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《新型鸭细小病毒DS-15株生物学特性研究及间接ELISA方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
硕士学位论文新型鸭细小病毒DS-15株生物学特性研究及间接ELISA方法的建立BiologicalCharactersoftheNovelDuckParvovirusDS-15StrainandtheEstablishmentofanIndirectELISAfortheDetectionofAntibodies姓名宫晓华导师王桂军教授专业预防兽医学二0一七年五月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明。与我确的说明并表示了谢意。、研究生签名：时间：年ｆ月ｉ曰ｙ年ｆ关于论文使用授权的声明本人完全了解安徽农ｉｋ大学有关保留、使用学位论文的规定，ｇ卩：学校有权保留送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。□本论文不保密。□本论文保密，在年解密后适用本授权。“”（请在以上□内划Ｖ）研究生签名：咬峻时间：力丨１年Ｔ月曰一导师签名：：第＿时间ａｎ年夂月４曰 单位代码：１０３６４．中图分类号：Ｓ８５５３ＵＤＣ６０９密级：：６３．安徽农业大学硕士学位论文新型鸭细小病毒ＤＳ－１５株生物学特性研究及间接ＥＬＩＳＡ方法的建立－ｒａｃｔｅｒｓｏｆＮｏｖｅｌＤｕｃｋＰａｒｖｏｖｉｒｕｓＤＳ１５ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈａｔｈｅｎＬＩＳＡｆｏｒｔｈｅｄｔｈｅＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｎＩｎｄｉｒｅｃｔＥｓｔｒａｉｎａＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ研究生（学号）：宫晓牮（１４７２０１７０）导师：王桂军教授申请学位：农学硕士所在学院：动物科技学院专业：预防兽疾学研宄方向：适Ｉ物传染病防治＿（领域）姜世金答辩委阅人：曹胜波员会主席：论文评—七年五二０月 致谢时光飞逝，仿佛昨日还是刚入学报到的研一新生，今天就迎来了毕业，一转眼三年的研究生学习即将画上句号。在这三年的研究生学习生活中我收获很多，除了丰厚的知识，更重要的是在阅读、实践中所培养的思维方式和处理问题的能力。在这期间有过成功亦有过失败，有过欢声笑语也有的悲观沮丧，我很庆幸的是这三年来我遇到了很多的良师益友，无论在学习上还是生活中，他们都给予了我无私的关怀与帮助，让我在一个充满关怀的和谐环境中走过我的研究生生涯。首先，我最想感谢的是我的恩师王桂军教授，他从我入学起对我生活的帮助到学习期间对我的淳淳教诲悉心关怀都让我感动。王老师渊博的专业知识、严谨的治学态度、精益求精的工作作风、诲人不倦的高尚师德、严于律己、宽以待人的崇高风范对我产生的了深远的影响，从刚入学的文献阅读到进入实验室开始试验研究，王老师都严格要求，让我们养成良好的学习习惯，严谨的科研态度，让我受益匪浅。同时，我也衷心感谢我的另一位恩师刘光清研究员，刘老师严谨勤奋的科研态度，孜孜不倦的治学精神，从容、乐观、豁达、以身立行的做人风格都是我学习的榜样。从论文选题、试验设计实施，到论文的撰写与修改，每一个环节中无不凝聚着恩师的汗水和心血。感谢李传峰老师、陈宗艳老师以及刘红梅老师在试验及学习上给予的指导与帮助，每当我试验中遇到难题时，总能耐心的帮助我解决问题，在此感谢你们。在此，我还要感谢陪我一起度过研究生生涯的同门：唐井玉、王楠楠、姜安安、聂睿、李雪、李丹丹师姐及朱杰、张世伟、费玮彦、郭浩、郭慧敏师兄对我试验上的指导和生活上的关心。感谢同窗殷冬冬、王瑞、许漩、吴巧梅、丁明洋、谭永贵、李琦、刘柱对我毕业论文的帮助。感谢兰梦蝶、周晓雅、梅楠、陈鹏、张雪梅、张莉、刘腾师弟师妹对我实验的支持和帮助。感谢室友芳芬、黄月月、罗聪玉、陈四玉对我生活的关心和帮助，是你们的关怀和帮助让我度过了美好的研究生生活。衷心感谢安徽农业大学预防兽医点的所有老师，在这三年研究生生涯中给予我的教诲和帮助。在此论文即将完成之际，借此机会向支持我、爱我的家人及朋友表示最诚挚的敬意和深深的谢意！感谢我的父母为我提供了可以无忧无虑学习的机会，感谢我的哥哥总是在我遇到困难的时候听我倾诉，开导我帮助我，是你们的支持让我顺利的完成了学业。宫晓华2017年4月2日 摘要2014年以来，在我国许多樱桃谷肉鸭养殖地区广泛流行一种“鸭大舌病”，其临床症状主要表现为鸭生长发育迟缓，鸭喙萎缩舌头外露下垂，跛行瘫痪等，又称鸭短喙-侏儒综合征。已经鉴定出该病的病原是一种新型鸭细小病毒（Novelduckparvovirus,NDPV）。目前对此病毒的生物学特性暂不清楚，临床上还没有有效的疫苗或药物行防治，也没有检测该病毒的方法或技术。为此，本研究对NDPVDS-15株的生物学特性进行了研究，同时为了给该病的流行病学调查提供一个可靠的检测方法，我们还对NDPV的主要抗原蛋白VP3进行了表达和纯化，并在此基础上建立了检测NDPV抗体的ELISA方法。首先，我们对新型鸭细小病毒DS-15株在鸭胚上的增殖特性及对鸭胚的致病力进行研究。试验结果显示，鸭胚接种NDPVDS-15株以后，96~120h出现死亡，胚体-5.5全身出血，病毒滴度（ELD50）为10/0.2mL。以鸭胚增殖的病毒感染樱桃谷肉鸭，成功复制出典型的“鸭大舌病”临床症状，并从发病鸭脏器中分离到病毒。其次，根据NDPVDS-15株的基因序列设计PCR引物扩增VP3基因并将其序列与国内外报道的部分GPV及MDPV分离株的VP3基因进行比对和分析。结果表明，NDPVDS-15株VP3基因与鹅细小病毒（Gooseparvovirus，GPV）之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为91.4%~98.4%和96.6%~98.1%，而与番鸭细小病毒（Muscovyduckparvovirus，MDPV）核苷酸和氨基酸同源性则较低，分别为81.4%~91.5%和91%~97%；在亲缘关系方面，NDPVDS-15株与GPV较近，提示二者可能是由同一病毒进化而来。最后，我们将NDPV的VP3基因克隆并插入到pGEX-4T-1中构建重组表达质粒pGEX-4T-VP3，诱导表达重组GST-VP3蛋白，重组蛋白分子量为84kDa。Westernblot方法检测结果显示重组VP3蛋白能与NDPV多克隆抗体发生反应，重组VP3蛋白具备用作诊断抗原的潜力。以表达的VP3蛋白作为抗原，包被ELISA板；然后，分别对包被抗原的浓度及条件、抗原封闭条件、一抗的孵育条件、酶标二抗的孵育条件和显色条件等进行优化，最终成功建立间接ELISA方法，确定方法的阳性阈值为0.35。所建立的方法有较好的重复性，运用该方法对临床样本进行了初步检测，结果表明该方法可用于NDPV疫苗的免疫效力评价，及NDPV感染鸭群的流行病学调查，同时也可用于鸭群GPV的检测。综上，本论文对NDPV的增殖特性及致病特性进行了初步研究，推测新型鸭细小病毒与鹅细小病毒可能是从同一病毒祖先进化而来。此外，我们建立了检测NDPV抗体的间接ELISA方法，为开展NDPV的疫苗研发和流行病学调查等提供了可靠的检测方法。I 关键词：新型鸭细小病毒；增殖特性；VP3蛋白；原核表达；间接ELISA方法II AbstractSince2014，anovelduckepidemichasbeenendemicinmanyduckfarmsofChina.Themainlyclinicalsymptomsoftheduckdiseaseweregrowthretardation,beakatrophyandtongueexposed,andlimpparalysis.Basedonthetypicalclinicalsymptoms,thisnewdiseasewascalledduckshortbeakdwarfsyndrome(DSBDS)orduckbigtonguedisease.Ithasbeenidentifiedthatthepathogenofthisdiseaseisanovelduckparvovirus(NDPV).Sofar,thebiologicalcharacteristicsofNDPVhasnotbeenclear,andthereisnoeffectivevaccineordrugforcontrollingthisdisease.Moreover,themethodortechniquesfordetectingthediseasearelacking.Inthispaper,thebiologicalcharacteristicsofNDPVDS-15strainwasstudied,andareliablemethod(indirectELISA)fordetectingthespecificantibodyagainstNDPVwasestablished..Firstly,thepathogenofDSBDSwasisolatedbyduckembryo,namedNDPVDS15strain.Afterpassagedthreetimes,NDPVDS15straincouldkilled60%-70%duck-5.5embryoin96-120h.Thetitre(ELD50)ofDS-15strainwas10/0.2mL.DucklingsinfectedwiththerecoveredDS-15strainfromduckembryoshowedtypicalclinicalsymptomsofDSBDS.TheVP3geneofNDPVDS-15strainwasamplifiedandsequenced,anditssequencewascomparedwiththosesequencesofGooseparvoviruses(GPV)andMuscovyduckparvoviruses(MDPV).TheresultsshowedthattheidentitiesofnucleotidesequenceandaminoacidsequenceofVP3genebetweenDS-15strainandthereferencedstrainsofGPVwere91.4%-98.4%and96.6%~98.1%,respectively.However,thehomologyofVP3genebetweenDS-15strainandMDPVisolateswere81.4%~91.5%(nucleotidesequence)and91%~97%(aminoacidsequence),respectively.ThephylogenetictreeshowedthatNDPVDS-15strainlocatedinthesametopologybranchwithGPVs,suggestingthattheirrelationshipisclose.AfterNDPVVP3genewasinsertedintopGEX-4T-1,Therecombinantplasmid(pGEX-4T-VP3)wastransformedintoDE3competentcellsandinducedwithIPTG.TheresultsofSDS-PAGEshowedthattherecombinantGST-VP3proteinweresuccessfullyexpressedanditsmolecularweightwas84kDa.WesternblotassayshowedthattherecombinantproteincouldreactwiththespecificpositiveseraagainstNDPV,suggestingthattherecombinantVP3couldbeusedasdiagnosticantigen.Subsequently,thepurifiedVP3proteinwasusedasantigentocoatELISAplates,afteroptimizedtheconcentrationandconditionsofthecoatedantigen,theconditionsoftheantigen-blockingcondition,theincubationconditionoftheprimaryantibody,theIII incubationconditionandthecoloringconditionoftheenzyme-labeledsecondaryantibody,asensitiveandspecificindirectELISAmethodwassuccessfullyestablished.Thepositivethresholdwasdeterminedtobe0.35.Besides,thismethodhasgoodreproducibility.Finally,someclinicalsampleswerecollectedanddetectedwiththisELISAmethod,theresultsshowedthatthismethodcouldbeusedforepidemiologicalinvestigationofNDPVinfection.Inaword,theproliferationcharacteristicsandgeneticevolutionofNDPVwerestudiedinthisstudy.WespeculatedthatNDPVandGPVmaybefromthesameviralancestors.Besides,anindirectELISAmethodfordetectingNDPVantibodywassuccessfullyestablished.AlloftheseresultsprovideaneffectivemethodforclinicalepidemiologicalinvestigationofNDPVandvaccinedevelopment.Keywords:NovelDuckParvovirus;Proliferationcharacteristics;VP3protein;Prokaryoticexpression;IndirectELISAmethodIV 