猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究

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分类号：S855.3单位代码：100860密级：公开学号：20152200401猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究StudyonIsolation,IdentificationandBiologicalCharacteristicsofPorcineDeltacoronavirusHB-BDStrain学位申请人：刘宝京指导教师：范京惠副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二○一八年六月一日 摘要猪丁型冠状病毒（PorcineDeltacoronavirus，PDCoV）是一种新发现的猪肠道病毒，可引起以水样腹泻、呕吐、脱水和仔猪死亡为特征的肠道疾病。2012年，PDCoV首次在我国香港被发现，随后该病于2014年在美国爆发。目前PDCoV在世界许多国家都被检测到，据报道，在我国的部分省份猪场中也检测到了PDCoV，该病毒已经成为严重影响养猪业健康发展的新发病原。本研究将RT-PCR检测为PDCoV阳性的腹泻样本接种ST细胞进行病毒的分离传代。通过观察其细胞病变，RT-PCR、病毒滴度的测定和间接免疫荧光的鉴定，结果成功分离到1株能在ST细胞上稳定增殖并能产生明显细胞病变（CPE）的猪丁型冠状病毒（HB-BD毒株）。通过RT-PCR对其全基因进行了扩增，除去3’端poly(A)，基因组全长为25420bp，基因结构为5’UTR-ORF1-S-E-M-NSP6-N-NSP7-3’UTR，每部分的碱基数分别为540nt，18803nt，3480nt，252nt，654nt，285nt，1029nt，603nt和392nt。全基因序列分析显示，HB-BD株与参考株之间的同源性为97.2%-99.5%，并与PDCoV/NH株之间的同源性最高（99.5%）；进化树分析表明，HB-BD株与其他PDCoV参考株同属于δ冠状病毒属，并且与中国毒株的亲缘关系比美国、韩国和泰国毒株近。以纯化的重组PDCoVS1蛋白作为包被抗原，通过对反应条件进行优化后，建立了检测猪血清中PDCoVIgG抗体的间接ELISA方法。优化结果显示，该方法的抗原最佳包被浓度为1.0µg/mL，血清稀释倍数为1∶200，封闭液为含5%胎牛血清的PBST工作液。酶标抗体最佳稀释度为1∶20000。一抗和二抗的孵育时间均为37℃作用1h；底物显色时间为15min。通过30份阴性血清，得出阴阳性临界值为0.369。特异性试验表明，该方法不与PEDV、TGEV、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV等常见猪病毒阳性血清发生交叉反应；重复性试验表明，批内和批间重复性试验的变异系数都小于10%，具有较好的特异性和重复性。ROC曲线分析得出，与westernblot相比，该方法的敏感性和特异性分别为100%和92.3%。上述试验结果表明，本研究建立的重组S1蛋白间接ELISA方法具备检测PDCoV抗体的可行性。应用建立的间接ELISA方法，对2017年1月至2017年12月份收集的来自河北部分地区的542份猪血清样品进行检测，样本阳性率为18.6%。鉴于目前尚无有效的治疗方法或疫苗可用于控制PDCoV。本研究为探讨依靠RNA干扰（RNAi）技术对PDCoV体外增殖的抑制作用，分别构建了针对PDCoV的M和N基因的两个shRNA表达质粒（pGenesil-M和pGenesil-N），并转染入ST细胞，进行基因干扰实验研究。分别对转染组和对照组进行TCID50检测，以及对CPE进行观察和荧光定量PCR检测，测定结果表明两种shRNA表达质粒（pGenesil-M和pGenesil-N）均能够抑制PDCoV在ST细胞上的增殖，且pGenesil-N表达质粒的抑制率要高于pGenesil-M表达质粒。综上所述，本研究对PDCoVHB-BD毒株进行了分离鉴定以及全基因序列分析，并根据S1蛋白建立了间接ELISA方法，对2017年河北省部分地区的血清样本进行 了检测，以及对RNAi技术抑制PDCoV体外增殖进行了研究。本研究为PDCoV的遗传进化、致病性等研究奠定了基础，也在流行病学调查、疾病的诊断、疫苗的研制和防治工作方面具有重要意义。关键词：猪丁型冠状病毒；分离鉴定；序列分析；ELISA；RNA干扰 StudyonIsolation,IdentificationandBiologicalCharacteristicsofPorcineDeltacoronavirusHB-BDStrainAuthor:LiuBao-jingAdvisor:ProfessorFanjing-huiMajor:PreventiveVeterinaryMedicineAbstractPorcinedeltacoronavirus(PDCoV)isanovelenteropathogeniccoronavirusinpigsthatcancauseentericdiseasewithclinicalsignsincludingdiarrhea,vomiting,dehydrationandmortalityinneonatalpiglets.PDCoVwasinitiallyreportedinpigsinHongKongin2012andthediseasesubsequentlybrokeoutintheUnitedStatesin2014.Atpresent,PDCoVhasbeendetectedinmanycountriesintheworld.AndithasbeenreportedthatPDCoVwasdetecredinpigfarmsinsomeprovincesinChina.Thevirushasbecomeanewpathogenthatseriouslyaffectsthehealthydevelopmentoftheswineindustry.Inthisstudy,toisolateandidentifyPDCoVfromthefaecal/intestinalcontentsofdiarrheapiglets，thesamplesofPDCoVpositivedetectedbyRT-PCRwasinoculatedtoSTcells.Thecellcultureswereconfirmedbythecytopathiceffect（CPE），RT-PCR，determinationofvirustiterandindirectimmunofluorescenceassay（IFA）.TheresultsrevealedthatHB-BDstrainwassuccessfullyisolated.ThecompletegenomesequenceofPDCoVHB-BDwasdeducedbyRT-PCR.Sequencingresultsshowedthatthecompletegenomesequencewas25,420nucleotides(nt