《长春市肾综合征出血热地理流行病学及病原基因序列分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
中文摘要长春市肾综合征出血热地理流行病学及病原基因序列分析肾综合征出血热（HFRS）是鼠传自然疫源性疾病，其分布广、发病多、病死率高，疫区类型复杂，能够严重危害人民群众的身体健康和生命安全，是当前重要的公共卫生问题之一。在过去的十年间，我国HFRS的发病呈现下降的趋势，发病率从3.05/10万下降到0.84/10万（>3倍），但部分地区首尔病毒型HFRS的比例出现显著上升的趋势。吉林省1955年报告首例HFRS病例，随后的40年间，HFRS始终维持在较低的流行水平。然而，上世纪90年代末，HFRS的发病率出现明显的增长，特别在省会城市长春市。该病再次发生流行后，其时空分布特征、存在的危险因素尚不清楚。因此，有必要探讨不同流行阶段、不同空间尺度上HFRS的分布特征，研究HFRS疫源地动态变迁规律及其与环境和社会因素之间的关系，弄清HFRS高发区域，准确预测、预报HFRS的流行范围和强度，这对预防和控制HFRS具有重要意义。目的：分析长春市HFRS不同流行阶段时空分布特点、疫区变化趋势及流行特征。进一步研究环境和社会因素等对HFRS流行动态的影响；建立长春市HTNV、SEOV宿主动物的生态位模型，绘制感染风险分布的预测图；从基因水平上分析长春市HV病毒的核苷酸序列特征及其进化关系、HV亚型分布及与其他毒株的基因同源性，为防控策略的制定提供科学依据。方法：①收集1988－2012年县区级的HFRS病例数据，根据其季节性分布的变化划分两个阶段对HFRS的流行病学特征进行分析；在乡镇尺度上，建立2004－2012年分年度平均发病率地图，使用地理信息系统（ArcGIS）将HFRS个案数据和鼠情数据进行关联，制作长春市人间疫情数据和鼠情监测空间分布地图，动态显示和分析长春市HFRS的空间分布特征；②使用STATA软件，应用Possion回归分析方法在县区尺度上分别探讨HFRS不同流行阶段空间分布、时间动态分布，与人口密度、海拔、土地利用类型、气象和畜牧业的关系，同时考虑到HFRS影响因素可能存在的空间尺度效应，进一步在乡镇尺度上对影响其空间分布的环境和社会因素进行了分析。对单因素分析中P值<0.1的变量I 作为协变量纳入多因素分析，进一步确定影响长春市HFRS发病时空异质性的主要环境与社会因素；③使用最大熵方法，利用89个监测点中捕获染疫动物的阳性标本采样点来构建长春市HV宿主动物生态位模型，预测HFRS感染发病的风险分布，探索不同型别HV病毒的分布与环境相关变量之间的关系；④采用免疫荧光法对鼠肺标本进行检测，阳性鼠肺进行核酸提取、RT－PCR扩增、测序，并进行同源性分析和系统发生树研究。结果：①1988－2012年以县区为单位分析结果显示，10个县（市）区的年发病率不同，位于长春东南部的双阳发病数最高（1525例，占所有病例的35.9%），但是其人口数只占总人口的5.6%。根据HFRS发病的季节性特征，确定了两个流行阶段。第一阶段为1988-1997年，发病呈单峰型；第二阶段为1998－2012年，呈春、秋冬两个发病高峰。HFRS发病率男性高于女性，患者主要为农民。从2004－2012年乡镇尺度分析结果可以看出，2004－2007年长春市HFRS呈现逐年下降趋势，自2008年开始进入发病平台期。该市119个乡镇有病例报告，不同乡镇（社区）报告发病率的差异较大。其中13个乡镇年累积发病率超过100/10万；②1988－2012年泊松回归分析结果表明，在县区尺度上，HFRS发病的时间动态及空间分布异质性均与畜牧业之间有显著的统计学意义，特别是与鹿饲养业明显相关（P<0.001）。利用2004－2012年HFRS乡镇尺度的发病数据进行泊松回归分析研究发现，人口密度、水田、稻田、灌木林、祼土地是HFRS发病的相关因素。其中，水田（IRR=1.23，P=0.003）、稻田（IRR=1.15，P=0.031）与HFRS发病呈正相关，发病率随着其面积的增加而增长；而人口密度（IRR=0.99，P<0.001），灌木林（IRR=0.22，P<0.001）和裸土地（IRR=0.25，P<0.001）与HFRS发病呈负相关，随着其面积或密度的增加而发病率降低；③啮齿类动物的生态位模型显示，土地利用、降水量、相对湿度、温度、植被指数、海拔与啮齿类动物分布存在相关性。其中，相对湿度（30.8%）、土地利用（29.7%）对野鼠型疫区贡献最大，温度（23.5％）次之；而土地利用对家鼠型疫区贡献最大，其次为降水量。HTNV、SEOV建模ROC曲线显示，AUC平均值分别为0.897、0.846，说明总体预测效果较好。宿主动物的风险预测分布图提示，感染HTNV风险最高的地区主要分布在双阳区和榆树市，而感染SEOV的高风险区域分布范围较广，主要集中在双阳区、榆II 树市和市辖区，而九台市、德惠市感染风险次之；④2010－2012年在该市共捕获1246只啮齿类动物，IFA检测到17份鼠肺标本阳性，均为SEOV型。从分离到HV病毒的双阳、榆树、农安、德惠4个县（市）区各选取1份鼠肺标本进行基因序列分析发现，S、M基因片段与SEOV型其他病毒核苷酸序列比对，同源性均在95%以上，氨基酸序列同源性在99%以上，说明该地区发现的这4株SEOV型病毒未出现较大变异。S基因片段氨基酸序列位点位于231~294之间，分析发现该区段在SEOV型病毒之间同源性高，不同型别HV病毒序列间差异性大于45%，符合多变区域的特点。S、M基因片段序列系统进化分析发现，4株SEOV型病毒均为S3亚型，与已报道的吉林省内双阳、白城、公主岭等地区分离的SEOV型病毒亲缘关系接近。结论：①长春市HFRS发病自1998年开始明显上升，同时伴有季节性特征的改变，其发病高峰由每年年末的单峰型转变为以春、秋冬发病为主的双峰型，提示长春市HFRS的再次流行与过去25年间季节发病模式的变化有关；②长春市HFRS发病率的增长、时空分布特征与畜牧养殖业、气候因素和土地利用类型显著相关，尤其是鹿类养殖。预防控制措施的重点应放在畜牧业养殖的相关地区；③生态位模型分析结果显示，土地利用为影响HV宿主动物生存生境的主要因素，而相对湿度、降水量分别为HTNV、SEOV宿主动物的次要影响因素。风险预测分布图提示，双阳区、榆树市为混合型疫区，是HTNV、SEOV两种病毒感染发病的高危区域，而其他地区主要为SEOV病毒；④目前长春市HFRS疫区是以家鼠型为主的混合型疫区，本研究检测到的HV病毒均为SEOV的S3亚型，其S片段、M片段的核苷酸、氨基酸同源性均较高，未发现较大变异。关键词：肾综合征出血热，汉坦病毒，流行病学，地理信息系统，环境和社会因素，生态位模型，基因分型III AbstractAnalysisofgeographicepidemiologyandpathogenicgenesequenceofHemorrhagicFeverwithRenalSyndromeinChangChunHemorrhagicfeverwithrenalsyndrome(HFRS)isanaturaldiseasetransmittedbymiceandcharacterizedbywidedistribution,highincidence,highmorbidityandmortality,highdiversityofaffectedareas.Duetoitssevereadverseeffectsonthehealthofpeopleandsocialandeconomicdevelopment,HFRSisoneofthepublicproblems.Duringthepastdecade,theoverallHFRSincidencehasdeclinedconsiderablyinmainlandChina,from3.05per100,000populationto0.84per100,000population(>3-fold).However,theproportionofHFRSresultingfromSEOVinfectionscontinuestoexpand.DuringthefourdecadesafterthefirstHFRScasewasreportedin1955inJilinProvince,therewasalowlevelofHFRSendemicityinJilin.However,theHFRSincidencehasincreasedsignificantlysincetheendofthe1990s,especiallyinChangchun,thecapitaloftheprovince.Thetemporalandspatialpatternsaswellaspotentialfactorsunderlyingthereemergenceofthediseaseremainunclear.ItisessentialtoexplorethespatialandseasonalpatternsofHFRSdistributionfordifferentepidemicphases,andtoidentifytheregularitiesofonsetanddevelopmentofHFRSandthemostaffectedareas,tostudytheassociationbetweenHFRSincidenceandenvironmentalfactors.Wefiguredoutthehigh-incidenceareaandpredictedtheprevalenceandintensityoftheaffectedareasinordertopromotpreventionandcontrolofHFRS.ObjectiveToillustratethetemporalandspatialpatternofHFRScases,endemicareastypeanditschangesandtheepidemiccharacteristicsinChangchun;TostudytherelationshipsbetweenHFRSincidenceandtheirenvironmentalandsocialdeterminantsatdifferenttemporalandspatialscalesinChangchun,andtoestablishtheecologicalnichemodelofhostanimalwithHTNVandSEOVrespectivelyandpreparetheriskdistributionmapinChangchun;ToanalyzethenucleotidesequenceofHVvirusinChangchunanditsevolutiontoidentifythesubtypesofHVandgenehomologywithothervirusstrainsandprovidescientificV basesforthedevelopmentofpreventivestrategiesagainstHFRS.Methods①CasedataofHFRSbetween1988and2012fromtownsanddistrictswascollectedandanalyzedthedatabasedontheseasonaldistributiontoidentifytheepidemiologiccharacteristicsofHFRS.Onthecountrysideandtownlevel,theaverageincidencemapwasdevelopedannuallybetween2004and2012.Withgeographicinformationsystem,theassociationbetweentheindividualcasedataandincidenceofHFRSwasexploredtodevelopthedistributionmapofincidenceofHFRSandvirusinfectionmonitoringandthedistributionofaffectedareasinChangchun；②BysoftwareSTATA,PossionregressionanalysiswasemployedtoexplorethedistributionofaffectedareasofHFRSatdifferentphasewithtimeattheleveloftownanddistrict;toinvestigatetherelationshipbetweenHFRSinfectionandpopulationdensity,altitude,land-usetypes,meteorologyandlivestocktakingtheimpactfactorsofHFRSonthevariationofaffectedareasandtheeffectsofsocialandenvironmentalfactorsontheaffectedareasintoaccountattheleveloftownandcountryside.Thevariablewithpvaluelessthan0.1inunvariateanalysiswasfurtherputintomultivariableanalysisascovariatestodeterminethemajorsocialandenvironmentalfactorswhichareabletoinfluencethetimeandspacedistributionofHFRSinChangchun；③Basedonamaximumentropymethod,thepositivesamplesofinfectedanimalsfrom89samplingsiteswereusedtoestablishecologicalanimalmodelofHVhostinfectiontopredicttheriskdistributionofHFRSandinvestigatetherelationshipbetweenthedistributionofHVvirusesandenvironmentalrelatedvariables；④Lungsamplesweredetectedbyimmunofluorescentmethodstoidentifyinfectionpositivesamples.ThenucleotideswereextractedfrompositivemicelungandRT-PCRandsequencingwereusedtoanalyzethehomologyandestablishthesystemtree.ResultsAnnualincidencevariedamongthe10countiesfrom1988to2012,ShuangyangCountyinsoutheasternChangchunhadthehighestnumberofcases(1525cases;35.9%ofallcases),butitspopulationonlyaccountedfor5.6%ofthetotalpopulation.BasedonseasonalpatterninHFRSincidence,twoepidemicphaseswereidentified.Onewasasingleepidemicpeakattheendofeachyearfrom1988to1997andtheVI otherconsistedofdualepidemicpeaksatboththeendofeachyearandatthebeginningofeachyearfrom1998to2012.HFRSincidencewashigherinmalescomparedwithfemales,andmostoftheHFRScasesoccurredinpeasantpopulations.Theresultsof2004to2012attheleveloftownsandcountrysideshowthattheincidenceofHFRSwasdecreasedfrom2004to2007andwasmaintainedataflatstateafter2008.Atotalof119townsandcountrysidesreportthepresenceofHFRScaseswithsignificantvariationofreportingincidenceamongdifferenttownsandcountrysides.TheaccumulatedincidenceofHFRSof13townsandcountrysidesexceeds100/100000；②TheresultsofPoissonregressionanalysisfrom1988to2012indicatedthatthespatialdistributionandtheincidenceofHFRSweresignificantlyassociatedwithlivestockhusbandryandclimatefactors,butwereespeciallyassociatedwithdeercultivation（P<0.001）.Basedonthepassionregressionanalysisofthedatefrom2004to2012attheleveloftownandcountryside,itisshownthattheriskfactorsinvolvedintheHFRSstrikeincludepopulationdensity,waterfield,ricefield,bushesandbareland.Amongtheriskfactors,irrigatedcropland（IRR=1.23,P=0.003）andpaddyfield（IRR=1.15,P=0.031）arepositivelycorrelatedwithHFRSstrike,theincidenceincreaseswiththeenlargingofthesquare;populationdensity（IRR=0.99,P<0.001）,shrub（IRR=0.22,P<0.001）andbareland（IRR=0.25,P<0.001）arenegativelycorrelatedwithHFRSstrike,theincidencedecreaseswiththeenlargingofthesquare;③Theecologicalmodelofrodentanimalmodelshowthatland-usetypes,precipitation,relativehumidity,temperature,vegetationindexandaltitudearecorrelatedwiththedistributionofrodents.Amongthem,relativehumidityandland-usetypescontributedthemosttoaffectedareabywildmicetype,followedbytemperature.Soilcovercontributesthemosttotheaffectedareasoftamedmicetype,followedbyprecipitation.TheROCcurvecalculatedbyamodelwithHTNVandSEOVshowsthattheaverageofAUCis0.897and0.846,respectively,whichindicatesthattheoverallpredictionvalueofthemodelisreasonable.TheriskdistributionmapofhostanimalsshowsthattheareaswithhighriskofHTNVinfectionarelocatedinShuangyangandYushuandtheareasundertheirjurisdictionwhilethosewithhighriskofSEOVinfectionarewidelydistributed,mainlylocatedinShuangyangandYushuaswellastheareasundertheirjurisdiction,followedbyJiutaiandDehui;④1246rodentswerecapturedbetween2010and2012VII