《重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及免疫原性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：S855.3单位代码：10193密级：公开学号：20150513硕士学位论文重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及免疫原性分析High-levelexpressionofporcinecircovirustype2Capproteinbyrecombinantbaculovirusandimmunologicalcharacteristic作者姓名：张艳艳学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：动物微生物学与免疫学指导教师：扈荣良研究员所在学院：动物科学技术学院2018年6月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合症（postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS）的主要病原。组织中高含量的病毒血症、PCV2病毒载量、肉芽肿性炎症、淋巴细胞减少和因免疫抑制造成的淋巴系统功能紊乱是严重感染PCV2的特征。目前预防猪圆环病毒2型感染的主要手段是疫苗接种。我国PCV2商品化疫苗包括全病毒灭活疫苗、原核系统表达的病毒样颗粒（VLP）疫苗、杆状病毒载体系统表达的亚单位疫苗等，但普遍存在的问题是灭活疫苗和亚单位疫苗抗原量不高，或是纯化抗原中内毒素残存量较多，导致免疫效果低下及副作用明显；很多大型猪场选择采用进口疫苗,但进口疫苗价格昂贵。为解决这些问题或缺陷，本研究采用Bac-to-BacTM杆状病毒表达载体系统，构建了高效表达PCV2Cap蛋白的重组杆状病毒。本研究的主要内容如下：1对转移载体pFastBacI进行了改造，即polh启动子后连接了另一个启动子，采用了双启动子策略；同时，在polh启动子上游增加了同源增强子调控元件。2Cap蛋白的N端突变了NLS序列及C端加入了6×His标签，Cap蛋白密码子进行优化合成后，克隆到pFastBacI多克隆位点，构建表达质粒。3重组杆粒转染到Spodopterafrugiperda9(Sf9)细胞，拯救获得重组杆状病毒，建立了毒种库；经表达条件优化，使重组cap蛋白在Trichoplusiani-derivedHighFiveTM（H5）悬浮细胞中获得了高效表达。4利用重组蛋白配制的疫苗肌肉免疫小鼠，首免后第14天进行第二次免疫，于第21、28、35和42天收集血清，同时以灭活疫苗、商品化亚单位疫苗、野型杆状病毒和PBS为对照，最后通过ELISA方法进行免疫效果比较及评价。本研究获得的结果：1通过改造杆状病毒载体表达盒、质粒筛选、鉴定和转染，获得了携带PCV2Cap蛋白的重组杆状病毒。2通过表达条件优化，Cap蛋白在H5悬浮细胞中获得高效表达，表达量在150mg/L以上。3通过cap蛋白配制的疫苗免疫小鼠，证明该重组蛋白诱导的抗体水平明显优于商品化全病毒灭活疫苗和原核表达亚单位疫苗。I 关键词：猪圆环病毒2型；亚单位疫苗；杆状病毒表达载体系统；Cap蛋白；免疫原性分析II AbstractPorcinecircovirustype2(PCV2)isthecausativeagentofpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS).HighPCV2viremiaandviralloadintissues,granulomatousinflammation,depletionoflymphocytesanddysfunctionofthelymphoidsystemcausingimmunosuppressionwerecharacterizedasthehallmarksofseverePCV2infection.Sinceitsdiscoveryin1991,PCV2hascausedaseriouseconomicproblemfortheswineindustryaroundtheworld.ThevaccinationisthemainwaytopreventPCV2infection.ThePCV2commercialvaccinesconsistofinactivatedvaccines,virus-likeparticlesvaccineusingprokaryoticexpressionsystemandsubunitvaccinesusingbaculovirusexpressionsystem.However,inactivevaccinesandsubunitvaccinesexpressedbyprokaryoticexpressionsystemmayhaveinsufficientantigenconcentration,ormoreendotoxintraces,whichresultsinimmunityfailureandremarkablesideeffects.Mostlargepigfarmstendtouseimportedsubunitvaccinesofhighprice.Therefore,therecombinantbaculovirusthatexpresshigh-levelCapproteinwereconstructedbyBac-to-BacTMbaculovirusexpressionsystem.Themainworkandresultsareasfollows:1ThepFastBacIvectorwasmodifiedwithanpromoterandhomologousenhancersequencecis-linkedtothedownstreamandupstreamofpolhpromoter,respectively.2TheoptimizedCapgenedeletedbyN-terminalnuclearlocationsignal(NLS)sequencethatwasaddedto6×HistagatC-terminalwasclonedintomultiplecloningsite(MCS).3TherecombinantbaculoviruswererescuedbytransfectionrecombinantbacmidsintoSpodopterafrugiperda9(Sf9)cellsandtherecombinantproteinwasexpressedefficientlyinHighFiveTM(H5)cellsunderoptimizedexpressioncondition.4Theimmunogenicityoftherecombinantproteinwasevaluatedbyvaccinationinmiceusingintramuscularinjectionroute.Aboosterinjectionwascarriedoutatanintervaloftwoweeksandserumswereseparatedat21,28,35,III 42daysrespectively.Simultaneously,commercialinactivedvaccine,subunitvaccine,wildbaculovirusandPBSweresetupascontrolsatthesamedoseandway.Results:1TherecombinantbaculovirusthatefficientlyexpressedPCV2CapproteinwereconstructedviathemodifiedBac-to-BacTMexpressioncassette.2TheexpressionofCapproteinreached150mg/LandaboveinH5cellsunderoptimizedconditions.3ComparingimmuneeffectbetweentheCapproteinandcommercialvaccines，theformerposesesssignificantadvantages.Keywords:Porcinecircovirustype2;subunitvaccine;baculovirus;Capprotein;immunogenicityanalysisIV 目录前言....................................................................................................................1第一篇文献综述.................................................................................................3第一章猪圆环病毒2型研究概况......................................................................31.1猪圆环病毒分类.................................................................................................31.2PCV2基本特性...................................................................................................31.3猪圆环病毒2型病毒结构.................................................................................31.4ORF2基因研究进展...........................................................................................51.5PCV2流行病学研究进展...................................................................................6第二章PCV2疫苗研究进展.................................................................................82.1PCV2灭活疫苗...................................................................................................82.2亚单位疫苗.........................................................................................................82.3DNA疫苗..........................................................................................................102.4重组活载体疫苗...............................................................................................10第三章杆状病毒表达系统概述及应用...............................................................123.1杆状病毒表达载体系统研究进展...................................................................123.2Bac-to-Bac®杆状病毒表达载体系统原理.....................................................143.3杆状病毒表达载体系统应用...........................................................................14第二篇研究内容.................................