)inlengthexcludingthe3’poly(A)tail.Thegeneorderofitsgenomicstructurewas5’UTR-ORF1-S-E-M-NSP6-N-NSP7-3’UTR,andthenucleotidesnumbersofthesepartswere540,18803,3480,252,654,285,1029,603and392,respectively.ThecompletegenomesequenceofPDCoVHB-BDshared97.5%-99.5%nucleotideidentitywiththeotherPDCoVreferencestrainsandhadthehighestnucleotideidentity(99.5%)withPDCoV/NH.PhylogeneticanalysisbasedonthecompletegenomesequencerevealedthatallPDCoVstrainswereseparatedintothegenusdeltacoronavirus,furtheranalysisdemonstratedthatthePDCoVisolate,HB-BD,wasmorecloselyrelatedtootherChinesePDCoVisolatesthantothoseisolatedfromtheUnitedStates,SouthKoreaandThailand.Accordingtooptimizingthereactionconditions,thepurifiedrecombinantPDCoVS1proteinwasusedascoatingantigentodevelopanindirectenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)fordetectingIgGantibodyagainstPDCoVinserumtoPDCoV.UsingacheckerboardELISA,theoptimalantigenconcentrationandserumsampledilutionweresetat1μg/mland1:200,respectively.Theoptimalblockingbufferwas5%fetalbovineseruminPBST,andthebestblockingtimewas2hat37°C.Theoptimaldilutionof secondaryantibodywasdefinedas1:20000.Aftertheabovementionedconditionsweredetermined,fortheoptimalincubationtimeofserumsamplesandsecondaryantibody,theywerebothdeterminedtobe1h,theTMBsubstratewasat37℃for15min.Thespecificitytestshowedthatnocross-reactionwasdetectedforthedevelopedELISAwithothercoronavirusorothercommonpigpathogensandboththeBoththeintra-assayandinter-assaycoefficientsofvariation(CV)were<10%.Thecut-offvaluewas0.369determinedby30negetivesamples.ROCcurveanalysisshowedthatcomparedwithwesternblot,thesensitivityandspecificityofthemethodwere100%and92.3%,respectively.TheabovetestresultsshowthattheestablisgedELISAbasedtherecombinantS1proteincouldbeusedfordetectingthePDCoVantibodies.UsingtheestablishedindirectElISAmethod,542serumsamplescollectedfromHebeiprovincefromJanuanr2017toDecember2017weretestedandthepositiveratewas18.6%.GiventhattherearecurrentlynoeffectivetreatmentsorvaccinesavailabletocontrolPDCoV.InordertoinvestigatetheinterferenceeffectofRNAinterference(RNAi)technologyonPDCoVreplicationinvitro,twoshRNAexpressionplasmids(pGenesil-MandpGenesil-N)targetingtheMandNgenesofPDCoV,respectively,wereconstructedandtransfectedintoSTcellsconductinggeneticinterferenceexperiments.TCID50wasdetectedbetweenthetransfectiongroupandthecontrolgroup,aswellastheCPEwasobservedandthemRNAlevelofNdetectedbyreal-timePCR.TheresultsshowedthatthetwoshRNAs(pGenesil-MandpGenesil-N)couldinhibitthereplicationofPDCoVonSTcells,andthepGenesil-NexpressingplasmidhadhigherinhibitionthanthepGenesil-Mexpressingplasmid.Insummary,thisstudyisolatedandidentifiedPDCoVHB-BDstrains,aswellasamplifythesequencethewholegenomeofHB-BDstrain,andestablishedanindirectELISAmethodbasedonS1proteintodetectserumsamplesfromsomeregionsofHebeiProvincein2017.Besides,RNAihadbeenstudiedfortheinhibitionofPDCoVreplicationinvitro.ThisstudyprovidesatheoreticalbasisforthestudyofPDCoVgeneticevolution,pathogenesisandothermechanisms,andisalsoofgreatsignificanceinepidemiologicalinvestigations,diagnosisofdiseases,developmentofvaccines,preventionandtreatmentofPDCoV.KeyWords:PorcineDeltacoronavirus；isolationandidentification；sequenceanalysis；ELISA；RNAinterference 