inChangchun,and17positivelungsampleswereidentifiedbyIFAtobeSEOV.TheHVvirusisolatedfromthelungsamplesselectedfromShuangyang,Yushu,NonganandDehuiweresequenced.ThesequenceshowsthatthehomologyofSandMgenefragmentswithothertypesofSEOVSisover95%,thehomologyofaminoacidisover99%,whichsuggeststhereisnolargevariationamongthefouridentifiedSEOVvirusstrainsintheareas.TheaminoacidsitesofSgenefragmentislocatedat231~294.Thesectionof231-294ishighlyhomologous,thedifferenceamongdifferentstrainofHVvirusesisover45%,whichisinaccordancewiththecharacteristicsofchangingareas.ThesequencingofSandMfragmentfortheevolutionofvirusshowsthatthefourstrainsofSEOVisidentifiedasS3subtype,whichindicatestheidentifiedstrainisclosetotheSEOVstrainidentifiedinShuangyang,Baicheng,andGongzhulingetc.Conclusions①HFRSincidencehassignificantlyincreasedinChangchunsince1998.ThisincreaseincludedaseasonalshiftinHFRSincidencefromoneepidemicpeakintheendoftheyeartodualepidemicpeaksinthebeginningandintheendoftheyear.ourresultsindicatedthatthereemergenceofHFRSinChangchunhasbeenaccompaniedbychangingseasonalpatternsoverthepast25years;②TheresultsofthePoissonregressionanalysisindicatedthatthespatialdistributionandtheincreasingincidenceofHFRSweresignificantlyassociatedwithlivestockhusbandry,meteorologicalconditionsandthetypesoflanduse,particularlywithdeercultivation.IntegratedmeasuresfocusingonareasrelatedtolocallivestockhusbandrycouldbehelpfulforthepreventionandcontrolofHFRS;③Theanalysisresultsofecologicalmodelshowthatland-usetypesisthemajorfactorwhichaffectsthesurvivalenvironmentofhostanimals,followedbyrelativehumidityandprecipitation.TheriskpredictionmapindicatesthatShuangyangandYushuismixedaffectedareaswhichhavethehighincidenceofHTNVandSEOVvirusinfectionwhileotherareasmostlyhaveSEOVinfection;④TheHFRSaffectedareasinChangchunarecharacterizedbymixinfectionmainlycausedbytamemice.ThedetectedHVvirusinthestudyisaS3subtypeofSEOV.ThehomologyofnucleotideandaminoacidofSandMfragmentofS3subtypeishighandnosignificantvariationisfound.VIII KeywordsHemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,hantavirus,epidemiology,geographicalinformationsystem,Environmentalandandsocialfactors,ecologicalnichemodel,genotypingIX 目录第1章绪论................................................................................................................11.1病原学.................................................................................................................11.1.1形态结构......................................................................................................11.1.2分子生物学特征..........................................................................................21.1.3免疫学特征..................................................................................................31.1.4理化性状......................................................................................................31.1.5病毒型别及分类..........................................................................................31.2流行过程.............................................................................................................51.2.1宿主动物及传染源......................................................................................51.2.2传播途径......................................................................................................61.2.3人群易感性..................................................................................................61.3流行特征.............................................................................................................71.3.1地区分布......................................................................................................71.3.2时间分布......................................................................................................81.3.3人群分布......................................................................................................91.4宿主动物与相关环境因素.................................................................................91.4.1环境因素......................................................................................................91.4.2气候因素....................................................................................................101.5临床表现...........................................................................................................101.5.1临床症状与体征........................................................................................111.5.2临床分型....................................................................................................121.6实验室检测技术...............................................................................................121.6.1血清学检测方法........................................................................................121.6.2分子生物学检测技术................................................................................131.7预防和控制.......................................................................................................131.7.1灭鼠防鼠....................................................................................................13XI 1.7.2灭螨防螨....................................................................................................141.7.3加强监测....................................................................................................141.7.4预防接种....................................................................................................141.7.5食品安全及其管理....................................................................................151.7.6加强个人卫生和个人防护........................................................................151.7.7宣传和培训................................................................................................151.8地理信息系统及其在HFRS研究中的应用....................................................151.8.1地理信息系统............................................................................................151.8.2地理信息系统在HFRS研究中的应用....................................................181.8.3生态位模型及其应用研究........................................................................191.9本研究的目的和意义.......................................................................................20第2章材料与方法....................................................................................................232.1研究地区...........................................................................................................232.2资料来源...........................................................................................................242.2.1疫情资料....................................................................................................242.2.2专题数据....................................................................................................252.2.3基础地图数据............................................................................................252.2.4人口资料....................................................................................................252.2.5鼠肺标本来源...........................................................................................252.3方法...................................................................................................................262.3.1HFRS时空分布特征分析.........................................................................262.3.2HFRS发病影响因素研究.........................................................................272.3.3HFRS宿主动物生态位模型研究.............................................................282.3.4HFRS基因分型及序列分析.....................................................................29第3章结果..............................................................................................................333.1HRFS时空分布特征分析................................................................................333.1.11988－2012年流行病学特征分析...........................................................333.1.2在乡镇尺度分析2004－2012年HFRS分布特征及疫区类型...............36XII 