目录摘要..............................................................................................................IAbstract.....................................................................................................III目录..........................................................................................................V插图和附表清单.....................................................................................VII缩写和符号清单....................................................................................VIII文献综述.....................................................................................................1引言.............................................................................................................81材料与方法.................................................................................................................91.1材料...................................................................................................................91.1.1毒株及血清.............................................................................................91.1.2细胞及疫苗.............................................................................................91.1.3主要试剂及试剂盒.................................................................................91.1.4试验动物...............................................................................................101.1.5主要仪器设备.......................................................................................101.1.6主要溶液的配制...................................................................................101.2方法................................................................................................................121.2.1病毒的培养...........................................................................................121.2.2ELD50测定............................................................................................121.2.3动物回归试验.......................................................................................121.2.4引物的设计...........................................................................................121.2.5病毒的检测..........................................................................................131.2.6新型鸭细小病毒DS-15株VP3基因的克隆与序列分析.................131.2.7重组VP3表达质粒的构建.................................................................131.2.8重组表达质粒的鉴定..........................................................................141.2.9重组蛋白的表达分析..........................................................................141.2.10重组VP3蛋白的纯化.......................................................................151.2.11重组蛋白的Westernblot鉴定.........................................................151.2.12基于VP3蛋白间接ELISA检测方法的建立..................................161.2.13抗原包被浓度和阴/阳性血清稀释度的确定...................................161.2.14酶标二抗工作浓度的确定................................................................161.2.15包被条件的确定.................................................................................16V 1.2.16封条件的确定.....................................................................................161.2.17血清及酶标二抗孵育时间的优化.....................................................171.2.18显色时间的确定.................................................................................171.2.19阴阳性临界值的确定.........................................................................171.2.20重复性试验及敏感性试验.................................................................171.2.21样品检测.............................................................................................172结果与分析...............................................................................................................182.1新型鸭细小病毒DA15株的生物学特性....................................................182.1.1新型鸭细小病毒DA15株的培养特性...............................................182.1.2ELD50测定............................................................................................192.1.3动物回归试验结果...............................................................................192.1.4病毒的检测...........................................................................................202.1.5VP3同源性分析...................................................................................202.1.6系统发生数分析...................................................................................222.2VP3基因的克隆与表达.................................................................................222.2.1VP3重组表达载体的构建...................................................................222.2.2重组VP3蛋白的诱导表达及纯化.....................................................232.2.3Western-blot鉴定....................................................................................242.3基于VP3蛋白的间接ELISA方法的建立..................................................242.3.1抗原蛋白包被浓度及血清稀释度的确定...........................................242.3.2酶标二抗稀释度的优化......................................................................252.3.3包被条件的确定...................................................................................252.3.4封闭条件的优化...................................................................................262.3.5血清孵育时间及酶标二抗孵育时间确定...........................................262.3.6显色时间的优化...................................................................................272.3.7阴阳性临界值的确定..........................................................................272.3.8重复性及敏感性试验..........................................................................272.3.9特异性试验..........................................................................................282.3.10检测方法应用.....................................................................................293讨论....................................................................................................................314结论...................................................................................................................33参考文献...................................................................................................34作者简介...................................................................................................40在读期间发表的学术论文.......................................................................40VI 