................................................................16第一章PCV2bCap蛋白在BEVS中高效表达..................................................161.1材料和方法.......................................................................................................161.1.1材料......................................................161.1.2方法......................................................201.2结果...................................................................................................................271.2.1重组转移载体pF-Cap的鉴定.................................271.2.2重组杆粒Bac-Cap的鉴定....................................281.2.3重组杆状病毒Ac-Cap的拯救.................................281.2.4间接免疫荧光鉴定..........................................291.2.5SDS-PAGE和Westernblot分析结果...........................291.2.6重组杆状病毒高效表达......................................301.3讨论...................................................................................................................31 1.4小结...................................................................................................................32第二章重组杆状病毒免疫原性分析..................................................................332.1材料和方法.......................................................................................................332.1.1材料......................................................332.1.2方法......................................................342.2结果...................................................................................................................352.2.1重组杆状病毒最佳灭活条件..................................352.2.2免疫效果评价..............................................362.3讨论...................................................................................................................362.4小结...................................................................................................................38结论..................................................................................................................39参考文献..............................................................................................................40作者简介..............................................................................................................50致谢..............................................................................................................51 前言PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS）的主要病原。在欧洲，PMWS又称作猪圆环病毒病（porcinecircovirusdisease，PCVD），在美洲则称为猪圆环病毒相关疾病（porcinecircovirusassociateddisease，PCVAD）。猪皮炎肾炎综合征（PDNS）、母猪繁殖障碍、A2型先天性震颤（CT）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）及猪增生性和坏死性肺炎（PNP）等疾病的发生也与PCV2的感染相关。PCV2的组织嗜性广泛，淋巴结和脾脏中的病毒含量最高，单核/巨噬细胞系是PCV2感染猪后的靶细胞。PCV2主要造成猪免疫器官损伤、淋巴细胞减少、淋巴组织增殖能力下降，引起免疫功能下降或紊乱，最终因缺乏有效的免疫应答能力，导致感染猪共感染其他病原，导致病情加重。因此，组织中高含量的病毒血症、PCV2病毒载量、肉芽肿性炎症、淋巴细胞减少和因免疫抑制造成的淋巴系统功能紊乱是严重感染PCV2的特征。猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）是目前发现的最小的动物病毒之一，病毒粒子结构简单，无囊膜，仅有核酸和衣壳蛋白（capsidprotein，Cap蛋白）组成。核酸为闭合、环状的双义单链DNA，全长约为1767或1768nt。PCV2ORF2编码的Cap蛋白是病毒唯一的结构蛋白，由233个氨基酸组成，其中N端前41个氨基酸是核定位信号肽（nuclearlocationsignal，NLS），研究发现，65～87、113～147、157～183和193～207四个氨基酸残基区域为Cap蛋白的免疫反应区，69～83和117～131两个氨基酸残基区域是线性B细胞表位。Cap基因可作为遗传进化分析、流行病学调查和PCV2分类的标志基因。许多研究证明Cap蛋白具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生特异性的免疫保护反应，ORF2是PCV2基因工程疫苗的首选基因。目前国内外普遍使用的PCV2疫苗可分为两大类，全病毒灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗。前者在我国疫苗数量上占比很大，后者又可分为杆状病毒表达载体系统和原核表达系统的亚单位疫苗，目前获得农业部批准的只有三种。PCV2基因突变速率为1.2×10-3替换/位置/年，是突变速度最快的DNA病毒，甚至高于某些RNA病毒。PCV2可划分为5个基因型，即PCV2a～2e，除PCV2c外，其他四种在我国均有报道。流行基因型从PCV2a、PCV2b，再到PCV2d，伴随着基因型的改变，PCV2的毒力也不断加强。虽然许多研究表明，无论是商品化疫苗还是试验性疫苗，许多情况下均能降低病毒血症和血清中的病毒载量，提高平1 均日增重，提供良好的免疫保护。但是近年来，免疫失败的情况增多，现有商品化疫苗不足以对免疫猪群提供完全保护。根据PCV2流行现状，当前市场迫切需要一种新型、廉价、高效疫苗。这或许可通过提高PCV2Cap蛋白的含量部分得到解决。2 第一篇文献综述第一章猪圆环病毒2型研究概况1.1猪圆环病毒分类1974年,PCV首次分离于PK-15细胞系[1]，基因组全长1758～1760bp，加拿大、英国和欧洲等多个国家的研究表明，PCV1对猪无致病性[2,3]。1991年，加拿大报道了以PCV2为主要病原的新型疾病—断奶仔猪多系统衰竭综合征[4]（PostweaningMultisystemicWastingSyndrome，PMWS）。PCV2基因组全长1767bp或1768bp，之后在多个国家流行[5-10]。这两株PCV基因组具有较大差异，为便于区分，将不致病的PCV命名为PCV1[8],具有致病性的PCV命名为PCV2。因此，PCV包括两种基因型，即I型（PCV1）和II型（PCV2）[11]。PCV2属于圆环病毒科、圆环病毒属，圆环病毒科是由国际病毒分类委员会在第六次学术报告上确认命名的。该科除了动物病毒如鸡贫血病病毒（ChickenAnemiaVirus，CAV）、鹦鹉喙羽病毒（PsittacineBeakandFeatherDisease，PBFDV）、鸽圆环病毒（PigeonCircovirus，PICV）等成员以外，还包括植物圆环病毒包括香蕉簇顶病毒（BananaBunchTopVirus，BBTV）、地三叶草侏儒病毒（SubterraneanCloverStuntvirus，SCSV）、椰树叶腐烂病毒（CocodutFoliarDecayVirus，CFDV）等。1.2PCV2基本特性PCV2对外界环境的抵抗力较强，在酸性条件（pH=3）下可以存活很长时间，在高温环境下（72℃）存活时间较短；对氯仿、乙醇等有机溶剂不敏感，但对氢氧化钠、苯酚和氧化剂等较敏感；不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞；PCV2不能在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK21细胞中生长；能在PK15细胞上生长，但不能引起细胞病变；感染的PK15细胞内含有许多胞浆内包涵体，少数感染的细胞内含有核内包涵体；D-氨基葡萄糖处理PK15细胞，可促进病毒DNA进入细胞核，并提高病毒复制能力；单核/巨噬细胞是PCV2感染猪后的靶细胞，淋巴结和脾脏中PCV2含量最高[12,13]。1.3猪圆环病毒2型病毒结构PCV2病毒粒子由核酸和衣壳蛋白（Capsidprotein，Cap蛋白）构成，无囊3 膜，直径为17nm，呈二十面体对称[8,14-16]。核酸为共价闭合的单股、环状、负链DNA,由1766～1768个核苷酸组成，编码复制相关蛋白的Rep基因和编码衣壳蛋白的Cap基因间隔由约80个核苷酸的基因间隔区分开[17]。PCV2是目前已知最小的DNA病毒之一。预测PCV2基因组含有11个开放阅读框（openreadingframes，ORFs），ORF1、ORF5、ORF7和ORF10位于基因组正义链，ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11位于基因组互补链[9]。目前已报道PCV2转录11种RNA和翻译5种蛋白，ORF1～ORF5编码的蛋白获得较多研究。ORF1为最大的阅读框，长为945nt（nucleotide，nt），分子大小约为37kDa，ORF1编码病毒的两种复制酶蛋白，即Rep和Rep'蛋白，这两种蛋白对病毒的复制至关重要[18]。ORF2位于基因组反义链上，编码病毒衣壳蛋白（capsidprotein，Cap蛋白），是PCV2唯一的结构蛋白，长为702nt，分子大小约为27.8kDa，60个Cap蛋白包裹病毒核酸形成完整的病毒粒子。Cap蛋白能够诱导机体产生针对PCV2的特异性中和抗体[19]，与免疫和病毒的感染密切相关[20]。ORF3基因嵌入在ORF1中，方向与ORF1相反，长为315nt，编码的蛋白大小为11.9kDa。