3.2不同空间尺度HFRS发病的影响因素研究...................................................403.2.1县区尺度上HFRS空间、时间分布相关影响因素研究.......................403.2.2乡镇尺度的HFRS环境影响因素分析....................................................433.3HFRS宿主动物生态位模型研究....................................................................443.3.1HFRS动物宿主调查分析.........................................................................443.3.2HFRS生态位模型建立与预测.................................................................453.4HV基因分型及序列分析.................................................................................493.4.1宿主动物调查及病毒抗原检测................................................................493.4.2扩增产物的鉴定及核苷酸序列分析........................................................503.4.3系统进化树分析.......................................................................................54第4章讨论..............................................................................................................574.1HFRS时空分布特征分析................................................................................574.1.1空间分布特征............................................................................................574.1.2时间分布特征............................................................................................574.2HFRS发病的影响因素....................................................................................584.2.1畜牧业的影响............................................................................................594.2.2气象条件的影响........................................................................................594.2.3土地利用类型的影响................................................................................604.3宿主生态位模型对HFRS感染风险的预测....................................................604.4HV病毒基因分型及序列分析.........................................................................624.4.1核苷酸和氨基酸序列分析........................................................................624.4.2基因分型....................................................................................................624.5本研究的局限...................................................................................................64第5章结论..............................................................................................................65本研究的创新之处......................................................................................................67参考文献......................................................................................................................69作者简介及在学期间所取得的科研成果..................................................................85致谢............................................................................................................................87XIII 英文缩写AMRVAmurvirus阿穆尔病毒ANDVAndesvirus安第斯病毒AUCAreaUnderCurve曲线下面积BAYVBayouvirus长沼病毒BCCVBlackCreekCanalvirus黑满港渠病毒CADVCanoDelgaditovirus卡尼奥德尔加蒂图病毒CIConfidenceInterval可信区间DOBVDobrava－Belgradevirus多布拉伐病毒EHFEpidemichemorrhagicfever流行性出血热ELMCVELMoroCanyouvirus莫洛峡谷病毒ENMEcologicalnichemodel生态位模型GARPAlgorithmforrule-setprediction规则集遗传算法GISGeographicalinformationsystem地理信息系统HemorrhagicfeverwithrenalHFRS肾综合征出血热syndromeHNTVHantaanvirus汉滩病毒HCPSHantaviruscardiopulmonarysyndrome汉坦病毒心肺综合征HVHantavirus汉坦病毒InternationalCommitteeforICNV国际病毒命名委员会NomenclatureofVirusID50Infectivedose50半数感染剂量IFAIndirectFluorescentAssay间接免疫荧光技术IgAImmunoglobulinA免疫球蛋白AIgEImmunoglobulinE免疫球蛋白EIgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GIgMImmunoglobulinM免疫球蛋白MIRRIncidencerateratio发病率比值ISLAVIslaVistavirus岛景病毒XV KHAVKhabarovskvirus哈巴罗夫斯克病毒KHFKoreahemorrhagicfever朝鲜出血热LNVLagunaNegravirus拉古纳内格拉病毒MAXENTMaximumEntropyModels最大熵模型MULEVMuleshoe穆勒舒病毒(美)NDVINormalizeddifferencevegetationindex归一化植被指数NEnephropathiaepidemica流行性肾病NYVNewYorkvirus纽约病毒PCPercentageChange变化百分比PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PHVProspectHillvirus希望山病毒PUUVPuumalavirus普马拉病毒P－valueProbabilityvalue假设机率RIOSVRioSegundovirus塞贡多病毒RMVRioMamorevirus马莫雷河病毒RNARibonucleicAcid核糖核酸ROCReceiverOperatingCharacteristic受试者工作特征曲线RSRemotesensingsystem遥感系统RT-PCRReversetranscriptionPCR逆转录PCRSAAVSaaremaavirus萨雷马病毒SEOVSeoulvirus首尔病毒SNVSinNombrevirus无名病毒TCID50Tissuecultureinfectivedose半数组织培养感染剂量THALVThailandvirus泰国病毒TPMVThottapalayamvirus索托帕拉亚病毒TOPVTopografovvirus托普格拉夫病毒TULVTulavirus图拉病毒XVI 第1章绪论肾综合征出血热(Hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)属于自然疫源性疾病，其病原体为布尼亚病毒科（FamilyBunyaviridae）的汉坦病毒[1](Hantaviruses，HV)。包括主要流行于亚洲的流行性出血热(Epidemichemorrhagicfever，EHF)和流行于欧洲的流行性肾病(Nephropathiaepidemica，[2，3]NE)。1982年WHO有关肾综合征出血热的工作会议上建议将世界各地由汉坦病毒及相关病毒引起的伴有肾综合征的出血热统称为肾综合征出血热。HFRS分布广、发病多、病死率高，临床上主要以高热、出血和肾脏损害为主要特[4，征。人类由于吸入感染汉坦病毒鼠类的排泄物、分泌物形成的气溶胶而感染5]。汉坦病毒呈世界性分布特点，但HFRS主要分布在欧亚大陆的北部及东部。全球每年报告病例数在15－20万左右，其中，中国大陆报告的HFRS占全世界[6-9]的70－90%。该病疫区类型复杂，不仅严重危害人民群众的身体健康和生命安全，同时对工农业生产、社会经济发展、旅游开发等事业均造成极大的影响[10]。1.1病原学1932年我国首次发现于黑龙江流域，称之为“孙吴热”。20世纪40年代，日本和苏联学者分别通过试验排除了细菌等微生物后，认为该病的病原体为病[11]毒。1978年，韩国学者李镐汪成功地从朝鲜出血热（Koreahemorrhagicfever，KHF）疫区汉坦河流域捕捉到的鼠类肺组织标本中检到抗原，并定名为[12]汉坦病毒（Hantavirus，HV）。我国对本病病原学和血清学也进行了大量研[13]究工作，1980年首次成功分离到HV病毒，在病原学上取得重大突破，从而促进了流行病学、免疫学、检验诊断、治疗和疫苗研制等研究的全面发展。1.1.1形态结构在电镜下可见，HV病毒为圆形、卵圆形或长形，大小不等，平均直径约122nm（80－210nm）。其包膜为典型的双层膜，表面有短丛状的纤突。在病毒的胞浆中可以观察到包涵体，其形态多样，有丝状、颗粒状、颗粒丝状和小泡1 [14-18]状。包涵体是由病毒的结构蛋白组成，是汉坦病毒感染的重要标志。1.1.2分子生物学特征病毒的核酸为单股负链RNA，分为大（L）、中（M）、小（S）三个基因666片段，分子量分别为2.7×10D、1.2×10D和0.6×10D。HV的蛋白包括RNA[19、20]聚合酶和三种结构蛋白，即NP（核衣壳蛋白）、G1、G2（包膜糖蛋白），L（聚合酶）。分子量分别为L：246kD，G1：68～76kD，G2：52～58kD，N：50～54kD。NP位于病毒颗粒的核心，G1和G2位于病毒的包膜上[21、22]。S片段编码病毒的核衣壳蛋白，M片段编码病毒的G1、G2包膜糖蛋白，L片段编码病毒RNA聚合酶。HV的全基因组大小不等，HTNV（Hantaanvirus）有11845个核苷酸，而SNV（SinNombrevirus）有12317个核苷酸。三个片段的碱基序列互不相同，但基因片段的3'端有一个共有核苷酸序列高度保守，为“3′AUCAUCAUCUGAGG”，与5'端（UAGUAGUAGACUCC）互补，此段核苷[22、23]酸序列不同于布尼亚病毒科的其他4个病毒属。通过对已测定的汉坦病毒各种毒株的完整基因片段核苷酸序列及M和S片段的部分序列进行分析比较，证明各型病毒之间的同源性有很大差别。研究发现，3个基因片段中，M片段的变异最显著，比其他2个片段更容易进行重组。同型病毒的M片段序列同源性较高，达95%左右；不同型别病毒M片段序列的同源性，以HTNV和SEOV（Seoulvirus），PUUV（Puumalavirus）和PHV（ProspectHillvirus）较高，分别为75%和76%，而前两者与后两者之间同源性较低为55%左右。比较不同编码G1和G2的核苷酸同源性发现，G1编码区的核苷酸序列差别较大，这可能是由不同糖蛋白抗原决定簇的差异所造成的。汉坦病毒S基因片段的变异程度介于M片段与L片段之间，不同型别的汉坦病毒S片段序列的同源性在50－80%之间。而同型HV的L片段同源性比较高，编码氨基酸序列和核苷酸序列之间的同源性分别在94%和85%以上；不同型别HV病毒的L片段核苷酸序列的同源性在69.2%－77.4%，编码氨基酸序列[24-28]的同源性为74%－89%。目前，普遍认为HV与宿主动物共进化，两者的[29]变异速率相同。2 1.1.3免疫学特征HV病毒与布尼亚病毒科的其它属病毒间无交叉免疫，外膜糖蛋白和核衣壳蛋白共同决定了其毒力和致病性。核衣壳蛋白有较强的免疫源性和抗原性，其抗体应答出现较早，在病程早期即可以检测到，有助于开展血清学诊断。一[30、31]般认为，核衣壳蛋白上不含中和抗原。膜蛋白中含中和抗原和血凝抗原，前者能诱导宿主产生具有保护作用的中和抗体，后者可引起低PH依赖性细胞整合，这与病毒颗粒吸附于受感染宿主的细胞表面及随后病毒脱衣壳进入胞质可能有关。机体感染HV病毒后，可产生IgM、IgA、IgE、IgG与中和抗体。各种抗体出现及达到高峰的时间为：IgM抗体在发病1－3天即可检出，5－6天滴度可达高峰，10－14天逐渐下降，一般半年后转阴；IgA抗体出现及消长趋势与IgM抗体相似；IgE抗体出现也较早，发热及少尿期显著增高，4－8个月后逐渐消退；IgG抗体虽可在2－3天出现，但其滴度一般在病后10－14天开始升高，以后仍继续升高，半年后仍可检出高滴度抗体，其后则缓慢降低，但多可持续存在；中和抗体第4天能检出，10天后迅速上升，约13－14天达高峰，也可长[28]期存在。1.1.4理化性状HV病毒抵抗力弱，对一般的脂溶剂和消毒剂均敏感，使用甲醛、乙醚、氯仿、丙酮、酒精和酸（pH<5.0）均可以将病毒杀灭。在加热56－60℃30分钟[16、32、33]或紫外线距离50cm，照射60min可灭活病毒。1.1.5病毒型别及分类目前国际病毒分类命名委员会已列举出22个已确定的汉坦病毒种类和30[34-36]个暂定种类。其中，世界卫生组织共认定4个型别，分别为Ⅰ型HTNV，Ⅱ型SEOV，Ⅲ型PUUV和Ⅳ型PHV。据研究结果表明，HTNV、SEOV、DOBV（Dobrava-Belgradevirus）、PUUV、SAAV（Saaremaavirus）和AMRV（Amurvirus）可引起人类肾综合征出血热，而SNV、NYV（NewYorkvirus）、BCCV（BlackCreekCanalvirus）、BAYV（Bayouvirus）、ANDV3 （Andesvirus）、LNV（LagunaNegravirus）和RMV（RioMamorevirus）引起以呼吸衰竭为主要表现的汉坦病毒心肺综合征（Hantaviruscardiopulmonary[37、38]syndrome，HCPS）。各型别HV分布在不同的区域，所导致出现疾病的轻重程度也不一致。目前，在我国流行的汉坦病毒至少有9个基因型，但引起HFRS的病原体仍然为HTNV、SEOV，以SEOV多见。HTNV宿主动物是黑线[39-41]姬鼠，SEOV宿主动物是褐家鼠。人类感染HTNV后出现的症状比SEOV[1、42]型HFRS更严重，病死率更高。2003年有文献报道，在吉林省发现[43]PUUV。HFRS流行病学分型与基因分型有关，不同的基因型由于宿主动物不同可构成不同的流行型别。在我国可分为姬鼠型HFRS、家鼠型HFRS和实验动物型HFRS。在日本可分为城市型、实验动物型。在韩国可分为城市型、野鼠型[18]和实验室动物型。欧洲重型HFRS为巴尔干姬鼠型，其宿主动物为黄颈姬鼠，病原为DOBV。详见表1.1。