插图和附表清单图1-1细小病毒分类....................................................................................................1图1-2新型鸭细小病毒电镜图片................................................................................3图1-3NDPV全基因组示意图....................................................................................4图2-1鸭胚接毒后病变情况......................................................................................18图2-2接种NDPV后的原代EDF细胞变化（100x）...........................................18图2-3动物回归试验临床症状..................................................................................19图2-4动物试验体重变化..........................................................................................20图2-5VP3基因的PCR扩增结果............................................................................20图2-6NDPVDS-15株VP3基因系统发生树.........................................................22图2-7双酶切鉴定pGEX-4T-VP3.............................................................................23图2-8重组VP3蛋白的SDS-PAGE分析................................................................23图2-9Western-blot鉴定结果....................................................................................24图2-10免疫后抗体水平变化....................................................................................30表1-1本研究所使用的主要试剂................................................................................9表1-2实验仪器..........................................................................................................10表1-3VP3基因上、下游引物序列..........................................................................12表1-4VP3基因PCR扩增体系................................................................................13表1-5VP3基因PCR反应程序................................................................................13表1-6重组质粒双酶切反应体系..............................................................................14表1-7连接反应体系..................................................................................................14表2-1ELD50的观察结果...........................................................................................19表2-2主要参考毒株的来源及VP3基因核苷酸和氨基酸的同源性比较.............21表2-3VP3蛋白抗原包被浓度和血清稀释度的选择..............................................25表2-4酶标二抗工作浓度优化..................................................................................25表2-5VP3蛋白包被条件优化..................................................................................26表2-6封闭液的选择..................................................................................................26表2-7封闭时间的选择..............................................................................................26表2-8待检血清样品孵育时间的优化......................................................................26表2-9酶标二抗孵育时间的优化.............................................................................27表2-10显色时间的优化............................................................................................27表2-11检测60份阴性血清OD450值....................................................................27表2-12重复性试验....................................................................................................28表2-13VP3蛋白ELISA方法敏感度检测..............................................................28表2-14特异性检测结果............................................................................................29表2-15临床检测结果................................................................................................29VII 缩写和符号清单英文缩写英文全称中文名称AAV2AdenoAssociatedvirus人细小病毒Ampampicillinresistant氨苄青霉素抗性bpBasePair碱基对BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白CRFKCrandellfelinekidney猫肾细胞ddH2Odoublewater双蒸水DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸EDTArthylenediaminetetra-aceticacid乙二胺四乙酸ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验FBSFatalcalfserurn胎牛血清GPVGooseparvovirus鹅细小病毒HalaHalacell宫颈癌细胞Kbkilo-base千碱基kDaKilo-Dalton千道尔顿LBLuria-bertanimediumLB培养基MDPVMuscovyduckparvovirus番鸭细小病毒MVMMinuteofmice小鼠细小病毒minMinute分钟mLMilliliter毫升NDPVNovelduckparvovirus新型鸭细小病毒NS1Non-structuralprotein1非结构蛋白1NS2Non-structuralprotein2非结构蛋白2ntnucleotide核苷酸数ODOpticaldensity光密度ORFOpenreadingframe开放阅读框PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PVDFPolyvinylideneFluoride聚偏氟乙稀Rep1Replication1复制相关蛋白1Rep2Replication2复制相关蛋白2SPFSpecificPathogenFree无特定病原体TAETris-acetateEDTATris-乙酸电泳缓冲液TMB3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine3,3',5,5'-四甲基联苯胺UUnit单位VP1Capsidprotein1衣壳蛋白1VP2Capsidprotein2衣壳蛋白2VP3Capsidprotein3衣壳蛋白3WBWesternblot免疫印迹VIII 文献综述1.1动物细小病毒概述细小病毒是动物病毒中形态最小的病毒，相比较于其他种属其是较简单的一类单股线状无囊膜DNA病毒。动物细小病毒分类学意义如图1-1，细小病毒科病毒分为两个亚科：细小病毒亚科、浓核病毒亚科。其中有些细小病毒可以进行自我复制，而[1]有些病毒则需要有辅助病毒才能增殖，细小病毒可以在宿主细胞核内增殖。细小病毒亚科细小病毒属的成员有犬细小病毒、猪细小病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒等，[2]可以引起动物消化系统、繁殖系统等疾病。细小病毒分子的主要特性为20面体对称、无囊膜、单分子线性单股DNA。细小病毒衣壳主要由VP2及少量VP1蛋白质分子组成，VP3是主要抗原，大多细小病毒属成员的结构蛋白及非结构蛋白功能相类似[3-5]，可以根据已研究清楚的细小病毒某些结构功能推测其他细小病毒属成员的蛋白功能特性。图1-1细小病毒分类Fig.1-1Theclassificationofparvoviridae1.2水禽细小病毒水禽细小病毒是细小病毒属中感染水禽的一类细小病毒。现报道的水禽细小病毒[6]主要有引起小鹅瘟的鹅细小病毒及感染番鸭的番鸭细小病毒。鹅细小病毒又称小鹅瘟病毒，是一种引起鹅，主要是30日龄以内的雏鹅以全身[7]败血症病变和渗出性伪膜性肠炎、心肌炎为特征的一种发病率高、死亡率高的接触[8]性病毒性传染病。