ORF3加快PCV2感染的细胞凋亡，与病毒毒力和病毒的散播有关[21-24]。缺失ORF3的PCV2依然可以在PK15细胞中复制，表明ORF3不是PCV2复制所必需的，但PCV2致病性减弱[23,25]。ORF4基因嵌入于ORF3中，与ORF3重叠并同向，由59个氨基酸组成，分子大小约6.5kDa，编码一种对PCV2复制非必需的非结构蛋白，抑制细胞的凋亡[26,27]，缺失ORF4的PCV2感染PK-15细胞后，通过激活caspase-3和caspase-8酶活性诱导细胞凋亡。He等[26]将缺失ORF4的PCV2病毒感染小鼠，14天时小鼠血清病毒载量升高，淋巴组织的病毒载量高于未缺失ORF4PCV2，CD4+和CD8T+淋巴细胞数量明显的降低，且抑制caspase酶活性。Lv等[28]利用酵母双杂交系统筛选出了与ORF4相互作用的FHC、SNRPN、COX8A和LaminC四种宿主蛋白。ORF5为最新发现的一种非结构蛋白，基因长度为180bp，与ORF1方向相同，是病毒复制、转录和翻译的非必需蛋白[29]。ORF5蛋白不仅通过延长细胞生长S期来抑制细胞的增殖，还具有级联放大作用，激活NF-κB，上调IL-6、IL-8和COX-2[29]，同时还发现了与ORF4相互作用的5种宿主蛋白[29]。4 图1.1PCV2基因组图解Fig.1.1genomicschematicofPCV2[29]1.4ORF2基因研究进展ORF2位于PCV2基因组的互补链上，编码的Cap蛋白是PCV2唯一的结构蛋白，60个Cap蛋白组装成病毒表面衣壳[30]。57～91nt、121～151nt、181～191nt和230～233nt是Cap蛋白中5个主要变异区，位于86～91亚型基序被置换后，可改变毒株毒力，1331～1339nt决定着PCV2毒力[13]。Liu发现从C端截短的ORF2，Cap依然聚集于细胞核内，突变N端41aa后，Cap蛋白聚集于细胞质内，其中12～18aa（RHRPRSH）和34～41aa（HRYRWRRK）对Cap蛋白核定位起着关键作用[31]；Guo报道了NLS中存在抗原表位[32]，且发现NLS与PCV2的生长特性没有相互联系[33]。Hou等证明NLS不仅介导Cap蛋白进入细胞核内，还能调控Cap蛋白出核，S17磷酸化位点在Cap蛋白出核调控中发挥重要作用[34]。Liu等在大肠杆菌中表达了PCV2ORF2完整编码区，Cap蛋白的表达产量只有1mg/L[35]，之后，Zhou[36]和Maria[37]分别将完整的ORF2基因和缺失NLS的ORF2基因在大肠杆菌中表达，发现缺失NLS的重组菌表达量约为20mg/L，表明NLS可能是影响Cap蛋白表达水平的重要因素。Yin等[38]将SUMO标签与全长Cap于大肠杆菌中融合表达，增加了Cap蛋白的溶解性，去除SUMO标签的Cap蛋白能够组装形成VLPs。Wu等[39]证明了Cap基因N端精氨酸密码子经优化后，Cap蛋白（1～233aa）可以在大肠杆菌中组装形成VLPs，而缺失NLS的Cap蛋白（51～233aa，51～103aa）不能形成VLPs；Cap蛋白中唯一的Cys108突变（CapC/S）后，表达产物中出现很多不规则的聚集体，结果表明了Cap蛋白1～103aa对组装VLPs十分重要，Cys108对VLPs的完整性发挥着重要作用。第65～87aa、113～139aa、169～183aa和193～207aa四个区域是PCV2Cap蛋白的免疫反应区[40]；PCV1Cap蛋白第102～104aa和PCV2Cap蛋白第143～145aa分别含有一个糖基化位点[9]；Truong等发现第69～83aa和第117～131aa是PCV2Cap蛋白线性B细胞表位，具有型特异性，可用来检测病毒抗体效价和用作血清学标记[41]；Cap蛋白163～180aa表位诱导产生PCV2非中和抗体[42,43]，该抗体只在自然感染PCV2的血清中检测发现，也可作为PCV2感染的血清学标记。Shang等确定了PCV2特异线性B细胞表位位于第231～233氨基酸5 残基，PCV1特异线性B细胞表位位于92～103氨基酸残基，156～162和175～192氨基酸残基为PCV1和PCV2共有的线性B细胞表位，并确定了233Proline和156Tyrosin是第231～233aa和156～162aa线性B细胞表位上非常重要的氨基酸残基，第231～233aa也参与了构象表位的形成，此外，还发现使用1C7和2B1（或7F5、6H9）单克隆抗体可以区分1766PCV2、1767PCV2和1768PCV2分离株[44]。Lekcharoensuk通过将PCV2Cap基因嵌合到PCV1基因组，首次报道至少有五个重叠的构象表位位于PCV2Cap蛋白47～85aa、165～200aa和230～233aa区域[45]；Lefebvre用PCV2Cap单克隆抗体证明了1766PCV2、1767PCV2和1768PCV2变异株的抗原差异[46]。Hou等[34]发现PCV2a的第59个氨基酸对PCV2构象中和表位至关重要，Cap蛋白微小变化便可能逃脱疫苗诱导的免疫反应，PCV2d与PCV2a有23个氨基酸不同，发生变异的位置主要位于构象表位、loopBC和loopCT，这些变异改变了病毒表面结构，增强了PCV2d与宿主细胞结合能力。Saha等[47]利用不同的单克隆抗体与不同PCV2基因型毒株竞争性反应，表明了不同PCV2基因型毒株间存在抗原性差异。PCV2基因型差异主要位于Cap蛋白，不同基因型具有不同的氨基酸基序[48,49]。Cap蛋白具有良好的免疫反应原性，已利用Cap蛋白建立了多种血清学检测方法，用于临床PCV2感染的血清学诊断和流行病学调查，使用Cap蛋白制备的单克隆抗体，对PCV2具有中和活性。Cap基因决定了PCV2分离株的多样性，是研究PCV2遗传变异、基因分型、免疫活性表位及疫苗等的靶基因，Cap基因可以代替全基因组作为PCV2遗传进化分析和流行病学调查的标志基因。1.5PCV2流行病学研究进展回顾性研究表明PCV2并不是一种新型病毒，PMWS也不是一种新型疾病，早在1962年就已使用PCR方法检测到PCV2病毒的存在[50]。早期收集的样品分析结果显示，1960年在美国和德国、1970年在北爱尔兰和瑞士和1980年在英国和丹麦，PCV2就已在猪群中存在[51-55]，遗传进化分析推断PCV2很可能在猪群中存在100多年[56]。PCV1和PCV2的结构组成十分相似，尤其在ORF1和ORF2的排列结构上，但核苷酸序列的同源性只有68～76%[40,57]，PCV1不同分离株基因组同源性约97～99%，ORF1氨基酸同源性约99.4%，ORF2氨基酸同源性约94%；PCV2不同分离株基因组同源性约为94.6～99%，ORF1氨基酸同源性约95.7%，ORF2氨基酸同源性约90%[58,59]。PCV1和PCV2的ORF1基因相对保守，基因型间ORF1核苷酸同源性约为85%；ORF2的变异较大，基因型间ORF2核苷酸和氨基酸同源性约为67%和65%[60]。PCV2的基因突变速率为1.2×10-3替换/位置/年，是DNA病毒中突变速度最6 快的[56,61,62]，ORF2的进化速度高于整个基因组的速度[49,61]；然而，PCV1的突变速率约为1.15×10-5替换/位置/年[63,64]。基因突变受多方面因素的影响，如自然选择、在细胞中复制和传播能力以及免疫压力等[65]。2008年，以ORF2基因多样性和遗传距离0.035为标准，对PCV2基因型进行分类[66]。PCV2可划分为5个基因型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e。PCV2b和PCV2d是目前存在的两个重要基因型，PCV2c和PCV2e基因型出现的较少[49,61,67-70]。2003年以前，PCV2a是主要基因型，当时PCV2a和PCV2b基因型在欧洲和中国都已存在，但PCV2a只存在于美国和加拿大[67,71,72]；2003年之后，PCV2出现“基因漂移”[70]；PCV2b基因型取代PCV2a基因型成为流行基因型，且毒力增加[54,67,70,73-77]。研究发现，免疫后的猪群中出现PCV2a和PCV2b混合感染[78]，Hesse等[79]发现PCV2aORF1和PCV2bORF2发生了嵌合。流行病学调查表明，PCV2a、PCV2b和PCV2d在免疫后的猪群中以不同的占比共存，其中以PCV2d为主，PCV2d开始在几个重要养殖猪的国家流行，包括美国、欧洲、中国、韩国和南美洲[61,70,72,80]。7 第二章PCV2疫苗研究进展目前控制PCVAD主要集中在三个方面，即加强管理、防止共感染和疫苗免疫，其中疫苗免疫是最经济、最有效的方法。PCV2疫苗的研究主要包括全病毒灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗和活病毒载体疫苗。使用重组病毒、细菌、酵母、植物和蚕等表达的Cap蛋白制备试验性疫苗，免疫仔猪和小鼠后，有效降低了仔猪血清中的病毒血症、组织中的病毒载量和仔猪死亡率，诱导产生了体液免疫和（或）细胞免疫，提高了平均日增重。从2004年开始，国内外出现多种PCV2商品化疫苗。2.1PCV2灭活疫苗灭活疫苗是指使用理化方法将培养的病毒杀死，加入相应佐剂制成的疫苗。灭活病毒丧失了感染性，但保留有免疫原性。灭活疫苗稳定、安全性好，但只能引起体液免疫，接种量大，需要2次以上的免疫才能达到保护效果，免疫维持时间较短。第一个商品化PCV2灭活疫苗是2004年法国梅里亚动物保健公司生产的矿物油佐剂疫苗CIRCOVAC®，用于分娩前2周的怀孕母猪[81]，必须进行两次免疫；第二个商品化PCV2疫苗是2006年由美国富道动物保健公司生产的PCV1-2嵌合型灭活疫苗SuvaxynPCV2OneDose®，该疫苗是以PCV1为骨架，将PCV1ORF2置换成PCV2ORF2，灭活后免疫2～4周龄仔猪[82]，一次肌肉注射免疫，这是美国批准的第一个PCV2疫苗；2010年，哈尔滨兽医研究所研制的猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）上市，这是我国首个PCV2灭活疫苗，也是我国首个商品化PCV2疫苗；2010年之后，我国开始陆续上市多个不同毒株和剂型的全病毒灭活疫苗，如福州大北农与成都天邦开发的DBN-SX07株灭活疫苗、武汉中博等联合开发的WH株灭活疫苗、浙江大学、诺倍威等共同开发的ZJ/C株灭活疫苗、江苏南农高科与洛阳普莱柯等开发的SH株灭活疫苗和扬州优邦与金宇宝灵生物等联合开发的YZ株灭活疫苗等。PCV2灭活疫苗种类繁多，批准生产灭活疫苗的公司已有30多家。2.2亚单位疫苗Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白和免疫相关蛋白，能刺激机体产生特异性免疫保护反应以抵抗PCV2的感染，是研制PCV2基因工程亚单位疫苗的理想抗8 原，目前也已有多个商品化PCV2亚单位疫苗。勃林格殷格翰公司研制的IngelvacCircoFLEX®和先灵葆雅公司研制的PorcilisPCV®/Circumvent®是最早的PCV2亚单位疫苗，这两种疫苗均利用杆状病毒载体表达PCV2aCap蛋白制备而成，用于2-4周龄仔猪，前者只需一次免疫即可达到保护作用[83]，后者需要进行两次免疫。我国上市最早的PCV2亚单位疫苗是2014年青岛易邦生物工程有限公司开发的原核表达系统表达的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗；同年，武汉中博生物股份有限公司和扬州优邦生物制药有限公司联合推出了杆状病毒载体表达的PCV2亚单位疫苗；2017年，洛阳普莱克公司开发了猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗，该亚单位疫苗由原核表达系统生产且组装形成病毒样颗粒。现有的表达系统均已用于PCV2亚单位疫苗的研究，其中报道最多的是杆状病毒表达载体系统和原核表达系统。Xi等[84]在大肠杆菌中表达无标签的PCV2Cap全长蛋白，Cap蛋白组装形成VLPs，免疫3周龄仔猪后，与商品化SH株灭活疫苗有着相似的保护效果。Wang等[85]利用杆状病毒表达载体表达了Cap蛋白、IFN-γ蛋白、Cap-IFN-γ三种重组蛋白，发现Cap蛋白和IFN-γ联合免疫的小鼠，中和抗体水平和T淋巴细胞高于PCV2LG株灭活疫苗、Cap蛋白和Cap-IFN-γ融合蛋白。Zhang等[86]将CSFVT细胞表位（1446-1460aa）、B细胞表位（693-716aa）替换了PCV2ORF2的核定位信号肽（1-39aa），分别构建了Cap-T、Cap-B和Cap-TB三种重组杆状病毒，三种重组杆状病毒均能组装成PCV2病毒样颗粒，免疫小鼠后诱导了体液免疫和细胞免疫。