疆兵团第十三师淖毛湖农场V.sordida49NLSalixmatsudana新疆兵团第十三师淖毛湖农场V.sordida50SLSalixmatsudana新疆吐鲁番地区鄯善县V.sordida51SY1PopulusnigraL.新疆吐鲁番地区鄯善县V.sordida523-3PopulusnigraL.新疆兵团第一师3团C.pullmanensis533-4Populuseuphratica新疆兵团第一师3团V.sordida543-5Elaeagnusangustifolia新疆兵团第一师3团V.sordida553-6PopulusnigraL.新疆兵团第一师3团V.sordida563-7PopulusnigraL.新疆兵团第一师3团V.sordida32 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究序号菌株编号寄主采集地点病原菌NumberStrainsHostOriginsPathogens573-8Populuseuphratica新疆兵团第一师3团V.sordida583-16PopulusnigraL.新疆兵团第一师3团C.pullmanensis59AWT-1Populuseuphratica新疆阿克苏地区阿瓦提县V.sordida60AWT-2Populuseuphratica新疆阿克苏地区阿瓦提县V.sordida61AWT-3Salixmatsudana新疆阿克苏地区阿瓦提县V.sordida6216-1Populuseuphratica新疆兵团第一师16团C.pullmanensis6316-2Salixmatsudana新疆兵团第一师16团V.sordida6416-3Populuseuphratica新疆兵团第一师16团V.sordida6516-4PopulusnigraL.新疆兵团第一师16团V.sordida6616-5PopulusnigraL.新疆兵团第一师16团V.sordida67THQ-1Salixmatsudana新疆库尔勒市和硕县塔哈其乡V.sordida68THQ-2Salixmatsudana新疆库尔勒市和硕县塔哈其乡V.sordida69THQ-3Salixmatsudana新疆库尔勒市和硕县塔哈其乡V.sordida70THQ-4Salixmatsudana新疆库尔勒市和硕县塔哈其乡V.sordida71THQ-5Salixmatsudana新疆库尔勒市和硕县塔哈其乡V.sordida72THQ-6Salixmatsudana新疆库尔勒市和硕县塔哈其乡V.sordida73THQ-7Salixmatsudana新疆库尔勒市和硕县塔哈其乡V.sordida74THQ-8Populuseuphratica新疆库尔勒市和硕县塔哈其乡V.sordida7549-1Salixmatsudana新疆兵团第三师49团V.sordida7649-3Salixmatsudana新疆兵团第三师49团V.sordida7749-4PopulusnigraL.新疆兵团第三师49团V.sordida7849-5Salixmatsudana新疆兵团第三师49团V.sordida7949-6Salixmatsudana新疆兵团第三师49团V.sordida8049-7PopulusnigraL.新疆兵团第三师49团V.sordida8149-8PopulusnigraL.新疆兵团第三师49团V.sordida82JC-1PopulusnigraL.新疆兵团第三师工程团V.sordida83JC-2Salixmatsudana新疆兵团第三师工程团V.sordida84JC-3PopulusnigraL.新疆兵团第三师工程团V.sordida85TKX-1Sophorajaponica新疆吐鲁番地区托克逊县V.mali86TM-1PopulusnigraL.新疆兵团第三师V.sordida87TM-2Populuseuphratica新疆兵团第三师V.sordida8853-1Populuseuphratica新疆兵团第三师53团V.sordida89KEL-1Salixmatsudana新疆巴州地区库尔勒市V.sordida90KEL-3Salixmatsudana新疆巴州地区库尔勒市C.pullmanensis91KEL-4PopulusnigraL.新疆巴州地区库尔勒市V.sordida92KEL-7PopulusnigraL.新疆巴州地区库尔勒市C.pullmanensis93AKS-4Salixmatsudana新疆阿克苏市V.sordida94HC-1PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.sordida95HC-2PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.sordida96HC-3PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.sordida33 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究序号菌株编号寄主采集地点病原菌NumberStrainsHostOriginsPathogens97HC-4PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.sordida98HC-5PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.sordida99HC-7PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.sordida100HC-15PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.sordida101HC-16PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.sordida10266-38Salixmatsudana新疆兵团第四师66团V.sordida103NLT-1Salixmatsudana新疆伊犁哈萨克自治州新源县L.niveum104GL-1PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州巩留县V.sordida105GL-2PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州巩留县V.sordida106GL-3PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州巩留县V.sordida107GL-4PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州巩留县V.sordida108YHT-18PopulusnigraL.新疆伊犁哈萨克自治州巩留县V.sordida2.2.3经济林腐烂病病原菌分离鉴定结果从新疆林果园分离得到199个分离物，经鉴定173株为腐烂病菌，得到的173株全为无性型Cytospora属真菌。经形态学鉴定，将173株腐烂病菌鉴定为C.mali(有性型：V.mali),C.chrysosperma（有性型：V.sordida）,C.schulzeri（有性型：V.macolica）,C.nivea（有性型：L.niveum）分别为149、14、9和1株，占腐烂病菌数量的86.13%、8.09%、5.20%和0.58%。其中在苹果和香梨树上得到腐烂病分离物为39株和114株，鉴定主要种类是V.mali，占腐烂病菌的94.77%；其次为V.malicola和V.sordida，分别占3.92%和1.31%；在南疆核桃上得到的腐烂病分离物11株，均鉴定为V.sordida，从北疆核桃得到两个分离物，L.niveum和V.sordida各1株；从枣树和杏树上分别得到3株和1株分离物，经鉴定均为V.mali。在石河子大学中区山楂树上分离得到的3株腐烂病菌均鉴定为V.malicola。表2-3新疆经济林腐烂病菌鉴定结果Table2-3TheidentificationresultofpathogensofeconomicforestcankerinXinjiang序号菌株编号寄主采集地点病原菌NumberStrainsHostOriginsPathogens17-2Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali228-1-6-DSPyrus新疆兵团第二师28团V.mali328-1-7-DSPyrus新疆兵团第二师28团V.mali428-1-10-DSPyrus新疆兵团第二师28团V.mali528-2-11-DSPyrus新疆兵团第二师28团V.mali628-DSPyrus新疆兵团第二师28团V.mali34 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究序号菌株编号寄主采集地点病原菌NumberStrainsHostOriginsPathogens713-1Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali813-2Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali928-1-3-1Pyrus新疆兵团第二师28团V.malicola1028-1-3-2Pyrus新疆兵团第二师28团V.malicola1128-1-4Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali1228-1-5Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali1328-1-8-1Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali1428-1-8-2Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali1528-1-9Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali1628-1-11Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali1728-1-12Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali1828-1-14Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali1928-2-1-1Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali2028-2-1-2Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali2128-2-3Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali2228-2-4Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali2328-2-5-1Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali2428-2-5-2Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali2528-2-6-1Pyrus新疆兵团第二师28团V.malicola2628-2-6-2Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali2728-2-7Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali2828-2-8Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali2928-2-9Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali3028-2-10Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali3128-2-12Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali3228-2-13-1Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali3328-2-13-2Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali3428-2-14Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali3528-2-15Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali3628-3-1Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali3728-3-2Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali3828-3-3Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali3928-3-4Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali4028-4-1Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali4128-4-2Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali4228-4-3Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali4328-4-4Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali4428-4-5Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali4528-4-6Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali4628-XL1-1Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali4728-XL1-2Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali35 