Table1.1TheclassificationoftheHantaanviruswasdeterminedbyInternationalCommitteeforNomenclatureofVirus(ICNV)GeographicalRodentreservoirAssociatedAbbreviationReservoirspeciesdistributionofsubfamily,virusdiseasesvirusChina,Korea,HantaanvirusHTNVApodemusagrariusHFRSRussiaSeoulvirusSEOVRattusnorvegicusworldwideHFRSDobrava-BelgradeDOBVApodemusflavicollisBalkansHFRSvirusClethrionomysEurope,Asia,PuumalavirusPUUVHFRSglareolusAmericasSaaremaavirusSAAVApodemusagrariusEuropeHFRSNewYorkvirusNYVPeromyscusleucopusAmericaHCPSBlackCreekCanalBCCVSigmodonhispidusNorthAmericaHCPSvirusBayouvirusBAYVOryzomyspalustrisNorthAmericaHCPSOligoryzomysArgentina,AndesvirusANDVHCPSlongicaudatusChileLagunaNegravirusLNVCalomyslauchaSouthAmericaHCPSRioMamorevirusRMVOligoryzomysmicrotisSouthAmericaHCPS4 ContinuedGeographicalRodentreservoirAssociatedAbbreviationReservoirspeciesdistributionofsubfamily,virusdiseasesvirusMicrotusProspectHillvirusPHVUSAunknownpennsylvanicusThailandvirusTHALVBandicotaindicusThailandunknownReithrodontomysELMoroCanyouvirusELMCVNorthAmericaunknownmegalotisReithrodontomysRioSegundovirusRIOSVCostRicaunknownmexicanusTulavirusTULVMicrotusarvalisRussia,EuropeunknownThottapalayamvirusTPMVSuncusmurinusIndiaunknownIslaVistavirusISLAVMicrotuscalifornicusNorthAmericaunknownKhabarovskvirusKHAVMicrotusfortisFarEastRussiaunknownTopografovvirusTOPVLemmussibericusSiberiaunknownCanoDelgaditovirusCADVSigmodonalstoniVenezuelaunknownMuleshoevirusMULVSigmodonhispidusUSAunknown来源于http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?taxnode_id=199956721.2流行过程1.2.1宿主动物及传染源HV在自然界的贮存呈多宿主状态。据不完全统计，迄今为止，世界上共有4纲219种陆栖脊椎动物能自然感染或携带HV病毒。其中，哺乳纲193种、鸟纲22种、爬行纲2种、两栖纲2种。这些动物多为HV的自然宿主，包括啮齿动物、食虫目、兔形目、食肉目及偶蹄目等。而啮齿类动物是HV的主要宿主，种群多集中在鼠总科的姬鼠属、家鼠属和仓鼠科的林平属、田鼠属、仓鼠属等，其种类多，分布范围广。HV与宿主动物形成对应关系，每种HV有其相对固定的宿主鼠种。由于适宜生存的地理环境因素存在差异，不同宿主动[44-46]物分布在不同地区。宿主动物种群类型、分布和数量决定HFRS疫区性质及分布范围，宿主动物分布密度及带毒状况决定人群感染HV强度、HFRS发病流行趋势。这也导致至今为止HFRS主要发生在欧亚大陆，而HCPS主要分布在美洲大陆。我国已证明存在姬鼠型、家鼠型和混合型疫区。黑线姬鼠作为姬5 鼠型疫区的主要宿主动物，栖息生存地大多在田间；褐家鼠为家鼠型疫区的优[39-41]势鼠种，常在人类居住环境附近（例如住宅，仓库和商店）生存。1.2.2传播途径20世纪80年代明确了HFRS病原体后，专家学者有针对性地进行动物试验和流行病学调查，探讨了HFRS的可能传播途径，并取得了明显的进展。研究[47]发现，携带HV病毒鼠类的血、尿、粪在排出体外后仍具有传染性，并可通[48-57]过皮肤破损伤口、呼吸道、消化道等途径进入人体。螨媒可机械传播HV，格氏禾在厉螨和厩真厉螨为HFRS疫区黑线姬鼠鼠窝的优势螨种，而柏氏[58、59]禽刺螨主要在家鼠窝巢和体外寄生。有实验证明鼠类可以通过胎盘将HV[60、61]病毒传给后代，而螨类也可经卵将病毒传递下去。综上所述，HFRS可以通过多种途径进行传播，目前认为有3类5种，在日常生活中伤口直接接触、[62、63]呼吸道传播为人群感染发病的主要途径。宋干等总结了HFRS可能的传播方式，详见表1.2。表1.2HFRS的可能传播途径类别种类传播方式与宿主动物及其排泄物（尿、粪）、分泌物（唾液）接触，病毒伤口传播动物源经污染皮肤或黏膜伤口感染性传播呼吸道传播吸入被宿主动物带病毒排泄物污染的气溶胶而感染消化道传播食入被宿主动物带病毒排泄物、分泌物污染的食物而感染螨媒革螨传播通过革螨叮咬传播恙螨传播通过恙螨叮咬垂直经胎盘传播孕妇患者或怀孕宿主鼠类经胎盘传给其胎儿传播经卵传递革螨或恙螨经卵将病毒传其子代（引自：宋干，预防医学文献信息，2002年）1.2.3人群易感性人群普遍易感，但研究发现，人感染HV病毒后大多为隐性感染，仅有少[64][65]数人发病。陈化新等对1984－2000年全国肾综合征出血热监测数据分析结果显示，健康人群汉坦病毒隐性感染率平均为3.14%。不同疫区类型不同性别健康人群的隐性感染水平不同，在家鼠型疫区女性从事家务劳动较多，其感染率要高于男性，而混合型疫区、姬鼠型疫区则相反，这是由于男性野外活动6 范围和作业场所接触到HV的可能性要多于女性。高发乡镇的隐性感染率高于低发病乡和非发病乡。与患者和传染源接触人群的隐性感染率要高于一般人群[65]。HFRS病后可获得稳固而持久的免疫，极少见到二次感染发病的报告。我国曾经有部分出现暴发或流行的家鼠型疫区，其发病逐年降低，并呈现稳定散发状态，这有可能是由于当地人群在日常生活中接触到HV后，感染但未发病，从而导致人群中隐性感染率处于一个较高的水平。人群中HV病毒虽持续传播，但通过提高隐性感染率和维持较高的免疫接种水平，可限制HFRS再次出现暴发流行。1.3流行特征1.3.1地区分布1.3.1.1世界分布HV病毒在全球分布广泛，遍布六大洲78个国家，但主要分布在亚洲，其次为欧洲和非洲，美洲病例较少。存在HFRS疫源地共有62个国家，其中，亚洲19个、欧洲35个、非洲5个、大洋洲2个、美洲1个。HCPS疫源地16个，全部为美洲国家。而姬鼠型HFRS的疫源地为欧洲巴尔干半岛、俄罗斯远东地区、朝鲜半岛和中国，家鼠型HFRS疫源地分布在东南亚、西亚和中国。[66-73]欧洲北部、中西部是流行性肾病的流行区域。1.3.1.2我国分布我国是受汉坦病毒危害最严重的国家。20世纪30－40年代，本病分布仅限于黑龙江、吉林等东北地区。50年代仅有8个省（市、自治区）有病例报告，疫情主要集中在东北、西北；进入60－70年代后，全国疫情呈现了扩大蔓[18、74]延的趋势，11个省市报告新发病例；1981年在中国发现家鼠型HFRS疫情后，全国出血热发病大幅度攀升，疫情迅速扩散至各省（市），华北、华南等地区相继出现病例。1986年发病数达到最高值，发病地区波及25省1257个县，[18、62、63、75-82]其中一半是1980－1986年新发现疫区。在过去的二十年间，中国整体的HFRS发病率呈现下降趋势，从3.05/10万下降到0.84/10万。然而[83、84]SEOV型HFRS的比例仍在持续增加。7 1.3.1.3吉林省分布1955年吉林省报告首例HFRS病例。随后的四十年间，疫源地分布范围逐年扩大，其流行的型别逐步多样化。1998年后以家鼠型、混合型为主的疫区逐年增多，其地域分布、流行型别、优势鼠种及带毒率等都在发生着明显的变化[85、86]。长春市作为吉林省的高发区域，1959年报告首例病例，历经低发平稳、逐年上升、持续高发、总体下降、相对平稳五个阶段。在90年代前疫情始终保持在低发平稳状态，以散发为主，主要分布在农村。1998年首次检出首尔病毒后，出血热疫区不断扩大，发病人数明显上升，发病率从1997年全省第五位上升到第二位。至1999年人群HFRS发病已扩散到10个县（市）区，不同区域流行强度存在明显差异，并在城区发生两起由实验动物感染出血热造成人间发病的特殊疫情。随后疫情强度持续攀升，2004年和2005年达到顶峰。近5年来，疫情维持在一个相对平稳的水平，总体发病人数虽呈下降趋势，但疫区范围仍在不断扩大，高发区域发生明显变化，部分地区流行强度持续上升，防控形势依然十分严峻。1.3.2时间分布HFRS发病有一定周期性波动，以姬鼠和棕背平为主要传染源的疫区一般相隔数年有一次较大流行。本病一年四季均有病例报告，但其发病有明显的季节性分布特征。不同类型疫区感染的病毒基因型别不同，HFRS的发病高峰期明显不同，其主要宿主动物种类亦有所不同。野鼠型HFRS主要传染源为黑线姬鼠，感染病毒为HTNV，发病为单峰型，高峰一般出现在秋冬季节（从10月到次年1月）；而家鼠型HFRS主要传染源为褐家鼠，感染病毒为SEOV，流行[83、87、88]高峰通常在春季和夏初（从3月到6月）。混合型疫区主要传染源为黑线姬鼠和褐家鼠，HTNV和SEOV同时存在，发病呈双峰型，但优势鼠种携带的病毒的季节性特征表现得比较明显。其季节性分布与鼠类繁殖、活动及与人[89]的活动接触有关。当疫区的流行季节发生变化时，疫区性质也会相继发生改变。20世纪80年代以前，我国历年HFRS发病季节全是姬鼠型的秋冬季高峰。1981年在黄河中下游地区暴发家鼠型HFRS流行后，随着疫情的蔓延，HFRS发病季节性特征也发生了变化。至1986年全国春季病例数所占比例达到8 [10、40.8%，而秋峰则下降至36.9%，其中华北、华中、华南等地区改变最大62]。1.3.3人群分布HFRS发病存在着年龄、性别以及职业分布差异，这主要与人群接触感染机会不同有关。1984－2000年全国HFRS监测数据显示，男性占67.9%，女性[65]占32.1%，这与青壮年及男性从事野外作业的时间和机会比老年、少年、女性多有关。姬鼠型和家鼠型HFRS发病人群分布有明显不同，家鼠型HFRS发病的性别、年龄及职业差别较小。因为各年龄组人群在居民区及其周围环境中，与主要宿主动物褐家鼠接触机会相对平均，感染几率大致相同。各种职业人群均可感染发病，但常以农民、工人及其他野外作业工作者为高。在春耕、秋收季节，由于农民长时间从事户外劳作，与鼠类接触频率增高，其发病率会随之增加。1.4宿主动物与相关环境因素HFRS自然疫源地和疫区的分布取决于HV病毒宿主动物和HFRS传染源的分布范围，而环境和社会因素影响鼠类的栖息生存环境、种群构成和繁殖密度等，从而对HV病毒在自然宿主体内持续从动物传播到人产生一定影响。1.4.1环境因素研究表明，土地利用类型，例如水田，旱地，疏林地，草地和水域是[90]HFRS发病的影响因素。方立群等发现建筑用地、园地和稻田与HFRS发病呈明显的相关性，居住在建筑用地缺乏，园地、稻田较多的乡镇居民是HFRS发病的高危人群。土地利用类型的改变对HFRS的分布可能会产生一定的影[91]响。另有YanLei等报道，农业用地（包括水田、稻田等）、林地、园地与HFRS发病具有关联性，森林工人和农民增加了感染发病的几率。[65]陈化新等研究证实，中国HFRS自然疫源地和疫区具有明显的地理景观特征。其发病与海拔呈负相关，病例主要分布在海拔500m以下的平原和丘陵[82、83]地带，但在海拔2000m以上地区也能见到。Mills和David等调查研究发现美国四角地区出现的HCPS发病率也与海拔呈现一定的关联性，在高于9 2500m时无病例报告。1.4.2气候因素[80]宿主动物的种群密度、繁殖及HV感染带毒状况受到气象条件的影响，[83]HFRS发病与降水量、温度和湿度密切相关。由于强降水增加了牧草产量，[67、94、95]使鹿鼠密度增高，从而引起美国四角地区出现HCPS的暴发流行。相反，雨水量过大会破坏鼠类生存栖息环境，频次过多会减少鼠类之间、鼠类与[90、96、97]人类之间的接触频率，从而降低人类暴露发病的可能性。HFRS病例的[67]发生与温度有着密切的联系，Engelthaler等报道月平均温度在0～24℃时更易发病。1997年智利HCPS的暴发也与当地冬季气温回升而导致的长尾茎鼠大[98][91]量繁殖有关。而YanLei等认为年积气温不同的地带，HFRS发病明显不同。年积气温低于1600°C的寒冷地带，HFRS发病率高于年积气温在3,400–[65]4,500°C和4,500°C–8,000°C的温带、亚热带。陈化新等研究表明，我国疫源地主要分布在东部季风气候区和东部森林土壤区域。但近20年来监测资料显示，我国东北寒冷地带HFRS发病率较高，而南方高温、潮湿和多雨地区发病[88、91]较低。因此，温度对HFRS发病影响的机制仍需进一步加强研究。HV病毒主要宿主动物黑线姬鼠和褐家鼠具有喜湿性，适应在多水带、过渡带生存和[65]繁衍。湿度不但影响宿主动物的种群分布，而且对病毒的传染性、稳定性也[99-102]会产生一定影响。有研究报道，在北坡上捕获的鼠类带毒率高于南坡捕获[103]的鼠类，这与北坡湿度高有关。气象条件可用来预测一个地区HFRS的发病强度，但仍需加强研究，明确其与鼠类栖息生境之间关系的潜在机制。汉坦病毒在人群中感染发病和传播还受到其他因素的影响，如人类生产活[104]动、经济条件、耕种模式、灭鼠措施、人和鼠的免疫状态等。因此，应综合分析各类因素影响的大小，深入开展相关危险因素研究。1.5临床表现HFRS潜伏期4－46天，一般为7－14天。患者的临床表现复杂，症状与体征差异较大，病情变化非常迅速。典型病例具有发热、出血和肾脏损害三大特[105-107]征，并可表现出特有的五期经过。10 1.5.1临床症状与体征1.5.1.1发热期主要有发热、感染中毒症状、毛细血管损害征、出血及肾脏损害。大多数病人起病急骤，畏寒或寒颤，继之高热。体温一般在38－40℃以上，最高可达41.5℃。通常患者的温度越高，病情越重。以弛张热和稽留热为多见，热程多在3－7天，如高热持续超过6天者，病情多危重，易发生病期重叠。具有全身中毒症状，主要表现为头痛、腰痛和全身酸痛，部分病例有眼眶痛。消化道症状明显，常有食欲减退、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等。重病例伴有烦躁不安、谵语、嗜睡等。毛细血管和小血管具有渗出和出血现象。第2－3病日通常出现[105-107]蛋白尿。1.5.1.2低血压休克期一般发生在第4－6病日，通常持续1－3天。主要表现为血压改变，波动不稳，收缩压<13.33KPa（100mmHg），脉压<3.47KPa（26mmHg），休克时收缩压<9.33KPa（70mmHg），甚至测不出。患者多有心率加快，严重者可出现前收缩、奔马律、胎心音和各种类型的心律失常。肾脏损害加重，酸碱代谢和电解质紊乱。在本期，易发生一个以上系统（器官）的功能衰竭，可涉及肾脏、心[105-107]血管、呼吸、凝血、代谢和中枢神经等，是本病的主要死亡原因。1.5.1.3少尿期少尿期多发生于第5－8病日，与低血压期常无明显界限，多继低血压休克期发生或同时存在。少尿期与低血压期重叠者往往肾功能损害严重，预后不良。24h尿量少于1000ml或每小时平均少于40ml为少尿倾向，24h尿量少于500ml或每小时平均尿量少于17ml为少尿。这个阶段对肾脏损害最为严重，能够导致出现肾衰，同时可伴有肺部、脑部、消化道等多器官的并发症。一旦发[105-107]生，病情常迅速恶化，甚至导致患者死亡。1.5.1.4多尿期多尿期患者尿量明显增加。但尿量越多，说明肾脏损害越重。有少尿期的病例本期可分为移行阶段、多尿早期、多尿后期三个阶段。由发热期或低血压11 [105-107]期直接进入多尿期的患者，症状不久即可得到改善。1.5.1.5恢复期病后3－4周进入恢复期，尿量逐渐接近正常，尿比重和渗透压逐渐好转。食欲明显增强，身体逐渐康复，各种临床检查指标基本正常。恢复期各种症状的发生与HFRS急性期各器官、系统病理损害有关。轻、中型恢复期症状少，且90%左右的患者可在两个月内基本恢复，而重型、危重型病人恢复期症状[105-107]多，时间长，基本恢复需3－6个月或更长时间。1.5.2临床分型[107-根据患者的病情轻重程度，可分为四型，即轻型、中型、重型及危重型109]。轻型：①体温一般在39℃以下，中毒症状较轻；②血压基本正常；③很少能够发现有出血现象；④肾脏损害不明显，尿蛋白（+）－（++），无明显的少尿期。中型：①体温波动在39－40℃，中毒症状重，外渗现象较明显；②收缩压<90mmHg或脉压<26mmHg；③皮肤、粘膜有明显出血现象；④肾脏损害明显，尿蛋白（+++），有明显的少尿期。重型：①体温≥40℃，全身中毒症状、外渗现象严重，或出现中毒性精神症状；②收缩压<70mmHg或脉压<26mmHg；③腔道、皮肤和粘膜出血；④肾脏损害严重，少尿期<5日或尿闭<2日的患者。危重型：在重型病例的基础上，出现下列任何严重症候群者：①难治性休克；②严重出血现象，某些重要脏器有出血；③肾脏损害极其严重，少尿>5天或尿闭>2天，或尿素氮>120mg/dl；④心衰、肺水肿；⑤中枢神经系统合并症；⑥严重的继发感染；⑦低血压期、少尿期重叠出现；⑧其他严重合并症。1.6实验室检测技术1.6.1血清学检测方法1976年，李镐汪和李平佑使用HFRS患者的恢复期血清成功地从感染HV12 的黑线姬鼠肺、肾切片上检测到HV抗原，并同时在血清标本中检到特异性抗[13]体，从而建立了HV病毒抗原、抗体的免疫荧光技术（IFA）。其方法可靠、[110、111]简便、特异、敏感，目前已成为诊断HFRS的常用方法，但其对实验室安全防护级别要求较高。1972年，Engvall建立了酶联免疫吸附试验（ELISA），1974年用于病毒学研究并获得成功。由于操作简便、定量准确、敏[112、113]感性较高，在医疗领域得到了广泛应用。2000年以来国内外先后成功开发了基于胶体金技术的免疫层析法，其方法检测时限短，尤其适用于基层医疗卫生单位，目前已在我国得到广泛应用。另外，血凝抑制试验（HI）、反向被动血凝试验（RPHA）、反向被动血凝抑制试验（RPHI）、空斑减少综合试验、免疫酶斑点试验和放射免疫沉淀试验等，也适用于HFRS的监测和实验室诊断。1.6.2分子生物学检测技术1990年，Tang等在美国首先报道了采用逆转录聚合酶链反应技术（RT－[114]PCR）鉴定HV病毒的血清型别研究。1992年，Puthavathana等采用RT－[115]PCR方法对HV病毒进行了基因分型研究。瑞典的Grankvist等率先将RT－PCR用于HFRS标本的检测。自此，HV病毒的分子生物学研究取得很大进[116、117]展，可对已发现的病毒毒株进行型别鉴定，并用于发现新型HV病毒、[36、118]追溯感染来源、研究传播途径及基因克隆、序列分析等。