鞭毛蛋白是Toll样受体5的兴奋剂，已用于疫苗佐剂，可刺激TNF-αandIFN-γ细胞因子的产生[87,88]，Zhang[89]、Zhu[90]等分别将鞭毛蛋白融合到PCV2Cap蛋白中，杆状病毒表达了重组鞭毛-Cap融合蛋白，重组蛋白免疫仔猪后，诱导机体产生了高水平的特异性IgG抗体和中和抗体，免疫21天攻毒的仔猪病毒血症减少、淋巴器官病变轻微，仔猪平均日增重增加。酵母表达系统常用于表达重组蛋白。酵母的细胞壁成分，尤其是β-1,3-D-葡聚糖和甘露聚糖具有佐剂效果，增强抗原特异性刺激作用能够激活树突状细胞和细胞免疫反应[66]，Silva等[91]利用酵母菌实现了PCV2Cap蛋白的分泌表达；Bucarey等[92]、Tu等[93]均将优化和未优化的PCV2全长Cap蛋白构建到酵母菌中。Tu构建的含有优化Cap基因的酵母菌实现了高水平表达，注射免疫仔猪有着良好的免疫效果。Bucarey同时将Cap全基因克隆到杆状病毒和大肠杆菌，与酵母菌表达的Cap蛋白的抗原性和结构特性进行比较，Cap蛋白在三种表达系统中均进行了有效表达；但未优化的Cap蛋白在酵母菌中表达产量极低，且影响酵母菌的正常生长，优化的Cap蛋白在酵母菌中具有很好的转化效率；酵母菌和昆虫细胞表达的Cap蛋白能够组装形成VLPs，将酵母菌产生的VLPs口服免疫小鼠，小鼠体9 内产生了高水平、特异性IgG和IgM，免疫效果显著。Patterson等[94]在酵母菌中表达了PCV2b基因型的Cap蛋白，然后使用冻干酵母菌粉末口服免疫2周龄仔猪，结果免疫仔猪血清和粪便中的病毒血症高低于位免疫组仔猪，TNFα和IL-1β降低，IFN-α和IFN-γ增多具有很好的免疫效果。2.3DNA疫苗1990年，Wolff发现将基因直接注射到小鼠的肌肉组织，可诱导产生相应的免疫反应[95]，很多动物模型研究结果表明DNA疫苗具有免疫保护效果[96-100]。Fenaux等[82,101]分别构建了PCV1、PCV2、PCV1-2和PCV2-1四种DNA克隆，直接注射到仔猪的腹股沟淋巴结，注射PCV1-2DNA克隆的仔猪未出现病毒血症和病毒载量，且诱导产生了特异性中和抗体。2003年，Blanchard等[102]分别将PCV2ORF1和PCV2ORF2构建到真核表达载体pcDNA3.1和杆状病毒表达载体pV1393，获得ORF1和ORF2的DNA疫苗和亚单位疫苗，分别免疫4周龄仔猪，发现ORF2编码的Cap蛋白是PCV2的保护性抗原，且亚单位疫苗的免疫效果优于DNA疫苗。而Shen等[103]表示DNA疫苗的免疫效果优于亚单位疫苗。2.4重组活载体疫苗活载体疫苗分为病毒活载体疫苗和细菌活载体疫苗。病毒活载体疫苗的载体通常为弱毒力的病毒，将其他病原的保护性抗原基因插入到载体基因组的非必需去基因中，形成表达外源蛋白的新的重组病毒。目前用于活载体的病毒有痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、反转录病毒（C型反转录病毒、慢病毒）、不分阶段的单股负链RNA病毒（新城疫病毒、水泡性口炎病毒）和脊髓灰质炎病毒。细菌活载体疫苗是使病原体的保护性抗原或表位插入的细菌基因组或质粒表达而获得的重组细菌。目前用于活载体的细菌有沙门氏菌、乳酸菌、李斯特菌、耶尔森氏菌、重组卡介苗，以及用于细菌表面呈现系统的细菌（LamB、OmpA、PhoE等）。Roques[104]等以腺病毒为载体分别将PRRSV和PCV2b保护性抗原GP5和Cap与M.hyopneumoniae的P97c构建成P97c-GP5、P97c-Cap和GP5-Cap三种重组腺病毒，小鼠免疫试验结果显示P97c-GP5和P97c-Cap免疫效果优于GP5-Cap，表明P97c具有免疫增强效果。Chi等[105]将PCV2Cap基因重组至缺失了gE-基因的伪狂犬病毒基因组中，表达的Cap蛋白可自动组装形成病毒样颗粒，免疫BALB/C鼠和豚鼠，均诱导产生了PCV2特异性中和抗体。Han等[106]将PRRSV的G3/G5蛋白基因和PCV2Cap蛋白基因克隆到牛痘病毒载体中，重组牛痘病毒免疫的仔猪T淋巴细胞增殖，产生特异性中和抗体。Lakshman等[107]将PCV2Cap蛋白65～87aa、113～146aa、158～183aa和194～207aa4个串联的抗原表位区连接到lambdaD基因的C端，Cap蛋白抗原表位在lambda噬菌体中表达，初次10 免疫的仔猪具有显著的免疫效果。Kim等[108]将PCV2Cap基因克隆到支气管炎博德特菌，滴鼻接种免疫小鼠和仔猪后，检测到了PCV2中和抗体，免疫的仔猪攻毒后获得了保护。Wu等[109]将克隆有PCV2Cap基因的重组表达质粒转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌中，表达产物口服免疫BALB/c小鼠后，CD+T淋巴细胞及CD4+/CD8+的比例明显升高；口服免疫8周龄猪后，Cap抗体滴度明显升高，具有很好的中和活性，与PCV2相关的病毒血症和淋巴结损伤显著减少。Wang[110]和Li[111]等分别将PCV2Cap蛋白克隆到乳酸菌递送颗粒--GEM微球的肽聚糖结构域（PA）[112]，构建了GEM-PA-Cap重组质粒，Cap蛋白在乳酸菌成功表达，口服免疫的仔猪产生高水平的中和抗体，发热期较短，肺和淋巴结病变减轻。11 第三章杆状病毒表达系统概述及应用杆状病毒是具有囊膜的双链环状DNA病毒，基因组大小不等，大约为80-180kbp，杆状病毒具有双相生活周期--出芽型病毒（BuddedVirus，BV）和包涵体型病毒（OcclusionDerivedVirus，ODV）两种形式，二者具有不同的感染方式，在宿主之间，杆状病毒以ODV形式传播感染，在细胞内，杆状病毒以BV形式发生感染。其专一宿主是节肢动物[113]，在昆虫细胞核中进行复制。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（autographaCaliforniamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是研究最广泛且应用较多的一种杆状病毒，AcMNPV约含有134kb，大约编码156种蛋白，大部分蛋白的功能还未可知[114]，一部分蛋白已得到详细研究，如多角体蛋白[115,116]、P10蛋白[117]、ac68基因[118]、p26基因[119]、GP64基因[120]等等。以AcMNPV为基础的杆状病毒表达载体系统（baculovirusexpressionvectorsystem，BEVS）发展迅速，已成为应用最普遍的表达系统之一。3.1杆状病毒表达载体系统研究进展第一代商品化BEVS是Clontech生产的BacPAK6TM，该表达系统对AcMNPV基因组进行以下修饰，即经过Bsu361酶切，病毒DNA线性化，除去了lacZ基因和orf1629的部分基因，导致病毒在昆虫细胞中无法复制[121]。线性的病毒DNA[122,123]与转移载体混合后转染到昆虫细胞进行同源重组，表达盒插入到病毒DNA，修复了orf1629基因，病毒DNA恢复环形，同时恢复了感染性。但由于Bsu361酶切效率并不是100%，转染出的病毒是亲代病毒和重组病毒的混合物，需要进一步的蚀斑纯化实验，将重组病毒从从亲代病毒中筛选出来。第二代商品化BEVS为Invitrogen公司生产的Bac-to-BacTM,该表达系统是将mini-F复制子、选择抗性基因和Tn7转座位点插入到杆状病毒基因组，以细菌人工染色体（Bacterialartificialchromosomes，BACs）的形式维持在细菌细胞内。外源基因的转移质粒转化到细菌内后，在Tn7转座酶作用下，Tn7左右臂中的外源基因转座到病毒基因组中，可在含有相应抗生素的琼脂平板上筛选出重组菌，扩增后重组菌经碱裂解抽提病毒DNA，然后将病毒DNA转染到昆虫细胞，拯救具有感染性的出芽病毒。该系统生产的杆状病毒不需要蚀斑纯化过程，然而，需要通过抗性基因从亲代病毒DNA中筛选重组病毒DNA，含有重组病毒DNA的细菌增殖过程以及重组病毒DNA的抽提纯化过程，均可能会影响杆状病毒粒子的稳定性，甚至导致重组病毒表达丢失[124]。目前Bac-to-BacTM杆状病毒表达12 系统已广泛应用。FlashBACTMBEVS对AcMNPV基因组进行了改造，AcMNPV病毒DNA缺失orf1629基因部分序列和BAC取代多角体蛋白基因。缺失了orf1629部分基因序列的病毒DNA不能在昆虫细胞内复制，BAC取代多角体蛋白基因后，病毒DNA能在细菌细胞内维持并进行低拷贝复制。改造后病毒DNA在细菌中增殖后，经碱裂解和氯化铯梯度纯化，获得用于共转染的flashBACTM病毒DNA，与带有外源基因的转移质粒共转染于昆虫细胞，通过细胞内同源重组，重组病毒的orf1629基因完整，病毒恢复复制功能，外源基因同时插入到病毒DNA中，重组杆状病毒获得拯救[125]。该系统中，去除了蓝白斑筛选过程，亲代病毒不可能在昆虫细胞中复制。FlashBACTMGOLDBEVS是在flashBACTM基础上缺失了几丁质酶基因（chiA）和组织蛋白酶基因（v-cath）。ChiA是一个辅助基因，编码的酶能够促进细胞内切酶和外切酶的活性[126]。对于感染的昆虫细胞，chiA表达于感染的晚期，与组织蛋白酶一起促进宿主表皮分解和组织溶解，从而释放病毒，感染更多的宿主细胞[127]。已有文献报道，缺失病毒基因组中chiA和（或）v-cath基因，可提高昆虫细胞和昆虫幼虫蛋白稳定性。Possee等将chiA基因从杆状病毒基因组缺失后，分泌性重组蛋白表达水平提高[128]；Lee等在B.mori幼虫中表达纤维素酶，表达量提高了17%[129]；Suzuki等用缺失v-cath的杆状病毒表达萤火虫荧光素酶和人生长因子，发现蛋白稳定性大大增加[130]；Park等使用缺失chiA/v-cath的病毒在B.mori中表达GFP融合蛋白，血淋巴中几丁质酶和组织蛋白酶的活性分别降低了95%和50%，与未修饰的病毒相比，表达的GFP（uv）-beta、3-N-葡萄糖胺乙酰转移酶降解量减少，活性增加了2.8倍[131]。FlashBACTMGOLD杆状病毒表达载体不仅增加了分泌蛋白的表达量，同时提高了重组蛋白的稳定性[132]。FlashBACTMULTRABEVS是在flashBACTMGOLD基础上，缺失了p10、p26和p74基因[133]。Silvia等[134]将BEVS的双表达盒载体进行了改造，polh启动子后克隆杆状病毒源激活因子ie0、ie1；p6.9p10双启动子代替原来的p10启动子，与杆状病毒源的增强子hr1顺式连接，启动外源蛋白的表达，polhAc-ie-01/hr1p6.9p10称为TB表达盒，该表达盒延长了细胞感染后保持完整性的时间，提高了蛋白的完整性，且EGFP表达量是原表达盒的4倍，TB表达盒可显著提高BEVS的蛋白表达水平。随后，Javier等[135]使用新的杆状病毒表达盒TB分别高效表达了PCV2Cap蛋白和RHDVVP60蛋白，两种蛋白的表达量比原表达盒相比均提高了300%，均组装形成了PCV2VLPs和RHDVVLPs。13 3.2Bac-to-Bac®杆状病毒表达载体系统原理1993年出现了Bacmid技术[136,137]，Bacmid是组装有杆状病毒DNA的细菌人工染色体（Bacterialartificialchromosomes，BACs），因此Bacmid可以维持于大肠杆菌细胞内并在大肠杆菌中增殖，Bac-to-Bac具有“Bacteria”到“Baculovirus”之意。杆状病毒表达载体系统包含3个部分：转移质粒、杆状病毒表达载体和昆虫细胞。转移质粒由Ph或P10启动子、启动子下游的多克隆位点、polyA序列、抗性基因及mini-Tn7位点（位于表达盒两侧的Tn7左、右臂序列）组成。根据需要可在外源基因N端加入GP64、蜂毒素或几丁质酶等信号肽促使蛋白分泌表达，在开放阅读框N端或C端加入6×组氨酸标签利于蛋白纯化，TEV酶切位点可用于后期组氨酸标签的移除。感受态大肠杆菌DH10Bac中包含两个质粒：穿梭质粒和辅助质粒。穿梭质粒（Bacmid）具有在细菌中低拷贝mini-F复制子、mini-attTn7转座位点、卡纳霉素抗性基因的杆状病毒基因组，不含有杆状病毒多角体蛋白；辅助质粒编码转座酶，可维持在大肠杆菌中，使转移质粒上的表达盒通过转座作用定向转移到杆状病毒表达载体上，含有四环素抗性基因。转移质粒转化到感受态细胞中后，在转座酶催化作用下，将Tn7转座子左右臂定向转移到Bacmid的Tn7位点，形成具有外源基因的Bacmid。