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究序号菌株编号寄主采集地点病原菌NumberStrainsHostOriginsPathogens4828-XL1-3Pyrus新疆兵团第二师28团V.mali4929-1-1Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali5029-1-2Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali5129-1-3Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali5229-1-4Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali5329-1-5Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali5429-1-6Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali5529-1-7Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali5629-1-8Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali5729-1-9Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali5829-1-9-2Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali5929-1-11Pyrus新疆兵团第二师29团V.malicola6029-1-12Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali6129-1-LUPyrus新疆兵团第二师29团V.mali6229-2-1Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali6329-2-2Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali6429-2-3Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali6529-3-1Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali6629-3-2-1Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali6729-3-2-2Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali6829-3-3Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali6929-3-4Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali7022T-XL1Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali7133T-XL1-1Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali7233T-XL1-2Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali737-3Pyrus新疆兵团第二师29团V.mali74TMG-11Pyrus新疆兵团第二师29团V.sordida751-2Pyrus新疆兵团第二师V.mali762-1Pyrus新疆兵团第二师V.mali772-2Pyrus新疆兵团第二师V.mali783-1Pyrus新疆兵团第二师V.mali793-2Pyrus新疆兵团第二师V.mali8022T8L-XL1Pyrus新疆兵团第二师22团V.mali8122T-XL1Pyrus新疆兵团第二师22团V.malicola828-1Pyrus新疆兵团第二师30团V.mali838-2Pyrus新疆兵团第二师30团V.mali8433T-XL1-1Pyrus新疆兵团第二师33团V.mali8533T-XL1-2Pyrus新疆兵团第二师33团V.mali8634T-ZZizyphusjujube新疆兵团第二师34团V.mali87YXX-XL1Pyrus新疆巴州地区库尔勒市英下乡V.mali885-1Pyrus新疆巴州地区库尔勒市轮台县哈尔巴克乡V.mali36 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究序号菌株编号寄主采集地点病原菌NumberStrainsHostOriginsPathogens895-2Pyrus新疆巴州地区库尔勒市轮台县哈尔巴克乡V.mali906-1Pyrus新疆巴州地区库尔勒市轮台县哈尔巴克乡V.mali916-2Pyrus新疆巴州地区库尔勒市轮台县哈尔巴克乡V.mali926-3Pyrus新疆巴州地区库尔勒市轮台县哈尔巴克乡V.mali939-1Pyrus新疆巴州地区库尔勒市上户镇V.mali949-2Pyrus新疆巴州地区库尔勒市上户镇V.mali959-3Pyrus新疆巴州地区库尔勒市上户镇V.mali9610-1Pyrus新疆巴州地区库尔勒市上户镇V.mali9710-2Pyrus新疆巴州地区库尔勒市上户镇V.mali9810-3Pyrus新疆巴州地区库尔勒市上户镇V.mali9910-4Pyrus新疆巴州地区库尔勒市上户镇V.mali10010-5Pyrus新疆巴州地区库尔勒市上户镇V.mali10110-6Pyrus新疆巴州地区库尔勒市上户镇V.mali10211-1Pyrus新疆巴州地区库尔勒市哈拉苏农场V.mali10311-2Pyrus新疆巴州地区库尔勒市哈拉苏农场V.mali10411-3Pyrus新疆巴州地区库尔勒市哈拉苏农场V.mali10512-2Pyrus新疆巴州地区库尔勒市哈拉苏农场V.mali10612-3Pyrus新疆巴州地区库尔勒市哈拉苏农场V.mali107LT-HTJuglans新疆巴州地区库尔勒市轮台县V.sordida10848T-XL1Pyrus新疆兵团第三师48团V.mali1096T4L-L1Pyrus新疆兵团第一师6团V.mali1106T-XL1Pyrus新疆兵团第一师6团V.mali1116T4L-P1Malus新疆兵团第一师6团V.mali1126T4L-P2Malus新疆兵团第一师6团V.mali1136T4L-P3Malus新疆兵团第一师6团V.mali1146T4L-P4Malus新疆兵团第一师6团V.mali11510T-ZZizyphusjujube新疆兵团第一师10团V.mali116SHPMalus新疆石河子市V.mali1173-9Pyrus新疆兵团区第一师3团V.mali1183-10Juglans新疆兵团第一师3团V.sordida1193-11Juglans新疆兵团第一师3团V.sordida1203-12Juglans新疆兵团第一师3团V.sordida1213-13Pyrus新疆兵团第一师3团V.mali1223-14Juglans新疆兵团第一师3团V.sordida1233-15Juglans新疆兵团第一师3团V.sordida12449-2Zizyphusjujube新疆兵团第三师49团V.mali125JC-4Malus新疆兵团第三师工程团V.mali126JC-5Malus新疆兵团第三师工程团V.mali127JC-6Malus新疆兵团第三师工程团V.mali128JC-7Pyrus新疆兵团第三师工程团V.mali129JC-8Pyrus新疆兵团第三师工程团V.mali37 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究序号菌株编号寄主采集地点病原菌NumberStrainsHostOriginsPathogens130ALE-1Juglans新疆阿拉尔市V.sordida131ALE-2Juglans新疆阿拉尔市V.sordida132ALE-3Juglans新疆阿拉尔市V.sordida133ALE-4Juglans新疆阿拉尔市V.sordida134KEL-6Juglans新疆巴州地区库尔勒市V.sordida135TD-2Pyrus新疆阿拉尔市V.mali136AKS-1Malus新疆阿克苏市V.mali137AKS-2Malus新疆阿克苏市V.mali138AKS-3Malus新疆阿克苏市V.mali139AKS-5Malus新疆阿克苏市V.sordida140HC-8Pyrus新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.mali141HC-9Malus新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.mali142HC-17Malus新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.mali143HC-18Malus新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.mali144HC-19Malus新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.mali145HC-21Malus新疆伊犁哈萨克自治州霍城县V.mali14661-24Malus新疆兵团第四师61团V.malicola14761-26Malus新疆兵团第四师61团V.mali14861-29Malus新疆兵团第四师61团V.mali149HT-XPrunusarmeniaca新疆和田地区和田市V.mali15066-37Malus新疆兵团第四师66团V.mali15166-39Malus新疆兵团第四师66团V.mali15266-40Malus新疆兵团第四师66团V.mali15366-41Malus新疆兵团第四师66团V.mali15468-2Malus新疆兵团第四师68团V.mali15578-1Malus新疆兵团第四师78团V.mali15678-2Malus新疆兵团第四师78团V.mali15778-3Malus新疆兵团第四师78团V.mali15878-4Malus新疆兵团第四师78团V.mali15978-6Malus新疆兵团第四师78团V.mali16078-7Malus新疆兵团第四师78团V.mali16178-8Malus新疆兵团第四师78团V.mali16278-9Malus新疆兵团第四师78团V.mali16378-10Malus新疆兵团第四师78团V.mali16478-11Malus新疆兵团第四师78团V.mali16578-13Malus新疆兵团第四师78团V.mali16678-15Malus新疆兵团第四师78团V.mali16778-16Malus新疆兵团第四师78团V.mali168YHT-1Juglans新疆伊犁哈萨克自治州巩留县V.sordida169YHT-3Juglans新疆伊犁哈萨克自治州巩留县L.niveum170SD-1Crataeguspinnatifida新疆石河子市石河子大学V.malicola38 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究序号菌株编号寄主采集地点病原菌NumberStrainsHostOriginsPathogens171SD-2Crataeguspinnatifida新疆石河子市石河子大学V.malicola172SD-3Crataeguspinnatifida新疆石河子市石河子大学V.malicola173AMalus新疆农业科学院微生物应用研究所赠予V.mali2.2.4致病性测定结果将分离鉴定的281个菌株分别接种1a生健康的苹果、香梨、核桃等经济林木枝条和箭杆杨、新疆杨、柳树等防护林木枝条后，均能使接种枝条发病，并出现与室外症状相同的病斑。其中在经济林上鉴定的菌株离体接种经济林枝条，病斑延接种部位扩张，呈圆形，病健交界明显。病斑为褐色，表面皱缩，有酒糟味，同时在接种部位木质部颜色变褐，接种20d左右，病斑表面皿出现黑色的分生孢子器；离体接种香梨树枝条，发病部位出现水渍般的病斑，病健交接明显，同时接种部位木质部变黑，接种20d左右出现黑色分生孢子器，并有黄色卷须状分生孢子角溢出（图2-1A,B,C）。用分离鉴定的菌株离体接种新疆杨、箭杆杨或胡杨等枝条，第5天接种部位开始出现水浸状、略凹陷的椭圆形病斑。病斑逐渐沿伤口扩展，病斑表面树皮皱缩。病健交界处的健康组织有时会出现裂缝，有时还会一条出现黑色的“菌线”的出现。在接种后20d左右，病斑表面有黑色小点的出现，即分生孢子器。在适宜的湿度条件下，有黄色卷须状的分生孢子角溢出（图2-1D,E,F,G,H）。图2-1离体接种症状表现Fig.2-1Cankersymptomsonstemsafterinoculationinvitro注：A-H.苹果枝条,香梨枝条,核桃树枝条,新疆杨枝条,柳树枝条,胡杨枝条,沙枣枝条,箭秆杨枝条，Note:A-G.malus,Pyrus,Juglans,PopulusalbaL.,Salixmatsudana,Populuseuphratica,Elaeagnusangustifolia,PopulusnigraL.39 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究2.2.5腐烂病菌不同种形态学特征2.2.5.1Cytosporamali（有性型为Valsamali）菌落较密实，初期白色至乳白色，背面灰白色；产孢体在菌落表面随机排列，白色至灰色，直径0.8~2.5mm，生长后期有黄色分生孢子角溢出（图2-2A,B）。子座埋生于树皮中，微突，黑褐色，球形至椭球形，直径0.6~1.2mm；孔口1个，与顶盘同高；产孢体多腔（locule），每个腔有独立的细胞壁，最终汇聚于孔口（ostioles）；分生孢子腊肠形，大小为（3.0~4.0）×（0.75~1.0）µm（图2-3A,B,C）。AB图2-2C.Mali(有性型:V.mali)在PDA培养基上菌落特征(A，正面；B，背面)Fig.2-2ColonycharacteristicsofC.mali(teleomorph:V.mali)onPDAABC图2-3C.Mali(有性型:V.mali)形态特征Fig.2-3MorphologiccharacteristicsofC.Mali(teleomorph:V.mali)注：A,分生孢子器横切；B,分生孢子器纵切；C,分生孢子Note：A–B,horizontalandlongitudinalsectionthroughconidioamata.C,conidiospore2.2.5.2Cytosporachrysosperma（有性型为Valsasordida）菌落较紧密，菌落白色至乳白色，菌落背面米黄色。培养后期褐色产孢体随机在菌落分布（图2-4A,B）。子座埋生在树皮中，突出，褐色，圆形至椭圆形，直径1.5~1.9mm；孔口1个，黑色，与顶盘同高；分生孢子器由大量内陷的小腔室组成，共用壁，内陷不规则排列呈玫瑰花座状；分生孢子透明、香蕉形，（3.5~5.0）µm×（0.9~1.4）µm（图2-5A,B,C）。40 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究AB图2-4C.chrysosperma(有性型:V.sordida)在PDA培养基上菌落特征(A,正面；B,背面)Fig.2-4ColonycharacteristicsofC.chrysosperma(teleomorph:V.sordida)onPDAABC图2-5C.chrysosperma(有性型:V.sordida)形态特征Fig.2-5MorphologiccharacteristicsofC.chrysosperma(teleomorph:V.sordida)注：A,分生孢子器横切；B,分生孢子器纵切；C,分生孢子Note：A–B,horizontalandlongitudinalsectionthroughconidioamata.C,conidiospore2.2.5.3Cytosporaschulzeri（有性型为Valsamalicola）菌落较密实，菌落乳白色，背面乳黄色；产孢体在菌落表面随机排列，米色至灰色，生长后期有黄色分生孢子角溢出（图2-6A,B）。子座埋生于树皮中，突出，褐色，球形，0.9-1.6mm；孔口1个，与顶盘同高；产孢体为单腔室，包含有不规则同中心的室；分生孢子腊肠形，大小为（5.5~6.0）×（0.9~1.2）µm（图2-7A,B,C）。AB图2-6C.schulzeri（有性型:V.malicola）在PDA培养基上菌落特征(A,正面；B,背面)Fig.2-6ColonycharacteristicsofC.schulzeri（teleomorph:V.malicola）onPDA41 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究ABC图2-7C.schulzeri（有性型:V.malicola）形态特征Fig.2-7MorphologiccharacteristicsofC.schulzeri（teleomorph:V.malicola）注：A,分生孢子器横切；B,分生孢子器纵切；C,分生孢子Note：A–B,horizontalandlongitudinalsectionthroughconidioamata.C,conidiospore2.2.5.4Cytosporanivea（有性型:Leucostomaniveum）菌落密实，菌落初期为米黄色，后期为黑色，产孢体在菌落随机排列，后期产生较小的产孢体，有黄色的分生孢子角溢出（图2-8A,B）。子座埋生在树皮下，突出，白色至褐色，扁平至凸状，1.4~2.0mm；每个子座有孔口1个，孔口米黄色至灰色；产孢体多腔，由大量内陷的不规则小室组成；分生孢子透明、香蕉状，大小为(6.0~7.5)×（1.1~1.2）µm（图2-9A,B,C）。AB图2-8C.nivea（有性型:L.niveum）在PDA培养基上菌落特征(A，正面；B，背面)Fig.2-8ColonycharacteristicsofC.nivea（teleomorph:L.niveum）onPDA42 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究CAB图2-9C.nivea（有性型:L.niveum）形态特征Fig.2-9MorphologiccharacteristicsofC.nivea（teleomorph:L.niveum）注：A,分生孢子器横切；B,分生孢子器纵切；C,分生孢子Note：A–B,horizontalandlongitudinalsectionthroughconidioamata.C,conidiospore2.2.5.5Cytosporinapullmanensis（有性型：Cryptosphaeriapullmanensis）菌落较为密实，菌落为白色至灰白色。