1995年美国PE公司研究出实时荧光定量PCR技术，近年来在HV病毒研究中得到了广泛应用。德国KramskiM等研发了5种实时RT－PCR实验，其中2种是针对检测HNTV、SEOV和ANDV、SNV病毒。实时荧光定量PCR技术实现了对整个PCR测定过程的实时监控，对临床分子诊断具有划时代的意义。1.7预防和控制由于本病具有多宿主、多传播途径、多流行类型及受自然因素、社会因素影响较大等特点，这决定了HFRS预防和控制工作的复杂性和艰巨性。目前，[18、119]我国主要采取以灭鼠、疫苗接种和宣传教育为主的综合性防控措施。1.7.1灭鼠防鼠灭鼠防鼠是控制本病流行的主要措施之一，在疫区应搞好对主要宿主鼠种13 的防灭措施，并兼顾其他鼠种。灭鼠时机应选择在本病流行高峰（5－6月和10－12月）前进行。春季主要灭家鼠，初冬重点灭野鼠。指标：无论家鼠、野鼠，灭鼠后的密度都要低于3%。目前常用的有器械法、药物法、生物法和生态法四大类，其中以药物法中的毒饵灭鼠最为有效，在大规模灭鼠运动中应用最广。常用药物有急性和慢性灭鼠剂两类，如敌鼠钠、杀鼠灵，灭野鼠的有磷化锌、毒鼠磷、万敌鼠钠、氯敌鼠等。毒饵法灭鼠收效高，但缺点是使用不慎可引起人、畜中毒，故在田野投放毒饵的3天内应派人看守，3天后应将多余的毒饵收回销毁。家庭灭鼠要在晚上入睡前安放毒饵、白天收回。因鼠类的繁殖能力极强，所以灭鼠工作应持之以恒，略有放松，即前功尽弃。在灭鼠为主的前提下，同时做好防鼠工作。如床铺不靠墙，睡高铺，屋外挖防鼠沟，均可防止鼠类进入屋内和院内。新建和改建住宅时，必须遵照防鼠要求，安装防鼠设施。1.7.2灭螨防螨要根据疫区的实际条件组织实施。在HFRS高发区进行施工、农垦、野营等野外作业单位应定期对有螨的工棚、宿舍和编草垫用的稻草进行消毒处理。要保持屋内清洁、通风和干燥，室内不堆放柴草，铲除住房周围杂草，以减少螨类孳生场所和叮咬机会。1.7.3加强监测掌握疫情动态，对疫源地和疫区进行监测是预防HFRS的一项重要工作。内容包括人间疫情监测、鼠间疫情（或称宿主动物和传染源）监测、疫区监测、病原类型监测、传播途径监测、易感人群免疫情况监测、预防（控制）效果监测和主要宿主动物的生态学研究等。目前，各疫区普遍开展的主要是人间[18、119]疫情和鼠间疫情监测。1.7.4预防接种疫苗接种是控制HFRS的主要手段之一。自各型HV病毒分离成功后，国内外学者已研制出数种灭活疫苗，并已取得良好的防病效果。疾病预防部门应根据疫区类型选用适合的疫苗，接种对象为疫区居住的居民及进入该地区工作14 的人员，主要目标为16－60岁的高危人群，但患有发热、急性疾病、严重慢性病、神经系统疾病、过敏性疾病及既往对抗菌素和生物制品有过敏史者，妇女哺乳期、妊娠期均不可给予注射。接种疫苗后，应对免疫效果进行观察和评价。接种覆盖面应在80%以上，以形成有效的免疫屏障。1.7.5食品安全及其管理在本病疫区，特别是家鼠型疫区，要设置防鼠设施，避免鼠类的排泄物污染到食品或餐具。如有剩饭剩菜必须在加热或者蒸煮后才可以食用。粮食储存要做好防鼠措施。1.7.6加强个人卫生和个人防护疫区居民及从事野外作业人员要注意个人卫生，不要直接用手接触鼠类及其排泄物。接触鼠、螨较多的人员要做好个人防护，田间作业时应穿鞋，扎紧袖口、裤脚口，衣服高挂，不卧草地或草堆；对裸露的手、脸、颈部皮肤可涂擦驱避剂，劳动时注意防止皮肤破伤。作业后，要及时换衣、洗澡及擦澡，减少被螨叮咬机会。1.7.7宣传和培训加强对基层卫生工作人员的培训工作，提高医护人员及疾控工作者疫情处理和诊疗的水平。要加大宣传力度，充分利用电台、电视台、网络等媒体，全方位、多层次、多渠道持久性地开展HFRS防病知识宣传，要注意宣传效果，做到宣教结合。除利用现代宣传媒体外，要将宣传单送到农村家庭，全面提高群众预防HFRS的知识水平和能力。1.8地理信息系统及其在HFRS研究中的应用1.8.1地理信息系统1.8.1.1概述地理信息系统（geographicalinformationsystem，GIS）是采集、存储、管理、分析和输出空间数据特征的一种计算机支持系统。它运用数据思维和空间15 分析思维，将抽象、繁冗的数据文件转化为可表达的图形。这对于传统意义上[120-122]的数据利用和分析具有质的改变。近年来，GIS广泛应用于公共卫生领域，在疾病监测及流行病学研究、环境健康研究、卫生服务利用与决策、突发[123、124]公共卫生事件应急处置等方面发挥了巨大的作用。1.8.1.2GIS的组成GIS计算机软件系统包括5个方面：①数据的采集和输入：将空间数据处理后输入到GIS系统中，使其能够被系统识别，为下一步数据管理和分析做好基础准备工作；②数据管理：GIS地理数据库主要用来存贮空间数据、专题数据，以及其他各类数据，它可以管理一切数据，具有数据的定义、维护、查询和通讯等功能；③空间分析：可对空间数据进行分析和运算，为GIS的具体应用提供分析处理后的信息。通常有地形分析、叠置分析、缓冲区分析、网络分析等基本的分析功能；④数据输出：利用GIS的表现工具，将数据的空间特征以报告、表格、图形的方式进行表达；⑤应用模块：这是应用于某种特定任务[125、126]的GIS软件模块，可以根据用户目的不同开发出相应的应用模块。1.8.1.3地理空间数据的基本特征地理空间数据的基本特征主要包括：①空间位置特征：地理空间数据须标明每个地物的地理空间位置成分，这类数据可称为空间特征数据。包涵两层含义：一是地物的地理位置，通常选择某种地理座标或者其组合用来表示，也可以对其他的参照系统或者地物位置来描述；二是绝大部分空间数据具有明显的几何特点，所以有时也称为几何数据。这是区别于其他数据的本质特征；②属性特征：指与空间数据相对应地点的地理、环境、人文等指标，这部分数据称为属性特征数据。它与空间特征数据存在一一对应关系，是应用GIS技术最本质的核心部分；③时态特征：指地理数据采集或地理现象发生的时刻或时段，这部分数据称为时态特征数据。同一地物的多时态数据可以动态地表现该地物[127、128]的发展变化。在流行病学研究中，搜集到的数据多为个案资料或某个区域的发病情况，其本身发生地地理位置明确，可以用经纬度进行地理编码。而每个地点具有其特有的地形地貌、植被覆盖、气候条件和人文经济状况，其属性特征清楚。在16 不同时点将其空间分布特征及其与影响因素的关系动态反映出来，可以分析不同阶段疾病的变化情况及趋势，并对下一步开展预警预测工作提供技术支撑。1.8.1.4空间分析空间分析是基于地理目标的位置和形态特征的空间数据分析技术，主要用于提取和传输空间数据信息。应用GIS等相关技术进行空间分析，可以科学、高效地将地理特征间的相互关系和空间分布模式准确地表达出来。空间分析可分为两个层次：第一层次为空间查询。空间查询是GIS系统的基本功能。可利用地理位置数据查询属性数据，也可由属性数据查询位置特征。如果指定具体区域，可查询该范围内地物的空间位置和属性特征。查询结果可通过图形、图像进行可视[113]化表达。在禽流感疫情中，即使用GIS系统查询了我国主要水系、湿地的分[129]布情况，并提取了疫情发生地的交通网络。在血吸虫、肝吸虫等疾病的调查研究中，使用GIS收集了疫情发生地及周边的土壤类型、土壤覆盖和地形坡度[130、131][132]等资料。Beck等用GIS确定了村庄周围环境的湿地与杂草所占比例，并用来预测了墨西哥南部地区的疟疾传播媒介白魔按蚊的丰度及分布。第二层次是空间分析。空间分析是对GIS数据库中的属性数据进行统计分析，包括叠置分析、矢量数据分析、三维分析等。其中叠置分析是利用多重属性的数据进行多因子综合分析，这在流行病学研究和疾病预防控制的实际工作中应用较为普遍。空间模型分析是将GIS与某个专业领域的知识进行结合后，开发获得的系统。它可以包括主要属性数据和因素，用于研究变量之间的关系[128]。空间分析在流行病学领域得到了广泛应用，2006年探讨广东省食管癌分布特征及其相关环境因素时，即在地理信息系统及遥感支持下，提取了该省分县的气候因素数据，并得出结论，认为食管癌的死亡率与多项气候因素、植被指[133]数及海拔高度呈相关性。在非典疫情处置中，许多学者利用GIS技术分析了SARS的扩散分布模式，并建立模型，开发控制与预警、辅助决策支持系统[134、135]等，可对疾病进行早期预报、预测。17 1.8.2地理信息系统在HFRS研究中的应用HFRS为自然疫源性疾病，具有空间分布不均衡性的特点。HV病毒的传播受到宿主动物种群类型、生存繁衍的影响，而不同的宿主动物适应不同的生存栖息环境。应用GIS技术分析HFRS的空间分布特点，研究疫区类型与主要宿主动物构成的关系，并将其与环境和社会因素叠加，进行分层聚类分析，获取影响HFRS发病的危险因子，建立回归模型可以较好地分析和预测HFRS疫源地的分布，具有明显的现实意义。目前，GIS在HFRS研究中的应用可分为以下三个方面：1.8.2.1空间分布特征研究[136-139]2003年方立群，曹务春等利用遥感和GIS分析了中国肾综合征出血热的空间分布，建立了我国HFRS危险区域分布图，非常直观地显示出我国HFRS的四个高发区。2004年利用GIS对中国HFRS疫区的类型、主要宿主动物的种群构成以及二者之间的联系进行分析，建立了中国HFRS主要疫区人群HFRSⅠ型构成以及野外主要宿主动物构成图、HFRSⅡ型构成以及居民区主要[46]宿主动物构成图。随后，陆续有学者运用遥感技术对本区域内HFRS发病的时空分布特征进行描述，并研究HFRS空间分布的异质性，分析不同类型疫区[83、90、140-142]的地理环境特点，为科学开展预防和控制工作奠定基础。1.8.2.2空间分布影响因素分析国内外一些学者已成功运用GIS和RS技术来研究汉坦病毒、宿主动物及[143-146][147]其环境之间的生态学关系。Gregory等使用遥感和GIS对美国西南部地区1993年爆发的汉坦病毒心肺综合征进行研究，结果表明，该病与植被指数[148、149]有相关性。赵文娟等基于空间信息技术研究了北京市HFRS宿主动物汉坦病毒感染分布与地理环境要素之间的关系，认为宿主带毒率与海拔、园地、[91、150]水浇地面积成正相关，与校正植被指数之间无相关性。LeiYan等利用遥感和GIS分析了中国HV病毒与环境因素之间的关系，认为林地和园地是HFRS宿主动物的适宜生存环境。种植小麦、玉米的半水层土壤可为宿主动物提供充足的粮食。18 1.8.2.3建立空间模型预警预测[151、152]2006年，王磊，刘起勇等报道应用GIS可进行网络和仿真模型分析，使模型化的数据能以直观的形式表现其内在属性，以便于人们从数据中分[153、154]析得到不同的有用信息，应用于不同的用途。方立群等利用空间信息技术和信息可视化技术建立了肾综合征出血热防治决策应用系统，它综合集成HFRS监测数据、传播媒介及动物宿主、相关地理环境等数据，可为HFRS现场流行病学调查、数据管理与分析、鉴别诊断、媒介与动物宿主识别、地图制作等提供工具，为疾病预防控制工作决策发挥了技术支撑作用。中科院与军科院在集成3S技术、虚拟地理环境技术基础上，设计了公共卫生突发应急反应的整体框架，建立了指挥中心与现场实时交流的突发公共卫生事件应急反应辅助[155]决策支持系统，为突发应急工作的处置提供了支持。1.8.3生态位模型及其应用研究生态位是指在生态系统中，每个物种的时空位置及功能关系，一般是按其食物和生境来确定。每个物种具有其独特的生态位，而且在不同的地理空间对气象、食物、土壤和地形地貌的适应要求也不完全相同，因此，可以形成不同类型的生物种群。生态位模型（ecologicalnichemodel，ENM）是利用生物种群已知的分布数据和相关环境变量，运用一定的运算构建模型，将与物种分布的生态空间与地理空间相关联，判断物种的生态学需求，得到的运算结果可投射到不同的时间、空间维度中，以达到预测物种实际分布和潜在分布的目的[156]。[157]2011年，Peterson等提出模型构建应符合3个前提条件：①物种的分布广泛，在适宜生境条件中均已存在；②不考虑物种间的相互作用，物种本身的迁移能力强；③物种的生态位相对保守。HFRS的发生和分布主要受宿主动物的影响，而其宿主动物在全球分布范围广泛，其本身迁移性强，传播速度快，不同种类有不同的生境适宜性。因此，我们认为生态位模型适用于影响HV病毒宿主动物的环境因素特征研究。[158]2006年，Jane等报道16种软件可建立生态位模型，如最大熵模型（MAXENT）和规则集遗传算法（GARP）等。MAXENT是基于熵最大原理，19 认为在已设定的特征参数的限制下，熵最大的模型是与训练数据最匹配的、最真实的，预测结果的风险性也最低。MAXENT可以将种群的分布数据与其所在环境和社会因素进行匹配，研究影响种群分布的主要因素。在满足一定的限制条件下，查找到熵最大的概率分布作为最优分布，此方法适用于物种的适宜生[159]境预测。GARP预测基于遗传算法原理，将预测数据随机分为训练数据及验证数据，并通过不断迭代从规则集中归纳出一种方法，并应用于训练数据，生成一个法则，并用验证数据判断该法则可否提高预测准确性，反复多次运行后[160][161、162]形成模型，可用于预测物种的潜在分布区域。2010年马松梅等运用上述两种方法分别对裸果木的潜在分布区进行预测，结果认为，MAXENT更适合于模拟分布数据有限、生态位窄的物种。生态位模型作为一个新兴的研究领域，已被广泛应用于各个行业，也为疾病预防控制研究开辟了新的途径，已陆续有利用生态位模型对禽流感、疟疾、[163-165][166]鼠疫、霍乱等疾病进行研究的报道。Levine等应用GARP建立了登革[167]热的生态位模型。刘静远等对塞拉伊蚊在中国的潜在分布进行分析预测，确[168]定了其高风险地区。Moffett等建立了10种按蚊的生态位模型，对非洲疟疾[169]发病情况进行了分析和预测。徐敏等利用最大熵生态位模型，基于地理、气候环境因素对中国霍乱弧菌的适生度进行分析，并根据适生度分布图选取合适[170、171]的阈值对中国发病风险进行分区预测。卫兰等在GIS基础上建立了HFRS的生态位模型，筛查了携带HV病毒的宿主动物生存、繁衍的适宜生境，确定了影响HFRS分布、HV病毒传播的主要环境危险因素，并进行了风险预[172-174]测。肖洪等分析了2005－2010年湘江中下游地区HFRS发病的时空分布特征，并结合地理信息系统、遥感技术和最大熵值法生态位模型探索了该地区HFRS传播风险和主要环境危险因素。1.9本研究的目的和意义1959年长春市报告首例病例。随后的40年间，疫情始终处于低发平稳阶段。上世纪90年代末，该市HFRS疫情呈现急剧上升趋势，至2005年发病达到顶峰，随后开始下降。HFRS的流行强度明显变化、高发区域迁移和季节性分布特征发生改变的原因及潜在的危险因素尚不清楚，有针对性落实疫苗接种20 和灭鼠工作仍存在困难。亟需引进新思维、新技术深入开展HFRS的流行病学、病原学研究。本文旨在探讨不同空间尺度、不同流行阶段HFRS发病的时空分布特征，分析其与畜牧业、气象条件和土地利用类型之间的关系，评价各环境因素对动物宿主种群分布及其感染的影响程度，从基因水平上分析HV病毒亚型及其变异程度。研究结果为明确长春市疫源地特征分析，划定重点防治区域，以及制定防控策略提供科学依据。21 22 第2章材料与方法2.1研究地区研究区域为长春市（北纬43.26°－45.3°，东经124.5°－127.2°），位2于中国的东北部，是吉林省省会（如图2.1）。其占地面积为20660km，10个县（市）区共760万人口。朝阳，绿园，南关，宽城和二道属于城区。其他5个县市区（如双阳，九台，农安，榆树和德惠）为外县（市）。榆树、德惠、九台和农安是重要的水稻和玉米的粮仓。畜牧业是长春的重要经济产业，特别是梅花鹿养殖。Figure2.1LocationofChangchuncityinChina.23 2.2资料来源2.2.1疫情资料长春市自1953年开始监测HFRS，但1987年前为手工报表，数据完整性无法考证。自1987年开始，市本级使用计算机统计发病数据，资料保存较完整。2004年国家启动传染病网络直报系统后，数据由统计汇总变更为个案报告，可收集内容更加详细、准确。本研究数据由三部分组成：一是1988－2012年HFRS分年、分月、年龄和职业统计数据，来源于长春市分年度传染病疫情资料汇编和国家疾病监测信息报告系统；二是2004－2012年长春市HFRS发病数据和传染病个案报告卡资料，内容包括每例病例的性别、年龄、家庭住址和发病日期等，通过查询国家疾病监测信息报告系统获得；三是长春市疾病预防控制中心整理提供了1999－2010年鼠密度和鼠带毒率调查数据，收集同期HFRS疫情数据、监测数据。所有数据录入EXCEL2010软件，核实后，分别建立长春市HFRS发病数据库、病例个案信息数据库、鼠情监测数据库；本研究中HFRS的诊断标准发生过变更，1950年，HFRS纳入乙类法定传染病进行管理。中国预防医学科学院（现中国疾病预防控制中心的前身）制定[175][139]了该病报告的标准程序；1983年前，根据国家指南进行临床诊断。临床诊断标准包括：暴露史（如发病前1－6周的田间工作史，鼠类和其粪便，唾液，尿液暴露史）；8种急性临床症状中至少2种（例如，发热，寒战，出血，头痛，腰痛，腹痛，急性肾功能不全，低血压）；充血，水肿，出血倾向，血尿常规异常；临床经历五期或者其中一部分（例如发热期，低血压休克[138]期，少尿期，多尿期和恢复期）。1983年后，通过流行病学史和患者的症状体征进行临床诊断，同时也采集患者的血样标本开展血清学抗体检测[84、175、176]（IFA）、汉坦病毒分离、汉坦病毒RNA检测进行确诊。24 2.2.2专题数据2.2.2.1气象资料来源于中国气象数据共享平台（http://cdc.cma.gov.cn)。获取1988－2012年长春市年平均温度，全年总降水量和年平均相对湿度等基本气象信息后，建立气象信息数据库。2.2.2.2土地利用数据通过地球系统科学数据共享平台（http://www.geodata.cn/）和中国科学院东北地理与农业生态研究所，收集了长春的土地利用情况（1990年，1995年，2000年，2005年和2010年），获得每个县（市）区农田、林地、草地和建筑[177、178]用地的覆盖率。提取了2004－2012年9种类型的土地利用数据，包括水田、旱地、稻田、林地、草地、灌木林、建筑用地、祼土地和水体。2.2.2.3畜牧养殖情况从长春市统计年报中收集了1988－2012年该市每个县（市）区大型动物（牛，马，驴和骡）、羊和鹿的养殖数量。使用上述数据计算动物的种群密度，用于影响长春市HFRS发病的空间、时间分布的危险因素分析。2.2.3基础地图数据数据来自于国家测绘科学研究院。收集长春市1:10万的数字地图，在ArcGIS9.3（ESRI公司，Redlands，CA，USA）校正后建立坐标系，对长春市乡镇边界和变量等图层进行矢量化，建立长春市数字地图图层。2.2.4人口资料各县（市）区人口数据来源于长春市统计局。乡镇尺度的人口数据来源于中国疾病预防控制中心基本信息系统。2.2.5鼠肺标本来源2010－2012年在全市开展鼠情监测，并进行鼠带毒率调查。