该病首次在我国报道于1956年，首次发现于江苏扬州。1961年首次用鹅胚分离到鹅细小病毒。鹅细小病毒是危害水禽养殖业的重大传染病，现以研[9-11]制出商品化的鹅细小弱毒疫苗，用于鹅细小病毒的预防，效果显著。番鸭细小病毒病又称“三周病”，主要感染三周以内的雏番鸭，由番鸭细小病毒引起的表现为腹泻、脚软、渗出性肠炎及呼吸困难为主要病征的一种急性传染性病毒病。此病于1980年在福建首次发生，后在我国华南、华东养鸭地区均有该病发生的报道1 [12-14]。新型鸭细小病毒是2014年起开始陆续在我国东南部养鸭地区爆发的一种新的疾病，其主要病征是感染鸭群出现短喙，舌头外漏，腿短跛行。此病死亡率不高，但感染后鸭群出现僵鸭，出栏鸭群比正常鸭群体重减轻20%，给养鸭业造成严重经济损失[15,16]。1.3新型鸭细小病毒概述自2014年来中国东南各省肉鸭养殖地区相继报道发生了一种临床表现为鸭生长发育迟缓，鸭喙萎缩舌头外露下垂，跛行瘫痪的传染病，命名为鸭短喙-侏儒综合征[15,17]（DSBDS），对发病鸭经过病原的分子生物学检测、培养分离及鉴定，病原动物回归试验可以复制出病征，由此确定造成鸭短喙侏儒综合征的病原为一种细小病毒[18,19]，暂时命名为新型鸭细小病毒。早在2008下半年，中国华南华东的半番鸭养殖区爆发了类似的疫病，黄瑜等经过病原分离鉴定和实验室检测发现其病原与经典MDPV在基因组、宿主范围和致病性方面都存在较大差距，因此将其命名为新型番[20]鸭细小病毒（NMDPV），陈少莺等认为造成半番鸭“短嘴矮小综合征”的病原为一[21]种新型鹅细小病毒或GPV变异株并暂时将其命名为半番鸭小鹅瘟病毒。肖世峰等根据造成樱桃谷鸭病征特征的特点将此病病原命名为短喙与矮小综合征鹅细小病毒[22]（SBDS-GPV），1997年在波兰的半番鸭中也有类似报道，我国台湾地区1990年[23]有该病发生流行的报道，但大陆地区在2014年前未出现此病的大面积爆发流行。该病主要发生于樱桃谷鸭及半番鸭，番鸭、绿头鸭也有报道发病。此病水平传播，发病日龄在7～40日龄不等，发病率在10%～100%之间，死亡率较小在2%-10%，病毒感染鸭群日龄越小，发病率及死亡率越高，发病鸭因短喙舌头外漏及瘫痪导致采食饮水困难而造成极度消瘦虚弱至死亡，发病鸭群出栏时体重较正常鸭群减少20%左右，给养鸭业造成一定影响及经济损失。1.3.1NDPV生物学特性NDPV生物学特性类似GPV，与GPV病毒粒子有相似的形态结构，都呈六边形[24]或圆形，在电镜下观察病毒粒子呈晶格排列，直径在20-25nm之间无囊膜如图1-2，二十面体立体对称，电镜下观察分为完整的实心病毒粒子和缺少核酸的病毒空壳两种[25]形态。2 图1-2新型鸭细小病毒电镜图片Fig.1-2TheelectronmicroscopyimageofNDPV新型鸭细小病毒为单链、线状DNA病毒，病毒全基因组长为5104nt，也有报道其全长为5006nt，因毒株不同核酸全长存在差异，报道的不同株NDPV基因组DNA差异出现在倒置末端重复序列，而编码蛋白的可读框的大小是相同的。NDPV与GPV基因组结构相似，NDPV核苷酸链的两侧存在着相同的倒置末端重复序列，大小约[26,27]为444nt，开始的407nt可以折返成形似"U”型的双链发卡区，这种基因组末端发卡结构在DNA复制的过程中起着重要的作用，被认为是病毒增殖的起点，对病毒核[28,29]酸和结构蛋白组合成病毒粒子的过程起着提供信号指引的作用，NDPV同GPV基因组DNA一样含有两个主要的开放阅读框（openreadingframe，ORF），两个主要的ORF位于同一可读框中，间隔18nt。左侧的ORF编码两种非结构蛋白（NS1、NS2）[30]其功能为调节病毒的复制与基因表达。右侧的ORF编码3种结构蛋白，分别为VP1、[31-33]VP2和VP3，其中VP2和VP3是主要的结构蛋白，VP2和VP3组成的60个亚基是构成病毒衣壳的主要结构蛋白。位于NDPV第539nt处的第一个ATG编码NS1，第1067nt处的第二个ATG起始于NS2非结构蛋白，左侧的开放阅读框终止于第2422nt处的UAA密码子。而右侧开放阅读框编码结构蛋白，编码VP1和VP3的起[34]始密码子位于2441nt处和3035nt处的ATG密码子，而起始VP2基因的起始子为不典型的ACG密码子，位于第2876nt处。三种结构蛋白的终止密码子均位于第4639nt处。编码VP1、VP2、VP3的核苷酸数分别为2199nt、1764nt和1605nt，基因长度依次为VP1＞VP2＞VP3。基因组的多聚A（ployA）信号位于右侧倒置末端重复序列前的第4655nt处。3 图1-3NDPV全基因组示意图Fig.1-3NDPVgenomediagram1.3.2结构蛋白特性NDPV基因组编码3种结构蛋白分别为VP1、VP2及VP3，VP3是NDPV主要衣壳蛋白，约占总蛋白的80%，三种蛋白质分子的大小根据核苷酸序列推测大小分别[4]约为81.3-87kDa、65kDa和60kDa，但在试验中电泳结果有时与推测结构结果不一致，其中有人推测原因可能是由于病毒蛋白翻译后的糖基化现象或者是因为结构蛋白[6]中有一个或多个是多聚体，其解聚后被误认为是一种独立的结构蛋白。对NDPV全基因组进行分析，可以得知其基因组右侧的开放阅读框有两个ATG起始密码子，分别为衣壳蛋白VP1和VP3的翻译起始位点。与AAV2衣壳蛋白起始位点相似且所测的的分子质量为72kDa，可以推测出NDPV衣壳蛋白VP2的翻译起始位点为第2876nt[35-37]处的不典型起始密码子ACG，由此推导的的VP1、VP2和VP3分别由723、587、534个氨基酸残基组成，三者具有相同的羧基末端，只是VP1的氨基末端比VP2多145个氨基酸残基，比VP3多了198个氨基酸残基，NDPV的三种结构蛋白功能尚不[26,38]明确，可以依据其他细小病毒结构蛋白功能进行推测。NDPV的VP1结构蛋白是病毒复制和包装所必须的，缺少VP1的病毒突变体的克隆转染敏感细胞后，仍可复制DNA产生子代病毒粒子，但是丧失了对细胞的感染[30,34]性，不能产生有感染性的病毒粒子，由此可以推测VP1蛋白是病毒侵袭细胞产生感染效应的重要结构蛋白，与病毒感染相关的氨基酸序列推测是位于N端的磷脂酶功能序列。VP1结构蛋白的氨基酸序列的氨基末端可能存在定位信号，参与病毒在宿主细胞中细胞核的定位，VP1蛋白的独特区不暴露于病毒粒子表面，但当病毒侵入[29]细胞并进入细胞核后，会因为环境因素而暴露其独特区。NDPV结构蛋白VP2是病毒的主要衣壳蛋白，可以刺激机体产生中和抗体，当缺少VP1的时候VP2蛋白可以参与病毒遗传物质的包装，VP2蛋白与VP1蛋白协同作用使NDPV病毒颗粒具有感染性，VP2蛋白可以自我组装形成病毒样颗粒[39]（virus-likeparticles，VLPs）且具有良好的免疫原性，因此根据此特性有基于鹅细小病毒VP2蛋白的疫苗研究以及用VP2蛋白运用血清学方法建立的各种临床检测方[40,41]法。4 VP3蛋白相比较VP2蛋白在N端缺少了53个氨基酸，Zadori等对鹅细小病毒的氨基酸序列进行分析，发现暴露于衣壳表面的氨基酸残基序列均出现在VP3内，表明VP3内含有病毒的主要抗原决定簇，是病毒的主要衣壳蛋白，VP3是NDPV的主[42]要保护性抗原，能诱导机体产生具有中和作用的抗体。VP3蛋白在NDPV的防治[43]免疫及诊断中具有很高的研究价值。在鹅细小病毒的单克隆抗体中，均可以与VP3蛋白的多肽链反应，说明VP3是病毒的免疫保护性抗原，可以刺激机体产生中和抗[43,44]体，这两种结构蛋白含有相同的抗原决定簇。1.3.3非结构蛋白特性NDPV基因组左侧开放阅读框至少编码两种非结构蛋白，即Rep1、Rep2，都参与病毒基因表达的调节，根据新型鸭细小病毒与GPV的相似性可以推测病毒非结构蛋白有2个翻译起始位点，第一个ATG位于539nt处，起始NS1的翻译，第二个ATG位于第1067处，起始Rep2的翻译，两个非结构蛋白终止于同一位点2422nt处。根[45]据氨基酸序列推测NS1的分子质量大小为69kDa，其氨基酸序列、功能结构域与[46,AAV的非结构蛋白Rep78相似。MVM病毒的NS1非结构蛋白具有细胞毒性作用47][45]，野生型毒株NS1蛋白具有明显的延缓细胞生长并杀伤细胞的作用，点突变NS1基因后的蛋白产物的细胞毒性显著减低，推测NDPV的NS1蛋白可能也与病毒对细胞的杀伤作用有关。根据MVM的NS1蛋白功能推测NDPV的Rep1可以以共价键[48,49]的形式与复制性DNA5’端ATPase位点的保守序列GPTTGKE结合，参与病毒DNA的复制，在病毒DNA复制早期起到重要作用。NS1蛋白与病毒DNA复制起始序列结合，抑制宿主细胞的DNA复制，对病毒衣壳蛋白表达起到正调节作用。1.3.3新型鸭细小病毒理化性质新型鸭细小病毒的理化性质与鹅细小病毒相似，对外界因素具有较强的抵抗力，新型鸭细小病毒在56℃加热1h，依旧具有感染性，病毒对乙醚、氯仿、胰蛋白酶、去污剂及pH3的酸性均有抵抗力，病毒对紫外线敏感。1.3.4病毒培养特性新型鸭细小病毒的分离可用樱桃谷鸭鸭胚，鹅胚及番鸭胚均不能使病毒增殖，病毒初次分离时，将病料悬液接种于11-13日龄的鸭胚尿囊腔中，培养8天无鸭胚死亡，连续在樱桃谷鸭胚上传3代后，鸭胚开始出现死亡，死亡时间在接毒后的4-7天，病毒适应鸭胚并引起部分死亡，随着传代次数增加，可引起60%鸭胚死亡，死亡鸭胚绒毛尿囊膜增厚，胚体皮肤心脏肝脏有出血，尿囊液粘稠。随着传代次数的增加，病毒对鸭胚的致死时间稳定在接种后的5-6天。病毒可在原代鸭胚成纤维细胞上增殖，不能形成明显的细胞病变。病毒接种鸡胚成纤维细胞、CRFK细胞、Hela细胞、Vero[17,50,51]细胞上均不能增殖。5 1.3.5流行情况早在2008年下半年，福建漳州、三明等地部分鸭场及台湾白鸭都出现软脚、低病死率，鸭群在40日龄左右出现翅脚易断，上喙变短近30%，出栏时残次鸭有将近60%。在2014年下半年报道，发病地点主要集中在商品代樱桃谷肉鸭养殖比较密集的安徽、江苏、山东等水禽养殖地，在广东、福建、浙江等部分地区的免疫接种了番[16,52,53]鸭细小病毒弱毒苗的番鸭群依然发生此病。该病主要发生于樱桃谷鸭、半番鸭，但番鸭、绿头鸭也有发病。该病水平传播，也可垂直传播，发病日龄在7～40日龄，发病率在5%～20%之间，严重者达40%左右，感染病毒鸭日龄越小，发病率越高，发病鸭因短喙舌头外漏及瘫痪导致采食饮水困难而造成极度消瘦虚弱死亡，发病鸭群[54]出栏时体重较正常鸭群减少20%左右。1.3.6临床症状感染新型鸭细小病毒的樱桃谷鸭鸭群大部分采食饮水基本正常，在雏鸭一周左右时观察可见有部分鸭精神不佳，不愿行走，两周后出现生长明显较慢发育迟缓矮小跛行瘫痪的现象，鸭群大小不一，体型明显偏小，全身骨质疏松，翅膀易折断。感染病毒鸭逐渐出现上下喙变短变钝圆，舌头外漏僵硬的“大舌病”典型症状，病鸭精神沉郁，进食困难造成消瘦，严重的死亡，患病鸭腿部无力，腿短出现跛行，站立不稳，蹲伏，翅膀下垂，有的临死前出现角弓反张。剖检死亡的樱桃谷鸭可见鸭胫骨短而易折断，[20]肠粘膜有出血。免疫接种了雏番鸭细小病毒弱活苗的10-30日龄雏番鸭，感染新型[55]鸭细小病毒后依然发生此病，发病率30%-65%，发病雏番鸭张口呼吸，软脚、腹泻，拉白色或绿色稀便，瘫卧，病死雏番鸭胰腺局灶性出血或白色坏死点、十二指肠粘膜出血，耐过鸭生长迟缓，发育受阻，体重比正常鸭轻，上喙钝圆变短多达53%，[56]高达83%的鸭愈后不良，成为僵鸭。1.3.7水禽细小病毒检测技术水禽细小病毒中有关GPV的常用诊断检测法有包括PCR、病毒分离、琼脂扩散试验、间接ELISA、免疫荧光试验等。对于临床血清学检测方法中，有基于VP2或VP3蛋白建立的检测鹅血清GPV抗体水平的间接ELISA方法以及全病毒包被建立的[57,58]间接ELISA方法。也有用VP2或VP3蛋白制备的单抗而建立的检测鹅血清中抗[59]原含量的夹心ELISA方法。这些方法可以用于鹅群抗体水平及GPV感染情况。而对于番鸭细小病毒的检测同样是包括实验室的分子检测技术以及血清学检测技术，MDPV的血清学检测中的ELISA方法建立多少基于番鸭细小病毒的结构蛋白[14]VP3，建立的ELISA方法可以检测番鸭血清中MDPV抗体的水平，以及对MDPV的流行病学调查，对于新型鸭细小病毒目前没有可用的检测方法。1.3.8防制此病首次在大陆报道，对于此病的防制有以下方式，对种鸭场加强检疫净化，对6 孵化室孵化设备及育雏舍进行消毒，严格管理，防治病毒入侵，养殖场进行全进全出的饲养模式，出栏后彻底清理，冲洗棚舍，消毒环境，以2%的火碱喷洒养殖器具，紫外线照射消毒，做好饲养管理及消毒防控工作。有报道称小鹅瘟疫苗可预防该病的发生，种鸭在45日龄及80-90日龄时接种小鹅瘟弱毒疫苗，雏鸭1日龄时接种小鹅[60]瘟弱毒苗，一周后再次免疫一次（刁有祥）。对于已经发生短喙侏儒综合征的鸭，尚无有效针对该病的预防和治疗措施，有部分鸭场采用组织灭活苗预防由一定的预防[61]效果，在饲养管理中可在饲料中适当增加钙、磷、维生素等促进鸭骨骼发育生长，以降低鸭群出现骨质疏松及侏儒的的比率。研究表明，在感染NDPV初期注射NDPV高免血清可有效降低发病率，鸭源抗NDPV卵黄囊抗体对NDPV的感染具有显著的[60,62]预防和治疗效果。7 引言“鸭大舌病”是自2014年下半年来发生在我国东南各省肉鸭养殖地区的一种临床表现为鸭生长发育迟缓，鸭喙萎缩舌头外露下垂，跛行瘫痪的传染病，命名为鸭短喙-侏儒综合征，对发病鸭经过病原的分子生物学检测、培养分离及鉴定，病原动物回归试验可以复制出病征，由此确定造成鸭短喙侏儒综合征的病原为一种细小病毒，暂时命名为新型鸭细小病毒通过对发病鸭的初步分析，PCR检测常见的水禽病毒，结果显示鹅细小病毒阳性，实验室在发病鸭组织病料中分离得到一种细小病毒（NDPV-DS-15株），对分离的病毒通过测序，对序列分析认为此株病毒与GPV亲缘关系最近，极有可能是由GPV变异而来。