背部为白色至淡黄色，且菌落边缘不整齐，产孢体在菌落随机排列（图2-10A,B）。子座包埋在树皮下，突出，扁平；子座有孔口一个，产孢体多腔；分生孢子呈尿囊状、透明，大小为(6.8~8.4)×(1.2~1.8)μm（图2-11A,B,C）。AB图2-10C.pullmanensis（有性型:C.pullmanensis）在PDA培养基上菌落特征(A，正面；B，背面)Fig2-10ColonycharacteristicsofC.pullmanensis（teleomorph:C.pullmanensis）onPDA43 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究ABC图2-11C.pullmanensis（有性型：C.pullmanensis）形态特征Fig.2-11MorphologiccharacteristicsofC.pullmanensis（teleomorph:C.pullmanensis）注：A,分生孢子器横切；B,分生孢子器纵切；C,分生孢子Note：A–B,horizontalandlongitudinalsectionthroughconidioamata.C,conidiospore2.2.6代表菌株分子生物学鉴定2.2.6.1rDNA-ITS，β-Tubulin基因的PCR扩增将分离菌株的DNA提取后经电泳检测。利用ITS和β-Tubulin两个基因对该病原菌进行PCR扩增，经电泳检测分别获得一条大小约为550bp、500bp的清晰条带（图2-12,图2-13）。M1234567891011121314151617500bp图2-12代表菌株的rDNA-ITS扩增结果Fig.2-12PCRproductofrDNA-ITSgeneofofsomecankerstrainsM1234567891011121314151617500bp图2-13部分菌株的β-Tubulin扩增结果Fig.2-13PCRproductofβ-Tubulingeneofofsomecankerstrains44 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究2.2.6.2基于rDNA-ITS基因的系统发育树构建采用MEGA5软件对28株代表不同寄主腐烂病分离株和11株（包括外群Alternariasp.）分别来自于GeneBank登录的腐烂病菌V.sordida，V.mali，L.niveum，V.molicola，C.pullmanensis序列分建立系统发育树进行分析，结果见图2-14。全部供试的腐烂病菌分离株及其近缘属种，在以Alternariasp.为外群的有根系统发育树中，共形成了6个比较大的分支（CladeⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和outgroup）。第Ⅰ分支编号49-5、111-1、TMG-7、TMG-2等12株菌株和菌株V.sordida（登录号HM156067.1，KC787361.1）聚在一起，同源性达到99%；分枝Ⅱ主要是编号61-24，YHT-1菌株和V.malicola（登录号JN545839.1，KF293799.1）聚在一分支，同源性达到98%；分枝Ⅲ是编号TMG-8、YQ-1菌株和L.niveum（登录号：KF293930.1，KJ739499.1）聚在一个分支，同源性达到99%；分枝Ⅳ是编号6T4L、6T4L-P4、6T-XL1、AKS等8株菌株和V.mali（登录号GU174587.1，HM156066.1）聚为一分支，同源性较高，达到99%；分枝Ⅴ是编号3-16、16-1、111-3、kel-3的菌株和C.pullmanensis（登录号：GQ293966.1，KM588263.1）聚为一分支，同源性达到99%。从图中可以看出，V.sordida和V.malicola处于同一个分枝，而V.mali与L.niveum也处于同一个分枝，C.pullmanensis成单独一个分支。45 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究ValsasordidaHM156067.1ValsasordidaKC787361.1图2-14腐烂病菌部分分离株rDNA-ITS系49-5(KT590408.1)统发育树111-1(KP114134.1)Fig.2-14PhylogramusingITSsequences27TMG-7(KP114129.1)dataofValsastrainsTMG-2(KP114128.1)TMG-5(KP114125.1)29AWT-1(KT428028.1)3-12(KT428023.1)TMG-3KP114124.161TMG-11KP114131.16399HS-2(KP114133.1)TMG-9()KP114126.1)66THQ(KT590414.1)ValsamalicolaJN545839.1ValsamalicolaKF293799.18161-24(KT934357.1)YHT-1(KT934359.1)99TMG-8(KP114130.1)88LeucostomaniveumKF293930.199YQ-1(KP114132.1)LeucostomaniveumKJ739499.1ValsamaliGU174587.19891ValsamaliHM156066.10.026T4L(KC454356.1)6T4L-P4(KC454354.1)996T-XL1(KC454352.1)6T-HY(KC473953.1)9322T8L-Y1(KC454345.1)48T-XL1(KC473952.1)AKS(KT934358.1)HS-GH(KC454320.1)CryptosphaeriapullmanensisGQ293966.13-16(KT428041.1)9916-1(KT428043.1)111-3(KT428042.1)63kel-3(KT428042.1)CryptosphaeriapullmanensisKM588263.1Alternariasp.KC584210.146 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究2.2.6.3基于β-Tubulin基因的系统发育树构建采用MEGA5软件对27株代表不同寄主腐烂病分离株和10株（包括外群Alternariasp.）分别来自于GeneBank登录的腐烂病菌V.sordida，V.mali，L.niveum，V.molicola，C.pullmanensis序列分建立系统发育树进行分析，结果见图2-15。全部供试的腐烂病菌分离株及其近缘属种，在以Alternariasp.为外群的有根系统发育树中，共形成了6个比较大的分枝（CladeⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ和outgroup）。第Ⅰ分支编号TMG-5、KEL-1-1、TMG-3、TM-2等11株腐烂病菌和C.chrysosperma（登录号：KF498689.1，KF039741.1）聚在一个分支上，同源性达到99%；分枝Ⅱ是编号61-24、YHT-12株腐烂病菌和V.malicola（登录号JQ900367.1，JQ900370.1）聚在一个分支上，同源性达到97%；分枝Ⅲ是NLT-1、YHT-3菌株和L.niveum（登录号EU219135.1）聚在一个分支上，同源性较高，达到99%；分枝Ⅳ是编号78-9、61-18、78-4、68-2等9株菌株和V.mali（登录号：JQ900349.1，JQ900358.1）聚为一分支，同源性达到98%；分枝Ⅴ是编号3-16、16-1、kel-7、KEL-3菌株和C.pullmanensis（登录号：KM593247.1，GQ294013.1）聚在一分支，同源性达到99%。从图中可以看出，V.sordida和V.malicola处于同一个分枝，L.niveum和V.mali聚为一分支，C.pullmanensis成单独一个分支。47 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究图2-15腐烂病菌部分分离株TMG-5(KP117038.1)β-Tubulin系统发育树KEL-1-1(KT428030.1)Fig.2-15PhylogramusingTMG-3(KP117037.1)β-TubulinsequencesdataofValsastrainsTM-2(KT428031.1)AKS-5(KT428032.1)CytosporachrysospermaKF498689.164CytosporachrysospermaKF039741.1ALE-2(KT428033.1)AWT-1(KT428039.1)993-12(KT428034.1)AWT(KT428035.1)TMG-11(KP114131.1)563-12(KT428034.1)61-24(KT934373.1)93YHT-1(KT934374.1)5975ValsamalicolaJQ900367.199ValsamalicolaJQ900370.10.02LeucostomaniveumEU219135.199NLT-1(KT934363.1)9799YHT-3(KT934364.1)ValsamaliJQ900349.178-1-1（KT934372.1）78-9（KT934365.1）61-18（KT934366.1）8078-4（KT934370.1）68-2（KT934368.1）9922T8L-Y1(KC454345.1)78-10-1（KT934371.1）AKS(KT934369.1)ValsamaliJQ900358.168-19（KT934367.1）CryptosphaeriapullmanensisKM593247.13-16(KT428045.1)9916-1(KT428047.1)kel-7（KT428048.1）66CryptosphaeriapullmanensisGQ294013.1KEL-3(KT428046.1)JN867491Alternariasp.+*48 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究2.3讨论与结论2.3.1讨论新疆经济林木和防护林木腐烂病发生普遍且危害严重。早期研究认为引起香梨和苹果腐烂病的病原菌主要是V.mali、V.malicola、V.leucostoma、C.ambiens、C.rubescens等（Wangetal.,2011;Mulenkoetal.,2008;Cash,1953;Guptaetal.,1973;Ashkanetal.,1993）。引起杨柳科林木腐烂病的病原菌报道主要是V.sordida、C.tritici、C.atrocirrhata、C.germanica、C.translucens等（Teng,1996;Zhangetal.,2012;Wangetal.,2013;Zhangetal.,2013;Wangetal.,2015）。本研究通过大量腐烂病样品采集、鉴定明确了在新疆引起香梨、苹果树腐烂病的病原菌主要是苹果树腐烂病V.mali，其次是V.malicola。引起杨树、柳树腐烂病的病原菌主要是金黄壳囊孢菌C.chrysosperma（有形型V.sordida），其次是C.pullmanensis和L.niveum，研究结果与文献报道基本一致。引起核桃腐烂病的病原菌报道较多，Yu（2015）首次报道引起陕西省核桃树腐烂病病原菌为Neofusicoccumparvum和Botryosphaeriadothidea。Haggag（2007）依据形态学特征和ITS序列分析，鉴定埃及核桃腐烂病原物为Botryodiplodiatheobromae。而Montecchio（2014）研究认为在欧洲核桃腐烂病是由真菌Geosmithiamorbida及昆虫Pityophthorusjuglandis共同危害所致。唐俊煜(2015)依据无性型形态学特征，认为新疆南疆核桃腐烂病菌为胡桃壳囊孢Cytosporajuglandis(DC)Sacc。刘振坤（1979）等依据形态学特征将新疆核桃树腐烂病菌鉴定为胡桃壳囊孢C.juglandis。而马荣等（2015）筛选新疆核桃腐烂病生防菌时所用病菌为金黄壳囊孢C.chrysosperma。我们对核桃树腐烂病的鉴定结果和马荣的一致（郭开发等，2016）。V.mali是Valsa属中寄主范围最广的一个种，可以侵染包括蔷薇科（苹果、梨、枣树）在内的多个科的多种植物，在世界上的分布较为广泛。Kobayshi（1969）在比较苹果树上的V.mali与其他阔叶林上的V.ceratosperma标本时发现二者在形态学和培养性状上十分相似，认为V.mali是V.ceratosperma的异名。V.mali种下又可以划分为2个不同的变种，即V.malivarmali和V.malivarpyri（臧睿，2012）。此外在新疆杨柳科林木上分离大量金黄壳囊孢菌C.chrysosperma（有形型V.sordida），金黄壳囊孢菌C.chrysosperma的寄主要是杨属Populusspp.、柳属Salixspp.、桉属Eucalyptusspp.等多种林木植物（Kobayashi,1969;Adamsetal.,2005;Fotouhifaretal.,2010）。C.chrysoperma的寄主范围和地理分布十分广泛，可以侵染8个科的林木，在亚洲、欧洲、非洲和北美洲均有分布。在试验中，我们杨树腐烂病样品中鉴定有3株样品为V.mali，在柳树腐烂病样品中鉴定有1株是V.mali，而V.mali从未报道在杨柳科寄49 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究主上分离得到。试验中首次发现胡杨腐烂病病原菌是C.pullmanensis，Glawe（1984）在杨属林木上首次描述了C.pullmanensis，主要危害杨树和柳树，C.pullmanensis与金黄壳囊孢菌C.chrysosperma的分生孢子器十分相似，容易混淆。2.3.2结论新疆因冬季气候寒冷容易在林木上造成伤口，同时新疆土壤瘠薄再加上病虫危害以及管理水平不高等因素的影响，使得新疆多数林木上均有腐烂病的发生和危害，新疆腐烂病菌主要以无性世代存在，目前尚未发现有性世代。本研究从新疆常见的经济林、农田防护林的17种林木上采集腐烂病样品，并采用常规组织分离法获得了321个分离物，其中281株为腐烂病菌，对281株腐烂病菌采用形态学特征鉴定结合ITS序列和β-Tubulin基因序列等方法将这些腐烂病菌鉴定为5种，分别为：V.mali、V.sordida、V.macolica、L.niveum、C.pullmanensis。在新疆农田防护林分离得到108株腐烂病菌，这些腐烂病菌鉴定为V.mali，V.sordida，L.niveum和C.pullmanensis四个种，其中V.sordida是主要种；从新疆经济林分离得到173株腐烂病菌，这些腐烂病菌鉴定为V.mali、V.sordida、V.macolica、L.niveum四个种，其中V.mali是主要种。C.pullmanensis报道危害杨树和柳树植物（Glawe,1984），在胡杨植物危害为首次报道。将不同地理和寄主来源的V.mali菌株进行离体接种试验发现，V.mali在同一种林木或在不同林木离体枝条上产生的病斑大小有差异，说明新疆苹果树腐烂病菌V.mali对不同寄主的致病力存在差异，造成这种致病力差异的原因有待进一步的研究。50 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究第三章新疆林木腐烂病菌主要种V.mali致病力分化研究根据前人研究，发现苹果树腐烂病菌V.mali存在致病力分化，并且初步表明致病力分化与该菌在PDA上的培养性状有一定的相关性。而王旭利等（2007）也初步研究发现我国梨腐烂病菌V.ceratosperma存在多种，致病力存在差异。韦洁玲（2009）对中国苹果树腐烂病致病力差异进行研究，结果说明V.ceratosperma致病性与菌落颜色有关，黑色菌株致病力强，白色菌株致病力中等。同时苹果腐烂病菌致病力分化与菌株的地域来源没有明显的相关性，各地均可以发现致病力强弱不同的菌株。张美鑫（2013）对源自中国14省市5个梨系统的91份梨树腐烂病V.malivarpyri菌株在不同梨品种上的致病力差异进行研究，91个菌株在不同梨品种上的综合致病力强弱可将其划分为3个类型，其中强致病力菌株16份，占17.6%；中致病力菌株70份，占76.9%；弱致病力菌株5份，占5.5%，中等致病力菌株为优势种。同时来源于不同地区和不同梨系统的菌株之间其致病类型的分布比例存在明显的差异，这种差异可能与其梨系统的抗病性相关。前期已有文献报道新疆苹果和香梨树上腐烂病发生普遍且危害严重，其腐烂病菌种类主要是苹果树腐烂病菌V.mali，因目前对新疆苹果树腐烂病菌V.mali致病力分化的系统报道较少，因此本研究对不同寄主来源的苹果树腐烂病菌V.mali菌落形态、最适生长条件、致病力等进行了测定，为明确不同寄主来源V.mali菌株在香梨枝条和苹果枝条致病性差异，以及不同寄主来源的V.mali在不同林木寄主上是否存在致病性差异，同时确定苹果树腐烂病菌V.mali在不同林木上是否存在的交叉侵染和传播。