转移载体中携带有LacZ基因，其产生的α-肽与宿主菌的α-肽互补可编码β-半乳糖苷酶，经过IPTG诱导分解底物X-gal形成蓝色噬菌斑。当外源基因插入到转移载体中LacZ的多克隆位点，导致LacZ失活，破坏了α-肽的互补形成，在含有X-gaL和IPTg的平板中生长白色噬菌斑。因此重组质粒可在相应抗性、IPTG和X-gal（或Bluo-gal）底物的琼脂糖平板上通过蓝白斑筛选获得，然后经过碱裂解方法获得病毒DNA，纯化的杆粒DNA用于转染昆虫细胞，生产具有感染性的BV。3.3杆状病毒表达载体系统应用BEVS具有很好的生物安全性，可在P1实验室的设施中操作[138]。杆状病毒在哺乳动物细胞中不能复制，进入人体细胞后会被降解，对人和哺乳动物无致病性，目前还未有杆状病毒整合到人染色体上的报道。（1）生物杀虫剂：杆状病毒具有较窄的宿主范围，因此最初用其研制的生物杀虫剂对植物、哺乳动物、鸟类、鱼类甚至对非靶标昆虫无影响[139,140]。（2）蛋白表达载体：从Smith等1983年初次采用杆状病毒感染昆虫细胞高效表达人干扰素-β[141]至今，杆状病毒表达载体系统已经相当成熟，在药物开发和疫苗研制中受到普遍使用，BEVS成功表达的重组蛋白已达数千种，研制的以14 杆状病毒为载体的人和兽用商品化疫苗相继上市，如乳头瘤病毒疫苗Cervarix®、前列腺癌治疗产品Provenge®、流感疫苗Flublok®、脂蛋白脂肪酶缺陷病治疗药物Glybera®等用疫苗和药物，以及针对预防猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、兔出血症病毒和水貂肠炎病毒等多种兽用亚单位疫苗。杆状病毒表达载体优势：（i）昆虫细胞是真核细胞，具有完备的翻译后加工修饰功能，重组蛋白与天然蛋白具有相似的生物活性；（ii）外源基因容量大，杆状病毒表达载体大小约为134kbp，适合较大的基因克隆和同时多个基因的克隆；（iii）生物安全性好，杆状病毒不感染包括人在内的哺乳动物；（iv）在强启动子Ph或P10的调控下，重组蛋白具有很高的表达水平。15 第二篇研究内容第一章PCV2bCap蛋白在BEVS中高效表达猪圆环病毒2型（PCV2）属于圆环病毒科、圆环病毒属，病毒颗粒呈二十面体对称，无囊膜，基因组为共价闭合环状单链DNA,大小约为1767或1768nt。PCV2基因组中含有11个开放阅读框（ORFs），其中最主要的为ORF1和ORF2。ORF1位于单链DNA51～985nt，编码病毒的复制相关蛋白（Rep和Rep'）；ORF2位于单链DNA1034～1735nt，该区域的互补链编码病毒的结构蛋白（Cap蛋白）。Mahe等[40]发现PCV2Cap蛋白65-87aa、113-139aa、169-183aa和193-207aa4个区域具有免疫原性。Cap蛋白前41个氨基酸为核定位信号肽（NLS）[153]，相关文献报道，缺失或突变NLS的Cap蛋白表达量高于未改变NLS的Cap蛋白[31]。杆状病毒表达载体系统（BEVS）是最为广泛应用的真核表达载体系统之一,除具有真核表达载体的优势外，其高水平表达受到疫苗行业的青睐。目前BEVS广泛应用于疫苗生产、蛋白结构和功能研究、医药等行业。本研究以实验室2015年分离的PCV2b为基础，构建了一株高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒。根据H5细胞对密码子的偏好性，对Cap蛋白密码子进行优化并合成，同时突变了Cap蛋白的NLS序列；此外，本研究还在杆状病毒转移载体中克隆了增强子元件，以提高Cap基因的转录效率。重组蛋白在悬浮培养的H5细胞中表达，悬浮表达方式不仅易于进行规模化生产，还可以进一步提高了重组蛋白表达水平。1.1材料和方法1.1.1材料1.1.1.1细胞、载体昆虫细胞系：Sf9细胞、H5细胞、pFastBacI转移载体（图2.1）购自LifeTechnologies公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH10Bac感受态细胞购自博迈德生物科技公司。16 图2.1pFastBacI转移载体Fig.2.1pFastBacItransfervector1.1.1.2试剂、耗材氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、庆大霉素、IPTG和X-gal均购自Sigma公司；TEMED、30%丙烯酰胺溶液购自CWBIO公司；转膜滤纸、硝酸纤维素膜（PVDF）购自Pall公司；一次性细胞培养皿、细胞培养摇瓶、6孔板和96孔板均购自康宁公司；5×SDS-PAGEloadingbuffer、10×DNAloadingbuffer、DL5000DNAMarker、PremixTap、高保真PrimeSTARMaxPremix和In-Fusion®HDEnzymePremix购自TaKaRa公司；KpnI、XbaI限制性内切酶购自NEB公司；PlasmidminiprepKit、DNAgelExtractionkit及BodyFluidViralDNA/RNAminiprepKit均购自Axygen公司；转染试剂TransIT®-LTI购自MIRUS公司；胎牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所；血球计数板购自百泰贸易公司；台盼蓝染液、BSA标准蛋白购自碧云天生物技术公司；鼠抗His单克隆抗体、FITC/HRP标记山羊抗小鼠（兔）IgG购自康为世纪公司。1.1.1.3试剂配制（1）细菌培养试剂100mg/ml氨苄青霉素（20ml）：取2g氨苄青霉素粉末溶于15ml灭菌二馏水中，定容至20ml，充分溶解后，使用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装（1ml/支），-20℃保存，按照1:1000使用，使用终浓度为100μg/ml。20mg/mlX-gal（20ml）：使用精准电子称称取0.4gX-gal粉末，溶于20ml二甲基甲酰胺中，-20℃保存，每200mlLB培养基中加入1ml该储存液，使用终浓度为100μg/ml。100mg/mlIPTG（10ml）：称取1gIPTG粉末溶于10ml灭菌二馏水中，充分17 溶解，使用0.22μm滤器过滤后分装，100μl/支，-20℃保存，每200mlLB培养基中加入80μl该储存液，使用终浓度为40μg/ml。10mg/ml四环素（20ml）：称取0.2g四环素溶于20ml灭菌二馏水，使用0.22μm滤器过滤后分装（1ml/支），-20℃保存，按照1:1000使用，使用终浓度为10μg/ml。7mg/ml庆大霉素（40ml）：称取0.28g四环素溶于40ml灭菌二馏水，使用0.22μm滤器过滤后分装（1ml/支），-20℃保存，按照1:1000使用，使用终浓度为7μg/ml。50mg/ml卡那霉素（40ml）：称取1g卡那霉素溶于20ml灭菌二馏水，使用0.22μm滤器过滤后分装（1ml/支），-20℃保存，按照1:1000使用，使用终浓度为50μg/ml。LB液态培养基（1L）：将10g蛋白胨、10g氯化钠、5g酵母提取物溶于二馏水中，在蒸汽高压锅中121℃灭菌20min，根据需要加入相应的抗生素。LB固态平板：将2g蛋白胨、2g氯化钠、1g酵母提取物溶于200ml二馏水中，加入3g琼脂粉，在蒸汽式高压锅中121℃灭菌20min，冷却至60℃左右倒板，培养基厚度约5mm左右。Amp-LB固态平板：制备LB固态平板的培养基冷却至60℃左右时加入氨苄青霉素，可配制含氨苄青霉素的LB平板，标记为Amp-LB。Bacmid-LB固态平板：制备LB固态平板的培养基冷却至60℃左右时加入终浓度为7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、50μg/ml卡纳霉素、40μg/mlIPTG和100μg/mlX-gal，可配制用于筛选重组杆粒的蓝白斑筛选平板，标记为Bacmid-LB。（2）杆粒提取试剂溶液I（100ml）：含有2.5ml1MTris-HCl（pH8.0）、2ml0.5MNa2EDTA·2H20（pH8.0）、4.5ml20%葡萄糖溶液（1.11M）、91ml二馏水，高温高压灭菌后，4℃保存。1MTris-HCl（pH8.0，40ml）：称取4.844gTris溶于30ml二馏水，加入约1.68ml浓盐酸，调节pH值至8.0，最后定容至40ml；0.5MNa2EDTA·2H20（pH8.0，50ml）：称取9.305gNa2EDTA·2H20溶于二馏水，用NaOH调节pH值至8.0，最后定容至50ml；20%葡萄糖溶液（50ml）：称取10g葡萄糖溶解到40ml二馏水，最后定容到50ml。溶液II（100ml）：含有5ml10%SDS溶液、5ml2NNaOH溶液和90ml二馏水，室温保存。10%SDS（20ml）：称取2gSDS粉末溶解于15ml二馏水，最后定容至20ml；18 2NNaOH（20ml）：称取1.6gNaOH溶解于15ml二馏水，最后定容至20ml。溶液III（100ml）：称取29.4g乙酸钾溶解于80ml二馏水，量取11.5ml醋酸溶液，最后定容到100ml，高温高压灭菌，4℃保存。10×TE缓冲液（100ml）：含有10ml1MTris-HCl、2ml0.5MEDTA和88ml二馏水，高温高压灭菌，4℃保存。使用时配成1×TE并加入RNA酶。（3）核酸电泳相关试剂50×TAE电泳缓冲液（1L，pH8.5）：称取242gTris、37.2gNa2EDTA·2H2O溶于800ml二馏水，加入57.1ml醋酸，定容至1L，室温保存。1×TAE电泳缓冲液（1L）：量取20ml50×TAE电泳缓冲液，加入980ml二馏水，混匀后备用。0.5%溴化乙锭（EB）：称取0.1gEB，溶于20ml二馏水中，于棕色瓶中室温保存，注意防护。1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖粉末，在盛有100ml1×TAE的锥形瓶中加热融合，冷却至60℃左右，加入7μl左右的0.5%EB，缓慢倒入制胶槽，待凝固后即可使用。（4）蛋白电泳相关试剂10%过硫酸铵（APS）：称取2gAPS溶于20ml二馏水，充分溶解后使用0.45μm滤器过滤、分装，230μL/支，-20℃保存，注意防护。10%SDS溶液（20ml）：称取2gSDS粉末于15ml二馏水，充分溶解后定容至20ml，pH值调至7.2，室温保存，注意防护。1MTris-HCl（200ml）：将24.22gTris粉末溶解到150ml二馏水中，高温高压灭菌后，使用浓盐酸调定pH值至6.8，最后定容到200ml，室温保存。1.5MTris-HCl（500ml）：称取90.85gTris粉末溶解到400ml二馏水中，高温高压灭菌后，使用浓盐酸调定pH值至8.8，最后定容到500ml，室温保存。5×SDS-PAGE电泳缓冲液（1L）：称取5gSDS、15.1gTris、94g甘氨酸溶解到800ml二馏水中，充分溶解后定容至1L，室温保存。1×磷酸盐缓冲液（PBSbuffer，1L）：称取8gNaCl、0.2gKCl、3.12gNa2HPO4·12H2O、0.27gKH2PO4溶解于800ml二馏水中，浓盐酸调至pH值至7.4，最后定容至1L。PBST（1L）：1×PBSbuffer中加入0.5mlTween20，充分混匀使用。80%甘油：量取20mlCBS缓冲液，加入到80ml的丙三醇混匀，室温保存。转膜缓冲液（1L）：称取2.9g甘氨酸、0.37gSDS、5.8gTris充分溶解到700ml19 二馏水中，定容至800ml，加入200ml甲醇混匀，室温保存。考马斯亮蓝R-250染色液（1L）：称取1g考马斯亮蓝R-250粉末充分溶解于250ml的异丙醇，加入100ml冰醋酸混匀，加入650ml二馏水定容至1L，使用滤纸过滤，除去不溶性杂质，室温保存。考马斯亮蓝染色脱色液（1L）：量取100ml醋酸、50ml乙醇、850ml二馏水，充分混匀，室温保存。1.1.1.4仪器恒温培养箱（Boxun，BPXTYPIS）；恒温培养振荡器（Thermo，ZWY-240）；生物安全柜（Thermo，1300SeriesA2）；电子分析天平(METTLE，TOLEDO，AL104)；荧光倒置显微镜（OLYMPUS，BX41）；光学倒置显微镜(OLYMPUS，E520)；PCR仪（AppliedBiosystems，2720ThermalCycler）；小型台式离心机（Thermo，HERAEUSPico17）；紫外凝胶成像仪（Wealtec，Dolphin-view）；纯水仪（PALL，CASCADALSMK2，CLDC271498）；DNA电泳仪和蛋白电泳仪（北京六一仪器厂，24DN）；半干转膜仪（BIO-RAD，TRANS-BLOT.SDsemi-drytransfercell）。