目前对该新型鸭细小病毒的生物学特性暂时不清楚，实验室在安徽某养鸭场分离到一株新型亚细小病毒，命名为NDPVDS-15株，对该病毒株的培养特性进行了研究，在对此株病毒培养过程中发现其余小鹅瘟病毒的培养增殖特性不同，新型鸭细小病毒DS-15株不能在鹅胚中培养增殖，只能在鸭胚中增殖，且可以使鸭胚产生病变并造成鸭胚死亡。在水禽细小病毒基因组中VP3基因是关系着病毒抗原性的重要结构蛋白，VP3蛋白是病毒的重要保护性抗原，在研究病毒的致病性及病毒毒株的进化分析中有着重要参考价值，同时也是作为病毒诊断抗原用来检测病毒的重要抗原蛋白，在小鹅瘟病毒及番鸭细小病毒的诊断中VP3蛋白被多次用于制备单克隆抗体用以检测病毒抗原，也多次被用来建立间接ELISA方法检测血清抗体水平，用于病毒的流行病学[40,57,63]调查等。对VP3结构的研究将有利于我们对新型鸭细小病毒临床诊断及疫苗研究的进展，同时对VP3基因的研究将对鹅细小变异特征研究提供有利依据，本研究对新型鸭细小病毒DS-15株VP3基因进行序列分析，并于其他的水禽细小病毒VP3基因序列比对，进行系统发生学分析，发现此株新型亚细小病毒与山东分离的一株鸭细小病毒同源性为100%，与鹅细小病毒属于同一支，推测其可能与鹅细小病毒由同一病毒进化[41]而来。间接ELISA方法是临床上检测病毒抗体及机体感染的最简单便捷准确的方法，对不同病毒的不同宿主建立间接ELISA方法可以直接检测机体血清中抗体含量的变化，为新型鸭细小病毒疫苗的研究提供支持，虽然其可能与鹅细小病毒存在交叉抗原反应，但在临床上还未有出现过检测鸭血清中鹅细小病毒抗体水平的试剂盒及报道出现，因此本研究既可以对NDPV感染后鸭血清抗体含量的检测，对NDPV疫苗的研制提供参考依据，同时可以运用于鹅细小感染鸭群后的血清学检测。8 1材料与方法1.1材料1.1.1毒株及血清NDPV-DS-15株由中国农业科学院上海兽医研究所采集鉴定及保存，NDPV阴性血清、阳性血清、呼肠弧病毒阳性血清、鹅细小病毒阳性血清、禽流感病毒阳性血清、新城疫病毒阳性血清、番鸭细小病毒阳性血清、鸭疫里默氏杆菌阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、鸭坦布苏病毒阳性血清、鸭瘟病毒阳性血清均由中国农业科学院上海兽医研究所小动物传染病创新团队制备保存。1.1.2细胞及疫苗DEF原代细胞由本实验室制作保存，小鹅瘟疫苗（SYG26-35株，生产批号：（2006）101042113）购自国药集团扬州威克生物工程有限公司。1.1.3主要试剂及试剂盒实验中所用到的主要试剂见表1-1。表1-1本研究所使用的主要试剂Tab.1-1Listoftheregents试剂名称制造商DNAMarker(DL2000)Takara公司pMD-19TTakara公司pGEX-4T-1，Takara公司DNA提取试剂盒OMEGA公司质粒提取试剂盒Axygen公司DNA凝胶回收试剂盒Axygen公司pET-SUMO蛋白表达试剂盒Invitrogen公司TransBL21，Transetta(DE3)北京全式金生物技术有限公司ExTaqMasteMixTakara公司T4DNA连接酶宝生物工程（大连）有限公司BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶宝生物工程（大连）有限公司Trans5α感受态细胞北京全式金生物技术有限公司大肠杆菌DH5α感受态细胞天根生化科技（北京）有限公司ECL显色液赛默飞世尔科技（中国）有限公司辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG二抗KPL公司TMB显色液碧云天公司CorningCostar96孔单条可拆酶标板康宁公司DAB显色液BOSTER公司9 1.1.4试验动物SPF鸭胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心；SPF鸡胚购自北京梅里亚实验动物技术有限公司。1.1.5主要仪器设备表1-2实验仪器Tab.1-2Listoftheinstrumentandequipment仪器名称品牌或制造商-80℃超低温冰箱ThermoScientificMM-1型微型振荡器江苏泰县医疗器械厂旋涡混匀器美国Scilogex公司YC-300L型4℃冰箱中科美菱低温科技公司酶标仪ThermoScientific电子天平Sartorius公司高压灭菌器Zealway公司净化工作台5W-CJ-IF型苏州净化设备有限公司LabconcoPurifier生物安全柜美国labconco公司-20℃低温冰箱日本三洋有限公司PCR仪PTC-100型BIO-RAD公司GSG2000凝胶成像分析系统珠海黑马医学仪器有限公司M-309169型台式低温高速离心德国Eppendorf公司漩涡混合仪WH-2型上海沪西分析仪器厂电热干式恒温器BG25型杭州朗基科学仪器有限公司恒压恒流电泳仪P25型德国BIOMETRA公司磁力搅拌器上海梅颖浦仪器制造有限公司核酸电泳仪德国BIOMETRA公司蛋白电泳仪BIO-RAD公司半干蛋白转移电泳仪BIO-RAD公司超声波破碎机上海净信事业发展有限公司Tanon-5200全自动化学发光图像分析系统上海天能科技有限公司Tanon2500R全自动数码凝胶成像分析系统上海天能科技有限公司1.1.6主要溶液的配制1.基因克隆、表达相关试剂50×TAE（Tris-乙酸）核酸电泳缓冲液贮存液（pH8.5）：称取Tris242g、Na2EDTA·2H2O37.2g溶于800mL去离子水中，充分搅拌溶解，后加入57.1mL冰乙10 酸充分搅拌，最后加去离子水定容到1L，调节pH至8.5，室温保存备用。1%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖加入到100mL1×TAE中，在微波炉中加热煮沸，后加入4SRedPlusNucleicAcid5μL。100mg/mL氨苄青霉素：称取氨苄青霉素1g溶于10mL去离子水中，过滤除菌后分装备用，贮存在-20℃。LB液体培养基（pH7.0）的配制：称取胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、NaCl10.0g，加800mL去离子水，搅拌溶解后定容，调节PH值，高压灭菌。LB固体培养基（含Amp抗生素）：LB液体培养基中加入20g琼脂粉后调定酸碱度，灭菌待温度冷却到45~55℃时，加入氨苄青霉素使其终浓度为100µg/mL的，充分混匀，倒灭菌后的平板，待凝固后放入4℃冰箱保存备用。磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：准确称量NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58g、KH2PO40.27g，置于烧杯中，加入适量双蒸水，搅拌至试剂全部溶解后定容至1L，调节pH至7.4，121℃高压灭菌30min，室温保存备用。PBST缓冲液的配制：1LPBS溶液中加入0.5mLTween20，溶解混匀后，室温保存备用。10×SDS-PAGE电泳缓冲溶液：称取Tris30.2g、Gly188g、SDS10g，加入去离子水溶解，最后定容至1L，室温保存备用。10%过硫酸铵（AP）：称取过硫酸铵1.0g溶解于10mL去离子水中，分装为1mL后放-30℃冰箱保存备用。考马斯亮蓝染色液：将1g考马斯亮蓝R-250、250mL异丙醇、100mL乙酸加到650mL去离子水充分中搅拌混匀溶解后加，滤纸过滤，室温保存备用。脱色液的配制：850mL去离子水中加入100mL乙酸及乙醇50mL，搅拌均匀，室温保存备用。2.Westernblot及蛋白纯化相关试剂：10×转膜缓冲液：称取Tris3.03g、Gly14.4g加入去离子水定容至800mL，充分搅拌均匀后加入200mL的甲醇，4℃保存（现配现用）。包涵体纯化洗液Ⅰ的配制：称取尿素120g、NaCl2.92g、EDTA0.05g、Triton100mL加800mLPBS溶液充分溶解混匀，后定容至1L，室温保存备用。包涵体纯化洗液Ⅱ的配制：称取尿素120g、Triton1001mL，PBS溶液溶解混匀，定容至1L，室温保存备用。8M尿素溶液：尿素480g、NaCl29.25g、Na2HPO4-2H2O7.16g、NaH2PO43.12g加800mL去离子水充分溶解混匀后调节PH到7.4，定容至1L，室温保存备用。5%脱脂乳封闭液：脱脂奶粉5g，加100mLPBST溶液充分溶解混匀，4℃保存备用。11 3.ELISA相关溶液配制ELISA包被缓冲液(0.05mol/LpH9.6碳酸盐包被液)：1.59gNa2CO3、2.93gNaHCO3，溶于1L蒸馏水，调节pH至9.6。ELISA显色终止液(2mol/LH2SO4)：量取178.3mL双蒸水，缓缓加入98％浓硫酸21.7mL。1.2方法1.2.1病毒的培养（1）胚体培养：将处理后的病料分别接种10日龄SPF鸭胚，每个0.2mL；接种9日龄SPF鸡胚，每枚0.1mL，以及10日龄鹅胚，每枚0.2mL。放入孵胚箱孵化，弃去24h内死亡的胚，逐日观察并记录胚体死亡情况，收集24~120h死亡胚体的尿囊液，盲传3代后，对F4代收集的各胚尿囊液提取DNA并进行PCR检测。（2）细胞培养：将处理后的病料分别接种到DF1细胞、原代CEF细胞、原代DEF细胞、CRFK细胞、Hela细胞、Vero细胞、BHK细胞。盲传三代后，收集F4代的细胞培养物，提取DNA，检测NDPV病毒。1.2.2ELD50测定以第5代鸭胚毒测定ELD50，将F5代胚毒按10倍比稀释至10-8，每个稀释度分别接种鸭胚8个，每个0.2mL。弃去24h内死亡的鸭胚，逐日观察至144h记录死亡情况，计算病毒ELD50。1.2.3动物回归试验NDPVDS-15株经SPF鸭胚增殖传代至F2代的病毒，肌肉注射2日龄雏鸭5只，每只0.5mL，对照组肌注未接毒的SPF鸭胚尿囊液，笼养连续观察30d，记录生长状况。1.2.4引物的设计参照GenBank上登录的鸭细小病毒DS-15株的全基因组序列（登录号为No.KT384726），利用Primer5.0软件设计特异性引物以扩增VP3基因片段，上下游引物分别引入酶切位点。引物序列如下，引物由上海Invitrogen公司合成。按照引物说明书用TEbuffer稀释到工作浓度10pmol/µL，-20℃保存备用。表1-3VP3基因上、下游引物序列Tab.1-3TheupstreamanddownstreamprimersequencesofVP3gene引物引物序列内切酶扩增长度VP3上游P15’-CGCGGATCCATGGCAGAGGGAGGAGG-3BamHⅠ1620bpVP3下游P25’-CCGCTCGAGCAGATTTTGAGTTAGATATCTGG-3’XhoⅠ12 1.2.5病毒的检测利用DNA提取试剂盒提取DS-15株的总DNA，以此为模版扩增VP3基因,扩增体系及扩增程序如下表，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0试剂盒进行胶回收纯化，具体步骤如下：（1）在紫外灯照射下将目的DNA切出；切胶时要尽快将DNA切下，防止DNA损伤；（2）将胶块切碎，可以加快胶块溶解时间提高目的DNA的回收效率；（3）将胶块放入EP管中，后按照DNA纯化试剂盒说明书进行操作表1-4VP3基因PCR扩增体系Tab.1-4PCRamplificationsystemofVP3genePCR扩增体系LATaqVersion2.0plusdye25μL模版DNA2μL上游引物1μL下游引物1μLddH2O21μL表1-5VP3基因PCR反应程序Tab.1-5PCRamplificationperformofVP3gene预变性95℃5min94℃45s循环52℃50s30Cycles72℃90s延伸72℃10min1.2.6新型鸭细小病毒DS-15株VP3基因的克隆与序列分析将回收的VP3基因目的片段，0.5μLpMD19-Tsimple载体及5μL连接酶SolutionⅠ混匀，使目的片段VP3与pMD19-Tsimple载体的物质的量比为8:1，加ddH2O补足至10μL，16℃连接过夜。转化：取连接产物5μL加入50μLDH5α感受态细胞中，冰上孵育30min，后42℃热激45s，立即冰上放置2min，加入500μL无抗性的LB液体培养基，置于220r/min的37℃摇床上1h。后涂布培养于含Amp的LB固体培养基，置于37℃恒温培养箱，12h-16h时挑取单克隆菌落。菌液PCR鉴定上述挑选的单克隆菌，选取菌液PCR鉴定阳性的菌株由生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序，正确的质粒命名为pMD19T-VP3将测序结果与选取的标准株序列进行分析。1.2.7重组VP3表达质粒的构建按照Axygen公司质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒pMD19T-VP3及空载体13 质粒pGEX-4T-1，然后分别用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，反应体系如下表1-6，酶切后的产物经电泳后，凝胶成像观察，按照目的条带大小分别切割目的片段的凝胶，并对目的片段纯化回收，将回收的目的片段VP3及表达载体pGEX-4T-1片段分别测浓度，使连接体系中目的片段与表达载体的物质的量比为6:1，连接体系如下表1-7，连接按照连接酶说明书进行。