缩写词表LISTOFABBREVIATION英文缩写英文全称中文全称PDCoVPorcinedeltacoronavirus猪丁型冠状病毒DEPCDiethypyrocarbonate聚碳酸二乙酸EBEthylenebromide溴化乙锭TCID50Tissuecultureinfectivedose半数组织培养感染剂量PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液NSPNonstructuralprotein非结构蛋白SDS-PAGESDS-PolyacrylamidegelelectrophoresisSDS聚丙烯酞胺凝胶电泳ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验IFAIndirectimmunofluorescenceassay间接免疫荧光试验RT-PCRReversetranscriptionpolymerasechain反转录聚合酶链式反应reactionNCNitrocellulosemembrane硝酸纤维膜HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶ODOpticaldensity光密度CPECytopathogencityeffect细胞病变β-actinBetaactinβ-肌动蛋白μLmicroliter微升ntNucleotide核苷酸bpBasepair碱基对RNAiRNAinterferenceRNA干扰siRNASmallinterferingRNA小干扰RNAshRNASmallhairpinRNA短发夹RNAdsRNADoublestrandedRNA双链RNALBLuria-BertanimediumLB培养基dDay天sSecond秒hHour小时minMinute分钟 目录1引言........................................................................................................................................................11.1猪丁型冠状病毒概述..................................................................................................................11.2PDCoV的生物学特性................................................................................................................11.2.1PDCoV的分类地位.........................................................................................................11.2.2形态特征...........................................................................................................................11.2.3培养特性...........................................................................................................................21.2.4PDCoV基因组结构.........................................................................................................21.2.5结构蛋白...........................................................................................................................31.2.6PDCoV流行病学.............................................................................................................31.2.7PDCoV的致病性.............................................................................................................41.3PDCoV诊断方法........................................................................................................................41.3.1病原学检测方法...............................................................................................................51.3.2血清学诊断方法...............................................................................................................61.4疫苗与防控技术..........................................................................................................................71.5RNA干扰技术的研究进展........................................................................................................71.5.1RNAi的作用机制............................................................................................................71.5.2RNAi的特点....................................................................................................................71.5.3RNAi的抗病毒机制........