1.1.2方法1.1.2.1重组杆状病毒拯救技术路线本课题将PCV2Cap基因克隆到pFastBacI转移载体多克隆位点；鉴定正确的重组质粒pFastBacI-PCV2-Cap（pF-Cap）转化到DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，经过蓝白斑筛选得到重组穿梭杆粒Bacmid-PCV2-Cap（Bac-Cap）；抽提重组穿梭质粒，转染Sf9昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒AcMNPV-PCV2-Cap（Ac-Cap）；重组杆状病毒接种H5细胞悬浮表达Cap蛋白（图2.2）。20 图2.2重组杆状病毒构建路线Fig.2.2Thegenerationofrecombinantbaculovirus1.1.2.2昆虫细胞培养Sf9细胞系：在一次性细胞培养皿中传代，使用含有10%热灭活胎牛血清的TMII培养基，在27℃的温湿培养箱（无需补充5%COSf-9002气体）中静置培养，传代时，使用无菌枪头轻轻吹起细胞，补充新鲜培养基，2～3天进行一次传代。H5细胞系：使用无菌摇瓶在27℃、110rpm的摇床上悬浮培养，培养基为无血清的Sf-900TMII，2～3天进行一次传代。1.1.2.3转移质粒改造依据H5细胞对密码子的偏好性，PCV2Cap基因于金唯智公司进行了优化，并合成了含有增强子、双启动子和Cap的基因片段（如图2.3）。根据优化后Cap基因序列和载体序列设计了含有转移载体同源臂的Cap基因引物，以及鉴定重组转移质粒的pFastBacI载体通用引物和鉴定重组杆粒的通用引物M13（见表2-1）。图2.3片段基因合成Fig.2.3synthesisofthefragmentgene21 启动子：gaattctacccg**********tactcgtaaagc；增强子：ttaatagtagc**********cgataaaccat（注：因该重组杆状病毒具有较高的商业价值，启动子和增强子序列此处未详细注明）；Cap基因核定位信号肽突变后氨基酸残基：原始序列：MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRK突变序列：MTYPRRRYRRRSVNPVSALGQILRVRPWLVHPRVNVRWSVN。6×His组氨酸标签：CATCACCATCACCATCAC表2-1PCV2Cap相关鉴定引物Table2-1TheprimersofPCV2bCapidentification引物名称引物序列（5'-3'）CapF:ccaccatcgggcgcggatccatgacgtatccaaggaggcgR:agtacttctcgacaagcttttaagggttaagtggggggtpFastBacIF:ctccggaatattaatagatcR:caaatgtggtatggctgattM13F:cccagtcacgacgttgtaaaacgR:agcggataacaatttcacacagg注：下划线碱基为载体同源臂序列使用2×PrimSTAR高保真酶对合成的Cap基因进行PCR扩增，50μlPCR反应体系为：2×PrimeSTARMaxPremix25μl，CapF/R各1μl，Cap基因片段1μl（约10ng），补充灭菌四馏水至总体积为50μl。PCR条件设置为：预变性98℃1min；变性98℃10s、退火55℃20s、延伸72℃1min，25个循环；延伸72℃10min。加入5×loadingbuffer，使用含有EB的1%琼脂糖凝胶电泳并使用DNA凝胶回收试剂盒回收，获得Cap基因，使用分光光度计检测回收DNA浓度，然后用于与线性pFastBacI载体的连接。限制性内切酶XbaI酶切pFastBacI载体50μl反应体系：pFastBacI载体10μl（约2μg），10×内切酶Buffer5μl，XbaI3μl，补充32μl灭菌四馏水至50μl，置于37℃水浴锅1h。加入适量DNAloadingbuffer，经1%琼脂糖凝胶电泳并使用DNA凝胶回收试剂盒回收，检测线性载体浓度，用于与Cap基因片段的连接。用In-Fusion®HDEnzymePremix将Cap基因和线性pFastBacI载体进行连接，5μl连接体系为：Cap基因片段1μl（约60ng），线性pFastBacIDNA片段1μl（约60ng），5×In-Fusion®HDEnzymePremix1μl，加入灭菌四馏水至总体积为5μl。反应条件：50℃15min，4℃2min。大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱取22 出后置于冰上融化，将5μl连接产物转化至感受态细胞，轻轻混匀，冰上放置30min；随即转移到42℃水浴锅，热激90s；然后立即转移到冰上，冷浴2min，期间不要晃动；加入适量SOC培养基，将细胞涂布于Amp-LB平板，过夜培养。挑选单菌落于10ml液态LB培养基，在37℃、200rpm条件下过夜震荡培养。使用pFastBacI载体通用引物进行菌液PCR鉴定。10μlPCR反应体系为：2×TaqPremix5μl，CapF/R各0.5μl，菌液1μl，补充灭菌四馏水至总体积为10μl。PCR条件设置为：预变性94℃1min；变性94℃10s、退火55℃20s、延伸72℃1min，25个循环；延伸72℃10min。对琼脂糖凝胶电泳结果出现约900bp左右长度的菌液，利用质粒小提试剂盒提取质粒后送库美生物公司测序，验证有无目的基因插入及有无碱基和氨基酸突变。1.1.2.4重组杆粒的筛选、鉴定和纯化从-80℃冰箱取出大肠杆菌DH10Bac感受态细胞置于冰上融化，将测序结果正确的重组质粒加入DH10Bac感受态细胞中，置于冰上30min，之后转移到42℃水浴锅热激90s，立即转移至冰上冷浴2min，期间不要移动，加入适量SOC培养基，涂布在Bacmid-LB平板上，在37℃培养箱中培养24～48h，出现清晰可见的蓝白斑时，挑选白斑于含有7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、50μg/ml卡纳霉素的液态LB培养基中，在37℃、220rpm条件下振荡培养12h左右。杆粒抽提纯化过程依照下述步骤进行：Ⅰ使用1.5mlEP管收集2ml左右菌液，以12000×g离心1min，弃上清收集菌体沉淀，加入100μl溶液I轻轻吹悬沉淀；Ⅱ加入200μl溶液II裂解菌体，轻轻上下倒置混匀，浑浊菌液变透明；Ⅲ加入150μl溶液III，轻轻上下倒置混匀，透明液体出现白色絮状沉淀，以12000×g离心5min；Ⅳ使用切去尖端的枪头吸取上清液（降低重组杆粒的破坏），转移到1.5mlEP管，加入0.5ml氯仿：异戊醇（24:1）的混合液，轻轻上下倒置数次，离心12000×g、5min；Ⅴ离心后液体分为上下两层，使用切去尖端的枪头小心吸取上层液体转移到新EP管中（可重复抽提）。然后加入2倍体积的无水乙醇，上下倒置混匀，置于-20℃冰箱30min。Ⅵ取出上述液体离心，以12000×g、5min，出现少许白色沉淀，弃上清液，使用75%酒精吹悬沉淀，12000×g离心5min，弃去75%酒精，在超净台吹干，白色沉淀变透明，加入50μlTE缓冲液，静置5分钟，轻弹混匀，使用分光光度计检测浓度。使用M13引物PCR鉴定抽提的杆粒是否为重组杆粒，同时设置空白对照，23 20μlPCR反应体系为：2×PremixTaq10μl，杆粒1μl，M13F/R各0.5μl，补充8μl灭菌四馏水至总体积为20μl。PCR条件设为：预变性94℃1min；变性94℃10s、退火55℃30s、延伸72℃3min，25个循环；延伸72℃10min。加入适量5×loadingbuffer，使用含有EB的1%琼脂糖凝胶电泳后观察结果。1.1.2.5重组杆粒转染Sf9细胞转染前选择状态良好的Sf9细胞铺于6孔板，取适量传代Sf9细胞使用台盼蓝染色30s左右，滴于血球计数板观察细胞活性并计数。将细胞活性≥97%的细胞铺于6孔板，每孔106个细胞左右。2h（或过夜）后细胞贴壁，可用于转染。转染过程如下（细胞传代、转染均在无菌条件下操作）：①准备两个灭菌的1.5mlEP管，各分装0.1ml无抗生素、无胎牛血清的Sf-900TMII培养基;②分别加入3μl重组杆粒（2μg）、6μl转染试剂，轻轻混匀，室温静置5min。③将含有转染试剂的培养基转移到含有杆粒的培养基中，轻轻混匀，室温静置20min；期间取出贴壁的Sf9细胞，弃去原培养基，使用无抗生素、无胎牛血清的Sf-900TMII培养基轻轻洗两遍，每孔加入2ml无抗生素、无胎牛血清的Sf-900TMII培养基；④将Ⅲ中的209μl混合液均匀滴加到6孔板的一个细胞孔中，另一孔为正常细胞对照。转染第3～5天，观察细胞变化。1.1.2.6重组杆状病毒液的扩增将状态良好、2×106个细胞/ml的12mlSf9细胞悬液传至细胞培养皿，细胞贴壁后，接种10μlP0Ac-Cap病毒液。接毒约72h，Sf9细胞开始出现病变，第5或6天，待细胞出现变大变圆、胞内颗粒状物非常明显时，收获病毒液，标记为P1Ac-Cap，4℃避光保存。使用TCID50方法检测病毒滴度。1.1.2.7野型杆状病毒拯救将空转移载体pFastBacI转化感受态大肠杆菌DH10Bac进行蓝白斑筛选，其它操作步骤同重组杆状病毒。1.1.2.8多克隆抗体制备按照50%疫苗推荐使用量免疫SPF级大耳白兔，以背部皮下多点注射方式进行，每隔一周免疫一次，第四次免疫10天后采血，分离血清用于Westernblot分析。1.1.2.9重组杆状病毒的鉴定24 利用PCR鉴定杆状病毒基因组、间接免疫荧光、SDS-PAGE及Westernblot方法鉴定重组杆状病毒。1.1.2.9.1PCR鉴定使用体液病毒DNA/RNA试剂盒提取P0Ac-Cap病毒DNA，同时以空杆状病毒和正常Sf9细胞作为对照，操作步骤依照试剂盒说明书进行。使用M13引物鉴定提取的DNA，PCR鉴定体系及反应条件同1.2.2Ⅵ，最后用1%琼脂糖凝胶电泳分析。1.1.2.9.2间接免疫荧光鉴定将Sf9细胞铺于24孔板的6个孔，每孔约5×105个细胞。细胞贴壁后，分别将P0Ac-Cap与P0AcMNPV病毒液接种于24孔板Sf9细胞中，每种病毒接种两个细胞孔，每孔接种5μl病毒液，剩余两孔为正常细胞对照，在27℃培养箱中静置培养。当接毒细胞出现明显病变（3天左右），弃去培养基，用PBS（pH=7.4）轻轻洗一遍，每孔加入0.4ml80%冷丙酮室温固定30min；弃去丙酮，电风扇吹干，每孔加入0.2mlPBS稀释的鼠抗His单克隆抗体（1:5000稀释），在37℃培养箱孵育1h，弃去多克隆抗体，每孔加入2mlPBST，静置3min，洗3次；每孔加入0.2mlPBS稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG（1:100稀释），置37℃培养箱避光孵育1h，每孔加入2mlPBST，方法同上；每孔加入2～3滴80%甘油（碳酸盐缓冲液配制），荧光显微镜观察。1.1.2.9.3SDS-PAGE电泳及Westernblot分析⑴样品制备选择状态良好、处于对数生长期的H5细胞，将台盼蓝染液和细胞悬液按照1:1混合后，滴于血球计数板上盖玻片的一侧，死细胞被染成蓝色，活细胞不着色，在倒置显微镜下观察细胞活性与细胞个数，选择活性≥97%的H5细胞接种病毒。将密度为2×106个细胞/ml的90ml细胞悬液分装到3个容量为125ml的摇瓶中，每瓶30ml，分别用于接种20μl重组杆状病毒液、20μl野型杆状病毒液和正常细胞对照。细胞培养条件为27℃、110rpm，悬浮培养72h左右。使用台盼蓝染液对病变细胞悬液染色，在血球计数板上观察接毒细胞是否出现明显病变并统计细胞活性，当接毒细胞出现明显病变且活性≥70%时，收获病毒液于-40℃反复冻融两次。分别取60μl冻融后的重组杆状病毒、野型杆状病毒与正常细胞冻融液，加25 入适量5×LoadingBuffer，混匀后煮沸5min，5000rpm离心5min，取上清保存备用。⑵SDS-PAGE电泳配制三块SDS-PAGE电泳凝胶，一块用于考马斯亮蓝染色分析，另两块用于Westernblot分析（用于不同抗体的孵育）。准备3份洗净的玻璃板、制胶槽、样品梳，按要求进行组装，按照分离胶-浓缩胶顺序进行配制。