连接产物转化到DH5α感受态细胞中，方法参照1.2.6，置于37℃培养箱12h左右后挑取单克隆菌落。表1-6重组质粒双酶切反应体系Tab.1-6DoubledigestionoftherecombinantplasmidwithBamHⅠandXhoⅠ试剂BamHⅠ和XhoⅠ双酶切10×Hbuffer2μL质粒12μLBamHⅠ1μLXhoⅠ1μLddH2OUpto20μL酶切条件：37°C水浴酶切2h后加入10×Loadingbuffer终止反应。表1-7连接反应体系Tab.1-7Thesystemofligationreaction试剂计量目的基因6表达载体pGEX-4T-11SolutionⅠ10μLddH2OUpto20μL反应体系置于250μLEP管中，混合均匀，16℃过夜。1.2.8重组表达质粒的鉴定挑取VP3转化平板上生长的单菌落，接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，菌液经PCR鉴定及双酶切鉴定后，将鉴定阳性的单克隆菌株委托生工生物工程（上海）有限公司测序，测序正确的质粒命名为pGEX-VP3。1.2.9重组蛋白的表达分析将鉴定正确的重组质粒pGEX-VP3及空载体pGEX-4T-1分别转化至感受态细胞BL21中转化方法同“1.2.6”，对转化到表达菌中的pGEX-VP3菌株进行PCR鉴定，筛选阳性克隆菌株。将VP3重组表达菌及空载体质粒菌液按照1:100转接10mL含Amp的LB液体培养基中。37℃振荡培养2-3h至OD600在0.4-0.6之间。取5mL菌液加入IPTG至终浓度约为1mmol/L，37℃振荡培养诱导5h。取诱导后的菌液及未诱导的菌液分别2mL，14 10000r/min离心10min，弃上清。菌体中分别加入500μLPBS，冻融2次后，冰上放置超声波破碎1min，超声条件为工作5s，间隔5s，至菌液变的通透清亮，将超声后的液体经12000r/min离心10min，分别收集上清及沉淀，沉淀用50μL8M尿素溶解。取上清和溶解后的沉淀各40μL，加10μL5×SDS上样缓冲液，100℃电热浴10min注意防止蒸干。后5000r/min离心5min取上清，经SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况及可溶性。若目的条带出现在上清，则为可溶性蛋白，若在沉淀中出现，则蛋白以包涵体形式存在。1.2.10重组VP3蛋白的纯化将VP3表达菌转接到含有100μg/mLAmp的LB液体培养基中，扩大培养，37℃振荡培养2-3h，至菌液达到对数生长期（检测菌液OD600值在0.4-0.6之间）。加入诱导剂，37℃诱导表达5h，10000r/min离心收集菌体。菌体用PBS重悬后离心弃去上清进行洗涤2次，后收集菌体加入30mL20mMTris-Cl（pH8.0）悬浮菌体，反复冻融3次后加入溶菌酶，置于37℃摇床上反应30min。超声波破碎菌体至菌体变的清亮，将破碎后的菌液10000r/min离心20min。VP3重组蛋白以包涵体形式存在，弃去离心后的上清，将沉淀用洗涤液I洗涤两次，4℃低温离心防止蛋白被溶解后洗去，12000r/min离心10min。收集沉淀用包涵体洗涤液II再次洗涤两次，方法同上。所得沉淀加入6mL8M尿素置于4℃冰箱过夜充分溶解后10000r/min离心5min，得到上清为粗纯化后的重组蛋白。将溶液置于透析袋中梯度透析复性。依次将透析袋放入6M、4M、2M、1M、0.5M的尿素溶液中，放于4℃水浴中置于磁力搅拌器上透析，每个浓度梯度透析的时间为2-4h，最后放入PBS中过夜透析，得到纯化复性后的重组VP2蛋白。1.2.11重组蛋白的Westernblot鉴定Westernblot方法对鉴定重组蛋白，一抗为抗新型鸭细小病毒多克隆抗体，二抗为HRP标记的山羊抗鸭IgG，具体操作步骤如下：（1）将纯化的后的蛋白VP2和VP3处理后分别经过SDS-PAGE电泳，（2）将含有目的条带的胶切下，并剪下胶同样大小的PVDF膜以及转膜用滤纸，分别置于转膜缓冲液中。（3）根据半干法转膜方法，从下往上依次放用滤纸、PVDF膜、胶、滤纸，15V电压转膜30min。（4）封闭：取转印后的膜放入5%脱脂乳中4℃封闭过夜。（5）一抗孵育：用封闭液按照1:200的比例稀释一抗，37℃孵育2h，弃去一抗PBST洗膜3次，每次15min。（6）二抗孵育：按照HRP标记的羊抗鸭IgG说明书，用PBS按照1:500稀释二抗，37℃孵育1h，弃去二抗，PBST洗涤。15 （7）ECL显色：按照ECL显色液说明书，分别加A液1mL，B液1mL，显色约1min后置于全自动化学发光图像分析仪中观察。1.2.12基于VP3蛋白间接ELISA检测方法的建立间接ELISA操作步骤如下：（1）包被：将抗原蛋白用碳酸盐包被液稀释后包被酶标版，每孔200µL，用封板膜封板后放37℃温育1h后4℃孵育过夜。（2）洗涤：小心揭去封板膜。甩去液体，加PBST震荡洗涤5min甩去，如此重复5次，拍干。（3）封闭：每孔加200µL封闭液，37℃封闭2h，甩去液体，洗涤同步骤（2）。（4）待测样品孵育：加入稀释后的待检血清，每孔100µL，37℃孵育30min，甩去液体，洗涤同步骤（2）。（5）酶标二抗孵育：按照工作浓度稀释二抗，每孔加入100µL，37℃孵育30min，甩去液体，洗涤同步骤（2）。（6）显色：每孔加入TMB显色液100µL，避光室温反应10min。（7）终止：每孔加2MH2SO4终止液100µL。（8）测定：测定每孔的OD450值。1.2.13抗原包被浓度和阴/阳性血清稀释度的确定采用棋盘法，将纯化的重组VP3蛋白以碳酸盐包被液稀释，加入酶标版中每孔100µL，每个稀释度包被横向12个重复，封闭稳定。加入稀释后的NDPV阴阳性血清，每个稀释度纵向8个重复，孵育并洗涤后加入HRP标记羊抗鸭IgG，按照说明书1:500倍稀释，参照“1.2.12”进行间接ELISA检测，得到数据并分析P/N值，选择最优的抗原稀释度及最佳血清稀释度。1.2.14酶标二抗工作浓度的确定将重组VP3蛋白以最佳抗原包被浓度包被酶标板，以NDPV阴阳性血清的最佳稀释度稀释作为一抗，将酶标二抗以不同浓度稀释，进行间接ELISA检测，读数计算P/N值，以最大P/N值的稀释度作为酶标二抗的最佳工作浓度。1.2.15包被条件的确定按照最佳抗原稀释度包被酶标板，37℃包被2h、37℃1h4℃过夜、37℃2h4℃过夜、4℃过夜这四种条件包被，以最佳血清稀释度设置3个重复的阴阳性血清对照，以最佳酶标二抗稀释度孵育二抗，以“1.2.12”操作进行间接ELISA检测，计算P/N值，选择最大的P/N值的条件作为最佳包被条件。1.2.16封条件的确定用确定最佳包被条件的方法，用以下方法封闭抗原：5%脱脂乳、10%胎牛血清、5%BSA、5%明胶，封闭重复3个孔，以最佳血清稀释度及最佳酶标二抗工作浓度操16 作，最后测定OD值，以P/N值最大的封闭液最为最佳封闭液。依照最佳封闭液确定最佳封闭条件，分别设置37℃1h、37℃2h、4℃过夜三个封闭时间，进行最佳封闭条件的确定。1.2.17血清及酶标二抗孵育时间的优化以最佳抗原包被条件、最佳封闭条件以及最佳血清稀释浓度和最佳酶标二抗工作浓度进行操作，分别设置37℃孵育30min、60min、120min三个时间，设置3个重复，进而确定最佳阴阳性血清及酶标二抗的孵育时间。1.2.18显色时间的确定分别以最佳条件操作后设置显色时间为5min、10min、15min、30min，室温避光显色，每个时间设置阴阳性血清对照3个重复，最后测定OD值，以P/N值最大且P值≥1的显色时间确定为最佳底物作用时间。1.2.19阴阳性临界值的确定按照优化的最佳条件进行的ELISA操作，检测60份阴性血清，计算阴阳性临界值：cut-off值=均值+3×方差，即为阳性阈值。1.2.20重复性试验及敏感性试验分别对5份待检血清进行批内及批间重复，每个样品重复3次，测定其OD值，检测批内及批间的变异系数，分析所建立的间接ELISA方法的重复性。取6份阳性血清，从1:200开始进行倍比稀释，分别检测不同稀释度，以检出阳性最大的稀释度作为其敏感度。1.2.21样品检测根据不同时间点分别采集免疫NDPV灭活苗后鸭的血清，用所建立的间接ELISA方法对血清抗体含量进行的检测，初步评价免疫NDPV灭活疫苗后的抗体水平变化情况。并对临床采集的鸭血清进行检测，检测结果也与实验室PCR检测阳性率进行比较，并区分GPV疫苗株以及NDPV感染，对建立的ELISA方法进行评价。17 2结果与分析2.1新型鸭细小病毒DA15株的生物学特性2.1.1新型鸭细小病毒DA15株的培养特性将处理的病料接种鸭胚后，盲传至第4代，鸭胚开始出现死亡，死亡时间集中在96~120h，鸭胚病死率在50%~60%之间。病死鸭胚全身出血和肿胀，发育受阻，如图2-1。病毒接种鸡胚后不能使鸡胚致死，盲传3代后检测，不能检测到NDPV。NDPV同样不能致死鹅胚，盲传3代后未能检测到病毒，表明NDPV不能在鸡胚和鹅胚上增殖。将处理后的病料接种细胞后，盲传3代，检测病毒，只能在原代DEF细胞中检测到病毒，其他细胞均未检测到NDPV，病毒可以在原代DEF细胞中增殖，但未能观察到细胞病变，连续培养至第10代，依旧不能产生明显的细胞病变，如图2-2。AB图2-1鸭胚接毒后病变情况Fig.2-1PathologyofduckembryoafterinfectedNDPVDS-15strainA96小时死亡的鸭胚B正常对照鸭胚A.duckembryoafter96hoursinfectedDNPV-DS-15strain.B.controlAB图2-2接种NDPV后的原代EDF细胞变化（100x）Fig.2-2ChangesofprimaryDEFcellafterinfectionNDPVA.48h正常细胞；B.接种NDPV后48h细胞变化ControlprimaryDEFcellB.PrimaryDEFcellinfectedNDPVafter48hours.18 2.1.2ELD50测定不同稀释度的病毒接种鸭胚后记录死亡情况，计算各稀释度死亡胚的百分率如表-5.662-1。按照Reed-Muench法计算病毒的ELD50为10/0.2mL。表2-1ELD50的观察结果Tab.2-1ResultoftheELD50test观察结果累计结果死亡数未死亡数死亡率%死亡数未死亡数死亡率%80100330100801002501007187.517194.4627510376.93437.54736.41712.51146.70800220-5.66距离比例=0.66，logELD50=-5+0.66×（-1）=-5.66。ELD50=10/0.2mL。2.1.3动物回归试验结果动物回归试验结果显示，攻毒组鸭生长缓慢且发育受阻，体重和体型明显轻和小于对照组鸭，出喙外，如图2-3、2-4。图2-3动物回归试验临床症状Fig.2-3TheclinicalmanifestationsofNDPVinfectioninduckA.攻毒组鸭发育受阻鸭喙变短B.攻毒组鸭喙短且舌头外漏A.ComparisonoftheinfectedNDPVDS-15strainduckandthecontrolgroup.B.Thediseaseoftestgroup.19 图2-4动物试验体重变化Fig.2-4Theweightchangeresultoftheanimaltest2.1.4病毒的检测新型鸭细小病毒DS-15株VP3基因PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在1605bp处出现特异性的目的条带，与预期的片段大小相同，如图2-5。8000bp5000bp3000bp1605bp750bp500bp250bp100bp图2-5VP3基因的PCR扩增结果Fig.2-5VP3genePCRamplificationresultsM:DNA分子质量标准；1：GPVVP3基因扩增结果；2：NDPVVP3扩增结果；3：阴性对照M:DNAMarker;1:ThePCRamplificationofVP3geneofGPV;2:ThePCRamplificationofVP3geneofNDPV;3:Negativecontrol2.1.5VP3同源性分析测序结果用DNAStar软件整理后进行比对，结果显示NDPV-DS-15株的VP3基因大小为1605bp，编码534个氨基酸，与GenBank上公布的部分水禽细小病毒的相20 应片段序列进行同源性比较，结果显示，DS-15株与其它新型鸭细小病毒分离株的VP3基因核苷酸序列同源性高达99.9%，与GPV核苷酸同源性为91.4%~98.4%，而与MDPV核苷酸同源性为81.4%~91.5%。VP3基因编码的氨基酸序列比对显示，NDPV-DS-15与GPV氨基酸同源性为96.6%~98.1%，与MDPV氨基酸同源性为91%~97%，如表2-2。表2-2主要参考毒株的来源及VP3基因核苷酸和氨基酸的同源性比较Tab.2-2ListofreferencestrainsandcomparisononhomologyofthenucleotidesequencesanddeducedaminoacidsequencesofVP3gene.