................................................................................................71.5.4RNAi在猪病毒感染的应用............................................................................................81.6研究的目的及意义......................................................................................................................82材料与方法............................................................................................................................................92.1材料.............................................................................................................................................92.1.1病料..................................................................................................................................92.1.2细胞和菌株.......................................................................................................................92.1.3血清..................................................................................................................................92.1.4主要试剂、试剂盒与耗材...............................................................................................92.1.5主要溶液的配置.............................................................................................................102.1.6主要仪器.........................................................................................................................112.2方法...........................................................................................................................................122.2.1PDCoVHB-BD株的分离与鉴定..................................................................................122.2.2PDCoVHB-BD株全基因序列分析..............................................................................152.2.3重组表达质粒的构建及鉴定.........................................................................................182.2.4重组表达质粒pET-32a-S1的诱导表达及重组蛋白的鉴定........................................202.2.5血清中PDCoVIgG抗体间接ELISA检测方法的建立..............................................212.2.6小干扰RNA对PDCoV在ST细胞内复制的影响.....................................................233结果......................................................................................................................................................29 3.1临床样本的检测结果................................................................................................................293.2病毒分离鉴定............................................................................................................................293.2.1细胞病变鉴定.................................................................................................................293.2.2RT-PCR鉴定...................................................................................................................303.2.3IFA鉴定..........................................................................................................................303.2.4TCID50测定结果............................................................................................................313.3PDCoVHB-BD株全基因序列及进化树分析.........................................................