使用移液器将分离胶混合液灌入玻璃板间隙，然后加入约1ml异丙醇溶液密封。每块分离胶成分及含量如表2-2所示：表2-212%SDS-PAGE分离胶体系Tab.2-212%separationgel成分体积（ml）4dH2O3.330%丙烯酰胺41.5MTris-HCl（pH8.8）2.510%SDS0.110%APS0.1TEMED0.004总体积10.004分离胶凝固后（约30min），弃去上层异丙醇溶液，并用吸水纸吸净，开始配制5%浓缩胶，配好后快速加入到分离胶上层，并插入样品梳。每块浓缩胶成分及含量如表2-3所示：表2-35%SDS-PAGE浓缩胶体系Tab.2-35%concentrationgel成分体积（ml）4dH2O2.130%丙烯酰胺0.51MTris-HCl（pH6.8）0.3810%SDS0.0310%APS0.03TEMED0.003总体积3.043⑶SDS-PAGE电泳26 轻轻拔去样品梳，取样品上清，按照Marker、正常Sf9细胞、野型杆状病毒、和重组杆状病毒顺序上样，每孔20μl样品，另外两块胶以相同顺序加样。将电压调至80V开始电泳，待样品进入分离胶后，将电压调至120V继续电泳，溴酚蓝指示剂到达底部时停止电泳。切取3块分离胶，1块分离胶加入适量考马斯亮蓝染色液，慢速振荡染色1～2h。取出着色的分离胶，加入适量脱色液，慢速振荡脱色，直至脱色液无色即可，拍照留存。⑷Westernblot分析另2块分离胶，剪切含目的蛋白带部分，置于转膜缓冲液约10min，滤纸和PVDF膜的大小依照胶＜滤纸＜PVDF膜剪取，PVDF膜在甲醇中活化约10后取出，和滤纸一起浸泡到转膜缓冲液约5min，按照“三明治”样式放置，即负极-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-正极，转膜条件为15V、1h。转膜1h后，PVDF膜用PBST振荡洗一遍，5min/次，使用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜（或室温封闭2h）；取出PVDF膜，用PBST振荡洗3遍，5min/次；分别加入一抗—鼠抗His标签多克隆抗体（1:5000，PBS稀释）和兔抗PCV2-Cap多克隆抗体（1:500，PBS稀释），室温振荡孵育1.5h；一抗孵育后，PBST振荡洗涤3遍，5min/次，分别使用二抗—HRP标记山羊抗His标签单克隆抗体和HRP标记山羊抗兔IgG抗体室温振荡孵育1.5h；PBST振荡洗涤3遍，5min/次，PVDF膜置于白色背景下，TMB显色液均匀滴至PVDF膜各处，出现清晰条带后拍照保存。1.1.2.10重组蛋白高效表达选择细胞活性大于97%的H5细胞（细胞筛选同1.1.2.9.3（1）），并稀释至密度约2.5×106cells/ml，分装到4个摇瓶，每瓶30ml细胞悬液。重组杆状病毒滴度为109.77TCID50/ml，分别以MOI=5、1、0.1、0.01的P2重组杆状病毒接种细胞并悬浮培养。按照pfu=0.69×TCID50，所需病毒液（pfu/ml）=MOI(pfu/cell）×细胞总数计算方法可知，每瓶的接毒量分别为90μl、18μl、病毒液滴度（pfu/ml）1.8μl和0.18μl。然后每隔24h收获少量细胞悬液，用于蛋白表达含量鉴定，连续收取七天。同时以150μg/ml、200μg/mlBSA标准蛋白稀释液作为参照，样品处理和电泳过程同1.1.2.9.3（3）。1.2结果1.2.1重组转移载体pF-Cap的鉴定使用pFastBacI载体引物鉴定重组pF-Cap。若构建成功，琼脂糖凝胶电泳结果会出现903bp的目的条带，否则会出现185bp条带，设置空转移载体对照和阴性对照。如图2.4，重组质粒出现与预期相符的目的条带，Cap成功克隆到pFastBacI载体中。送至库美生物公司测序，结果表明氨基酸未发生突变。27 1：DL5000DNAMarker；2：重组载体pFastBacI-Cap；3：空载体；4：阴性对照图2.4重组质粒pF-Cap的PCR鉴定Fig.2.4PCRidentificationofrecombinantplasmidpF-Cap1.2.2重组杆粒Bac-Cap的鉴定使用M13引物对白斑菌液进行菌液PCR，若重组成功，应出现3026bp的目的条带，否则会出现2300bp条带。鉴定结果如图2.5，片段大小与预期相符，成功获得重组杆粒。1：DNAMarkerDL5000；2：重组杆粒Bac-Cap；3：空杆粒；4：阴性对照图2.5重组杆粒Bac-Cap的PCR鉴定Fig.2.5PCRidentificationofrecombinantplasmidpF-Cap1.2.3重组杆状病毒Ac-Cap的拯救被感染的Sf9细胞停止增殖，体积增大1～3倍，胞内出现颗粒状物，细胞容易脱落。感染时间过久，细胞出现破碎；未感染的细胞密度增大，体积变小，甚至长成双层（如图2.6）。28 A：重组杆状病毒感染Sf9细胞B：野型杆状病毒感染Sf9细胞C：未感染Sf9细胞图2.6未感染和感染的Sf9细胞形态Fig.2.6Sf9cellularmorphologicalvariationofnon-infectionandinfection1.2.4间接免疫荧光鉴定病变Sf9细胞和未感染Sf9细胞经固定、AntiHis-TagMouseMonoclonalAntibody孵育和FITCConjugatedDonkeyAnti-MouseIgG孵育后，在荧光显微镜下可观察到，感染重组杆状病毒的细胞出现明亮的绿色荧光，野型杆状病毒感染的Sf9细胞和未感染的Sf9细胞暗淡，未出现荧光。A：未感染Sf9细胞；B：野型杆状病毒感染Sf9细胞；C重组杆状病毒感染Sf9细胞图2.7重组杆状病毒间接免疫荧光鉴定Fig.2.7Indirectfluorescenceassay(IFA)oftheCapproteinexpressedinSf9cells1.2.5SDS-PAGE和Westernblot分析结果感染Sf9细胞经处理后进行了SDS-PAGE及Westernblot分析，小鼠抗His单克隆抗体和兔抗PCV2/Cap多克隆抗体分别用作一抗，HRP标记的山羊抗鼠（兔）IgG分别用作二抗，未感染的Sf9细胞、空杆状病毒感染的Sf9细胞为对照。SDS-PAGE（A）及Westernblot（B）结果显示（如图2.8），利用重组的杆状病毒成功表达了Cap蛋白，蛋白大小与预期（28kDa）相符。29 ABCA：SDS-PAGE电泳；B：以抗His标签单克隆抗体为一抗；C：以抗PCV2Cap多克隆抗体为一抗1：预染的蛋白Marker（180kDa）；2：未感染的Sf9细胞：3：空杆状病毒感染的Sf9细胞；4：重组杆状病毒感染的Sf9细胞图2.8SDS-PAGE和Westernblot分析Fig.2.8AnalysisofSDS-PAGEandWesternblotoftherecombinantprotein1.2.6重组杆状病毒高效表达分别将P2重组杆状病毒以MOI=5、1、0.1、0.01病毒量接种到密度为2.5×106个/mlH5细胞，每隔24h收取0.5ml细胞悬液，连续收取七天。样品电泳结果显示，当接种毒量MOI≥0.1时，H5细胞感染48h时开始表达重组蛋白；MOI≥1时，感染的细胞在重组蛋白表达水平上表现出明显优势，感染第四天时，H5细胞大量破碎，细胞存活率小于50%（利用台盼蓝染液染色后在血球计数板上进行），此时细胞的密度低于之前的细胞密度，但目的蛋白降解不明显；当MOI为0.01时，H5细胞后期细胞密度较之前增加，第3～4天时重组蛋白开始表达，且表达时间往后延长。同时以100、150和200μg/mlBSA标准蛋白作为参照，由SDS-PAGE电泳结果比较可知，重组蛋白表达含量在150μg/ml以上。SDS-PAGE和Westernblot分析结果如图2.9和图2.10所示。30 图2.9重组蛋白SDS-PAGE分析Fig.2.9SDS-PAGEanalysisoftherecombinantproteinindifferentMOI图2.10重组蛋白Westernblot分析Fig.2.10WesternblotanalysisoftherecombinantproteinindifferentMOI1.3讨论PCV2基因组为共价闭合的单链环状DNA，病毒粒子由核酸和Cap蛋白构成，60个Cap蛋白组装成病毒表面衣壳[30]。Cap蛋白的N端富含碱性氨基酸（如精氨酸），序列高度保守，其中前41个氨基酸是Cap蛋白的NLS序列对Cap蛋白的核定位起着决定性作用[153]。Liu等[35]在大肠杆菌中表达了PCV2ORF2编码的完整Cap蛋白，31 表达产量约为1mg/L；之后，Zhou[36]和Maria[37]分别将完整的ORF2基因和缺失NLS的ORF2基因在大肠杆菌中表达，发现缺失NLS的重组菌表达量高达20mg/L，高于完整ORF2的重组菌，因此NLS可能是影响Cap蛋白表达水平的重要因素。本实验室在前期研究中已利用杆状病毒表达了PCV2Cap蛋白，但蛋白产量一直在20-50μg/ml水平。在2015年，实验室新分离一株PCV2b基因型。基于新分离的PCV2b基因型，实验室继续了杆状病毒表达Cap蛋白的研究。不同的是，在构建重组杆状病毒过程中，根据H5细胞对密码子的偏好性，本次研究对Cap蛋白的密码子进行了优化，有利于H5细胞高效识别；突变了Cap蛋白前41个氨基酸的NLS，使表达的Cap蛋白同时存在于胞质和胞核中；此外，该研究利用双启动子和同源增强子调控元件，显著提高了目的蛋白在杆状病毒载体中表达水平，Cap蛋白的表达含量从20-50μg/ml提高到了150μg/ml左右。最佳表达条件结果发现，将重组杆状病毒以不同的MOI接种H5细胞后，重组蛋白均获得有效表达。当MOI≥1时，H5细胞第二天就已表达出重组蛋白，第4～5天，感染的H5细胞开始破碎，细胞活性和完整性大大减低，在第5天左右，重组蛋白获得最高表达量，随后，重组蛋白少量降解，目的蛋白以外的其他蛋白降解明显；当MOI≤0.1时，SDS-PAGE显示，重组杆状病毒在第3～4天才开始表达Cap蛋白，昆虫细胞达到最大表达量的时间延长。考虑到实际生产过程中生产成本和培养时间，建议使用MOI=1左右的接毒量接种2.5×106个细胞/ml的状体良好的H5细胞，在第5天左右收获重组蛋白。1.4小结1.4.1构建了一株表达PCV2bCap蛋白的重组杆状病毒。1.4.2增强子、双启动子的使用，以及Cap蛋白密码子的优化和核定位信号肽的突变，显著提高了Cap蛋白表达含量。1.4.3最佳表达条件：将重组杆状病毒以MOI=1接种到密度约为2.5×106个/ml的H5细胞，悬浮培养120h左右，表达量在150mg/L以上。32 第二章重组杆状病毒免疫原性分析Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白和免疫相关蛋白，本研究利用杆状病毒表达载体系统高效表达了PCV2Cap蛋白。本章利用小鼠试验模型对Cap蛋白的免疫原性进行了分析。首先使用终浓度为2mmol/LBEI灭活剂在24h左右灭活重组杆状病毒。BEI由BEA在适宜浓度的氢氧化钠溶液中，37℃环化1h制备而成，灭活的病毒液使用硫代硫酸钠溶液中和剩余BEI，配制方法简单[154-157]。BEI的灭活机制是烷化DNA分子中的腺嘌呤和鸟嘌呤，破坏病毒核酸[158]，但不同的病毒对BEI的抵抗力不同，已有BEI对鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、犬冠状病毒、猪细小病毒和口蹄疫病毒等的灭活研究，以后两种的研究居多[158]。本试验针对灭活的重组杆状病毒添加氢氧化铝佐剂后，肌肉注射免疫昆明小鼠，以商品化灭活疫苗、原核表达的亚单位疫苗、野型杆状病毒、PBS为对照组，依照相同的剂量和方式进行免疫，32只/组，首免两周后进行第二次免疫，分别在第21、28、35、42天，随机从每组取8只小鼠，采集血液，分离血清保存。利用ELISA检测方法对重组蛋白与商品化疫苗的免疫效果进行了比较分析。结果表明，终浓度为2mmol/LBEI在24h左右可以完全破坏重组杆状病毒的核酸；经每日观察统计，各组昆明小鼠经过免疫后，均无不良反应出现；ELISA检测结果显示，重组杆状病毒OD450值高于灭活疫苗和亚单位疫苗，表现出良好的免疫效果。