编号名称登录号来源日期核苷酸同源性氨基酸同源性StrainsNameAccessionnumberCountryofCollectionnucleotideaminoacidisolationdatesequences（%）sequences（%）1GPVAY506547Heilongjiang200393.297.22GPVEU088102Guangzhou201696.198.13GPVHQ891825Fujian201193.096.64GPVEF515837Chongqing200791.496.85GPVDQ175657.1Taiwan200596.897.46GPVEF661584Hebei200794.897.97GPVEU583389Taiwan200898.497.98GPVFJ240170Heilongjiang200895.297.99GPVGQ392034Heilongjiang200994.997.810GPVKC996729Vaccinestrain201493.297.211GPVKY475562Chongqing201795.397.912MDPVAY382890Taiwan200381.491.213MDPVZ68272France199581.791.614MDPVAY510603Guangzhou200381.791.415MDPVKT865605Vaccinestrain201581.591.016MDPVKU844281Fujian201681.691.217MDPVKX000918Jiangsu201681.691.218MDPVJF926697Fujian201181.691.219MDPVX75093Budapest199381.691.020MDPVKC171936Shanghai201291.597.021MDPVKM093740Guangxi201490.795.922DPVKY679174Chengdu201799.799.423NDPVKT343253Shandong201599.910024NDPV/Anhui2014//21 2.1.6系统发生数分析测序结果整理后经Megalign5.0软件绘制系统进化树，发现DS-15株与最近报道的其他新型鸭细小病毒亲缘关系最近，同属一分支；与台湾及广州报道的GPV相似度很高，同属同一大分支，与鹅细小病毒疫苗不属于同一大分支，亲缘关系较远，与MDPV较远如图2-6，由此可知NDPV可能是由GPV变异后而形成的感染鸭的新型鸭细小病毒。图2-6NDPVDS-15株VP3基因系统发生树Fig.2-6ThephylogenetictreeofVP3nucleotidesequences.2.2VP3基因的克隆与表达2.2.1VP3重组表达载体的构建VP3基因的PCR纯化产物连接pMD-19T-1克隆载体后，菌液PCR鉴定阳性的菌株测序正确后命名为重组质粒pMD-19T-VP3。用BamHⅠ和XhoⅠ酶分别对质粒pMD-19T-VP3及pGEX-4T-1进行双酶切，对酶切后的目的片段分别胶回收后，T4DNA连接酶连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞中，得到含有重组表达质粒的菌体，经过菌液PCR鉴定后得到阳性克隆菌株，提取阳性克隆株质粒，再由BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，结果如图2-7，酶切鉴定正确后送生工生物工程（上海）有限公司测序，鉴定正确的质粒命名为pGEX-VP3。22 4900bp3000bp1605bp750bp500bp250bp100bp图2-7双酶切鉴定pGEX-4T-VP3Fig.2-7IdentificationofpGEX-4T-VP3withBamHⅠandXhoⅠM:DNA分子质量标准；1：pGEX-4T-1；2：重组质粒pGEX-4T-VP3的BamHⅠ、XhoⅠ双酶切产物M:DNAMarker;1:TheplasmidpGEX-4T-1ascontrol;2:ProductsfrompGEX-4T-VP3digestedwithBamHⅠandXhoⅠ2.2.2重组VP3蛋白的诱导表达及纯化将重组质粒pGEX-VP3转化BL21感受态细胞，并以pGEX-4T-1空质粒转化BL21感受态细胞作为对照，用IPTG诱导表达后，冰上超声波破碎菌体，离心收集沉淀及上清，对上清及包涵体样品处理后经SDS-PAGE电泳分析，结果显示，诱导pGEX-VP3重组菌获得大小约84kDa的蛋白，与预测的蛋白大小一致。可溶性分析显示，重组GST-VP3蛋白以包涵体形式存在。用包涵体粗纯化方法对重组GST-VP3蛋白进行纯化，经SDS-PAGE结果显示如图2-8。M123456M78kDa17013010084kDa7055403525图2-8重组VP3蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2-8AnalysisresultsofrecombinantVP3proteinbySDS-PAGEM:蛋白质分子质量标准；1：pGEX-VP3重组菌诱导后；2：pGEX-VP3重组菌未诱导；3：空载体诱导；4：空载体未诱导；5：表达菌超声波上清；6：表达菌超声波沉淀；7：未纯化的重组VP3蛋白；8：纯化后的重组VP3蛋白23 M:ProteinmolecularweightMarker;1:AfterinducedpGEX-VP3;2:BeforeinducedpGEX-VP3;3:pGEX-4T-1inducedwithIPTG;4:pGEX-4T-1withoutinduce;5:SupernatantsofpGEX-VP3;6:SedimentofpGEX-VP;7:Unpurifiedrecombinantprotein;8:Purifiedrecombinantprotein2.2.3Western-blot鉴定一抗为抗新型鸭细小病毒多克隆抗体，二抗为HRP标记的山羊抗鸭IgG经Western-blot检测，结果显示，纯化的GST-VP3蛋白在蛋白标准分子质量约84kDa处出现特异性条带，大小与预期的蛋白大小84kDa相符如图2-9。kDa图2-9Western-blot鉴定结果Fig.2-9Western-blotresultsofrecombinantVP3proteinwithNDPVserumM:蛋白质分子质量标准；1：pGEX-VP3诱导的重组蛋白；2：pGEX-VP3诱导前；M:ProteinmolecularweightMarker;1:therecombinantproteinVP3byinducedpGEX-VP3;2:BeforeinducedpGEX-VP3;2.3基于VP3蛋白的间接ELISA方法的建立2.3.1抗原蛋白包被浓度及血清稀释度的确定经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纯化后的重组VP3蛋白浓度为5.4mg/mL。每个抗原稀释度设置三个重复，方阵滴定法确定抗原包被浓度及血清稀释度，结果如下表2-3，计算P/N值，选择P/N值最大，因此确定VP3蛋白的包被稀释度为1:750，蛋白浓度为：7.2μg/mL，血清稀释度为1:100。24 表2-3VP3蛋白抗原包被浓度和血清稀释度的选择Tab.2-3OptimalantigencoatingconsentrationofproteinVP3andserumdilution血清VP3蛋白稀释倍数稀释度1:1001:2501:5001:7501:10001:15001:20001:25+2.6552.0891.9381.8331.7321.6771.3941:25-0.5130.3840.3820.4310.3560.3670.292P/N值5.175.445.074.254.874.574.771:50+2.1491.5371.4071.4341.1751.4081.2331:50-0.3970.2860.2920.3080.2680.3140.304P/N值5.415.374.824.664.384.484.061:100+1.8441.5341.2281.5551.4541.4451.3781:100-0.3540.2790.2370.2120.1990.2060.325P/N值5.215.505.187.330.737.014.241:150+1.6151.1160.9240.9030.7130.6910.5361:150-0.3160.2690.2090.2030.1790.2650.159P/N值5.114.154.424.453.982.613.371:200+1.331.0460.8460.5250.3820.3740.3581:200-0.3880.3630.3110.2380.1610.1730.143P/N值3.432.882.722.212.372.162.502.3.2酶标二抗稀释度的优化不同浓度的酶标二抗做三个重复对照，取平均值，对酶标二抗工作浓度进行优化，结果如下表2-4，基于VP3蛋白的间接ELISA二抗稀释度确定为1:500。表2-4酶标二抗工作浓度优化Tab.2-4OptimizationoftheworkingconcentrationofHRP-IgG酶标抗体1:4001:5001:10001:15001:2000稀释度阳性OD值1.861.7321.5641.5131.421阴性OD值0.3780.2070.2210.2060.189P/N值4.928.367.077.247.512.3.3包被条件的确定对包被条件进行优化，如下表2-5选择条件，VP3蛋白的包被条件确定为37℃包被1h后4℃过夜。25 表2-5VP3蛋白包被条件优化Tab.2-5OptimizationofcoatingconditionofVP3protein包被条件37℃包被2h37℃℃1h4过夜37℃℃2h4过夜4℃过夜阳性OD值1.6511.7681.7421.693阴性OD值0.2080.2150.2230.211P/N值7.938.227.818.022.3.4封闭条件的优化对所选的4种封闭液分别做3次重复，取平均值，结果如下表2-6，选择5%脱脂乳作为封闭液，并对封闭时间优化，最终确定封闭条件为5%脱脂乳4℃过夜。表2-6封闭液的选择Tab.2-6Optimizationofblockingbuffer封闭液5%脱脂乳10%胎牛血清5%BSA5%明胶阳性OD值1.8211.7951.8621.758阴性OD值0.2280.2340.3120.265P/N值7.987.675.966.68表2-7封闭时间的选择Tab.2-7Optimizationofblockingtime封闭时间37℃1h37℃2h4℃过夜阳性OD值1.8311.7561.658阴性OD值0.320.2630.205P/N值5.726.678.082.3.5血清孵育时间及酶标二抗孵育时间确定血清孵育时间设3组平行对照，取平均值，选择其中P/N值最大的以确定血清孵育时间，确定其血清孵育时间为30min，以同样的方法确定的基于VP3蛋白的间接ELISA方法的酶标二抗孵育时间为30min。表2-8待检血清样品孵育时间的优化Tab.2-8Optimizationofreactiontimeofthetestedserum血清孵育时间30min1h1.5h阳性OD值1.7551.8361.852阴性OD值0.2130.2710.254P/N值80236.777.2926 表2-9酶标二抗孵育时间的优化Tab.2-9OptimizationofreactionofHPR-IgG二抗孵育时间30min1h1.5h阳性OD值1.7061.8271.803阴性OD值0.1970.2340.228P/N值8.657.817.912.3.6显色时间的优化每个显示时间设3个平行对照，取平均值，选择P/N值最大的最为ELISA方法的显色时间，确定其显色时间为10min。表2-10显色时间的优化Tab.2-10Optimizationofcolortime二抗孵育时间10min15min30min阳性OD值1.7181.7651.838阴性OD值0.2170.2910.286P/N值7.916.066.432.3.7阴阳性临界值的确定检测60份樱桃谷鸭阴性血清OD450值（见表2-11），计算阳性阈值=平均值+3×SD作为阴阳性临界值，得到的VP3阳性阈值为=0.35。表2-11检测60份阴性血清OD450值Tab.2-11TheOD450of60negativeserums0.2250.2090.1990.1730.190.1620.2130.1790.1610.1470.1670.1390.3420.2520.380.3690.2750.2290.2460.2130.2210.2090.1850.2080.1110.1180.2080.2180.240.1750.2220.1120.2040.2410.2120.1150.1970.1920.1760.1570.2160.1930.1540.1280.1730.2250.1310.1850.1650.2610.2420.1960.220.1880.2710.1090.2040.210.2050.2162.3.8重复性及敏感性试验运用建立的间接ELISA方法对5份已知NDPV阴阳性血清进行重复性检测，结果显示批内及批间变异系数均小于7%。如下表2-12，说明所建立的的间接ELISA方法具有良好的重复性。