................313.3.1PDCoVHB-BD株全基因组的RT-PCR扩增...............................................................313.3.2PDCoVHB-BD株的基因结构特点..............................................................................323.3.3PDCoVHB-BD株全基因序列分析..............................................................................323.3.4全基因进化树分析.........................................................................................................333.4PDCoVS1蛋白间接ELISA方法的建立................................................................................343.4.1PDCoV-S1基因的扩增及鉴定......................................................................................343.4.2重组表达质粒pET-32a-S1的构建及鉴定....................................................................353.4.3pET-32a-S1的原核表达及重组蛋白的鉴定.................................................................363.4.4ELISA检测方法条件的确定及优化.............................................................................383.5小干扰RNA对PDCoV在ST细胞内复制的影响................................................................463.5.1pGenesil-shRNA质粒的PCR鉴定...............................................................................463.5.2细胞转染结果.................................................................................................................463.5.3RNAi对细胞产生病变的影响.......................................................................................473.5.4病毒感染滴度测定结果.................................................................................................483.5.5荧光定量PCR对RNA干扰效果的检测结果.............................................................484讨论.......................................................................................................................................................514.1病毒的分离鉴定........................................................................................................................514.2HB-BD分离株的全基因序列分析...........................................................................................514.3PDCoVS1基因优势抗原表位区的克隆及原核表达.............................................................524.4间接ELISA检测方法的建立...................................................................................................524.5质粒表达的siRNA对PDCoV在ST细胞内复制的抑制效应..............................................535结论.......................................................................................................................................................55参考文献..................................................................................................................................................56在读期间发表的学术论文......................................................................................................................64作者简介..................................................................................................................................................65致谢..........................................................................................................................................................66 1引言1.1猪丁型冠状病毒概述猪丁型冠状病毒，又名猪δ冠状病毒（PorcineDeltacoronavirus，PDCoV）是近年来新出现的一种猪肠道冠状病毒，导致的临床症状与猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎相似，主要表现为严重的腹泻、呕吐、脱水，甚至死亡[1-3]。