2.1材料和方法2.1.1材料2.1.1.1试剂、佐剂、实验动物BEA试剂购自Sigma公司；TMB显色液购自KPL公司；猪圆环病毒II型ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司（批号：170705）；商品化猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株）购自南农高科技股份有限公司（批号：1711054）；商品化猪圆环病毒2型亚单位疫苗购自青岛易邦生物制品公司（批号：170802501）；氢氧化铝胶佐剂、稳定剂由军事兽医研究所刘晔博士配制，于本实验室保存；5周龄、SPF级昆明雌鼠购自由长春生物制品研究所实验动物中心。33 2.1.1.2相关试剂配制1×碳酸盐缓冲液（CBS，1L）：称取1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3溶解于800ml二馏水中，最后定容至1L。包被液（1×CBS，pH=9.6）：1×CBS定容前使用浓盐酸调pH值至9.6。封闭液（5%脱脂奶粉溶液）：2g脱脂奶粉溶解到40ml1×PBS中，现用现配。终止液（2MH2SO4）：量取54.25ml浓硫酸缓慢加入到盛有445.75ml去离子水的烧杯中，边加边搅拌，室温保存。0.2mol/LBEI（10ml）：①先配制10ml1mol/LBEA溶液，即取2.05gBEA粉末溶解到8ml灭菌蒸馏水中，最后定容到10ml；②取0.14gNaOH完全溶解到8ml灭菌蒸馏水中；③取2ml1ml/LBEA溶液到8mlNaOH溶液中，混匀，置于37℃水浴锅1h，每隔15分钟混匀一次。2.1.2方法2.1.2.1BEI最佳灭活条件⑴将悬浮培养的25ml重组杆状病毒平均分装到5个15ml离心管；⑵分别加入0.2mol/LBEI，使其终浓度分别为0.5mmol/L（12.5μl）、1mmol/L（25μl）、2mmol/L（50μl）、3mmol/L（75μl）和4mmol/L（100μl），混匀后置于37℃培养箱灭活；⑶在第6、12、18、24、30h时各取出1ml病毒液，分别加入1.5μl、3μl、6μl、9μl和12μl1MNa2S2O3溶液（Na2S2O3终浓度为BEI终浓度的5倍），以中和残留的BEI,使其终浓度依次为2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L和20mmol/L,混匀后置于37℃、30min，然后于-40℃保存。2.1.2.2灭活效果评价使用体液病毒DNA/RNA试剂盒提取灭活的重组杆状病毒基因组DNA，步骤见试剂盒说明书，使用pFastBacI载体引物鉴定。10μlPCR反应体系为：2×TaqPremix5μl，pFastBacIF/R各0.5μl，基因组DNA1μl，补充灭菌四馏水至总体积为10μl。PCR条件设置为：预变性94℃1min；变性94℃10s、退火55℃20s、延伸72℃1min，25个循环；延伸72℃10min。最后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。灭活的重组杆状病毒DNA受到破坏，PCR的电泳结果应无目的条带。2.1.2.3重组杆状病毒免疫原成分重组杆状病毒Ac-Cap经过BEI灭活后，加入了四种成分，即氢氧化铝胶佐剂（10%）、稳定剂（2.5%）、叠氮钠防腐剂（0.02%），混合物中Cap蛋白浓度34 约为80μg/ml，用于小鼠的免疫试验。2.1.2.4小鼠免疫与分组将128只健康雌性昆明小鼠随机分成五组，每组32只，对应组的每只小鼠分别肌肉注射100μl灭活重组杆状病毒、全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、野型杆状病毒和PBS。第一次免疫14天后，按相同途径与剂量进行第二次免疫。每日观察并统计各组小鼠状态。第21、28、35和42天，从各组随机取出8只小鼠，采集血液并分离血清，-40℃低温保存，同时用于ELISA抗体检测。2.1.2.5免疫小鼠ELISA抗体检测使用PBS缓冲液按1:50稀释每份小鼠血清，加入到抗原包被板中（ELISA试剂盒中提供），每孔100μl，置37℃孵育1h；用PBST洗涤3次，每次3min，最后一次拍干；HRP标记的山羊抗小鼠IgG（使用PBS缓冲液1:5000稀释），100μl/孔，在37℃培养箱孵育1h，PBST洗3次，3min/次，最后一次拍干；加TMB底物液，每孔100μl，37℃避光显色10min；加入2MH2SO4终止液，每孔50μl，随即使用酶标仪读取450nm波长下的OD450值，进行分析。2.2结果2.2.1重组杆状病毒最佳灭活条件使用试剂盒提取BEI灭活的重组杆状病毒DNA，利用pFastBacI载体引物进行PCR分析，以无模板体系为阴性对照，以未灭活的重组杆状病毒DNA为阳性对照。结果显示，6h时，与未灭活的重组杆状病毒PCR电泳目的条带相比，各个浓度的BEI只破坏部分重组杆状病毒核酸；12h时，终浓度为2-4mmol/LBEI几乎破坏了全部重组杆状病毒核酸；18h以后，终浓度大于2mmol/LBEI能够完全破坏重组杆状病毒核酸。考虑到实际应用过程中大批量灭活，最终选择2mmol/L、24h为重组杆状病毒最佳灭活条件。大批量灭活时，建议每隔3h左右混匀一次灭活的病毒液。6h12h18h24h36h图2.10不同浓度BEI灭活重组杆状病毒效果分析Fig.2.10ResultsofrecombinantbaculovirusinactivationindifferentconcentrationsofBEI35 2.2.2免疫效果评价将128只5周龄昆明雌鼠随机分为5组，即重组杆状病毒、灭活疫苗、亚单位疫苗、野型杆状病毒和PBS，每组32只。在第0天和第14天分别进行第一和第二次免疫昆明小鼠，在第21、28、35和42天，随机从每组中采集8只小鼠血清，最后利用ELISA试剂盒进行抗体检测。注：***表示Pvalue＜0.001，差异显著；**表示Pvalue＜0.01；*表示Pvalue＜0.05；ns表示Pvalue＞0.05，差异不显著图2.11各免疫组小鼠特异性抗体OD450nm水平比较Fig.2.11OD450nmofspecificantibodyineachgroup间接ELISA检测结果经过统计学分析表明（图2.11），重组杆状病毒组和疫苗组与野型杆状病毒组和PBS组相比，差异显著，说明重组Cap蛋白和商品化疫苗均有效诱导小鼠产生抗体；随着免疫时间的变化，重组Cap蛋白组和疫苗组抗体水平均有不断升高的趋势，其中重组杆状病毒和全病毒灭活疫苗间的差异大于重组杆状病毒与亚单位疫苗间的差异；重组杆状病毒与亚单位疫苗间在28天后差异不显著，OD450略高于亚单位疫苗。2.3讨论PCV2于1991首次在加拿大得到鉴定，不久便扩散，呈世界性分布，目前被全世界公认为最重要的猪致病原。目前，利用各种技术平台设计的灭活疫苗、DNA疫苗、嵌合疫苗和亚单位疫苗等试验性疫苗已广泛在动物模型中进行了免疫效果评估并取得了良好的效果。目前，国内外PCV2商品化疫苗包括全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗（杆状病毒表达载体系统、原核表达系统），我国PCV2商品化疫苗从2010年开始陆续上市，大部分为灭活疫苗，有三种是亚单位疫苗，36 其中两种利用原核表达系统生产，一种利用杆状病毒表达载体系统生产，但几乎全为PCV2a基因型疫苗。人们普遍看好的进口亚单位疫苗由杆状病毒表达，进口疫苗对仔猪提供良好的免疫保护，但价格昂贵，规模化养殖场一般只用于种猪、后备母猪。全病毒灭活疫苗存在着病毒灭活不彻底，副反应大的不足之处，其次，因免疫持续期短而需要两次免疫；原核表达的亚单位疫苗产量高，但需要纯化，过程繁琐且成本高，原核表达系统蛋白翻译后修饰不完全，以及不可避免的内毒素的影响，使得人们追求更有效的表达系统。现有PCV2疫苗有效减少了病毒血症和组织中的病毒载量，提高了平均日增重[144,148,149,151,159-162]。但近年来发现PCV2在免疫后的猪群中散播[78,142-146]。研究发现，在免疫后的猪群中，PCV2a、PCV2b依然广泛存在，PCV2d在阳性率中占有比例较大[73,147]。分析可能原因：其一，现有疫苗的抗原含量不足，导致部分免疫个体未能达到免疫保护；其二，疫苗评价的结果是在良好的生物安全条件下进行的，但在实际养殖环境中各种因素更为复杂，PCV2可重复暴露或动物面临多种抗原威胁；其三，PCV2d和PCV2b为当前的流行基因型，而市场上PCV2疫苗绝大部分基于PCV2a基因型，研究发现，同源疫苗的免疫效果好于异源疫苗[65,148-151]。所以在目前这个情况下，现有疫苗在复杂的养殖环境下可能不足以提供完全有效的免疫保护。现有疫苗降低了PCV2传播速率，但基因突变导致免疫失败频繁出现。本研究构建的Ac-Cap重组杆状病毒利用增强子和双启动子调控元件，重组杆状病毒在Sf9细胞中获得高滴度的病毒液，接种悬浮H5细胞，可高效表达Cap蛋白，含量在150mg/L以上；重组蛋白表现出良好的免疫原性；将灭活的重组杆状病毒与商品化疫苗分别以相同的剂量和方式两次免疫昆明小鼠，结果表明该重组杆状病毒表达的Cap蛋白诱导的抗体水平占有明显的优势。本研究完成了PCV2b型Cap蛋白亚单位疫苗的构建，可以预测，针对现在流行的PCV2d基因型，本实验室可利用现有的平台将PCV2bCap基因替换成PCV2d或PCV2aCap基因，制备PCV2二价或三价疫苗，以实现不同基因型的完全交叉保护。PCV2变异株的出现和毒力的改变，对PCV2疫苗的研制进一步带来了挑战，尽管目前的表达系统可实现抗原的快速制备，但从PCV2的变异趋势来看，PCV237 疫苗依然具有广阔的发展空间。2.4小结2.4.1BEI灭活重组杆状病毒的最佳条件为2mmol/L、24h左右。2.4.2重组杆状病毒免疫小鼠后，ELISA检测结果显示很好的免疫效果。38 结论1本研究通过对转移载体pFastBacI和PCV2Cap蛋白的修饰，构建了一株表达PCV2Cap蛋白重组杆状病毒。2经表达条件优化，PCV2Cap蛋白在H5悬浮细胞中获得了高效表达，表达含量在150mg/L以上。3ELISA方法检测免疫小鼠抗血清结果表明，该Cap蛋白重组亚单位疫苗诱导的抗体水平优于商品化疫苗。39 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作者简介姓名张艳艳性别女民族汉河南省郸城籍贯政治面貌党员入学时间2015.9县申请学位类别农学硕士论文答辩日期2018.5.28授予学位年月2018.6就业信息就业单位性就业单位就业单位地址联系方式（个人/办公）质学习（工作）经历2011.9-2015.6就读于河南科技大学，获得农学学士学位。期间，2012.1获得校三等奖学金；2013.5获得国家励志奖学金和“优秀团员”称号；2013.11成为正式中共党员；2014.7-10在河南雏鹰集团进行三个月的暑期实践。2015.9-2018.6就读于吉林农业大学，获得农学硕士学位。期间，2016年获得校级一等奖学金；2018年在中国生物制品学杂志上发表论文一篇。攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息署名发表情况题目刊物名称（级别）署名单位发表学术论文次序(刊出时间/录用)重组杆状病毒高效表达中国生物制品学吉林农业大猪圆环病毒2型Cap蛋白张艳艳2017.12.14（录用）杂志学及免疫特性分析署名获奖名称成果级别署名单位发表情况次序项目及专利50 致谢硕士研究生的学习和生活即将结束，回顾期间的点点滴滴，美好的人和事将成为珍贵的回忆。首先感谢我的导师扈荣良研究员，他是一位聪明睿智、勤奋努力、知识渊博、和蔼可亲、积极进取、一心奉献国家的良师益友。实验上遇到阻碍，扈老师耐心引导，生活中遇到问题，他及时给予帮助，从初到实验室的懵懂到现在的成熟，都与扈老师的谆谆教导分不开；扈老师一直教导我们充分利用时间，认真工作，培养思考问题和解决问题的能力，所以我才在研究期间如此充实，才有这么大的进步。其次，十分感谢实验室主任张守峰老师，一位为人师表、知识渊博、待人和善、一丝不苟、有责任心、德才兼备的好老师，研究生期间给予我很多点拨和指导，也是我学习的榜样！感谢实验室各位老师和缪发明师兄、郑光来师兄、严妍师姐、张静远师姐、和陈腾师姐，是他们带着我跨过实验操作技术的门槛，使我可以熟练完成各项实验操作，也是他们在实验过程中给予的指导，才让我解决一个又一个难题；感谢阮晓凤师妹、杨金金师妹、郭晓盼师妹和王立冬、周鑫韬同学，感谢身边的同学朋友谢谢你们给予的帮助。正是因为大家庭的陪伴和帮助，研究生生活才没有那么枯燥，谢谢你们！感谢我的家人，你们是我勇往前行最大的动力，很爱很爱你们！最后，再次向所有鼓励、支持和帮助过我的老师、同学和亲朋表示衷心的感谢！51
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