双阳区作为国家级监测点，连续3年在春秋两季，分别在居民区和野外捕鼠，全年共200只25 以上。除双阳外的其他9个县（市）区均为市级监测区域，每年随机选择3－4个县（市）区在春季进行捕鼠，每点捕获50－100只。在无菌条件下，采集鼠肺标本，使用液氮罐储存运输，-80℃冰箱保存。2.3方法2.3.1HFRS时空分布特征分析2.3.1.11988－2012年流行病学特征分析使用Stata10.0软件的邹检验对HFRS月发病数据进行检验，确定拐点为1998年，使用Origin软件绘制不同阶段的流行曲线。并以此为界，将长春市HFRS划分为两个不同的流行阶段。分别计算1988－1997年、1998－2012年长春市10个县（市）区HFRS累计年平均发病率。按照流行强度划分为不同图层，使用渐变颜色代表，与长春市县级行政单元的边界地图图层进行空间关联，利用ArcGIS9.3建立该市HFRS发病率的空间分布趋势图。为研究不同阶段各县（市）区季节性分布特征，将每年划分为两个时间段，即分别计算各地春夏季（2－7月）、秋冬季（8月－次年1月）的发病构成比例，将使用红黑两色表示的饼图引用在地图上，建立HFRS季节性分布地图。用双阳区（长春市HFRS流行热点地区）和其他9个县（市）区25年月平均发病率的柱状图表示HFRS发病的季节性分布特点。考虑到HTNV和SEOV引起的HFRS发病的季节特点不同，使用红色和黑色分别表示春夏季（2－7月）和秋冬季（8月－次年1月）的月发病率。同时绘制了1998年前后分年龄和性别的平均发病率柱状图、职业构成饼图。2.3.1.2在乡镇尺度分析2004－2012年HFRS分布特征及疫区类型使用Origin软件绘制长春市2004－2012年HFRS发病曲线图和季节性分布柱状图。整理各乡镇（社区）HFRS分年度的发病数据，计算发病率。按照流行强度，使用不同颜色显示发病情况。在乡镇尺度上，建立2004－2012年分年度平均发病率地图，动态显示长春市HFRS的空间分布。根据每例HFRS病例的现住址和鼠类捕捉地点进行查询，确定其地理编码，使用ArcGIS将病例、鼠26 类空间分布与长春市数字化地图进行关联，制作长春市人间疫情数据和鼠情监测空间分布图。2.3.2HFRS发病影响因素研究2.3.2.1县区尺度上HFRS空间、时间分布相关的影响因素研究将每个县（市）区HFRS累计发病数作为结果变量，人口数作为偏移变量。将每个县（市）区两个流行阶段潜在的危险因素，如畜牧业（大型动物，羊和鹿的平均密度），气候因素（平均温度，降水量和相对湿度）和土地利用类型（农田，林地，草地和建筑用地的覆盖率）作为分析的联合变量。PC是指给定变量的值变化引起发病率变化的百分比。由于离差偏大，在校正后计算295%可信区间（CIs）和P值。PC值的估计，用10头/km的差异表示畜牧业，1°C,1mm和1%的差异分别表示年平均温度，平均降水量和平均相对湿度的变化。1%的差异表示土地覆盖情况。单因素分析检验单个变量的作用。然后将单因素分析中P值<0.1的变量作为协变量纳入多因素分析。定量评估协变量之间的相关性，依次加入或者移除相关变量，用对数似然比的-2倍对模型进行优化。本部分使用STATA10.0软件（StataCorpLP，Texas，USA）进行分析。为探究长春市HFRS再度高发的影响因素，对1988－2012年双阳区和其他9个县（市）区的数据分别进行时间序列Possion回归分析。时间序列Possion回归分析HFRS的年发病数，年人口数作为偏移变量纳入分析范围。与上述描述的方法相同，单因素分析P值<0.1的所有变量纳入多因素分析。定量评估协变量之间的相关性，依次加入或者移除相关变量，用对数似然比的-2倍对模型进行优化。代表HFRS病例和决定性因素之间关系的PCs来自于最终的模型。每个PC估计值包含95%CI和P值。本部分也使用STATA软件进行分析。2.3.2.2乡镇尺度的HFRS环境影响因素分析在乡镇尺度上，将土地利用的变量与2004－2012年HFRS的发病个案数据进行关联，使用STATA软件，应用Zero-inflated泊松回归分析方法，验证海拔和土地利用类型与疾病发病的关系。用每平方公里人口数表示人口密度。各类土地利用类型的定义：水田指能正常灌溉的耕地；旱地指无灌溉水源，天然生长的耕地；稻田是指水稻与其他作物轮种的耕地；林地是指具有一定密度树林27 的地区；草地是指指以生长草本植物为主，覆盖度在5%以上的各类草地；灌木林是指有一定木本植物的区域；建筑用地是指人类的住宅、工业用地和已占用的各类道路；裸土地是指地表土质覆盖，植被覆盖度在5%以下的土地；水体包括湖泊，水库，池塘和各类的水道。所有的土地覆盖变量的单位是1%。单因素分析检验每个变量的作用，然后将P值<0.1的变量作为协变量纳入多因素分析。2.3.3HFRS宿主动物生态位模型研究2.3.3.1标本采集和宿主动物感染率调查综合HFRS的发病情况、地理分布特征，在全市统一布点，选取89个存在HFRS疫情的乡镇或街道开展鼠情调查，以减少相关季节性因素的影响，调查点分布见图2.2。根据中国疾病预防控制中心制定的监测方案要求，1999年－2010年期间，每年5月、9月使用夹夜法在监测点捕获啮齿类动物。每个采样点布置100－200个鼠夹，连续放置3晚。记录每个点位的地理位置信息，并计[179]算出鼠密度及构成。鼠名称和分类鉴定方法参考《医学动物分类鉴定》和[180]《肾综合征出血热监测及疫苗应用研究》。收集血液标本后，取出肺组织并在检测前置于液氮中保存。应用间接免疫荧光法（IndirectFluorescentAssay，[1]IFA）检测鼠肺HV抗原。Figure2.2Geographicdistributionof89samplesites,1999to2010,Changchun,China.28 2.3.3.2生态位模型建立和预测使用最大熵方法（MAXENT，version3.3.1）探索不同型别HV病毒的分布与环境相关变量之间的关系。本研究使用1999－2010年捕获的染疫动物中的阳性鉴定结果来构建模型，公式如下：P*为所有模型中熵最大的模型。各因素对模型的重要性主要通过其贡献百分比来判断。使用ROC（ReceiverOperatingCharacteristic）判断模型预测的效果，由曲线下面积（AreaUnderCurve，AUC）的大小来判断其预测的准确性。使用ArcGIS软件分别绘制HTNV和SEOV感染风险预测分布图，并使用不同颜色的图层代表不同型别病毒的感染风险。2.3.4HFRS基因分型及序列分析2.3.4.1免疫荧光法检测肺组织病毒抗原在长春市疾病预防控制中心P2实验室使用冷冻切片机（Thermo公司生产，HM525型）将鼠肺冷冻切成4－6μm厚度薄片，冷丙酮固定10min，用蒸馏水冲洗3次，吹干，每孔滴加10μl荧光素标记的单克隆抗体(HV病毒单克隆荧光抗体由第四军医大学生产，工作浓度1:10，分为SEOV型、HTNV型和共同型)，置湿盒内37℃水浴30min，取出，用PBS洗液进行振荡洗涤3次，再使用蒸馏水漂洗1次，吹干，在组织上滴加缓冲甘油，盖上玻片封片，使用荧光显微镜（OLYMPUS公司生产，CX41RF型）观察结果。结果判定：特异性免疫荧光呈黄绿色颗粒，分布在鼠肺组织的上皮细胞浆中，正常组织细胞呈暗红色。若镜下见到鼠肺组织的上皮细胞浆内有颗粒状黄绿色荧光即可判断为[1]HV病毒特异性抗原。阳性标本用于核酸提取、RT－PCR扩增、测序。29 2.3.4.2核酸提取将标本送至吉林省疾病预防控制中心后，在P2实验室进行核酸提取。取阳性鼠肺，研磨后，使用QIAGEN公司的QIAamp®ViralRNAMiniKit试剂盒提取RNA。2.3.4.3目的基因扩增使用Promgea公司的反转录试剂盒，用汉坦病毒特异性逆转录引物P14，按照使用手册操作说明反转录合成cDNA。以合成cDNA为模板，使用SEOV型特异性S片段引物HS1F/HS1R和特异性M片段引物HM1F/HM1R（见表2.1），PCR扩增部分S片段与M片段基因，PCR扩增反应条件为94℃预变性8min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸60s、共35个循环，72℃延伸10min，4℃终止反应。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，若条带的分子量于预期片段大小相同，则是特异性扩展产物。目的片段PCR产物纯化：切下特异分子量条带，用QIAquick凝胶回收试剂盒回收（按其说明书操作），并送至上海生工生物技术公司测序。Table2.1TheprimerofreversetranscriptionPCR引物序列（5’～3’）位片段（bp）逆转录引物TAGTAGTAGACTCC1~14LMSHS1FGTAAGCCCTGTCATGAGTGTAG682~703S（+）HS1RCTAGTGTACATCCAGCATCCTT922~901S（－）HM1FGTGGACTCTTCTTCTCATTATT1928~1949M（+）HM1RTGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG2333~2355M（－）2.3.4.4序列分析测序结果采用DNAMAN软件和MEGA6.0软件进行同源性、基因亲缘关系分析。本研究中使用的S片段726－920bp，M片段G2区1993－2343bp的部分核苷酸序列，用于比较分析的其他汉坦病毒序列来自于GenBank，见表2.2。30 Table2.2ThebackgrounddataofSEOVreferencestrainsGenebank登录号型别病毒株宿主来源SM(726－920bp)(1993－2343bp)SEOBaichengRn8褐家鼠中国吉林FJ884339－ChifengRn37褐家鼠中国内蒙FJ884342－GaomiRn9褐家鼠中国GU592941－Gongzhuling108褐家鼠中国吉林KF745947－HuludaoRn68褐家鼠中国辽宁FJ884358－QiananRn2褐家鼠中国吉林FJ884399－ShenyangRn139褐家鼠中国辽宁GU592951－WuhanRf08黄胸鼠中国湖北JQ665914－Z37褐家鼠中国浙江AF187082AF190119L99黄毛鼠中国江西AF288299AF035833ShuangyangRn50褐家鼠中国吉林－FJ884530Gongzhuling97褐家鼠中国吉林－KF745936Taonan52小家鼠中国吉林－KF745940BjHD01褐家鼠中国北京－DQ133505HBQ43褐家鼠中国河北－KM233657ZT10褐家鼠中国浙江－DQ159911GM04-38－中国山东－DQ46939780－39褐家鼠韩国－S47716ZB8－中国山东－DQ469396B－1褐家鼠日本－X53861HTNHTN_76－118黑线姬鼠韩国－M14627PUUPuumalaP360欧洲棕背俄罗斯L11347－DOBDobrava黄喉姬鼠斯洛文尼亚L41916－DOBVAF19黄喉姬鼠希腊－NC_00523431 32 第3章结果3.1HRFS时空分布特征分析3.1.11988－2012年流行病学特征分析3.1.1.1空间分布特征1988－2012年间共报告4251例病例，分布在10个县（市）区。但不同县（市）、区HRFS年发病率存在明显差异。其中，位于长春东南部的双阳区在两个阶段的年发病率均为最高（如图3.1），该区报告的病例数占全市总病例数的35.9%（1524/4251），但其人口数仅占全市总人口的5.6%。在第一阶段，九台、德惠、榆树三个外县（市）发病率略高于城区，但病例高度散发，未发生聚集性疫情。而城区病例少见，朝阳区和绿园区各2例、二道区、南关区各1例、宽城区无病例报告。在第二阶段，HFRS流行特征发生改变，地区分布范围逐渐扩大，第一阶段的低发区发病呈明显上升趋势，但高发区仍维持在较高水平。特别是九台市发病呈现大幅上升，发病率已跃居全市第二位。Figure3.1Thematicmapofannualincidenceforeachcountybeforeandsince1998,Changchun.33 3.1.1.2时间分布特征根据长春市HFRS月均发病曲线分析，长春市HFRS两个阶段流行情况呈现不同的发病特点：第一阶段为1988－1997年，共计报告病例323例，发病呈单峰型，主要集中在8月至次年的1月（图3.2黑色曲线）。这种模式是HTNV型传播的季节性特点。1981年后发病虽有上升趋势，但季节性分布特点未发生改变，仍以秋冬峰为主；第二阶段为1998－2012年，自1997年开始，是长春市HFRS发病的快速增长期，累计报告病例3928例，同时伴有发病季节性高峰的变化。发病出现两个高峰，其中秋冬峰虽略有增长，但春夏峰上升速度迅猛（图3.2红色曲线），表现为以春夏峰为主的双峰型特点，呈现SEOV型传播的季节性特点。在此阶段，双阳区发病率呈明显的双峰分布，春夏峰增长幅度较快（约10倍），而秋冬峰小幅增长（图3.3），与长春市整体疫情走势一致。Figure3.2TemporaldistributionpatternsofHFRSincidencebeforeandsince1998,Changchun.34 Figure3.3TemporaldistributionofmonthlyHFRSincidenceinShuangyangCountyandofthecombinedmonthlyincidencetotalsfortheotherninecountiesinChangchun.3.1.1.3人群分布特征第二阶段各年龄组发病均高于第一阶段。10岁及以下年龄组个别年份有散发病例报告。其他各个年龄组，男性发病均明显高于女性，但男女性别比例缩小（图3.4）。第二阶段职业构成多样化，农民所占构成比例降低（由85.96%降至68.91%），干部职员、家务待业发病人数有所增加。另外，外来务工人群所占比例呈现增长趋势，从1.71%上升至6.80%（图3.5）。35 Figure3.4Averageincidenceoveragegroupsandsexduringtwoepidemiologicalphases(1988–1997and1998–2012).Figure3.5OccupationalproportionsforHFRScasesduringtwophases(1988–1997and1998–2012).3.1.2在乡镇尺度分析2004－2012年HFRS分布特征及疫区类型3.1.2.1发病特征分析2004－2007年，长春市HFRS呈现逐年下降趋势，发病率由8.57/10万降至2.57/10万，HFRS的高发区域逐渐减少。自2008年进入发病平台期，年发病率始终控制在2/10万以下，发病相对稳定（图3.6、3.9）。时间分布曲线图显36 示，HFRS具有明显的季节性分布特征，发病存在春、秋冬两个高峰，以春峰为主（图3.7）。全市共119个乡镇有病例报告，不同乡镇（社区）报告发病率的差异较大。13个乡镇的累积发病率超过100/10万（图3.8），其中，榆树市和双阳区各3个乡镇、九台市和农安县各2个乡镇，城区3个社区。由家庭住址分布图可以看出，城区报告病例相对集中，外县（市）区发生的HFRS高度散发，除2004年在榆树市黑林镇曾出现一次聚集性疫情外，无其他聚集性发病。Figure3.6Annualincidenceofhemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,Changchun,People’sRepublicofChina,2004-2012.Figure3.7Temporaldistributionofhemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,Changchun,People’sRepublicofChina,2004–2012.37 Figure3.8CumulativeincidencerateofHFRSandrodentsinformation,Changchun,People’sRepublicofChina,2004-2012.*Per100,000populationFigure3.9Yearlydistributionofhemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,ChangChun,People’sRepublicofChina,2004–2012.38 3.1.2.2高发乡镇鼠情监测结果分析除1、3、11三个高发乡镇未开展监测工作外，其他10个高发乡镇鼠情调查结果显示，优势鼠种均为褐家鼠，其携带SEOV，是引起家鼠型HFRS的主要宿主动物。但在5、6、13三个乡镇同时捕获到野鼠，其携带HTNV，是引起野鼠型HFRS的主要宿主动物（见表3.1）。在地点13捕获了105只鼠类，8只HV病毒阳性，阳性率为7.62%。其中，SEOV（+）5份，HTNV（+）3份。Table3.1Rodentinvestigationinthetownship,2004－2012.SamplaingNorwayFieldRodentscoughtrate%Positiverate%SEOVHTNVtownratmouse1－－－－－－20.33（1/306）100003－－－－－－45（15/300）150000513.43（29/216）191000064.15（13/313）9400071.25（4/320）4000081.88（6/320）6000097.86（7/89）70000100.32（78/24320）78000011－－－－－－122（6/300）20000131.07（105/9850）56387.62(8/105)53Note:place1,3,11didnotcarryoutthediseasesurveillance39 3.2不同空间尺度HFRS发病的影响因素研究3.2.1县区尺度上HFRS空间、时间分布相关影响因素研究利用1988－2012年各县区的HFRS发病数据进行泊松回归分析，第一阶段的单因素分析结果显示，HFRS发病的空间分布与年降水量（p=0.030）和平均相对湿度（p<0.001）有关，HFRS发病率与鹿养殖密度有关（p=0.057）。多因素分析结果显示HFRS发病率仅与平均相对湿度有关（p<0.001），发病率随着相对湿度增加而增长。第二阶段的单因素分析显示，HFRS发病的空间分布与鹿养殖密度（p<0.001）和年降水量（p=0.005）有关，但在多因素分析中HFRS发病仅与鹿养殖密度有关（p<0.001），发病率随着鹿养殖密度增加而增长。在这部分研究中，以县区为单位分析HFRS发病与土地利用之间的关系，未发现有统计学意义（P>0.05）（表3.2）。双阳区的单因素时间序列泊松分析结果显示，HFRS发病率与大型动物的密度（牛、马、驴和骡子）、羊的密度、鹿的密度、平均温度、年降水量、平均相对湿度有关（p<0.001）。多因素分析结果显示，鹿密度每增加10头2/km，HFRS的发病率升高70.7%（p<0.001）。