3.1材料与方法3.1.1材料3.1.1.1供试腐烂病菌：分别选取具有代表性的分离自新疆苹果树、香梨树、槐树的腐烂病菌V.mali，选择菌株编号见表3-1。3.1.1.2接种用枝条：试验中致病性测定选择植物枝条为2年生健康的新鲜枝条，主要选择香梨树、苹果树、箭杆杨、柳树、榆树、槐树、杏树、桃树、山楂树、山荆子10种寄主枝条。51 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究3.1.2方法3.1.2.1不同地区和寄主来源的V.mali培养性状观察将19株新疆苹果树腐烂病菌V.mali代表菌株活化后接种在PDA培养基上，在28℃培养箱暗培养，生长3天后测定菌落生长直径和菌落颜色，观察菌株在PDA上培养性状。3.1.2.2最适pH测定选择不同菌落形态的腐烂病菌V.mali各2株，接种在PDA平板上，分别置于4、5、6、7、8、9六种不同pH条件下，在28℃暗培养3天后测量菌丝生长直径，每个处理3次重复。3.1.2.3最适温度测定选择不同菌落形态的腐烂病菌V.mali各2株，接于pH为6.0的PDA平板上，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃六种不同温度条件下，暗培养3天后，测量菌丝生长直径，每个处理3次重复。3.1.2.4不同寄主来源V.mali在苹果、香梨枝条上的致病性测定采用离体枝条接种法进行致病性测定。选择1a生健康的香梨树和苹果树新鲜枝条，截成20cm左右长的小段，先用自来水冲洗后，再用0.1%HgCl2浸泡1min，然后用无菌水冲洗、晾干，枝条两端用保鲜膜将保湿脱脂棉包裹。用铁钉钉帽(直径5mm)加热后烫伤枝条树皮，以腐烂病菌V.mali菌饼(5mm)接种在烫伤部位，用保鲜膜将其包裹。每个分离物接种5个枝条。每个枝条上接种2处，以无菌PDA饼作为空白对照，接种枝条放置在白瓷盘，在28℃光培养箱试验。光暗交替（12h/12h）环境下，培养至2d，将保鲜膜和菌饼去掉并观察其发病情况，培养至4d。观察、记录枝条发病情况，测定病斑直径。3.1.2.5同一寄主来源V.mali在10种林木寄主上致病性测定采用离体枝条接种法进行致病性测定。选择1a生健康的香梨、苹果、箭杆杨、榆树、柳树、杏树、槐树等10种寄主林木新鲜枝条，截成20cm左右长的小段，先用自来水冲洗后，再用0.1%HgCl2浸泡1min，然后用无菌水冲洗、晾干，枝条两端用保鲜膜将保湿脱脂棉包裹。用铁钉钉帽(直径5mm)加热后烫伤林木树皮，以菌饼(5mm)接种在烫伤部位，用保鲜膜将其包裹。每个分离物接种3个枝条。每个枝条上接种2处，以无菌PDA饼作为空白对照，接种枝条放置在白瓷盘，在28℃光培养箱试验。光暗交替（12h/12h）环境下，培养至2d，将保鲜膜和菌饼去掉并观察其发病情况，培养至4d。观察、记录枝条发病情况，测定病斑直径。3.1.2.6致病力分级标准52 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究参照周玉霞等（2013）的致病力分级方法，将梨腐烂病菌菌株致病力强弱分为3个等级：LD≧29.4mm为强致病力；29.4mm﹥LD﹥17.7mm为中致病力；LD≦17.7mm为弱致病力。3.2结果与分析3.2.1不同来源V.mali培养性状观察V.mali在PDA培养基上主要有三种颜色，白色、乳白色和淡黄色，其背面颜色分别是白色、乳白色和淡黄色。白色、乳白色、淡黄色的菌株分别有2、11和6株，分别占总株数的10.53%、57.89%和31.58%。不同寄主来源的V.mali在PDA培养基上的生长速率有明显的不同，乳白色菌落在PDA培养基上生长较快，且边缘较整齐，菌落稀薄。如菌株编号6-3，29-1-11，Yxx-xl，生长3d后菌落直径分别是8.05cm、8.00cm、7.28cm。淡黄色菌落生长速率较慢，且菌落边缘生长不整齐，菌落厚实，如菌株编号29-1-6，A，61-24，生长3d后菌落直径分别为4.60cm、2.53cm、4.70cm。表3-1V.mali在PDA培养基上菌落特征Table3-1ColonycharacteristicsofV.malionPDA寄主菌株编号平均菌落直径（cm）菌落颜色HostNumberofstrainsAveragecolonydiameterColourofcolony香梨29-3-16.85bc乳白色香梨Yxx-xl7.28b乳白色香梨28-2-8-26.28cd乳白色香梨29-1-54.60e淡黄色香梨29-1-118.00a乳白色香梨29-1-9-22.18g乳白色香梨28-1-84.63e乳白色香梨8-15.85d乳白色香梨29-1-64.60e淡黄色香梨6-38.05a乳白色苹果A2.53g淡黄色苹果61-244.70e淡黄色苹果66-394.70e白色苹果AKS-13.35f乳白色苹果AKS-3-23.35f白色苹果78-155.13e乳白色苹果6T4L-P34.53e淡黄色槐树HS-GH-24.88e乳白色槐树6T-GH8.60a淡黄色数据平均重复三次，依据Duncan’s在一列中不同的字母表示差异显著(P≤0.05)。Dataarethemeansofthreereplications.Differentletterswithinacolumnindicatesignificantdifferences(P≤0.05)accordingtoDuncan’sMultipleRangeTest.53 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究3.2.2最适pH测定试验结果表明（表3-2），V.mali菌株对不同pH的适应性无明显差异。6株供试菌株在pH值为5和6的条件下菌落生长直径最大，如菌株AKS-3-2在pH为5或6时，菌落生长3d后直径为7.03cm和6.85cm。随着pH值得增加，菌落生长逐渐缓慢。当pH值为8和9时，供试菌株生长受到抑制，如菌株AKS-3-2在pH为8或9时，菌落生长3d后直径为1.68cm和1.25cm。白色菌落菌株66-39和AKS-3-2的生长速率快于乳白色菌落菌株AKS-1和28-1-8。淡黄色菌落菌株29-1-6和A的生长速率最慢。表3-2不同pH对V.mali菌丝生长的影响Table3-2GrowthofV.maliunderdifferentpH菌株菌落直径Averagecolonydiameter/cmStrainspH=4pH=5pH=6pH=7pH=8pH=9AKS-13.48b5.28b4.07d3.35b1.45bc1.12b28-1-83.34b5.50b5.30c4.63a1.24c0.99c29-1-62.47c4.21c4.58d4.60a1.08c1.22aA2.25c3.34d3.27e2.53c1.34bc1.09b66-394.35a6.45ab6.03b4.70a1.90a1.32aAKS-3-24.20a7.03a6.85a3.35b1.68b1.25a数据平均重复三次，依据Duncan’s在一列中不同的字母表示差异显著(P≤0.05)。Dataarethemeansofthreereplications.Differentletterswithinacolumnindicatesignificantdifferences(P≤0.05)accordingtoDuncan’sMultipleRangeTest.3.2.3最适温度测定该病原菌在15～40℃均能生长。20～30℃是腐烂病菌V.mali生长最适温区，在该温区内，菌落生长迅速，如菌株66-39在20～30℃生长3d后菌落直径分别是5.45cm、6.65cm、7.21cm；低温段15～20℃和高温段35～40℃，菌落生长生长减慢，菌落较稀薄。不同颜色的菌落生长速率也明显有差别，白色菌株66-39和AKS-3-2菌落生长速率较快，而淡黄色菌株29-1-6和A菌落生长速率较慢。54 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究表3-3不同温度对V.mali菌丝生长的影响Table3-3GrowthofV.maliunderdifferenttemperature菌株菌落直径Averagecolonydiameter/cmStrains15℃20℃25℃30℃35℃40℃AKS-13.20a4.05bc4.45c4.42c2.12a1.03b28-1-82.86ab4.55b5.30b5.25b2.19a1.02b29-1-62.14b3.48c4.39c5.24b1.34b0.79cA2.32b3.20c3.27d3.21d1.23b0.81c66-393.16a5.45a6.65a7.21ab2.45a1.23aAKS-3-23.15a5.35a6.85a7.65a2.38a1.37a数据平均重复三次，依据Duncan’s在一列中不同的字母表示差异显著(P≤0.05)。Dataarethemeansofthreereplications.Differentletterswithinacolumnindicatesignificantdifferences(P≤0.05)accordingtoDuncan’sMultipleRangeTest.3.2.4不同寄主来源V.mali在苹果、香梨致病性测定将不同寄主来源的V.mali接种在离体苹果枝条和梨树枝条上，接种1d后开始发病，接种4d后病斑扩大。在离体苹果枝条上，病斑为黑褐色，病斑部位软化，病健交接明显；在离体香梨枝条上，病斑组织黑褐色，病斑部位皱缩，病健交接明显。依据周玉霞等（2013）对腐烂病致病力分级标准，V.mali在新疆主要有中致病力和弱致病力两个致病等级，试验未发现强致病力菌株。在本次接种的18个菌株中，离体接种香梨枝条后，12株为中致病力菌株，6株为弱致病力菌株；离体接种苹果枝条后，8株为中致病力菌株，10株为弱致病力菌株。V.mali的致病力接种离体香梨枝条致病力强于接种在苹果枝条上。在槐树腐烂病枝条分离的2株V.mali，在苹果枝条和香梨枝条上显示均有中等致病力。55 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究表3-418份V.mali在香梨枝条和苹果枝条致病力测定Table3-4Thepathogenicitytestsof18V.maliofPyrusorMalusbranchesinvitro寄主菌株编号香梨枝条(cm)致病力强弱苹果枝条(cm)致病力强弱HostNumbersofstrainsPyrusbranchespathogenicityMalusbranchespathogenicity香梨29-3-11.88cde中致病力1.65bc弱致病力香梨Yxx-xl1.70de弱致病力1.50c弱致病力香梨28-2-8-22.00bcde中致病力1.90b中致病力香梨29-1-52.08bcd中致病力1.75bc弱致病力香梨29-1-111.68de弱致病力1.60bc弱致病力香梨29-1-9-21.78cde中致病力1.90b中致病力香梨28-1-82.38ab中致病力1.68bc弱致病力香梨29-1-62.55a中致病力1.65bc弱致病力苹果66-391.65de弱致病力1.70bc弱致病力苹果AKS-11.85cde中致病力2.50a中致病力苹果A1.80cde中致病力1.85b中致病力苹果61-241.80cde中致病力1.48c弱致病力苹果6-31.65de弱致病力1.90b中致病力苹果AKS-3-21.60e弱致病力1.75bc弱致病力苹果78-151.65de弱致病力1.58bc弱致病力苹果6T4L-P31.80cde中致病力1.90b中致病力槐树HS-GH-22.18abc中致病力1.88b中致病力槐树6T-GH1.78cde中致病力1.78bc中致病力数据平均重复三次，依据Duncan’s在一列中不同的字母表示差异显著(P≤0.05)。Dataarethemeansofthreereplications.Differentletterswithinacolumnindicatesignificantdifferences(P≤0.05)accordingtoDuncan’sMultipleRangeTest.3.2.5同一寄主来源腐烂病菌V.mali在不同林木寄主上致病性测定选择在3.2.4试验中致病力较强的V.mali菌株29-1-6、28-1-8、A三个菌株进行在不同林木寄主的致病力测定。在试验中，在同一寄主上分离得到的V.mali离体接种在不同林木上致病力表现不同，部分林木表现抗病，部分林木表现为感病。菌株28-1-8在山荆子、香梨具有中等致病力，病斑直径为1.90cm和1.83cm；在苹果、榆树、山楂上具有弱致病性，病斑直径分别是1.53cm、1.45cm和1.38cm；而在桃树和杏树表现不致病力，病斑无扩展。菌株29-1-6在山荆子、香梨、柳树、苹果、山楂、榆树上具有弱的致病力，病斑直径在1.48cm-1.65cm之间；而在桃树和杏树表现不致病，病斑无扩展。菌株A在山荆子具有中等致病力，病斑直径为1.85cm；在苹果、国槐具有弱致病力，病斑直径为1.68cm、56 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究1.75cm；而在杏树和箭杆杨上表现不致病，病斑无扩展。表3-5V.mali在不同林木寄主上致病力测定Table3-5ThepathogenicitytestsofV.maliondifferenthosttrees寄主菌株StrainsHost28-1-829-1-6A榆树1.45c1.48abc1.33cd山楂1.38cd1.50ab1.33cd山荆子1.90a1.63a1.85a箭杆杨1.35cde1.33bc0.80e国槐1.03ef1.25c1.75ab桃树0.70f0.70d1.20cd杏树0.70f0.83d0.70e香梨1.83ab1.63a1.10d苹果1.53bc1.53ab1.68ab柳树1.05de1.65a1.33bc数据平均重复三次，依据Duncan’s在一列中不同的字母表示差异显著(P≤0.05)。Dataarethemeansofthreereplications.Differentletterswithinacolumnindicatesignificantdifferences(P≤0.05)accordingtoDuncan’sMultipleRangeTest.3.3讨论与结论3.3.1讨论已有大量文献报道了苹果树腐烂病菌V.mali致病力存在明显的分化。王卫雄（2015）对甘肃省苹果树腐烂病V.mali进行致病力分化进行测定，认为褐色类群菌株V.malivar.mali致病力强于乳白色类群菌株V.malivar.pyri，V.mali不但侵染苹果树还可以侵染梨树和桃树，V.malivar.pyri菌株在梨树上的致病力强于V.malivar.mali。V.mali两变种内各菌株之间也存在致病力差异显著。而王旭利等（2007）也初步研究发现我国梨腐烂病菌V.ceratosperma存在多种，致病力存在差异，黄褐色类群致病力强，乳白色类群中的大多数分离株致病力中等，灰黑色类群的致病力弱。桂腾茸（2015）对云南省18株苹果树腐烂病菌V.ceratosperma进行致病性分化研究，黄褐色菌落的菌株致病性强于灰褐色菌落和乳白色菌落，而灰褐色菌落和乳白色菌落的致病性差异不明显，腐烂病菌V.mali出现了明显的菌群分化和致病力分化现象。王兰（2008）对香梨腐烂病菌V.ceratosperma生物学特性进行研究，结果表明，菌落在高温、低温和最适温区内生长差异显著，在20～30℃的条件下生长较快，低于10℃或高于35℃均不利于菌落的生57 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究长，菌落最适生长pH值为4～5，研究结果与本文基本一致。在本次进行致病力测定所用的18个不同来源代表菌株中，新疆腐烂病菌V.mali主要是中等致病力和弱致病力为主，没有发现强致病力菌株。这个结果和张美鑫（2013）对我国梨树腐烂病致病力分化结果一致，认为在新疆分离出的V.mali主要是中等致病力菌株，少数为弱致病力菌株。试验发现，在梨树和苹果上分离的腐烂病菌V.mali离体接种在苹果和梨树枝条，致病性表现基本一致，在梨树枝条上接种致病力稍强于在苹果枝条。因此，本研究可以得出，苹果树、桃树、梨树之间的腐烂病菌可能成为彼此腐烂菌的侵染来源。通过对来源于不同林木系统和不同地区的菌株的致病力进行比较，分析其致病力分化状况，可为了解腐烂病的发生规律和致病机理提供有价值的信息。目前已有报道证实，植物病原菌和寄主在长期共进化的过程中，其致病力也在不断变异（Abeetal.2011；韦洁玲，2009；杜雷等，2009）。3.3.2结论将不同来源的苹果树腐烂病菌V.mali进行不同条件培养并对不同寄主枝条进行致病力测定。发现所用的18株代表菌株，其培养出的主要菌落颜色有三种：白色、乳白色和淡黄色，其中白色菌株的生长速率快于乳白色和淡黄色，淡黄色菌株的生长速率最慢，腐烂病菌V.mali的最适pH值为5~6，最适温度在20~30℃。