27 表2-12重复性试验Tab.2-12Resultofrepetitiontest批内重复性试验批间重复性试序号平均数±SD变异系数平均数±SD变异系数11.51±0.0120.791.497±0.0835.5420.556±0.0305.400.563±0.0376.5731.409±0.0835.891.421±0.0765.3441.319±0.0151.141.289±0.0715.5050.435±0.0317.120.451±0.0286.20取6份阳性血清，从1:200开始进行倍比稀释，分别检测不同稀释度，以检出阳性最大的稀释度作为其敏感度，如表2-13可以确定建立的间接ELISA方法灵敏度为1:800。表2-13VP3蛋白ELISA方法敏感度检测Tab.2-13sensitivitydetectionofindirectELISAbasedonVP3protein血清血清稀释度编号1:2001:4001:8001:16001:32001:640011.2310.8120.5680.3280.2010.13521.0130.630.5010.3010.1350.10631.1380.7210.4930.2940.1790.12441.2010.8210.5760.2030.1310.10751.320.8170.6030.2960.1110.09661.0360.6240.5310.3070.1580.1132.3.9特异性试验每组设置3个平行对照，取六种特异性阳性血清用建立的间接ELISA方法进行检测，结果显示鹅细小病毒及番鸭细小病毒检测结果与新型鸭细小病毒阴性血清检测结果的比值均大于2，表明建立的ELISE方法对于其他水禽细小病毒属成员也具有检测作用，对这也在临床检测上证明了新型鸭细小病毒是由鹅细小病毒变异而来的推测。而其他病原阳性血清检测值与新型鸭细小病毒阴性血清检测结果的比值小于2，表明次方法对非细小病毒的检测特异性良好。28 表2-14特异性检测结果Tab.2-14Theresultofspecificitytest特异性禽流感病毒H5亚型鹅细小病毒呼肠弧病毒新城疫病毒番鸭细小病毒待检血清阳性阳性阳性阳性阳性OD值0.3281.2510.570.4250.938与阴性比值0.943.571.631.22.68鸭病毒性肝炎特异性鸭疫里默氏杆菌鸭坦布苏病毒鸭瘟病毒病毒待检血清阳性阳性阳性阳性OD值0.1360.2570.3150.362与阴性比值0.0560.7340.91.032.3.10检测方法应用对采集的免疫灭活疫苗后不同时间的鸭群血清进行抗体检测，检测结果如下表，可以看出，基于VP3蛋白建立的ELISA方法可以检测鸭血清抗体水平变化，从变化情况可以看出，免疫由实验室制备的鸭胚增殖NDPV油乳灭活苗及GPV弱毒苗后的第三天开始血清抗体转阳，免疫灭活NDPV疫苗的鸭群鸭血清抗体含量高于免疫GPV弱毒苗的鸭群，空白对照组鸭血清检测抗体水平一直表现为阴性，可以说明，NDPV灭活疫苗免疫鸭群后鸭群在第三天就产生了较高的抗NDPV抗体，且抗体水平随免疫时间的延长而升高，至第3周达到高峰，检测结果与预期结果相吻合，说明建立的间接ELISA方法可以用来临床检测鸭血清中NDPV抗体水平，可以用来评价NDPV灭活疫苗的免疫效力。表2-15临床检测结果Tab.2-15theresultsofclinicaltest免疫灭活NDPV免疫天数GPV弱毒苗空白对照组疫苗00.210.230.2330.650.380.3470.860.530.27140.970.810.28211.30.960.33281.231.170.27351.011.260.3129 03714212835图2-10免疫后抗体水平变化Fig.2-10Antibodylevelchanges30 3讨论鸭短喙侏儒综合征是近两年新发生的水禽细小病毒病，病原为鹅细小病毒变异株，暂命名为新型鸭细小病毒，主要感染樱桃谷肉鸭，造成肉鸭养殖业的经济损失。此种新型鸭细小病毒在遗传学上与鹅细小病毒有很高的相似度，但是在临床致病特征上表现出其特有的病变，感染此病的鸭发育受阻，脚软站立不稳，鸭喙变短，舌头外漏是此病的特征性临床症状，这与番鸭细小感染所表现“三周病”的临床症状有相似之处，如脚软站立不稳，但番鸭细小病毒一般感染番鸭及半番鸭，而对于樱桃谷鸭一般很少发病，并且在遗传学上此种新型鸭细小病毒与番鸭细小病毒亲缘关系没有与鹅细小病毒近，可以看出此种新发现的水禽细小病毒遗传上有鹅细小病毒的特征同时在临床症状上又同时有番鸭细小病毒的特征，而在感染宿主及临床症状上又具有其自身的特异性，目前对新型鸭细小病毒的生物学特征暂时不清楚，对新型鸭细小病毒的生物学特性研究将对水禽细小病的的遗传变异特征及临床致病特征的研究提供参考。本试验对NDPVDS-15株的增殖特性进行了研究，可以观察到病毒可在鸭胚上传代增殖，对鸭胚敏感并对鸭胚造成病变，导致鸭胚出血死亡，此株新型鸭细小病毒[64]可以在鸭胚成纤维细胞中增殖但不产生明显的细胞病变。但对鸡胚及鹅胚及细胞不敏感。相比较鹅细小病毒对鸭胚及鹅胚敏感，GPV可以在鸭胚及鹅胚中增殖并在鹅胚及鸭胚组织成纤维细胞中增殖，产生细胞病变，但GPV对其他禽类胚体及细胞不敏感。新型鸭细小病毒的基因组全长与鹅细小病毒的5106nt相比较缺少数个到几十个碱基，这些缺失的碱基都是在其基因组两端的末端倒置重复序列，而在其开放阅读框中其基因大小与鹅细小病毒基因相同，新型鸭细小病毒VP结构蛋白基因及非结构蛋白NS基因与鹅细小蛋白的相似度很高，VP3蛋白是动物细小病毒重要的结构蛋白，是研究动物细小病毒最常用的蛋白，其是病毒的主要保护性抗原，刺激机体产生保护性抗体，VP3在以往的鹅细小病毒研究中常被用作诊断抗原，同时在研究病毒遗传进化方面VP3基因作为主要结构蛋白基因具有重要的参考价值，对该毒株细小病毒的VP3基因进行克隆分析，发现VP3基因长1605bp，将其序列与国内外报道的部分参考GPV及MDPV株的VP3基因序列比对，发现DS-15株与GPV的核苷酸同源性远大于与MDPV的同源性，VP3基因编码的氨基酸序列比对同样显示此结果。推测NDPV可能与GPV由同一病毒进化而来。VP3蛋白是NDPV主要结构蛋白，是病毒主要抗原成分，本研究对新型鸭细小病毒的VP3基因进行克隆并原核表达VP3蛋白，经推导VP3蛋白大小约为60kDa，VP3基因克隆连接至表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达质粒pGEX-4T-VP3，诱导表达得到包涵体形式存在的重组GST-VP3蛋白，蛋白表达量高，且所表达的蛋白经包涵体纯化后复性的到纯化重组蛋白VP3，以全病毒多克隆抗体经Western-blot检测，显示VP3蛋白具有很好的抗原性。原核表达具有其直观的优点，方法简单，表达量高且成本低廉，表达的蛋白经过复性后可以直接作为抗原在实验中运用，在对病毒蛋白的研究中一直是最常用的方法。新型鸭细小病的VP3蛋白在病毒蛋白中尤为31 重要，在研究鹅细小病毒过程中，对于VP3蛋白的研究直至都是重点，VP3蛋白在病毒的检测，抗体的制备以及临床检测方法的建立上有着重要作用。VP3蛋白可以诱导机体产生具有中和作用的抗体。临床上暂时还未有关于检测鸭血清中NDPV抗体含量的方法，ELISA作为临床血清学检测方法，是当前动物流行病学调查及疫病检测的常用检测技术。有报道关于鹅细小病毒VP3蛋白包被的检测鹅细小病的的间接ELISA方法的建立，但其无法检[65]测鸭血清抗体。以及有关检测番鸭细小病的血清抗体检测的间接ELISA方法的建[44,63,66]立，其检测的是番鸭细小病毒，试验证明此种试剂盒无法检测樱桃谷鸭血清的抗体水平，由于不同品种鸭血清检测敏感性不同，本试验根据推测VP3蛋白的抗原性，是理想的包被抗原，相比于全病毒包被抗原其不具有生物安全威胁。因此，本研究以原核表达重组VP3蛋白作为抗原包被酶标板，建立了基于VP3蛋白的NDPV樱桃谷鸭血清抗体检测的间接ELISA方法。对各条件摸索优化后降低ELISA方法的非特异性，获得标准操作步骤。以建立的间接ELISA方法确定进行特异性交叉反应，检测方法的特异性。发现其对鹅细小病毒及番鸭细小病毒呈现非特异性，对其他水禽病毒病及细菌病的检测都具有特异性。所建立的间接ELISA方法具有良好的重复性，可以运用于临床检测NDPV灭活疫苗的免疫效力。对免疫新型鸭细小病毒灭活疫苗后的樱桃谷鸭血清抗体水平变化进行检测，可以看出此方法可以对疫苗免疫后的樱桃谷鸭检测其血清抗体变化水平，血清中抗体的升高与理论相符，随着免疫后天数的增加，抗体水平升高，在第天后达到高峰，之后血清抗体水平开始下降，由此看出所建立的ELISA方法具有一定的临床应用价值。同时此方法同样可以对免疫GPV疫苗后的樱桃谷鸭群血清中抗GPV抗体水平进行监测，结果看出弱毒的GPV活疫苗免疫后，血清抗体水平持续增加，这符合弱毒疫苗抗体水平变化的特征。本研究所所建立的检测鸭血清NDPV抗体的间接ELISA方法存在一定的不足，此方法由于可以同时检测其他水禽细小病毒，所以临床上此方法无法区分是细小病毒感染的种类及也不能判断血清抗体的产生是病毒感染还是疫苗免疫而引起的，这有待于我们继续对此种方法进行改进以解决方法的不足，所以此方法暂时仅用于新型鸭细小病毒疫苗研制过程中对免疫疫苗后鸭体内抗体水平的监测及对新型鸭细小病毒疫苗免疫效果的评价。32 4结论1.新型鸭细小病毒DS-15株只能在鸭胚中增殖，病毒可在DEF细胞中增殖，遗传特性研究发现此株病毒是鹅细小病毒变异株。2.利用原核表达系统表达新型鸭细小病毒DS-15株的主要结构蛋白VP3，重组蛋白分子量为84kDa。Westernblot检测结果表明，表达的重组蛋白能与抗鸭细小病毒阳性血清发生特异性反应。3.以表达的重组VP3蛋白为诊断抗原，建立了检测新型鸭细小病毒抗体的间接ELISA方法，结果判定标准为0.35，此方法有良好的重复性及特异性，为临床检测细小病毒感染以及疫苗评价提供了参考方法。33 参考文献[1]BachmannPA,HogganMD,MelnickJL,etal.Parvoviridae[J].Intervirology,1975,5(1-2):83-92.[2]PalinskiRM,MitraN,HauseBM.DiscoveryofanovelParvovirinaevirus,porcineparvovirus7,bymetagenomicsequencingofporcinerectalswabs[J].VirusGenes,2016,52(4):564-567.[3]WangF,WeiY,ZhuC,etal.NovelparvovirussublineageinthefamilyofParvoviridae[J].VirusGenes,2010,41(2):305-308.[4]GurdaBL,ParentKN,BladekH,etal.Humanbocaviruscapsidstructure:insightsintothestructuralrepertoireoftheparvoviridae[J].JournalofVirology,2010,84(12):5880-5889.[5]SieglG,BatesRC,BernsKI,etal.CharacteristicsandtaxonomyofParvoviridae[J].Intervirology,1985,23(2):61-73.[6]TsaiHJ,TsengCH,ChangPC,etal.Geneticvariationofviralprotein1genesoffieldstrainsofwaterfowlparvovirusesandtheirattenuatedderivatives[J].AvianDiseases,2004,48(3):512-521.[7]ShienJH,WangYS,ChenCH,etal.IdentificationofsequencechangesinliveattenuatedgooseparvovirusvaccinestrainsdevelopedinAsiaandEurope[J].AvianPathologyogy,2008,37(5):499-505.[8]JanssonDS,FeinsteinR,KardiV,etal.EpidemiologicinvestigationofanoutbreakofgooseparvovirusinfectioninSweden[J].AvianDiseases,2007,51(2):609-613.[9]王浩,田先举,张烁,等.2株鹅细小病毒全基因组特征分析[J].畜牧兽医学报,2013,44(4):602-609.[10]王浩,张烁,刘红梅,等.小鹅瘟的诊断及其病理组织学观察[J].安徽农业大学学报,2012,39(6):859-862.[11]王传钧,汪凯,韩梅,等.安徽地区2011年～2014年小鹅瘟的病毒分离及其流行情况[J].中国预防兽医学报,2016,38(5):403-406.[12]WangJ,HuangY,ZhouM,etal.Constructionandsequencingofaninfectiouscloneofthegooseembryo-adaptedMuscovyduckparvovirusvaccinestrainFZ91-30[J].VirologyJournal,2016,13:104.[13]ZhuY,ZhouZ,HuangY,etal.IdentificationofarecombinantMuscovyDuckparvovirus(MDPV)inShanghai,China[J].VeterinaryMicrobiology,2014,174(3-4):34 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