其他9个县（市）区的单因素分析结果显示，HFRS发病率与大型动物的密度（牛，马，驴和骡子）、羊和鹿的密度、平均相对湿度具有显著相关性（p<0.001）。多因素分析结果显示，2鹿的密度每增加10头/km，HFRS的发病率升高90.4%（p<0.001）。平均相对湿度每升高1%，HFRS发病率升高7.1%（p<0.001）（表3.3）。40 Table3.2FactorsaffectingspatialheterogeneityinHFRSincidenceinChangchun.Poissonregressionanalysisresultsaftercorrectionforover-dispersion.UnivariateanalysisMultivariateanalysisPeriodVariable(Unit)PC(95%CI)P-valuePC(95%CI)P-value1988-1997Livestockhusbandry2Largeanimals(10h/km)60.5(-68.9,729.4)0.572--2Sheepdensity(10h/km)-41.3(-81.6,87.4)0.368--2Deerdensity(10h/km)154.6(-2.6,565.4)0.057NS.NS.ClimatefactorsTemperature(1℃)-74.6(-95.6,48.0)0.128--Precipitation(1mm)26.7(2.3,56.9)0.030NS.NS.Relativehumidity(%)243.1(136.3,398.1)<0.001243.1(136.3,398.1)<0.001LandcoverIrrigatedcropland(1%)16.7(-2.0,38.9)0.084NS.NS.Rainfedcropland(1%)-2.8(-11.8,7.0)0.564--Forest(1%)4.5(-4.4,14.3)0.332--Grassland(1%)-28.8(-63.9,40.4)0.327--Built-uplands(1%)-25.2(-54.0,21.6)0.242--1998-2012Livestockhusbandry2Largeanimals(10h/km)2.1(-21.2,32.3)0.874--2Sheepdensity(10h/km)-12.1(-43.8,37.4)0.571--2Deerdensity(10h/km)41.4(30.2,53.5)<0.00141.4(30.2,53.5)<0.001ClimatefactorsTemperature(1℃)7.7(-87.6,836.5)0.947--Precipitation(1mm)28.6(7.8,53.4)0.005NS.NS.Relativehumidity(%)46.3(-19.5,165.7)0.211--LandcoverIrrigatedcropland(1%)6.4(-7.7,22.6)0.392--Rainfedcropland(1%)-2.4(-10.6,6.5)0.580--Forest(1%)4.4(-4.4,14.0)0.342--Grassland(1%)-17.1(-52.6,45.0)0.511--Built-uplands(1%)-3.5(-15.2,9.8)0.591--41 Table3.3FactorsaffectingtemporaltrendsinHFRSincidenceforShuangyangCounty,andforthecombinedotherninecounties,Changchun.Time-seriesPoissonregressionanalysisresults.UnivariateanalysisMultivariateanalysisCountyVariable(Unit)PC(95%CI)P-valuePC(95%CI)P-valueShuangyangLivestockhusbandry2Largeanimals(10h/km)45.0(42.2,47.8)<0.001--2Sheepdensity(10h/km)1154.0(978.0,1358.8)<0.001--2Deerdensity(10h/km)70.7(65.8,75.7)<0.00170.7(65.8,75.7)<0.001ClimatefactorsTemperature(1℃)61.9(49.9,74.8)<0.001--Precipitation(1mm)-35.2(-37.8,-32.4)<0.001Relativehumidity(%)-3.2(-3.8,-2.5)<0.001--OthernineLivestockhusbandry2)countiesLargeanimals(10h/km26.8(24.9,28.8)<0.001--2Sheepdensity(10h/km)68.6(63.0,74.5)<0.001--2Deerdensity(1h/km)76.4(69.0,84.1)<0.00190.4(81.6,99.6)<0.001ClimatefactorsTemperature(1℃)4.8(0.02,9.7)0.049--Precipitation(1mm)-1.1(-1.6,-0.7)<0.001--Relativehumidity(%)-6.1(-7.6,-4.5)<0.0017.1(5.1,9.0)<0.00142 3.2.2乡镇尺度的HFRS环境影响因素分析利用2004－2012年HFRS乡镇尺度的发病数据进行泊松回归分析，单因素分析结果显示，HFRS发病与人口密度、海拔、水田、旱地、稻田、草地、灌木林、建筑用地、祼土地、水体有关。多因素分析结果显示，人口密度、水田、稻田、灌木林、祼土地是HFRS发病的相关因素。其中，水田（IRR=1.23）、稻田（IRR=1.15）与HFRS发病呈正相关，其发病率随着其面积的增加而增长；而灌木林（IRR=0.22）和裸土地（IRR=0.25）与HFRS发病呈负相关，随着其面积的增加而发病率降低。人口密度（IRR=0.99）与HFRS发病呈负相关，说明人口密集区域HFRS的发病率低（表3.4）。Table3.4PoissonregressionanalysisofenvironmentalfactorsinrelationtoHFRSincidenceinChangchuncity,People’sRepublicofChina.UnivariateanalysisMultivariateanalysisVariablesCrudeIRRP-ValueAdjustedIRRP-ValuePopdenity0.99<0.0010.99<0.001Elevation,m0.99<0.001NotsignificantandexcludedIrrigatedcropland1.42<0.0011.230.003Dryland1.10<0.001NotsignificantandexcludedPaddyfield1.12<0.0011.150.031Forest0.220.251－Grassland0.63<0.001NotsignificantandexcludedShrub0.54<0.0010.22<0.001Built-upland0.24<0.001NotsignificantandexcludedBareland0.02<0.0010.25<0.001Waterbody1.200.005Notsignificantandexcluded43 3.3HFRS宿主动物生态位模型研究3.3.1HFRS动物宿主调查分析89个采样点捕获了2592只啮齿类动物，其分布范围见图3.10。鉴别后确定共有5个鼠种，褐家鼠、黑线姬鼠分别为居民区和野外的优势鼠种。其中，黑线姬鼠、大林姬鼠和大仓鼠存在于姬鼠型疫区，占9.03%（234／2592）；而褐家鼠和小家鼠为家鼠型疫区的优势鼠种，占90.97%（2358／2592）。鼠带毒率调查结果显示，HTNV感染率为4.70%（11／234）、SEOV的感染率为3.52%（83/2358）。Figure3.10InfectionrateinHantaanvirusrodentsandSeoulvirusrodents,Changchun,People’sRepublicofChina,1999－2010.44 3.3.2HFRS生态位模型建立与预测建模和分析结果表明，土地利用、降水量、相对湿度、温度、植被指数，高程与啮齿类动物分布存在相关性。其中，相对湿度（30.8%）、土地利用（29.7%）对姬鼠型疫区贡献最大，温度（23.5％）次之；而土地利用（42.3%）对家鼠型疫区贡献最大，其次为降水量（33.2%）。反应曲线如图3.11、3.12所示。各变量的贡献率在表3.5中列出。HTNV和SEOV建模ROC显示，AUC平均值分别为0.897（标准偏差为0.080）、0.846（标准偏差为0.100）（见图3.13），表明该模型总体效果具有良好的符合性。通过数据分析和模型建立，分别绘制了携带HTNV和SEOV宿主动物的风险预测分布图（图3.14）。其颜色越深表明宿主动物存在概率越高，而存在概率越高表示病毒感染风险越高。感染HTNV风险最高的地区主要分布在双阳区和榆树市，而感染SEOV的高风险区域分布范围较广，主要集中在双阳区、榆树市和市辖区，而九台市、德惠市感染风险次之。Table3.5ThepercentagecontributionofeachvariableforthemodelVariablesHantaanvirusrodentsSeoulvirusrodentslandcover29.742.3precipitation7.933.2rh30.811.4temperature23.57.8ndvi1.63.6dem6.51.745 Figure3.11ResponsecurvefortherelatedenvironmentalvariablesofHantaanvirusinfectedrodents46 Figure3.12ResponsecurvefortherelatedenvironmentalvariablesofSeoulvirusinfectedrodents47 HantaanvirusrodentsSeoulvirusrodentsFigure3.13TheROCcurveofrepeatmodelingfortherelatedenvironmentalvariablesofHantaanvirusandSeoulvirusinfectedrodents48 Figure3.14SpatialriskmapofHantaanvirusinfectionandSeoulvirusinfection3.4HV基因分型及序列分析3.4.1宿主动物调查及病毒抗原检测2010－2012年共捕获1246只鼠，IFA检测到17份鼠肺阳性标本，分布在双阳（2份）、榆树（11份）、农安（3份）和德惠（1份），鼠种均为褐家鼠，阳性率为1.36%，均为SEOV型（+），而HTNV均为阴性，表明17份鼠肺标本未检出HTNV，见图3.15。PositiveresultsNegativecontrolFigure3.15ResultsofdetectingSEOVantigenintherodentlungtissueinIFAmethod（thepicturesunderthemicroscope,enlarged40times）49 3.4.2扩增产物的鉴定及核苷酸序列分析在上述有鼠肺阳性标本检出地区，各选择1份鼠肺标本进行核酸序列分析。从4份鼠肺阳性样本中，扩增出3份S基因片段的PCR产物（CC-01；CC-02；CC-03）和一份M基因片段的PCR产物（CC-04）。经测序S片段获得195bp（726－920bp）的序列，M片段获得351bp（1993－2343）的序列。测序结果经Ncbi－BLAST比对，证实S、M片段均为SEOV序列。其S、M片段的部分核苷酸序列及其所推导出的氨基酸序列与其他已知HV病毒株序列的同源性比较分别见图3.16－3.19及表3.6，3.7。同源性比较分析发现，CC-01CC-02CC-03部分S基因片段序列之间的核苷酸同源性为100%，与其他SEOV核苷酸同源性在95.4%－100%之间；与DOBV和PUUV核苷酸同源性在26%和33%。氨基酸序列同源性比对分析发现，这3份S基因片段氨基酸同源性为100%，与其他SEOV该片段氨基酸序列同源性也为100%；而与DOBV和PUUV氨基酸序列同源性分别为56%和17%。CC-04部分M基因片段序列与其他SEOV核苷酸同源性在95.4%－99.7%之间；与DOBV和HTNV核苷酸同源性在70%左右。氨基酸序列同源性比对分析发现，CC-04与其他SEOV该片段氨基酸序列同源性也为99%－100%；而与DOBV和HTNV氨基酸序列同源性分别为80%和78%。可见，与其他SEO、HTN、DOB、PUU型HV病毒比较，CC-01CC-02CC-03CC-04的氨基酸序列的保守性大于其核苷酸序列的保守性。另外，比较发现SEOV型病毒间此S、M片段序列高度保守，氨基酸同源性近乎100%，而与HTNV、DOBV、PUUV等其他型别病毒比较，序列间差异性较大，尤其S片段序列差异性大于45%。50 Table3.6ThehomologyofSgenenucleotidesequenceandaminoacidsequence12345678910111213141511111111111110.1720.56321111111111110.1720.56331111111111110.1720.56340.9950.9950.9951111111110.1720.56350.9950.9950.9951111111110.1720.56360.9950.9950.9951111111110.1720.56370.9850.9850.9850.990.990.991111110.1720.56380.9950.9950.9951110.99111110.1720.56390.9850.9850.9850.990.990.990.990.9911110.1720.563100.9950.9950.9951110.9910.991110.1720.563110.9850.9850.9850.9790.9790.9790.9790.9790.9790.979110.1720.563120.9790.9790.9790.9850.9850.9850.9850.9850.9850.9850.97410.1720.563130.9540.9540.9540.9490.9490.9490.9490.9490.9590.9490.9590.9440.1720.563140.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3440.3380.3380.125150.2620.2620.2620.2560.2560.2560.2560.2560.2560.2560.2560.2510.2620.267Note:Lowertriangle:Homologyofntsequences;Uppertriangle:Homologyofaasequences（1.CC-01；2.CC-02；3.CC-03；4.BaichengRn8；5.ChifengRn37；6.GaomiRn9；7.Gongzhuling108；8.HuludaoRn68；9.QiananRn2；10.ShenyangRn139；11.WuhanRf08；12.Z37；13.L99；14.puu；15.DOB）51 Table3.7ThehomologyofMgenenucleotidesequenceandaminoacidsequence1234567891011121314151111110.9911111110.7840.80220.99711110.9911111110.7840.80230.99711110.9911111110.7840.80240.9940.9970.997110.9911111110.7840.80250.9910.9940.9940.99110.9911111110.7840.80260.9910.9940.9940.99110.9911111110.7840.80270.9720.9740.9740.9740.9690.9690.9910.9910.9910.9910.9910.9910.7760.79380.9910.9940.9940.9910.9890.9890.969111110.7840.80290.9660.9690.9690.9660.9630.9630.9490.96311110.7840.802100.9910.9940.9940.9910.9890.9890.96910.9631110.7840.802110.9720.9740.9740.9720.9690.9690.9540.9720.9770.972110.7840.802120.9690.9720.9720.9720.9720.9720.9910.9660.9460.9660.95210.7840.802130.9540.9570.9570.9540.9520.9520.9430.9520.9540.9520.9540.940.7840.802140.6980.6950.6950.6980.7010.7010.6780.6950.6890.6950.7010.6870.6870.819150.7010.7040.7040.7070.7090.7090.7010.7040.7090.7040.7150.7040.6870.724Note:Lowertriangle:Homologyofntsequences;Uppertriangle:Homologyofaasequences（1.CC-04；2.ShuangyangRn50；3.Gongzhuling97；4.Taonan52；5.BjHD01；6.HBQ43；7.ZT10；8.GM04-38；9.80-39；10.ZB8；11.B-1；12.Z37；13.L99；14.HTN_76-118；15.DOB）52 Figure3.16ComparisonchartofMgenenucleotidesequenceFigure3.17ComparisonchartofSgenenucleotidesequence53 Figure3.18ComparisonchartofMgeneaminoacidsequenceFigure3.19ComparisonchartofSgeneaminoacidsequence3.4.3系统进化树分析用mega6.0软件将4份阳性标本（CC-01、CC-02、CC-03、CC-04）的核苷酸序列构建系统进化树见图3.20、3.21。