乳白色和淡黄色菌株的致病力强于白色菌株。在致病力分化测定中，新疆腐烂病菌V.mali主要是中等致病力和弱致病力为主，没有发现强致病力菌株。通过人工接种离体苹果枝条进行致病性试验，结果表明不同腐烂病菌V.mali致病性强弱不同。同一腐烂病菌V.mali在不同的林木上致病性也存在不同，苹果树腐烂病菌V.mali主要对蔷薇科林木引起腐烂病，而对杨柳科林木不致病或存在弱致病力。58 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究第四章新疆林木腐烂病主要种V.maliISSR遗传分析腐烂病菌在新疆各地区广泛存在，并危害多种经济林木，造成了不可估量的损失。一般的年份发病率在30%~50%之间，严重发生时发病率在80%~100%（宋素琴等，2015）。研究发现，苹果树腐烂病存在致病性分化，有研究指出V.ceratosperma致病性与菌落颜色有关，褐色类群致病力均比白色或灰黑色类群强。同时苹果腐烂病菌致病力分化与菌株的地域来源没有明显的相关性，各地均可以发现致病力强弱不同的菌株（韦洁玲，2009）。Khadijeh（2015）采集分离伊朗地区12省147份核桃腐烂病分离株，选用58株代表菌株进行ISSR分析，20条随机引物得到119条带，结果表明C.chrysosperma遗传与菌株的地理来源没有明显的相关性。试验前期调查新疆经济林腐烂病的主要病原菌是苹果树腐烂病V.mali，并对其培养性状与致病力分化进行研究。而本章的研究目的通过ISSR分子标记的方法，对新疆地区苹果腐烂病菌V.mali的遗传特性进行研究，以期为病害流行和抗病育种奠定一定的基础。4.1材料与方法4.1.1材料从新疆各地采集的腐烂病样品经形态学特征、ITS、β-Tubulin鉴定为苹果树腐烂病菌V.mali。选择不同采集地点和不同寄主植物的V.mali共计44株进行试验。试验菌株见表4-1。表4-1不同来源苹果腐烂病菌V.mali信息表Table4-1InformationtableofdifferentsourceV.maliinXinjiang编号菌株编号寄主采集地点NumbersNumberofstrainsHostcollectionsize129-1-9-2Pyrus新疆兵团第二师29团228-2-5-1Pyrus新疆兵团第二师28团3AMalus新疆阿克苏市4AKS-2Malus新疆阿克苏市528-2-1-1Pyrus新疆兵团第二师28团6AKS-3Malus新疆阿克苏市7HS-GH-2S.japonica新疆巴州地区库尔勒市和硕县828-XL-1Pyrus新疆兵团第二师28团929-3-2-1Pyrus新疆兵团第二师29团59 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究编号菌株编号寄主采集地点NumbersNumberofstrainsHostcollectionsize1066-40Malus新疆兵团第四师66团11AKSMalus新疆阿克苏市1210T-2Jujube新疆兵团第一师10团13Yxx-xlPyrus新疆巴州地区库尔勒市英下乡1461-26Malus新疆兵团第四师61团156T4L-P1Malus新疆兵团第一师6团1666-29Malus新疆兵团第四师66团1766-41Juglans新疆兵团第四师66团18HS-GH-3S.japonica新疆巴州地区库尔勒市和硕县1966-39Malus新疆兵团第四师66团206T4L-P3Malus新疆兵团第一师6团2128-Y-1-1P.nigraL.新疆兵团第二师28团221-2Pyrus新疆兵团第二师2378-11Malus新疆兵团第四师78团2461-24Malus新疆兵团第四师61团2528-1-8Pyrus新疆兵团第二师28团266T-GHS.japonica新疆兵团第一师6团278-1Pyrus新疆兵团第二师30团2828-4-1Malus新疆兵团第二师28团295-1Pyrus新疆巴州地区库尔勒市轮台县哈尔巴克乡3078-15Malus新疆兵团第四师78团3129-3-2-2Pyrus新疆兵团第二师29团3229-1-11Pyrus新疆兵团第二师29团3329-3-1Pyrus新疆兵团第二师29团3428-3-1S.japonica新疆兵团第二师28团3529-1-5Pyrus新疆兵团第二师29团3628-2-8Pyrus新疆兵团第二师28团37AKS-1Malus新疆阿克苏市3828-2-13-2Pyrus新疆兵团第二师28团3929-1-6Pyrus新疆兵团第二师29团406T4L-P2Malus新疆兵团第一师6团41HC-21Malus新疆伊犁哈萨克自治州霍城县426-3Pyrus新疆巴州地区库尔勒市轮台县哈尔巴克乡4378-2Malus新疆兵团第四师78团446T4L-P4Malus新疆兵团第一师6团60 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究4.1.2方法4.1.2.1试验菌株菌丝体获得具体方法参见2.1.2.4.14.1.2.2DNA提取具体方法参见2.1.2.4.24.1.2.3试验引物参照臧睿（2012）关于V.mali遗传多样性ISSR分析，选择8对引物进行试验，选择的引物交北京六合华大基因科技股份有限公司进行合成。引物信息序列及退火温度见表4-2。表4-2ISSR引物的序列组成及退火温度Table4-2ThesequencesandannealingtemperatureofISSRprimersusedinthisstudy引物序列（5′-3′）TM退火温度AnnealingPrimersSequences℃temperatureUO2DHBCGACGACGACGACGA4360UO5NDBCACACACACACACAC3951VCA11GAGAGAGAGAGAGAGAT5054VCA16ACACACACACACACACYC52.649VCA21GTCGTCGTCGTCGTCGTC6051.5VCA22GTGGTGGTGGTGGTGGTG6260VCA25CACCACCACCACGC5660VCA30GATGATGATGATGATGAT56454.1.2.4ISSR-PCR反应体系及程序ISSR-PCR的反应体系：PCRTaqMix12.5µL、10µmol/Lprimer0.5µL、基因组DNA1.0µL、ddH2O11µL至终体积为25µL。ISSR-PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火1min，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸10min。退火温度设定见表4-2，反应完成后，20g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。61 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究4.1.2.5数据统计和分析ISSR-PCR扩增结果中每个扩增条带代表一个信息位点，将清晰且可重复获得的条带记为1，弱带或不可重复性条带记为0，对结果进行统计。用POPGEN32软件对群体遗传多样性水平的评估，其中关键性指数包括：多态性条带百分率（percentageofpolymorphicbands，PPB）、有效等位基因数（effectivenumberofallelesperlocus，Ne）、Shannon信息多样性指数（Shannon’sinformationindex，I）、Nei’s基因多样性指数（Nei’sgenediversity，H）（Yehetal.1997）。对群体间遗传分化分析用NTSYS-pc（Version2.10）软件进行分析，采用其中的SIMQUAL程序获得相似系数矩阵，通过UPGMA聚类获得聚类图。4.2结果与结论4.2.1不同来源苹果树腐烂病V.maliISSRPCR结果通过前人文献报道选择8条多态性丰富的引物，用于新疆苹果树腐烂病菌V.mali扩增，8条引物共扩增出清晰可重复的条带80条，平均每条引物扩增10条，其中80条具有多态性，多态性比率为100%。图4-1为引物VCA-16对44份V.mali的ISSR扩增图谱，图4-2为引物VCA-25对44份V.mali的ISSR扩增图谱。62 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究M12345678910111213141516172000bp1000bp500bp250bp2000bp1000bp500bp250bp2000bp500bp250bp图4-1引物VCA16对44株苹果树腐烂病菌株ISSR-PCR的扩增结果Fig.4-1TheISSR-PCRamplificationof44strainsofV.maliinXinjiangwithprimerVCA16注：M,2000bpDNAladder;泳道1到44,来自新疆V.mali菌株Note:M,DL-2000;Lane1to44,V.malistrainsfromXinjiangprovince63 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究M12345678910111213141516172000bp1000bp500bp250bp2000bp1000bp500bp250bp2000bp1000bp500bp250bp图4-2引物VCA25对44株苹果树腐烂病菌株ISSR-PCR的扩增结果Fig.4-2TheISSR-PCRamplificationof44strainsofV.maliinXinjiangwithprimerVCA25注：M,DL-2000;泳道1到44,来自新疆V.mali菌株Note:M,DL-2000;Lane1to44,V.malistrainsfromXinjiangprovince4.2.2V.mali的不同地理区域种群的群体遗传分析苹果树腐烂病V.mali主要寄主是苹果和香梨，而苹果和香梨在新疆的主要种植区在兵团第一师、第二师和第四师。从新疆采集分离鉴定的苹果腐烂病菌V.mali主要集中在新疆兵团第一师、第二师、第四师。对苹果树腐烂病菌3个不同地理区域种群的群体遗传多样性的统计结果显示（表4-3），3个地理区域种群的基因多样性指数（H）大小虽然各不相同，但相差较小，各个地理区域种群的基因多样性指数（H）均达到了0.2以上，而且，3个地理区域种群的Shannon信息指数（I）也都达到了0.3以上，说明这三个不同的地理区域种群的遗传多样性水平均比较高。3个地理区域种群经8条ISSR引物扩增，得到的多态性位点的数目也各不相同，第二师得到的多态性位点比率高于兵团第一师和第四师。64 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究表4-3新疆腐烂病菌V.mali种群遗传多样性参数Tab4-3DiversityparametersofV.malispeciesfromXinjiangprovince样品种群NaNeHIP(%)Geographicalgroup新疆兵团第一师1.88751.53870.30580.454988.75%新疆兵团第二师1.92501.49950.29380.444692.50%新疆兵团第四师1.88751.42950.26960.418288.75%群体水平1.90001.48920.28970.439290.00%物种水平2.00001.56960.26960.4182100%注：Na：观察等位基因数；Ne：有效等位基因数；H：Nei’s(1973)基因多样性指数；I：Shannon信息指数；P：多态性位点百分率。Note:Na:observednumberofalleles;Ne:effectivenumberofalleles;H:Nei’sgenediversityindex;I:Shannon’sinformationindex;P:percentageofpolymorphicloci.4.2.3V.mali不同地理区域种群的群体遗传结构与分化依据新疆腐烂病菌V.mali不同地理区域，将44份V.mali分为3个种群。用POPGEN32软件获得相关参数见表4-3。经分析得到新疆苹果腐烂病菌V.mali种内总基因多样性Ht=0.3263，群体内基因多样性Hs=0.2897，由Dst=Ht-Hs可得到群体间基因多样性为0.0366，群体间的基因分化系数GST=Dst/Ht=0.1122，这说明V.mali种群间遗传多样性占11.22%，种群内的变异占总变异的88.78%，也就是说，地理种群内遗传多样性占总群体多样性的89.1%，群体内多样性大于群体间多样性。说明新疆地区苹果腐烂病V.mali遗传变异以种群内变异为主。根据遗传分化系数估算的基因流的值Nm=3.96，大于1，表明种群间基因交流丰富。4.2.4苹果腐烂病V.mali的聚类分析遗传相似系数(GS)反映了物种个体间遗传分化情况及亲缘关系的远近。根据获得的遗传相似系数进行UPGMA聚类分析结果见图4-5所示。将供试的3个自然种群聚为2个不同的类群，第一个类群包含以新疆南疆苹果园、香梨园为主的V.mali，第二个类群主要是新疆北疆苹果园中分离得到的V.mali，同时也包含部分的南疆采集分离得到的V.mali，这样的聚类结果表明不同的自然种群间存在一定的基因流动，同时，也表明各自然种群之间的遗传亲缘关系与其地理来源之间没有明显的相关性。65 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究29-1-9-2HS-GH-2Yxx-xl29-1-528-2-8-229-1-66-329-3-16T4L-P328-Y-1-11-28-1AKS-16T4L-P128-XL-16T4L-P26T4L-P428-2-5-1ІAAKS-2AKS-329-3-2HS-GH-2-110T-228-1-86T-GH29-3-2-129-1-11Yxx-xl-128-2-13-2HC-2161-2461-2661-2928-2-1-1AKSП66-4078-228-4-166-3966-4178-1178-156T-GHHS-GH-30.540.650.760.870.97Coefficient图4-7新疆苹果树腐烂病菌3个不同自然种群的UPGMA聚类图Fig.4-7TheUPGMAdendrogramof3populationsofV.maliinXinjiangbasedonISSRmarkers4.3讨论与结论4.3.1讨论依据前人（臧睿，2012；Khadijehetal.2015）研究报道，选择8条ISSR引物对新疆苹果腐烂病菌V.mali进行遗传多样性研究，所选的引物对腐烂病V.mali具有非常高的多态性。李正力等（2011）通过SRAP分子标记的方法，对陕西省杨凌地区的苹果树腐烂病菌V.mali遗传分析发现，苹果树腐烂病菌V.mali的SRAP多态性与菌株的采集来源没有明显相关性，与本试验结果相一致。对新疆不同地理区域种群的UPGMA聚类分析发现，苹果树腐烂病菌V.mali种群的遗传分布与其所处的纬度位置之间具有一定66 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究的关系，但是这种关系却非常弱。新疆兵团第一师和第二师在南疆地区，距离相对较近，V.mali存在着遗传信息交流，而兵团第四师在北疆伊犁地区，天山山脉阻碍着苹果树腐烂病V.mali遗传信息的交流。臧睿（2012）对陕西省和全国不同地理区域苹果腐烂病菌V.mali种群遗传多样性分析，认为我国的苹果树腐烂病菌具有丰富的遗传多样性。对不同地理区域种群遗传结构的分析表明，不同地理区域种群间的遗传变异，只占总变异很小的一部分，各自然种群内的不同分离株之间的遗传变异是腐烂病菌最主要的变异来源。聚类分析也发现来自于同一地理区域种群的不同自然种群可分布于不同的聚类群中，说明各个自然种群之间的遗传亲缘关系与其地理来源之间并没有明显的相关性。对中国不同地理区域种群内不同自然种群的UPGMA聚类分析发现，苹果树腐烂病菌种群的遗传分布与其所处的纬度位置之间具有一定的关系，但是这种关系却非常弱。物种遗传多样性对其适应环境变化及物种进化有重要意义。新疆地域广泛、环境多样、气候多变、物种丰富等因素，对苹果腐烂病菌V.mali遗传变异创造便利条件。基因流交换越频繁的物种其居群间的遗传分化越小，反之，基因流交换匮乏加速居群间的遗传分化（赵鹏等，2016）。新疆地区苹果腐烂病V.mali遗传多样性丰富和种群间变异大，使防治难度加大。同时依据基因流值，苹果腐烂病菌V.mali在种群间基因交流丰富。4.3.2结论通过UPGMA方法构建了新疆苹果树腐烂病菌不同自然种群遗传关系的聚类分析结果显示，聚类分成南疆和北疆2个大的类群，聚类分析也发现来自于同一地理区域种群的不同自然种群可分布于不同的聚类群中，说明各个自然种群之间的遗传亲缘关系与其地理来源之间并没有明显的相关性。结果也表明地理距离较近的居群并不总是遗传相似性也高或聚类在一起。新疆苹果腐烂病V.mali遗传变异以种群内变异为主。根据基因流的值，表明苹果腐烂病菌V.mali种群间遗传信息丰富。