各年龄段的猪群都可被PDCoV感染，但对新生仔猪的危害最大，感染率最高，死亡率为30%-40%[4]。2012年Woo等首次在香港的猪群中检测到PDCoV，该病毒引起的腹泻病2014年在美国俄亥俄州大范围爆发，之后很快传播到美国的其他地区，现如今已经给世界上的养猪大国造成了不小的经济损失[2,5]。目前为止，美国、加拿大、韩国、中国大陆、泰国和老挝等国家均已经检测和报道了PDCoV[1,3,5-14]。相关文献报道，PDCoV具有很强的致病力，可引起10日龄左右的无菌仔猪发生严重的临床腹泻症状和小肠病理损伤，尤其是空肠和回肠部位，该病毒已经成为了一种十分重要的肠道病原，且目前尚无有效的治疗方法和疫苗能够控制PDCoV[15-17]。因此，了解该病毒的流行特点、致病机理、检测方法以及潜在疫苗的研制具有十分重要的意义。1.2PDCoV的生物学特性1.2.1PDCoV的分类地位PDCoV属于套式病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus）的新成员。冠状病毒的宿主范围广泛，涉及鸟类、人以及其他的哺乳动物，并被分为了四个属：α、β、γ和δ冠状病毒属[18]。α和β冠状病毒属主要感染哺乳动物；γ冠状病毒主要感染禽类；δ冠状病毒作为冠状病毒科的新成员，既能感染哺乳动物也能感染鸟类，人们目前对δ冠状病毒的了解还很少。2007年最早在中国白鼬獾和亚洲豹猫中检测到了δ冠状病毒[19]。2012年在香港首次发现猪δ冠状病毒，随后2014年在美国首次分离到猪δ冠状病毒，并且是δ冠状病毒属中唯一被成功分离的病毒[20]。1.2.2形态特征PDCoV是单股正链RNA病毒，电镜观察PDCoV显示，病毒离子的直径约为60nm~180nm，有囊膜、纤突、外膜上有大量棒状凸起结构，与其他冠状病毒相似，具有典型“皇冠”状结构[17]（图1）。1 图1.PDCoV病毒粒子电镜图Fig.1ElectronicmicroscopicbservationfPorcineDeltacoronavirus1.2.3培养特性自从2014年美国俄亥俄州大面积爆发PDCoV以来[2]，美国和中国已经先后从临床腹泻样本中分离得到了PDCoV病毒，具文献报道已有三株美国分离株（OH-FD22[21]、USA/IL/2014[15]、OhioCVM1[17]）和三株中国分离株（CH-HN-2014[6]、NH[22]）以及本实验室分离鉴定得到的HB-BD[23]。Hu等通过实验证实了PDCoV可以在猪肾细胞（LLC-PK）和猪睾丸细胞（ST）中进行传代培养，均能产生细胞变大、变圆、聚集和脱落等典型的细胞病变。在培养过程中，细胞病变和病毒滴度情况会与是否向培养基中加入胰酶、小肠内容物（SIC）和胰液素有关。当在LLC-PK细胞系上接种时，若用含有胰酶的培养基培养，则可看到明显的细胞病变；若用不含有胰酶的培养基培养，PDCoV也可进行复制增殖，但不能产生细胞病变，而且病毒滴度会下降。当在ST细胞系上接种时，若用含有胰液素或者同时含有小肠内容物（SIC）和胰酶的培养基时，则细胞能够产生CPE，而单独用含有胰酶的培养基时，则不会产生细胞病变[21,24]。PDCoV的成功分离，为研究其致病机制、潜在疫苗和分子生物学特性奠定了基础[6,21,22]。1.2.4PDCoV基因组结构PDCoV基因组全长约25.4kb，基因组具有5’端帽子结构和3’Poly（A）尾巴结构[18]。PDCoV基因组结构为5’UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7-3’UTR，其模式见图2[25]，分别编码多聚酶蛋白1a/1b、纤突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、非结构基因NS6、衣壳蛋白（N）及非结构基因NS7。其中ORF1a和ORF1b两个开放阅读框长约19300bp，占整个基因组全长的2/3，两个非结构基因NS6和NS7分别位于M和N基因之间以及N基因内部[1,9,11,13,17]。图2.PDCoV基因组结构示意图Fig.2TheschematicdiagramofgenomestructureofPDCV2 1.2.5结构蛋白目前关于PDCoV结构蛋白的具体功能还处于进一步研究阶段。现只能通过其他冠状病毒来研究PDCoV。S基因全长3483或3480bp，编码病毒的纤突蛋白，而且还主要参与病毒与宿主细胞的吸附和融合，并且包含促使宿主产生中和抗体的主要抗原表位区。S蛋白可被加工成S1和S2两个蛋白，S1蛋白是S蛋白诱导产生中和抗体的主要位点和主要的抗原受体结合的区域。区分S1和S2两个区域，对S蛋白抗原表位和抗体结合域的筛选提供了基础[26]。此外S蛋白还是与病毒毒力和适应性相关的蛋白，可用于当作开发疫苗的重要靶位[24]。S蛋白也是冠状病毒基因组中最容易发生变异的基因，S蛋白的突变可能导致病毒跨物种传播和新宿主的出现[17]。PDCoV的S1蛋白已经被美国学者Thachil用作间接ELISA方法的建立，取得了很好的检测效果。E基因是PDCoV基因组中结构最小的基因，编码小膜蛋白，由252nt组成，编码83个氨基酸。E蛋白包埋在脂质双层中，其羧基端和氨基端分别位于病毒粒子内部和朝向病毒粒子外部，单次跨膜。缺失E蛋白基因，病毒的感染性明显下降，说明E蛋白在病毒的出芽和复制过程中有重要的意义[27]。M蛋白由M基因编码，是膜蛋白，位于囊膜表面，全长654nt，M蛋白是跨膜蛋白，负责营养物质的运输。此外，M蛋白在病毒的装配以及诱导机体产生中和抗体的过程中起着重要作用[28]。N蛋白是N基因编码的结构蛋白，为磷酸化的核衣壳蛋白，由342个aa组成。N蛋白可以与细胞膜及磷脂结合，促进病毒组装及RNA复制体的形成。此外，N蛋白具有高度保守性，常被作为诊断抗原。目前经文献报道PDCoVN蛋白能够与自身相互作用形成非共价连接的寡聚物，并主要定位在细胞核[29]。1.2.6PDCoV流行病学PDCoV最早于2012年由Woo等人从香港收集的猪粪便拭子中检测到[18]。之后在2014年美国的俄亥俄州大面积爆发仔猪腹泻，其症状以水样腹泻、呕吐、脱水为特征，和猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎类似，临床上不能区分诊断，并且对常见的腹泻病原检测都是阴性，通过特异性的PDCoV检测引物对样本进行鉴定，结果显示为PDCoV阳性，表明了该病毒的存在[2]。随后该病相继传至美国的20多个州[1]。Marthaler等对美国猪群进行了PDCoV流行情况调查，结果表明30%（89/293）的样品是PDCoV阳性[30]。为了调查PDCoV对不同年龄的猪群，不同采样部位和地区的感染情况，Homwong等对肠道、粪便、粪便拭子和口腔液分别854份、619份、358份和602份进行了调查，发现PDCoV在口腔液中比在粪便中检出率高，但在不同年龄的猪群中未体现出差异[31]。Lee也对韩国的猪群进行了感染情况调查，发现2013年1月至2015年3月间681份样品有2份为PDCoV阳性[14]。