由图3-20可以看出，由S基因片段构建的系统进化树发现长春市3只褐家鼠所携带病毒（CC-01、CC-02、CC-03）均处于同一组内，与葫芦岛、赤峰、白城分离到的毒株在同一进化分支上，亲缘关系较近。另外，CC-01、CC-02、CC-03与Z37、HuludaoRn68、ChifengRn37、QiananRn2等S3亚型病毒在同一分支，同属于S3亚型。54 由图3.21可以看出，由M基因片段构建的系统进化树发现长春市双阳区1只褐家鼠所携带病毒（CC-04）与已报道的双阳、公主岭分离的毒株处于同一组内，与河北、山东等地分离到的毒株在同一进化分支上，具有较近的进化关系。另外，CC-04与Z37、ZT10等S3亚型病毒在同一分支，属S3亚型。Figure3.20PhylogenetictreeswereconstructedbasedonpartialSgenenucleotidesequence(N-J)Figure3.21PhylogenetictreeswereconstructedbasedonpartialMgenenucleotidesequence(N-J)55 56 第4章讨论4.1HFRS时空分布特征分析HFRS是一种在全球广泛分布、发病数多、病死率高的自然疫源性疾病，其空间分布特点既高度分散又相对集中，这种空间分布不均衡的特点是由宿主动物空间分布不均衡所决定的。世界上报告的HFRS病例主要集中在中国大陆，特别是在1981年我国发现家鼠型HFRS后，疫情迅速扩散。由于流行强度不断增强和疫区逐渐扩大，我国自1986年开始出现全国性的大流行。长春市1959年首次报告HFRS病例后，疫情呈散发状态，主要发生在外县（市）。1981年疫情传入城区，随着人流、物流往来频繁，长春市HFRS发病呈现快速增长趋势，2005年达到高峰后疫情始见回落。本研究使用地理信息技术，从不同尺度分析了长春市HFRS的时空分布特征。4.1.1空间分布特征1988-2012年长春市HFRS时空分布地图显示，位于该市东南部的双阳区始终为高发区域，但九台市、榆树市、农安县等外县（市）疫情上升速度较快。在乡镇尺度上，使用2004－2012年HFRS发病率构成比地图展示了HFRS的时空分布特点和发病变化趋势。9年间共有119个乡镇报告了HFRS病例，可确定的高发乡镇（社区）共计13个。虽然大多数乡镇（社区）发病率呈现了下降趋势，但HFRS的疫区范围不断扩大，新发现病例的乡镇数量仍在增加。发病主要集中在20－49岁的青壮年，以男性为主，各年龄组发病人数逐年增加，说明HFRS流行强度在增大，范围更广泛。农民仍是HFRS的高危人群，但职业的多样化说明人群发病的危险性差异在逐渐减少。4.1.2时间分布特征根据HFRS发病的季节性特征分析，本研究确定了两个流行阶段。第一阶段为1988－1997年，呈现秋冬季节单个发病高峰分布的流行特点。另一阶段为1998－2012年，呈春、秋冬两个发病高峰，以春峰为主。HV病毒在秋冬季节[87、88、176、181]通过黑线姬鼠传播，而春季主要通过褐家鼠传播。根据文献记载和57 本研究中分析获得的两个流行阶段的发病特点，我们推断，第一阶段（1988－1997年）主要是由HTNV引起的HFRS，第二阶段（1998年后）是由HTNV和SEOV共同引起的HFRS感染，其春季发病高峰的出现与SEOV病毒有关。1999-2010年10个高发乡镇（社区）鼠情调查分析结果显示，优势鼠种均为褐家鼠，其携带的SEOV病毒导致出现春季发病高峰，流行季节持续将近半年时间，部分原因为漫长寒冷的冬季对疾病传播的滞后影响。这与1998－2012年研究阶段所得结果相符。值得注意的是，在上世纪90年代后，中国大陆新出现和再次发生HFRS流行的地区，包括北京市、山东省、葫芦岛市和长春市，均与SEOV感染有关[83、176、182]（与周围环境中的鼠类有关），在人间体现为春季高发的特点。在中国大陆，HV病毒阳性的黑线姬鼠、大林姬鼠和褐家鼠分别为农村、森林和城[88]市的优势鼠种。针对引起HFRS的HV病毒型别不同应采取不同的控制措施。在春季，主要的控制措施是降低居民区的鼠密度。秋末冬初，应在林区针对能够引起出血热的鼠类采取有效措施。4.2HFRS发病的影响因素1988-2012年泊松回归分析结果显示，畜牧业，特别是鹿类养殖，与HFRS发病的时空分布具有明显相关性。HV病毒主要由宿主动物通过分泌物（如粪便和尿液）污染周围环境，并传播给人类。通过被污染的食物或者鼠类叮咬等[40]其他方式传播的几率较低。HFRS的发病高低取决于宿主动物的带毒率和分布范围；宿主的分布受到自然栖息环境结构的影响，例如人类建筑，植被组[169、171、183]成，植被结构，年平均气温和季节变化。气候、农业生产、社会经济[4、184]条件等外在环境因素变化，均会影响病毒由鼠间传播至人间的模式。内蒙古自治区鄂伦春和莫力达瓦寒而的研究表明，中国东北地区的气候变化（包括降雨，陆地表面温度，相对湿度和MEI指数）对HFRS的传播有重大影响[185]。在美国四角地区开展的汉坦病毒肺综合征出血热研究结果显示，环境因素（如1992到1993年间由于厄尔尼诺现象引起的降水量显著增多）能够间接增[67]加暴露于SNV病毒的风险。另外，由于种群环境、气候条件、病毒和鼠类栖[186]息地种类不同，也造成了不同地区汉坦病毒引起的疾病分布不均衡。本研究58 中使用时间序列泊松回归分析，主要用来说明在较长一段时期内HFRS发病率和影响因素之间的复杂关系。4.2.1畜牧业的影响相对于气候因素，畜牧业（主要是鹿类养殖业）对HFRS发病率影响更大。HFRS发病空间分布相关影响因素的分析结果显示，鹿类养殖密度对HFRS病例分布有一定的作用，特别是对1998－2012年间出现的以SEOV型为主的HFRS影响更大。畜牧业始终是新发传染病出现的主要推动因素之一，而且也[187、188]可以改变某些地方病的传播方式。上世纪80年代末，长春的传统畜牧业重建，扩张到90年代中期。在中国东北，特别是长春市，鹿类养殖和鹿产品一直占主导地位。由于动物数量的增多，建立了更多的养殖场，饲料的需求也随之增加。多余的饲料为鼠类提供了栖息地和食物。与养殖业相关的农业活动也[75、150]增加了暴露于感染鼠类的几率。在四川省的一项病例对照研究中，作者们认为与养殖相关的农业活动（如在院子或者仓库里堆积干草）能够增加HFRS[189]传播的风险。猪圈和鸡舍内的啮齿动物对人类和动物的健康是一种潜在的威胁，在猪圈或者鸡舍及其周围环境中，能找到至少20种病原体（如汉坦病毒和[190]钩端螺旋体）。畜牧业能够影响啮齿类动物种群，增加人类暴露于感染动物气溶胶和分泌物的几率，从而影响HFRS发病率。HFRS发病率和鹿类养殖之间虽具有统计学关联，但不能证明有因果关系。需要对啮齿动物种群密度和生活在养殖场附近啮齿动物的HV病毒感染状况进行进一步的现场研究，以提高我们对这种潜在机制的理解。4.2.2气象条件的影响本研究结果显示，HFRS的发病率与年平均相对湿度有关。良好的天气条[191]件使啮齿类动物种群快速增长。啮齿动物种群动态和气象因素之间的关系是[83、91、183]复杂的，并随着啮齿动物种群和气候区域不同而变化。这些复杂的关系可能对疾病的传播造成了不同的影响，在较大的地理区域内疾病和气候因素通常呈现非线性关系。本研究中发现的HFRS和相对湿度之间存在相关性，与[184]长春市临近地区报道的结果一致。较高的相对湿度影响外环境中病毒的感染[99、100]力和稳定性。然而，HFRS发病率和相对湿度之间存在正相关性的潜在机59 制尚未弄清。我们的研究结果表明，畜牧养殖对长春市HFRS的流行起到了更重要的作用，而非气候因素。4.2.3土地利用类型的影响[170、171]每种啮齿类动物均选择适宜生存的生态环境。黑线姬鼠在农村野外[91、192]环境中繁衍生存，而褐家鼠则生存在城市居民区周围。同时，栖息地环境[39]结构可以影响宿主的种群密度。已有研究证实稻田是HFRS传播的危险因素[90、176]之一。当许多乡镇常住居民在种植水稻时，可能通过直接接触或气溶胶吸入从被感染鼠类分泌物中排泄出的病毒。但是以县区为研究单元分析结果中，我们没有发现HFRS的空间分布和土地覆盖情况之间具有统计学关系。可能与本研究中各县（市）区土地覆盖情况的差异不显著有关。为进一步探讨地理因素对HFRS发病的影响，在乡镇尺度上，对2004－2012年土地利用类型与HFRS个案数据进行关联分析。研究结果表明，人类感染HV发病与土地利用类型密切相关，如水田、稻田存在区域可增加发病的风险性。因此，建议采取有效手段来影响宿主种群存在的因素，改变栖息地的结构，从而影响宿主动物的种群密度。农民作为高危人群在水田、稻田工作时要注意个人防范。农村饲料的储存方式方法要加以改变，周边环境要做好防鼠灭鼠工作。通过多措并举，有效降低鼠密度，控制鼠带毒率。4.3宿主生态位模型对HFRS感染风险的预测黑线姬鼠和褐家鼠分别是HTNV和SEOV引起的HFRS的主要动物宿主，其栖息地、种类和分布与环境因素密切相关。本研究采用GIS遥感技术和最大熵法建立生态位模型预测方法，分别分析了HTNV、SEOV宿主动物的空间分布范围，探讨了影响其生长、繁殖等栖息生境的主要环境因素，并构建了风险分布地图。我们将携带HTNV和SEOV的啮齿类动物受环境因素影响的差异进行了量化。留存的6个环境因素与啮齿类动物感染HV病毒存在相关性，但对于HTNV和SEOV宿主动物的影响具有不同的贡献度。土地覆盖、相对湿度、温度和降水量与感染鼠类的分布密切相关。对于两种病毒类型的宿主动物来说，土地覆盖的贡献率均为最大，它通常影响啮齿类动物的物种分布及病毒感60 染状况，但两类动物适宜的土地利用类型却不尽相同。海拔影响啮齿类动物的分布，但高度＞200m时，SEOV感染的风险性会降低，表明携带SEOV的啮齿类动物分布于适宜人类居住的环境周边。相对湿度、温度、降水量可能影响鼠类活动以及病毒在动物之间的传播。NDVI标示了作物及植被的生产情况，是两类啮齿动物的食物来源，可为鼠类的生长繁殖提供必要的生态条件。但由于本研究样本量小，图3.11、3.12中反应曲线的95%置信区间较大，这在一定程度上影响了模型的可靠性，在今后应加强研究，扩大调查范围，对模型进一步进行优化。HTNV、SEOV宿主动物感染风险预测分布图显示，不同地区中不同病毒的潜在风险可能存在差异。双阳区、榆树市携带HTNV、SEOV的宿主动物分布范围均很广，鼠带毒率较高，是发病风险最高的区域，也是野鼠型和家鼠型HFRS的混合疫区。九台市、德惠市作为老疫区，发病率始终位居全市前列，而本次预测结果显示其为汉城型病毒感染发病风险较高的地区。1981年HFRS传入城区，由于城市化进程加快，破坏了鼠类栖息生存环境，加之人口密集，因此HFRS发病的风险性始终较高。但在预测风险图中可以看到，农安县两种类型病毒感染风险均低，与实际发病存在一定偏差，这是由于1999－2009年我们在这个县未采集到宿主动物标本，可能与监测布点和采样质量有关。一些研究已经探讨了宿主动物种群和分布与病毒感染风险的关系。我们对啮齿动物中不同病毒感染率分布的研究表明，HFRS发病的危险因素包括环境因素（土地覆盖，海拔）和气候因素（相对湿度，温度，降水），尤其是在HTNV和SEOV感染同时存在的地区，这一结论具有较高的可信度和有效性。然而，气候因素变化（温度，降水等的变化）和环境结构（城市化，免疫密[193]度）可能会影响病毒传播和感染的风险。HTNV和SEOV主要宿主动物不同，其分布范围和生存环境有一定的区别，人群感染发病的传播模式、高危人群和临床表现也不一致。因此，防控策略和措施侧重的方向要根据疫区类型不同进行适当调整，例如使用特异性的疫苗、不同季节采用不同的控制手段，也包括临床治疗和药物的使用等。61 4.4HV病毒基因分型及序列分析[194-197]目前，PCR技术已广泛应用于HV病毒的研究，特别是在确定流行毒株型别时，常使用HV病毒的特异性引物进行PCR扩增、测序，并与已明确型[198]别的HV病毒核苷酸序列进行比较，最终查明HV病毒亚型。4.4.1核苷酸和氨基酸序列分析已有SEOV型汉坦病毒核苷酸序列资料显示，该型病毒最为保守，其核苷酸序列的同源性基本在95%以上，病毒蛋白的氨基酸序列显示出更高的保守性[199、200]。本研究中所获得4份的S、M基因片段序列分析发现，与SEOV型其它病毒核苷酸序列比对，同源性均在95%以上，氨基酸序列同源性在99%以上。可见本地区发现这4株SEOV型病毒未发生明显变异。HV基因组为分节段的单股负链RNA，由L、M、S3个基因片段组成，分别编码病毒的RNA依赖的RNA多聚酶(L)、外膜蛋白G1、G2和核衣壳蛋白(N)[17]。N蛋白由428－433个氨基酸组成，中间部分210－310氨基酸主要为疏水[201]氨基酸，是HV多变的区域。本研究所获得的S基因片段氨基酸序列位点位于231－294之间，分析发现该区段在SEOV型病毒之间同源性高，不同型别HV病毒序列间差异性大于45%，符合多变区域的特点。4.4.2基因分型目前我国流行的HV仍然为HTNV和SEOV两型，通过亚型分析，发现HTNV可分为9个亚型，SEOV可分为4～6个亚型，各亚型在不同地区分布明显不同，并有明显的地区聚集性，同一地区有特定的亚型存在，而且地理位置[202、203]相近的地区病毒基因组核苷酸序列的同源性相对较高。我们对双阳、榆树、农安、德惠4个县（市）区褐家鼠中分离到的HV部分S、M基因片段序列系统进化分析发现，4株SEOV型病毒均为S3亚型，与已报道的吉林省内双[204]阳、白城、公主岭等地区分离的SEOV型病毒亲缘关系更近。赵臣等研究发[205]现吉林市地区褐家鼠携带的HV病毒为SEOV型S3亚型。李明慧等研究发现辽宁省葫芦岛市居民区的鼠类以褐家鼠为主，其携带的病毒属于SEOV型S362 亚型。这些数据提示我们，SEOV型S3亚型广泛分布在吉林、辽宁地区，有着地区聚集性。长春市双阳区、榆树市、农安县和德惠市作为国家级或市级HFRS监测点，始终开展人间、鼠间疫情监测工作。但由于条件所限，以前未开展过基因分型，仅能其发病的流行病学特征、病例的临床表现和监测到的宿主动物种类及带毒情况综合进行分析，判断为混合型疫区。本研究使用RT－PCR检测技术和基因序列分析方法，对2010－2012年采集、并检测到的HV病毒进行了进一步地分析。本阶段鼠情调查分居民区、野外两部分进行，捕获鼠类以褐家鼠为主（93%），17份鼠肺阳性标本均为褐家鼠。而病毒的基因序列分析结果表明，检到的HV病毒均为SEOV型S3亚型。在我国，SEOV型疫区主要分布在吉林、内蒙古、河北、河南、山西、广东、海南、江西、云南等地。因携带[203、206]SEOV型病毒的宿主动物分布广泛，其疫区范围不断扩大。褐家鼠是SEOV型病毒的主要宿主，由于繁殖能力强，分布广泛，作为居民区的优势鼠［180］种，与人类生活关系非常密切，是HFRS传播、流行重要的传染源。长春市外县（市）区畜牧养殖业发达，特别是有“养鹿之乡”美称的双阳，其鹿的养殖场所为鼠类的繁殖、迁移和HV的传播提供了条件。HFRS的再次流行也受到包括防控措施落实和其他人类活动在内的多种因[207-209]素的影响。长春市疾病预防控制中心保存的档案资料显示，自上世纪90年代末发病率上升之后，该市已经采取了以强化监测、防鼠灭鼠、预防接种和宣传教育为主的综合性防控措施。并在2005年再度强化上述措施。1999－2004年间，主要在双阳，九台和榆树等高发地区使用单价疫苗进行预防接种。自2005年起，全市统一规划、统一行动，对HFRS高发病地区（发病率>5/10万）使用双价纯化灭活疫苗开展大规模接种。自2006年起，该市HFRS发病呈现逐年下降趋势。本研究结果表明，长春市HFRS的预防控制效果得益于在城镇和野外采取的防鼠灭鼠措施，特别是对畜类养殖区域褐家鼠的控制，以及在春耕前对高危人群开展的免疫接种。63 4.5本研究的局限一是由于疫苗接种覆盖率、接种率调查等部分资料未收集到详细的可用于本研究的信息，我们没有检验疫苗的效力和防治效果，无法分析疫苗接种对HFRS流行状况的影响；二是在对土地利用类型的影响分析时，仅考虑了土地利用类型对HFRS发病的影响，未将气候因素、社会经济因素、其他影响环境的因素，如城市化进程等方面纳入到研究范围；三是仅对时空分布特征进行分析，未确定每个高发乡镇形成的主要影响因素，影响下一步制定更加有针对性的防控措施；四是数据来源于国家疾病监测系统，为被动监测，收集到的信息量相对较少，同时受当地医务人员诊断能力的制约，部分轻症或不典型病例可能未进行报告，影响分析精度；五是由于目前遥感产品缺乏高分辨率，数据空间分辨率较低。64 第5章结论①长春市HFRS发病自1998年开始明显上升，同时伴有季节性特征的改变，其发病高峰由每年年末的单峰型转变为以春、秋冬发病为主的双峰型；长春市HFRS的再次流行与过去25年间季节发病模式的变化有关；②长春市HFRS发病率的增长、时空分布特征与畜牧养殖业、气候因素和土地利用类型显著相关，尤其是鹿类养殖，预防控制措施的重点应放在畜牧业养殖的相关地区；③土地利用为影响HV宿主动物生存生境的主要因素，而相对湿度、降水量分别为HTNV、SEOV宿主动物的次要影响因素。风险预测分布图提示，双阳区、榆树市为混合型疫区，是HTNV、SEOV两种病毒感染发病的高危区域，而其他地区主要是SEOV病毒；④长春市HFRS疫区是以家鼠型为主的混合型疫区，本研究检测到的HV病毒均为SEOV的S3亚型，其S片段、M片段的核苷酸、氨基酸同源性均较高，未发现较大变异。65 66 本研究的创新之处①首次从不同空间尺度、不同流行阶段对长春市HFRS发病情况进行了流行病学研究，明确了本地HFRS疫情的时空分布特征，为进一步分析和探讨中小城市HFRS发病特点提供了参考依据。②利用GIS技术，将人间、鼠间疫情监测数据与地理环境因素相结合，分析了HFRS与气候因素、土地利用类型及畜牧业之间的关系，首次发现畜牧养殖对长春市HFRS的流行起到重要作用；并建立生态位模型，分别研究了HTNV、SEOV宿主动物栖息生存的生境适宜性，绘制了风险分布图，从而实现对HFRS的预测。③从病原体分子和遗传层面上确定了长春市HFRS的病毒型别和亚型，掌握人群和宿主动物感染HV的基因变异特征。67 68 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致谢衷心感谢我的导师于雅琴教授，您多年来在学习和生活上给予我耐心指导和大力帮助，在学术上为我指引前进的方向。您严谨的科研思路，敏锐的学术眼光，渊博的学识水平和忘我的敬业精神将时时激励和鞭策我努力前行。感谢军事医学科学院五所的曹务春教授、方立群老师、王丹丹和李新楼在研究立题、数据分析和论文撰写中给予的精心指导、无私帮助和大力支持，使我的课题得以顺利完成。感谢刘雅文老师、任淑萍老师、李波老师、寇长贵老师在论文撰写和修改过程中给予的悉心指导。感谢吉林省疾病预防控制中心吴冬林所长、沈博，长春市疾病预防控制中心孙炳欣、阴媛、闫莉、朱红、金银花、修佳祺、王博、韩淇卉在资料收集、实验室检测和论文撰写过程中给予的帮助。感谢我的亲人，在我攻读学位期间，给予我的支持和鼓励。再次向所有关心和帮助过我的人们表示衷心的感谢和诚挚的祝福!86
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