67 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究第五章林木腐烂病菌快速分子检测方法研究腐烂病在南疆香梨园和苹果园中发生普遍且危害十分严重。果农每年都要花费大量的人力、物力和财力对腐烂病进行防治，但由于果树腐烂病菌存在潜伏侵染现象，果农们往往是在果园内能见到大面积的腐烂病病斑时，才开始采取措施进行防治，错过腐烂病防治的最佳时间，而造成人力物力的大量浪费。王美娜（1990）研究表明苗木带菌是苹果树腐烂病菌远距离传播的主要原因之一。如果能对移栽苗木进行快速、准确的检测，剔除带菌的苗木，就可以在一定的程度上阻断腐烂病菌在不同地区之间的传播。同时，如果能够对该病害进行早期的预测预报，在腐烂病还没有表现出明显的症状时，就采取措施进行有效的预防，防患于未然，也能有效的降低果树腐烂病所带来的危害。但是，传统的腐烂病菌分离、检测方法，不仅费时费力，而且，鉴定结果的准确性也不高。近年以来，由于PCR分子检测技术具有快速、准确的优点，已经在许多农业病害的快速检测中发挥了主要的作用。Zang（2012）依据腐烂病菌rDNA-ITS的特异序列，设计种特异性引物VmF/R，VmcF/R，VpF/R，区分苹果树腐烂病菌V.malivar.mali,V.malicola,V.persoonii，检测灵敏度达到100fg/μL。本研究以在新疆已报道4个种V.mali,V.sordida,L.niveum和V.malicola为研究对象（杜琴等，2013），基于腐烂病菌β-Tubulin基因序列设计特异性引物，建立针对新疆林木腐烂病菌快速、准确的PCR检测体系，以便为新疆林木腐烂病菌的早期监测和防治提供技术支持。5.1材料和方法5.1.1供试菌株本研究所用腐烂病菌菌株有4个种，分别是V.mali,V.sordida,L.niveum和V.malicola，前期已通过形态学、ITS序列、β-Tubulin基因对腐烂病种类进行准确鉴定，同时从中国林业微生物菌种保藏管理中心购买部分林木腐烂病菌株作为对照。菌株编号、来源、种名以及寄主等信息见表5-1。68 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究表5-1腐烂病菌分子快速检测供试菌株Table5-1ThestrainsofValsacankerpathogenswereusedtorapidmoleculardetection序号编号来源种名寄主No.StrainsNo.OriginsofstrainsSpeciesHost新疆兵团第一师6团16T4L-LRegiment6ofDivisionNo.1ofV.mali梨树PyrusXPCG,Akesu,Xinjiang新疆兵团第二师29团229-1-6Regiment29ofDivisionNo.2ofV.mali梨树PyrusXPCG,Korla,Xinjiang新疆兵团第二师28团328-Y-1-1Regiment28ofDivisionNo.2ofV.mali箭杆杨PopulusnigraL.XPCG,Korla,Xinjiang中国林业微生物菌种保藏管理中心4cfcc84640ChinaforestryculturecollectionV.mali海棠Malusspectabiliscenter中国林业微生物菌种保藏管理中心5cfcc86482(ChinaforestryculturecollectionV.mali苹果Maluscenter)新疆兵团第二师29团6TMG-3Regiment29ofDivisionNo.2ofV.sordida胡杨PopuluseuphraticaXPCG,Korla,Xinjiang新疆喀什市7KsV.sordida箭杆杨PopulusnigraL.Kashgar,Xinjiang新疆巴州和硕县8HS-2V.sordida沙枣ElaeagnusangustifoliaHeshuocountyofXinjiang中国林业微生物菌种保藏管理中心9cfcc85445(ChinaforestryculturecollectionV.sordida毛白杨Populustomentosacenter)中国林业微生物菌种保藏管理中心10cfcc84642(ChinaforestryculturecollectionV.sordida刺槐Robiniapseudoacaciacenter)新疆兵团第二师22团1122T-XLRegiment22ofDivisionNo.2ofV.malicola梨树PyrusXPCG,Korla,Xinjiang新疆兵团第二师29团1229-1-11Regiment29ofDivisionNo.2ofV.malicola梨树PyrusXPCG,Korla,Xinjiang新疆兵团第二师29团13TMG-8Regiment29ofDivisionNo.2ofL.niveum新疆杨PopulusalbaLXPCG,KorlaXinjiang新疆巴州焉耆县14YQ-1L.niveum新疆杨PopulusalbaLYanqicountyofXinjiang69 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究序号编号来源种名寄主No.StrainsNo.OriginsofstrainsSpeciesHost新疆兵团第六师芳草湖农场15FCH-1FangcaohufarmofDivisionNo.6ofAlternariasp.箭杆杨PopulusnigraL.XPCG，Changji,Xinjiang新疆兵团第六师芳草湖农场16FCH-2FangcaohufarmofDivisionNo.6ofFusariumsp.箭杆杨PopulusnigraL.XPCG，Changji,Xinjiang注：黑色字体为购买的标准菌株;XPCG为新疆生产建设兵团（XinjiangProductionandConstructionGroup)简写。Note:Standardstrainsarepresentedwithblackfont;XPCGareshortforXinjiangProductionandConstruction5.1.2DNA提取及PCR扩增病原菌DNA的提取采用Edwards（1991）的方法：挑取少量腐烂病菌菌丝体加入1.5mL离心管中，加入500μL的buffer提取液（200mMTrisHClpH7.5，250mMNaCl，25mMEDTA，0.5%SDS），用研磨棒进行研磨，室温静置2h，13000rpm离心2min，取上清液400μL加入新的离心管中；加入400μL的异丙醇，静置5min后，13000rpm离心5min后，弃上清液；加入75%乙醇进行洗涤，晾干后加入40μL的TE溶液，-20℃保存。PCR反应体系：PCRTaqMix10μL，10μmol/L引物各1μL，病原物DNA0.5μL，ddH2O12.5μL，终体积为25μL。扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，引物退火30s（见表2），72℃延伸40s，30个循环；最后72℃延伸10min。反应完成后，10g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。5.1.3特异性引物设计采用DNAStar软件中的Seqman程序，对四种已知种类的林木树腐烂病菌的β-Tubulin序列，和在GeneBank中找到的同属的其它种类的β-Tubulin序列进行多重同源性比较，以这四个已知种类的病原菌β-Tubulin的保守区段和多态性丰富的特异性的区段为靶标，应用Primer5.0软件分别设计种特异性引物（Species-specificPrimers）。设计好的引物序列交由北京华诺时代科技有限公司合成。5.1.4特异性引物的特异性检测以在林木腐烂病菌分离过程中出现频率最高的其它属分离物：1株链格孢菌（Alternariasp.）和1株镰刀菌（Fusariumsp.）为阴性对照。用合成引物对参试菌株的70 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究基因组DNA进行PCR扩增，检测其特异性条带的有无来分析引物的特异性。5.1.5特异性引物灵敏度检测用紫外分光光度计测量所提取腐烂病菌基因组DNA的OD260值，将浓度调整为1μg/mL，并按10倍梯度稀释为1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL备用。PCR反应体系和反应程序同上。5.2结果与分析5.2.1特异性引物的设计结合DNAStar软件对腐烂病菌及黑腐皮壳属（Valsa）中其它种类病原菌β-Tubulin序列的分析，分别以腐烂病菌的β-Tubulin特异性区段为靶标，用引物设计软件Primer5，设计用于扩增种特异性引物，VcF和VcR，VsF和VsR，VnF和VnR以及VmF和VmR，这些引物的序列、退火温度，以及种特异性引物所检测的对应的病原菌的相关的信息见表5-2和表5-3。表5-2林木腐烂病的保守引物和种特异性引物的序列信息与退火温度Table5-2Thenucleotidesequencesandannealingtemperaturesofuniversalprimersandspecies-specificprimersofWoodsCanker引物名称引物序列引物退火温度（Primername）PrimerSequence(5’-3’)Annealingtemperature(℃)VcFATTGTGCGATGGCCATCATCTCG52VcRCAAGGCTAGAAGCAACGCGAAA59VsFCGCAACCCATCTTTCGCTTC50VsRCTGGACGGAAACACGTCAGT49VmFCGTACCTCCAACTCCATCCC60VmRCATACTTGTTGCCGGAAGCC56VnFTTTCCTTCGCGTACAGGTCC59VnRGTTGTAACTGCGCGATGGTC5871 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究表5-3种特异性引物所检测的病原菌种类及扩增产物的大小Table5-3Species-specificprimersforthecorrespondingV.speciesandthesizeoffragment检测病菌种类上游引物下游引物目的片段大小V.speciesUpperprimerLowerprimerFragmentsize(bp)V.maliVcFVcR144V.sordidaVsFVsR180V.malicolaVmFVmR324L.niveumVnFVnR2405.2.2特异性引物的检测对种特异性引物特异性的检测，旨在检测所设计的引物是否只具有靶向的唯一性，即只对其所检测的靶标菌进行扩增，而不能对非靶标菌进行扩增。在图5-1中，菌株6T4L-L，29-1-6，28-Y-1-1、cfcc84640和cfcc86482共5株V.mali检测到约为144bp左右的目的片段，其他的均未检测到。表明引物VcF/VcR对V.mali具有相对专一性，可用于腐烂病菌V.mali的快速分子检测。M1234567891011121314151617100bp图5-1VcF/VcR对不同病原菌的特异性检测Fig.5-1Specificitytestofspecies-specificprimersVcF/VcRbyPCRfromdifferentstrains.注：泳道1-5为V.mali菌株；6-10为V.sordida菌株；11-12为V.malicola菌株；13-14为L.niveum菌株；15-17分别为Alternariasp、Fusariumsp和阴性对照；M表示DL-2000。Note:Lane1-5:V.malistrains;lane6-10:V.sordidastrains;lane11-12:V.malicolastrains;lane13-14:L.niveumstrains;lane15to17:Alternariasp.,Fusariumsp.andCK(noDNAtemplate),MrepresentsDL-2000.在图5-2中，TMG-3，KS，HS-2，cfcc84642和cfcc95445共5株V.sordida检测到约为180bp左右的目的片段，其他的均未检测到。表明引物VsF/VsR对V.sordida具有相对专一性，可用于腐烂病菌V.sordida的快速分子检测。72 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究M1234567891011121314151617250bp图5-2VsF/VsR对不同病原菌的特异性检测Fig.5-2Specificitytestofspecies-specificprimersVsF/VsRbyPCRfromdifferentstrains.注：泳道1-5为V.mali菌株；6-10为V.sordida菌株；11-12为V.malicola菌株；13-14为L.niveum菌株；15-17分别为Alternariasp,Fusariumsp和阴性对照；M表示DL-2000。Note:Lane1-5:V.malistrains;lane6-10:V.sordidastrains;lane11-12:V.malicolastrains;lane13-14:L.niveumstrains;lane15to17:Alternariasp.,Fusariumsp.andCK(noDNAtemplate),MrepresentsDL-2000.在图5-3中，22T-xl和29-1-11共2株V.malicola检测到约为320bp左右的目的片段，其他的均未检测到。表明引物VmF/VmR对V.malicola具有相对专一性，可用于腐烂病菌V.malicola的分子检测。M1234567891011121314151617250bp图5-3VmF/VmR对不同病原菌的特异性检测Fig.5-3Specificitytestofspecies-specificprimersVmF/VmRbyPCRfromdifferentstrains.注：泳道1-5为V.mali菌株；6-10为V.sordida菌株；11-12为V.malicola菌株；13-14为L.niveum菌株；15-17分别为Alternariasp.,Fusariumsp和阴性对照；M表示DL-2000。Note:Lane1-5:V.malistrains;lane6-10:V.sordidastrains;lane11-12:V.malicolastrains;lane13-14:L.niveumstrains;lane15to17:Alternariasp.,Fusariumsp.andCK(noDNAtemplate),MrepresentsDL-2000.在图5-4中，TGM-8、YQ-1共2株L.niveum检测到约为240bp左右的目的片段，其他的均未检测到。说明引物VnF/VnR对L.niveum具有相对专一性，可用于腐烂病菌L.niveum的快速分子检测。73 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究M1234567891011121314151617250bp图5-4VnF/VnR对不同病原菌的特异性检测Fig.5-4Specificitytestofspecies-specificprimersVnF/VnRbyPCRfromdifferentstrains.注：泳道1-5为V.mali菌株；6-10为V.sordida菌株；11-12为V.malicola菌株；13-14为L.niveum菌株；15-17分别为Alternariasp.,Fusariumsp.和阴性对照；M表示DL-2000。Note:Lane1-5:V.malistrains;lane6-10:V.sordidastrains;lane11-12:V.malicolastrains;lane13-14:L.niveumstrains;lane15to17:Alternariasp.,Fusariumsp.andCK(noDNAtemplate),MrepresentsDL-2000.5.2.3特异性引物灵敏度检测以稀释为1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL作为模板，选用种专化型引物进行PCR扩增后，如图5-5，分别为4种腐烂病菌V.mali、V.sordida、L.niveum、V.malicolaDNA浓度稀释后，选择对应种特异性引物进行PCR扩增后电泳条带。4种病原物DNA浓度稀释为10pg/mL时均可以检测到条带。M1234567M1234567AB250bp250bpM1234567M1234567CD250bp250bp图5-5种特异性引物对腐烂病菌的灵敏性检测Fig.5-5SensitivityofPCRwithspecificprimersfordetectionofValsaCanker.注：泳道1-6分别为稀释浓度分别为1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL，泳道7为对照，M表示DL-2000（A:V.mali;B:V.sordida;C:V.malicola;D:L.niveum）Note:Lanes1-6：AmplifiedproductsusingDNAatconcentrationsof1μg/mL,100ng/mL,10ng/mL,1ng/mL,100pg/mL,10pg/mL,respectively,lane7forcontrol,MrepresentsDL-200074 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究5.3讨论与结论5.3.1讨论新疆林木腐烂病有逐年加重的趋势，已成为新疆林木主要的病害之一（潘朝印，1997；郭铁群，2002）。腐烂病菌危害寄主种类较多，且病菌种类复杂多样（Adamsetal.2005;马荣等，2015，岳朝阳等，2011；Zhuang,2005）。传统的生物学形态鉴定就显得十分困难。因此建立快速PCR检测技术对于腐烂病病害的早期诊断、预防显得十分重要。随着分子检测技术的发展，建立基于rDNA-ITS区段的分子检测技术已得到了广泛应用（赵永强等，2009；张海峰等，2008；宋娜等，2012）。Nicolas（2005）利用种特异性的引物，成功的从杨树上检测到了三种壳针孢属（Septoria）病原菌的存在。Zang（2012）利用苹果树腐烂病菌的rDNA-ITS的特异区段为靶标设计特异性的引物，区分苹果树腐烂病菌V.malicola,V.persoonii和V.malivarmali，检测灵敏度达到100fg/μL。周晓云等（2013）设计特异性引物SF1/SR2对华丽腐霉（A.andraeanum）进行快速检测，检测灵敏度在DNA水平上可达1pg。王璠（2012）设计了桃流胶病F.aesculi的特异性引物。在β-Tubulin基因序列区域设计了一个正向引物FaF，与非特异性反向引物Bt2b组成引物对，特异性的扩增桃流胶病菌F.aesculi基因组DNA，得到一条大小为322bp条带。参与检测的20个F.aesculi都能扩增出该条带，其它两种桃流胶病菌L.theobromae和D.seriata及桃树和其它植物上的其它属真菌显示为阴性。引物FaF/Bt2b的检测灵敏度为浓度1pg/μL。本研究建立方法只对新疆林木腐烂病进行快速定性检测，并且可满足农业生产上大量样品批量检测的需求。很多文献报道苹果腐烂病菌V.mali和V.ceratosperma是同种异名(Kobayashi,1970;Suzaki,2008;Wang,2011)。同时新疆林木腐烂病菌是否存在其他种类，也需要进一步进行分离鉴定。5.3.2结论本研究建立了一种基于DNA分析的新疆林木腐烂病菌的PCR快速检分子测检测方法，该方法可以快速检测出枯枝落叶以及潜伏侵染的腐烂病菌，且对V.mali,V.sordida,L.niveum和V.malicola4种腐烂病病原菌可以进行快速鉴别，鉴别灵敏度可达10pg/mL，可以对腐烂病菌进行快速定性检测。该方法具有高通量、快捷、灵敏度高的特点，用于新疆林林木腐烂病预测预报、田间诊断、越冬场所、传播途径等研究有重要意义。75 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究第六章新疆苹果园及香梨园腐烂病菌初侵染源检测腐烂病菌主要以菌丝体、分生孢子器、孢子角、子囊壳以及子囊孢子等在田间病株和修剪下来的残枝上藏匿越冬，成为翌年发病的主要初侵染来源，而春季是分生孢子释放的特大高峰期（高克峰等，1995）。由于腐烂病菌分生孢子常与树体胶体物质一起形成分生孢子角，所以很难被风所吹散，只有在下雨时，孢子角才能充分的溶解并分散，并且随着雨露的流淌和雨滴的飞溅而扩大病菌的传播侵染范围。另外，粘质的孢子也可以粘附于一些昆虫的体表，随着昆虫的活动而得到传播。腐烂病菌的侵染具有伤口侵入、潜伏侵染、枝干向阳面病重、落皮层积累菌量等特点。一般情况下，腐烂病菌侵入寄主后，并不立即扩展显示出溃疡症状，当林木寄主生长势比较强时，侵入的病菌能够长时间的处于潜伏状态，只有当寄主生长势衰弱时，病菌才开始活跃起来。腐烂病潜伏侵染现象的发现，说明腐烂病菌的分布区域要远远大于病菌的流行区域。而且，潜伏侵染现象的发现，也为提高林木生长势来防治腐烂病提供了有力的理论依据（刘福昌等，1979；Bills,1996）。试验前期建立了新疆林木腐烂腐烂病菌的快速分子检测方法，选择腐烂病发生较为严重的一个香梨园，一个苹果园，对新疆腐烂病菌的初侵染来源进行采样，确定新疆林果腐烂病菌的初侵染源。6.1材料与方法6.1.1材料2015年4月选择了新疆库尔勒市周边兵团第二师28团一块腐烂病发生严重的香梨园，香梨树树龄为15年以上，腐烂病发病率为70%以上。主要采集树皮、落叶落果、修剪枝条、香梨园外林木枝条以及土壤等，将样品收集在封口袋，带回实验室-70℃保存备用。2015年4月选择了新疆阿克苏市周边红旗坡农场一块腐烂病发生严重的苹果园，苹果树树龄在20年以上，腐烂病的发病率为100%。主要采集树皮、落叶落果、修剪枝条、香梨园外林木枝条和土壤等，将样品收集在封口袋，带回实验室-70℃保存备用；采集样品详见表6-1。76 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究表6-1新疆林木腐烂病初侵染来源样品采集表Table6-1thesamplecollectionofcankerdiseaseprimaryinfectionsourcefromXinjiang采集样品香梨园苹果园SamplesPearorchardAppleorchard落叶落果KF1—KF6AF1-AF8果园土壤KS1—KS6AS1-AS5健康枝条KH1-KH5AH1-AH4初侵染源修剪枝条KW1—KW6AW1-AW6园外植物KP1-KP8AP1-AP6落皮层KD1-KD8AD1-AD46.1.2方法6.1.2.1枯枝落叶、枝条和树皮DNA提取植物组织中DNA的提取采用天根新型植物基因组DNA提取试剂盒（DP320-03），并略加改进，具体方法为：1）取林木植物组织0.5~1.0g，加入液氮充分碾磨，取40mg到离心管中。加入400μL缓冲液LP1和6μLRNaseA(10mg/mL)，旋涡振荡2min后，室温放置10min。2）加入130μL缓冲液LP2，旋涡振荡2min。3）12000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中。4）加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀30s，此时可能会出现絮状沉淀。5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。6）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前先确定加入无水乙醇到PW中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7）重复操作步骤6。8）将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温干燥放置数分钟，以彻底晾干吸附柱内残余的漂洗液。9）将吸附柱CB3转入一个新离心管中，向吸附柱膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置10min充分溶解，12000rpm离心2min，离心后的溶液为植物DNA。放置在-20℃冰箱保存备用。6.1.2.2土壤DNA提取土壤DNA提取选择MOBIO强力土壤®DNA提取试剂盒，并略加改进，具体方法为：77 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究1）加入约0.30g土壤样品到一个PowerBeadTubes中，涡旋2min混匀；2）加入60μLSolutionC1，混匀；3）把PowerBeadTubes在涡旋仪适配器上连续涡旋振荡10min；4）室温8000rpm离心30s，转移上清液至一个干净的2mLCollectionTube中；5）加入250μLSolutionC2到CollectionTube中中，涡旋混匀30s。4℃孵育5min；6）室温8000rpm离心1min，转移上清液到一个新的离心管中；7）加入200μLSolutionC3到离心管中，涡旋混匀30s。4℃孵育5min；8）室温8000rpm离心1min，转移上清液到一个新的离心管中；9）加入1200μLSolutionC4到离心管中，涡旋混匀30s；10）加入约675μL上清到SpinFilter中，8000rpm离心1min，弃去滤液。继续加载675μL上清，室温8000rpm离心1min。重复直至过滤完所有上清；11）加入500μLSolutionC5到SpinFilter中，室温8000rpm离心30s，弃去上清，室温8000rpm离心1min；12）小心转移Spinfilter到2mLCollectionTube（试剂盒提供）中，尽量避免SolutionC5污染，干燥风干；13）加入50μLSolutionC6到白色滤膜中心，使充分溶解后，室温8000rpm离心30s，弃去SpinFilter，此时收集管中的DNA可直接用实验，建议DNA-20℃保存。6.1.2.3腐烂病菌初侵染源PCR检测试验依据表6-1中采集的样品，使用基因组DNA提取试剂盒，对腐烂病菌的初侵染源样品提取DNA后，依据第五章设计的腐烂病菌种特异性引物进行PCR扩增快速检测。6.2结果与分析6.2.1林果植物材料和土壤样品DNA提取运用新型植物基因组试剂盒提取林木植物基因组DNA，结果见图6-1。林木基因组DNA长度大于2000bp，条带清晰明亮。运用NOBI新型土壤基因组试剂盒提取11份土壤样品基因组DNA，结果见图6-2。土壤基因组DNA长度大于2000bp，条带清晰明亮。78 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究M123456789101112131415162000bp图6-1林木植物基因组总DNAFig.6-1ResultsofthetotalDNAextractionofsomeplantM12345678910112000bp图6-2土壤样品基因组总DNAFig.6-2ResultsofthetotalDNAextractionofsomesoil.6.2.2库尔勒香梨园腐烂病初侵染源检测选择腐烂病菌种特异性引物VcF/VcR对新疆库尔勒香梨园腐烂病初侵染源进行快速检测，泳道4、21、22、27、30、31、36均检测到约150bp左右的电泳条带，而其他的泳道未检测到，说明泳道4、21、22、27、30、31、36所对应的样品携带有腐烂病菌V.mali。而其他检测样品均不携带腐烂病菌V.mali。在腐烂病发生严重的香梨园内，腐烂病菌可以隐藏在香梨园内落叶吊果、修剪枝条、香梨园外林木寄主植物、香梨树落皮层进行越冬。在第二年5月份条件适宜的情况下，病原菌侵染香梨树，对树体进行危害。其中落叶落果带菌率为16.67%，修剪枝条带菌率为33.33%，园外植物林木带菌率为37.5%，落皮层带菌率为12.5%。在调查的39份样品中，检测到腐烂病菌V.mali样品为7份，占所检测样品的17.95%。79 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究M1234567891011121314151617181920212223100bpM242526272829303132333435363738394041100bp图6-3种特异性引物VcF/VcR对香梨园初侵染源样品检测Fig.6-3Specificitytestofspecies-specificprimersVcF/VcRbyPCRfromprimaryinfectionsourceinpearorchard注:泳道1-6为园内落叶落果，泳道7-12为果园土壤，泳道13-17为健康枝条，泳道18-23为修剪枝条，泳道24-31为园外植物，泳道32-39为落皮层，泳道40为对照CK。Note:Lane1-6,leafandfruitsamplesofpear;lane7-12,soilsamplesofpearorchard;lane13-17,healthtwigsinpearorchard;lane18-23,pruningbranches;lane24-31,plantsamplesoutsidepearorchard;lane32-39,rhytidomesamples;lane40forcontrol,MrepresentsDL-2000.使用种特异性引物VmF/VmR、VnF/VnR、VsF/VsR均未检测到腐烂病菌V.malicola、V.sordida,L.niveum，在香梨园中，苹果树腐烂病V.mali是主要的病原物，占94.77%，而V.malicola、V.sordida共占5.23%，L.niveum在香梨园中不存在。6.2.3阿克苏苹果园腐烂病初侵染源检测选择种特异性引物VcF/VcR对新疆阿克苏苹果园腐烂病初侵染源进行快速检测，泳道2、3、4、6、7、9、10、16、19、20、21、23、25、26、27、28、31、32、33均检测到约150bp左右的电泳条带，而其他的泳道未检测到，说明这些泳道所对应的样品携带有腐烂病菌V.mali。而其他泳道对应的样品未携带腐烂病菌V.mali。其中落叶落果带菌率为62.5%，果园土壤带菌率为40%，健康枝条带菌率为25%，修剪枝条带菌率为66.67%，园外植物林木带菌率为66.67%，落皮层带菌率为75%。在调查的33份样品中，检测到腐烂病菌V.mali样品为19份，占所检测样品的57.58%。在阿克苏苹果园内，腐烂病菌可以隐藏在苹果园内落叶吊果、修剪枝条、园外林木寄主植物、落皮层等进行越冬。在第二年4-5月份条件适宜的情况下，病原菌初侵染苹80 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究果园树体，进行危害。M1234567891011121314151617100bpM1819202122232425262728293031323334100bp图6-5种特异性引物VcF/VcR对苹果园越冬场所样品检测图6-4种特异性引物VcF/VcR对苹果园初侵染源样品检测Fig6-4.Specificitytestofspecies-specificprimersVcF/VcRbyPCRfromprimaryinfectionsourceinappleorchard注:泳道1-8为园内落叶落果，泳道9-13为果园土壤，泳道14-17为健康枝条，泳道18-23为修剪枝条，泳道24-29为园外植物，泳道30-33为落皮层，泳道34为对照CK。Note:Lane1-8,leafandfruitsamplesofapple;lane9-13,soilsamplesofappleorchard;lane14-17,healthtwigsinappleorchard;lane18-23,pruningbranches;lane24-29,plantsamplesoutsideappleorchard;lane30-33,rhytidomesamples;lane34forcontrol,MrepresentsDL-2000.使用种特异性引物VmF/VmR、VnF/VnR、VsF/VsR均未检测到腐烂病菌V.malicola、V.sordida,L.niveum。在苹果园中，苹果树腐烂病V.mali是主要的病原物，占94.77%，而V.malicola、V.sordida共占5.23%，L.niveum在苹果园中不存在。6.3讨论与结论6.3.1讨论腐烂病是影响新疆林果生产最重要的枝干性病害之一，其主要危害果树的主枝、主干和小枝的皮层部分，造成主枝、主干枯死，从而严重的影响水果的产量和品质。腐烂病菌具有潜伏侵染的现象，潜伏期会因为寄主自身的生理条件和外界环境条件的不同而长短不一。因此，在病害发展的早期阶段，果树是否被病原菌侵染不易察觉。通过对果81 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究树树体自身样品检测发现，在果树树体携带有腐烂病菌V.mali，可以在果园内作为越冬的场所，第二年在环境条件适合的情况下，侵染树体进行危害。曹若彬(1992)认为苹果枝条带菌，在苹果种植区普遍存在，即使腐烂病未发现、未报道地区，枝条仍可以检测到腐烂病菌，1~5年生的枝条，带菌率随着枝条年龄增长而提高。藏睿(2012)对陕西省苹果种植区的279份外表无症状的节间组织样品进行PCR检测，检测结果表明在其中的150份样品中检测到了V.malivar.mali，占所检测样品的53.76%；在64份样品中检测到了V.malicola，占所检测样品的22.94%；在24份样品中，检测到了病原菌V.persoonii，占所检测样品的8.60%。检测结果说明，陕西省苹果腐烂病存在三种病原菌交叉侵染，也说明外表无腐烂症状的苹果树节间组织中，也携带有苹果腐烂病菌，其中以V.malivar.mali最为普遍，V.malicola居中，V.persoonii检测到的频率最低。刘钰娇(2014)通过2011~2013年连续2个年度进行不同时间分别用带菌和不带菌修剪工具进行剪枝的试验。结果表明，带有腐烂病菌的修剪工具能够在修剪过程中传播苹果树腐烂病，修剪时期在12月、1月、2月相比，选择在3月份进行集中修剪，腐烂病发病率最低。证明了修剪工具是腐烂病菌传播的一个重要途径，同时修剪的枝条也可能是腐烂病传播和越冬的潜在来源。商靖（2014）对我国细菌性溃疡病的越冬场所进行快速检测认为老病斑是其越冬的主要场所，通过雨水飞溅进行传播，同时四斑露尾甲、白星花金龟可能是欧美杨淸病病的传播媒介。果园的管理水平对腐烂病的病害流行起十分重要影响，在采样中，果园外林木寄主不仅包括林带防护林，还有一部分为修剪枝条堆放在园外，均可能是腐烂病菌的越冬场所，在第二年条件适合的情况下，病原菌将会传播到果园进行再次侵染，危害果园。修剪果树枝条不及时清除、销毁，修剪枝条和落叶落枝均可能是腐烂病菌越冬的隐藏场所。所以，加强果园管理、清洁果园卫生对防治腐烂病的流行具有十分重要作用。试验中仅仅是对腐烂病在果园中越冬场所和初侵染来源进行研究，黑腐皮壳属分生孢子侵染林木寄主过程没有进一步研究，将在以后的工作中采用ATMT技术对腐烂病菌进行GFP标记、借助扫描电子显微镜等继续研究。6.3.2结论在试验中，对库尔勒香梨园的39份样品进行检测，检测结果表明在其中的7份样品中检测到了V.mali，占所检测样品的17.95%；在对阿克苏苹果园的33份样品进行检测，检测结果表明在其中的19份样品中检测到了V.mali，占所检测样品的57.58%。腐烂病菌广泛的存在在新疆林果园中，修剪枝条、果树树体、果园土壤、园外寄主林木等均可能是腐烂病菌分生孢子、菌丝体、分生孢子器的传播来源和越冬场所。82 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究第七章全文总结7.1结论7.1.1新疆主要林木腐烂病病原菌种类鉴定新疆林木腐烂病发生较为严重，特别是苹果、香梨、核桃等经济林木和杨树、柳树及胡杨等防护林木，腐烂病阻碍新疆农林生产健康发展。本研究从新疆17种林木寄主植物采集腐烂病样品321份，分离得到281个腐烂病菌，经鉴定全为无性型。通过形态学特征、ITS序列、β-Tubulin基因序列将这些腐烂病菌鉴定为5种，分别为：Valsamali(无性型：Cytosporamali)、Valsasordida（无性型：Cytosporachrysosperma）、Valsamacolica（无性型：Cytosporaschulzeri）、Leucostomaniveum（无性型：Cytosporanivea）和Cryptosphaeriapullmanensis（无性型：Cytosporinapullmanensis）。其中V.mali是危害新疆经济林腐烂病的主要种，V.sordida是危害新疆防护林的主要种。7.1.2新疆林果腐烂病菌主要种V.mali致病性分化研究新疆苹果树腐烂病菌V.mali生物学性状和致病性研究表明，新疆苹果树腐烂病菌V.mali不同颜色菌株的致病力有差异，淡黄色和乳白色菌株致病力强于白色菌株。新疆苹果树腐烂病V.mali致病力主要以中等致病力和弱致病力为主，没有发现强致病力菌株，新疆苹果树腐烂病菌V.mali存在致病力分化现象。苹果树腐烂病菌V.mali可以在不同林木寄主上致病，不同林木寄主致病力也存在差异，V.mali可交叉侵染林木寄主。本研究揭示了新疆地区苹果树腐烂病菌V.mali种群多样性、复杂性和致病性分化现象。7.1.3新疆林木腐烂病菌主要种V.maliISSR遗传分化通过UPGMA方法构建了新疆苹果树腐烂病菌不同自然种群遗传关系的聚类分析，聚类分成南疆和北疆2个大的类群，聚类分析也发现来自于同一地理区域种群的不同自然种群可分布于不同的聚类群中，说明各个自然种群之间的遗传亲缘关系与其地理来源之间并没有明显的相关性，表明两地区间的苹果树腐烂病V.mali之间存在有一定的基因流。结果也表明地理距离较近的居群并不总是遗传相似性也高或聚类在一起。新疆苹果腐烂病V.mali遗传变异以种群内变异为主。根据基因流的值，表明苹果腐烂病菌V.mali种群间基因交流丰富。83 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究7.1.4林木腐烂病菌快速分子检测方法建立建立一种林木腐烂病菌的PCR快速分子检测方法。设计的4对种特异性引物分别可对4种腐烂病菌V.mali,V.sordida,L.niveum,V.malicola，分别检测到144bp、180bp、240bp、324bp的条带，检测灵敏度均为10pg/mL。此检测方法可用于新疆林木腐烂病的快速分子检测。7.1.5新疆林木腐烂病初侵染源检测腐烂病初侵染源结果表明：对腐烂病发生严重的库尔勒香梨园的39份样品进行检测，检测结果表明在其中的7份样品中检测到了V.mali，占所检测样品的17.95%；在对腐烂病发生严重的阿克苏苹果园的33份样品进行检测，检测结果表明在其中的19份样品中检测到了V.mali，占所检测样品的57.58%。修剪枝条、园外寄主植物、果园内落叶吊果、树体落皮层、土壤均可以检测到腐烂病菌，可成为腐烂病菌越冬、初侵染源。因此清洁果园卫生对新疆林木腐烂病的防治起重要的作用。7.2特色和创新7.2.1研究特色新疆地域辽阔，拥有复杂多样的地质地貌及气候条件，因而也形成了丰富多样的植物类群和微生物类群。本研究对新疆特色林果、绿化及农田防护林等17种林木寄主采集腐烂病样品321份，分离得到的281株腐烂病菌进行鉴定，研究结果明确新疆林木腐烂病寄主林木种类和病原菌种类，具有十分鲜明的地方特色和实用价值。引起新疆经济林木腐烂病的主要种是苹果腐烂病V.mali，以苹果腐烂病V.mali为试验对象，研究其致病力及遗传多样性，致病力试验表明新疆苹果树腐烂病V.mali存在分化现象，通过ISSR进行遗传多样性分析，表明苹果腐烂病菌V.mali种群间基因交流丰富。7.2.2研究创新本研究采集新疆地区腐烂病菌样品分布地域广、分布区域气候条件变化多样。腐烂病将从新疆特色林果、绿化和农田防护林木上采集，这些林木与新疆经济发展和生态安全密切相关。相关内容在新疆尚未开展过系统、全面的研究，因此所针对的研究对象具84 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究有创新性。明确引起新疆果园腐烂病的病原菌主要种V.mali，新疆防护林腐烂病的主要种是V.sordida。同时，发现引起胡杨树腐烂病病原菌是C.pullmanensis。以林果园腐烂病主要种V.mali为对象，研究V.mali致病性分化及遗传多样性，研究结果将会为有效控制新疆林木腐烂病提供理论依据和技术支持。7.3存在问题3年来，虽然已达到了预期的研究目标，但是由于个人能力和时间有限，研究中工作中难免会存在一些不能解决或暂时没有解决的问题。如苹果腐烂病V.mali存在两个变种，即V.malivarmali和V.malivarpyri，在试验中没有区分到变种，只以V.mali代表。其次，报道引起苹果树和梨树腐烂病的病原菌主要为V.mali，少数为V.malicola，无金黄壳囊孢V.sordida的报道，在试验中，从香梨腐烂病上分离得到2株V.sordida。同样V.sordida主要报道引起杨柳科植物的腐烂病，我们在试验中从杨属林木上也分离到2株V.mali。通过形态学和分子生物学鉴定均为V.mali，是样品标记错误还是正确结果，有待于进一步确定。新疆林木种类繁多，如报道新疆杨树种、品种(无性系)约有57种，柳树品种48种，苹果栽培种6个，梨树栽培品种6个。新疆众多的杨树、柳树、苹果、香梨等品种腐烂病收集、鉴定可能不是很全面。引起新疆经济林木腐烂病的病原菌主要种为V.mali，主要寄主林木是苹果和香梨，但是甘肃省、陕西省均是我国苹果主产区，腐烂病发生也十分严重。在对V.mali致病力和遗传分化试验中，仅对新疆苹果腐烂病V.mali进行致病力分化和遗传多样性分析，没有选择其他省份的苹果腐烂病V.mali作为对照和对比，研究内容有所限制。85 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新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究附图1新疆林果腐烂病的危害症状A．香梨树腐烂病危害果园；B.腐烂病危害柳树；C-D.腐烂病危害杨树；E.腐烂病危害榆树；F.腐烂病危害胡杨；G.腐烂病危害苹果树；H.腐烂病危害核桃。A.SymptomsofpearValsacanker;B.SymptomsofSalixmatsudanaValsa.canker;C-D.SymptomsofPopulusspp.Valsacanker;E.SymptomsofUlmuspumilaValsacanker;F.SymptomsofPopuluseuphraticaValsacanker;G.SymptomsofappleValsacanker;H.SymptomsofJuglansValsa.canker97 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究附图2腐烂病菌V.mali致病性分化V.mali在PDA培养基上形成菌落形态（A.乳白色；B.淡黄色；C.白色）ColonycharacteristicsofstrainsonPDAofV.mali（A.milk-white,B.yellow;C.white）不同菌株V.mali对苹果枝条致病性测定PathogenicitytestofsomedifferentV.malistrainsinapplebranches不同菌株V.mali对香梨枝条致病性测定PathogenicitytestofsomedifferentV.malistrainsinpearbranches98 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究致谢感谢石河子大学，让我在这儿度过了美好的本科、硕士、博士共十年的学习生活！感谢我的两位导师向本春教授和赵思峰教授！向老师作为石河子大学校长，工作非常繁忙，但他任然在百忙之中抽出时间修改我的博士开题报告，给出宝贵的修改意见，平时经常详细询问我的试验研究进展及试验中存在的困难等。感谢向老师三年来对我学习、生活上给予的关心和教诲。赵老师严谨的学术作风、渊博的专业知识、孜孜追求的科研精神、朴素简洁的生活态度使我终身受益！从进入大学到博士研究生，一直师从赵老师进行学术研究。学到了丰富的专业知识，更懂得了许多为人处世的道理。记得和赵老师在6团凌晨四点多，无处可去，只能在团场的人行道上铺两张报纸，一直聊生活、学习……。所有这一切，不仅使我在思维方式、研究技能、写作能力得到了极大的锻炼，更将对我今后生活和从事的工作具有深远影响。在毕业之际，对我敬爱的两位导师表示诚挚的谢意。在论文工作期间，感谢农学院植保系植物病理教研室黄家风、任毓忠、张莉、都业娟、杜娟等各位老师；感谢我大学班主任吴彩兰老师；感谢同门师姐陈莉；同门同学姚兆群、郝小军；毕业师弟师妹张学坤、杜琴、王斌、孙洁、赵静、池振江、李进等同学；在研师弟师妹方小翠、田芳、曹晓蕾、王刚、汪凤娟、何丽、艾尼古丽、包亚洲、彭金凤、许瑛、陈虹娇、陈美秀等同学；感谢新疆康正农业科技开发有限责任公司李英贤对采样帮助。感谢农学院研究生办陈诚、莫文萍、王春娟、贾成军老师对我学习和科研上的关心，感谢新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室提供优越的实验条件。感谢我家人对我的期待和支持，感谢女友在学习和生活的照顾！感谢每一个关心和帮助我的人，愿你们永远幸福，我将因为你们的幸福而更加幸福。再次向你们致以最诚挚的谢意！郭开发2016年6月99 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种Valsamali遗传分化和初侵染源快速检测研究作者简介郭开发，男性，生于1985年3月，籍贯甘肃武威。2009年毕业于石河子大学农学院植物保护系，获农学学士学位。同年考取石河子大学硕士研究生，2012年毕业于石河子大学农学院植物保护系植物病理学专业，获农学硕士学位。同年参加工作，在阿拉山口出入境检验检疫局技术中心工作，主要从事植物及植物产品植物检疫工作。2013年至今在石河子大学农学院攻读园艺学专业园艺植物有害生物防治研究方向博士。在学期间主要参与的研究项目1.参加了新疆维吾尔自治区科技支疆课题“新疆苹果树腐烂病生物和化学协同防控技术开发”（201491150）的研究工作。2.参加了新疆生产建设兵团青年专项基金“新疆主要林木腐烂病菌鉴定及其综合防治技术研究”（2013CB002）的研究工作。3.参加了新疆维吾尔自治区高层次人才引进项目。在学期间发表的文章1.K.F.Guo,J.Sun,S.F.Zhao,L.He.BlackSpotDiseaseofChineseJujube(Ziziphusjujuba)CausedbyFusariumincarnatuminChina.PlantDisease2016,100(2):529.DOI.org/10.1094/PDIS-06-15-0694-PDN2.BinWang,ZhaoqunYao,SifengZhao,KaifaGuo,JieSunandHuiZhang.Arbuscularmycorrhizalfungalapplicationtoimprovegrowthandtoleranceofprocessingtomato(LycopersiconesculentumMiller)underdroughtstress.JournalofFood,Agriculture&Environment,2014.12（2）：452-4573.郭开发,王刚,吴彩兰,等.新疆南疆核桃腐烂病病原鉴定.新疆农业科学,2016,53(3):496-501.4.郭开发,杜琴,赵思峰,等.库尔勒香梨腐烂病发生的影响因素及药剂防效.中国植保导刊,2016,36(1):71-73.5.郭开发,吴彩兰,方小翠,等.塔里木河下游胡杨树腐烂病病原鉴定.中国森林病虫,2015,34(5):1-4.6.郭开发,莫善明,曾怡然,等.阿拉山口口岸从进境红花籽中截获杂草疫情分析.植物检疫,2014,28(2):76-78.7.郭开发,莫善明,宋华海,等.阿拉山口口岸2012年交通工具及旅客携带物疫情截获分析.检验检疫学刊,2014,24(2):65-68.8.郭开发,莫善明,曾怡然,等.阿拉山口进口纺织原料中携带有害生物分析.安徽农业科学,2013(27):11020-110219.莫善明,郭开发,曾怡然,等.阿拉山口口岸发现检疫性有害生物单柱菟丝子.植物检疫,2014,28(3):74-7610.王斌,郭开发,赵思峰,等.NaCl胁迫下促进加工番茄生长的AM真菌筛选.新疆农业科学.2013,50(2):319-324.11.孔利,吴彩兰,郭开发,等.林木腐烂病主要致病菌Cytosporasacculas致病力分化的初步研究.湖北农业科学,2016,55(3):638-642.100 新疆林木腐烂病菌种类鉴定及其主要种吻／ｍｍａ／／遗传分化和初侵染源快速检测研宄石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表研究生姓名郭开发专业园艺学研究方向园艺植物有害生物防治｜学术评语：本研究主要针对新疆林木上腐烂病菌开展种类鉴定、主要种Ｆａ／ｗｚｎａ／／遗传分化和初侵染源快速检测研究。从新疆１７种林木寄主植物分离得到２８１个腐烂病菌株，－ｔｕｂｕ５种分别为：ｌｉｎ基因序列将这些分离株鉴定为通过形态学特征、ＩＴＳ序列、０，Ｖａｌｓａｍａｌｉ无後型：Ｃｔｏｓｏｍｍａｌｉ、Ｖａｌｓａｓｏｒｄｉｄａ（元性盤：Ｃｙｔｏｓｐｏｒａｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍａ）、（ｙｐ）Ｖａｌｓａｍａｃｏｌｉｃａ（元後变：Ｃｙｔｏｓｐｏｒａｓｃｈｕｌｚｅｒｉ）、Ｌｅｕｃｏｓｔｏｍａｎｉｖｅｕｍ（无盤：Ｃｙｔｏｓｐｏｒａｎｉｖｅａ）和Ｃｒｙｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａｐｕｌｍａｎｅｎｓｉｓ。其中Ｖａｌｓａｍａｌｉ、Ｖａｌｓａｓｏｒｄｉｄａ两种腐裝病菌分别是危害新疆经济林和防护林的主要种。明确了主要种厂ａ／Ｍｗａ／ｆ致病性分化情况，ｗａ／主要以中等致病力和弱致病力为主／似新疆腐炫病菌阶／。聚类分析明确了阶一地理区域的不同ｍａ／／不同自然种群可分成南疆和北疆２个大的类群，来自于同种群明自然种群可分布于不同的聚类群中，说明遗传亲缘关系与地理来源没有一显的相关性。建立新疆林木腐烂病菌的ＰＣＲ快速分子检测方法，对苹果园和香种主林梨园样品进行检测明确了修剪枝条、果树树体、果园土壤、园外寄木等均可能是，腐烂病研菌的越冬场所和初侵染源。本究立足研于新疆特色林果上腐烂病严重发生亟需防治技术的实际需求开展研究采样量大究内容较为系统；研究方法选用得当，研究技术比较先进，实验设，，理据和资料翔实；论文写作规范文字表达比较清楚。该同学已掌握较为宽计合础，数理论和，广的基系统深入的专业知识，具备了独立从事科研工作的能力。方的士论文。综上，该论文达到了园艺学专业园艺植物有害生物防治向博水平指导教师签字：《年月／日＜）１０１
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