在中国，自从PDCoVHKU15-44和HKU15-155毒株在2012年被发现[18]，PDCoV就相继在某些省份报道，其发病率也已被调查。在一项研究中，Chen等利用RT-PCR检测了我国山西省、广东省和湖北省6个养猪场的64份粪便和肠道样本，结果显示PDCoV感染率为23.4％(15/64)[32]。3 Song等利用巢式PCR对2012年11月至2015年3月间江西省51个猪场的356份猪粪/肠道样本进行了检测，结果显示PDCoV单独感染率为为33.71％（120/356），PDCoV与PEDV混合感染率为19.66％（70/356）[3]。董等收集了安徽，广西，湖北，江苏等省份2004～2014年间不同时期215例肠道或粪便标本进行病原检测，结果显示6.51％(14/215)为PDCoV阳性，14份PDCoV阳性样品中有50%(7/14)也是PEDV阳性[6]。Zhai等收集了海南、广东的390份粪便样品，通过进行的PDCoV病原检测，发现有4份为PDCoV阳性[8]。之后，在加拿大、墨西哥、越南、老挝和泰国都报道了PDCoV[8]。通过回溯性的试验，Thachil等利用建立的ELISA方法对美国2010年的猪血清样本进行了检测，结果检测到了PDCoV抗体，说明2010年PDCoV就已经传入了美国[33]。Dong等对我国2004年的猪腹泻样品进行检测，也检测到了PDCoV，证明PDCoV在我国大陆早已经存在多年[34]。这些研究结果，不仅体现了PDCoV在世界范围内的流行情况，还表明PDCoV与其他病原，特别是与PEDV共同感染是比较常见的，但是PDCoV在河北省的流行情况还不清楚。1.2.7PDCoV的致病性猪是该病毒的自然宿主，可以感染不同年龄段的猪群，对仔猪的危害最大[35-39]。患病猪主要表现为水样腹泻、呕吐和脱水等症状。目前，研究人员已经能够从临床样本中分离得到PDCoV，仔猪感染PDCoV后的死亡率约为30%-40%[2]。用除菌的PDCoV阳性病料人工口服接种10日龄无菌仔猪，24h内即可观察到明显的腹泻症状，48-72h出现呕吐现象[16,17]。用PDCoV细胞毒分别感染普通仔猪和无菌仔猪时，发现都能导致仔猪腹泻，但是人工感染普通仔猪时的症状却比无菌仔猪严重，出现症状的时间更早，持续时间更长，甚至感染后21天仍能检测到PDCoV，推测可能肠道内的细菌在PDCoV致病的过程中起到了协同的作用[17]。剖检病理结果显示，感染PDCoV的仔猪与PEDV感染有相似的病变，如肠壁变薄，变透明，内部充斥着大量黄色液体，胃和小肠内有未消化的凝乳块，严重者可观察到胸腺萎缩以及胸腔积液。组织病理分析显示，十二指肠、空肠和回肠绒毛严重萎缩，并伴有大量的肠上皮坏死；盲肠和结肠的上皮细胞空泡化，空肠的绒毛高度与腺窝的深度比率在一定程度上会随时间而增大[4,15,17,24,40]。虽然PDCoV属于肠道病原体，主要导致病猪出现腹泻症状，但是通过RT-PCR检测结果发现病毒不仅存在于消化道，在血液、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等部位都能检测到，体现了PDCoV有较强的组织嗜性，这一点不同于另外两种猪肠道冠状病毒TGEV和PEDV[17]。1.3PDCoV诊断方法2014年PDCoV的爆发给美国的养猪业造成了严重的经济损失，在其他国家和我国部分省份也相继检测到了PDCoV，并且感染PDCoV后猪群会出现明显的腹泻症状，据报道可感染各年龄段的猪群，临床上与PEDV和TGEV不能区分，还会伴随混合感染的情况，因此建立PDCoV的特异性诊断和检测方法迫在眉睫[22,41-45]。4 1.3.1病原学检测方法1.3.1.1电子显微镜技术电子显微镜（Electronmicroscopy,EM）在研究病毒的形态结构以及病毒性诊断中很重要。目前两种EM技术通常用于实验室诊断：负染EM用于检测流体基质中病毒粒子;超薄切片EM用于检测固定的组织或细胞中病毒颗粒。基于特征形态和在EM下观察到病毒颗粒的大小，可以将病毒归为到适当的病毒属，例如在初步调查由PDCoV导致的腹泻病例的粪便时会观察到冠状病毒样颗粒。虽然EM无法识别具体是哪种病毒，但种属层面的认同仍然可以促进下一步的测试，并加以确定诊断。但是，电子显微镜价格比较昂贵，并且需要具有高技能的显微镜专家等条件的限制，只有部分科研机构才有电子显微镜。目前，电子显微镜主要在PDCoV分离鉴定的工作中用的较多，并没有成为常规的PDCoV诊断方法[6,21,40]。1.3.1.2RT-PCR检测方法RT-PCR（Reversetranscription,RT-PCR）技术是目前实验室检测应用最广泛的生物技术。目前研究学者已经建立了很多种检测PDCoV的RT-PCR检测方法。PDCoV在美国流行初期，Wang等根据PDCoV的M和N基因建立了PDCoV的RT-PCR检测方法，并对俄亥俄州的流行情况进行了检测[2]。张帆帆等和逄凤娇等分别针对PDCoV的N基因和M基因设计了特异性引物，所建方法均具有高度灵敏度，并用所建方法分别对江西省和我国华东地区猪场PDCoV流行情况进行了调查[42][44]。此外，其他学者还建立了多重RT-PCR检测方法[43,45]。1.3.1.3荧光定量PCR检测方法荧光定量RT-PCR（QuantitativeReal-timeRT-PCR,RT-qPCR）是根据对RT-PCR扩增反应中每一个循环产生的荧光信号进行的实时检测，可实现对起始模板的定性和定量分析。Ma等根据N基因建立了荧光探针的检测方法，并对OhioCVM1细胞毒攻毒后仔猪的排毒情况进行了调查[17]。Marthaler等也建立荧光定量PCR检测方法，并对美国2014年1月6日至2月27日间的猪群PDCoV单一感染和与其他腹泻病毒混合感染情况进行了研究调查[30]。Jung等根据M基因设计了引物，建立了TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，并对PDCoV的致病力和毒力进行了研究[16]。Sanhi等也根据M基因的保守区建立了TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，并对美国1734份临床腹泻样本进行了检测鉴定，推测出PDCoV至少在2013年8月就已经在美国存在[46]。Masuda等更是建立了PDCoV、PEDV、TGEV、PRV的多重荧光定量PCR检测方法，为检测腹泻病毒提供了方便[47]。Zhang等根据PEDV的N基因和PDCoV的M基因建立了PEDV/PDCoV的二联荧光定量PCR检测方法[48]。5 1.3.1.4套式PCR套式PCR也被称为巢式PCR（NestedPCR），是使用两对引物扩增，可增加反应的特异性和灵敏度。江西农业大学Song等最早根据N基因设计了套式PCR的两对引物，并用建立的套式PCR对山西省PDCoV的流行情况进行了调查，结果显示PDCoV单一感染率为33.71%，与PEDV混合感染率为19.66%，并获得了一株PDCoV全长基因。1.3.1.5环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplificationmethod,LAMP)是一门新兴的基因扩增技术。Zhang等最早建立了PDCoV的RT-LAMP检测方法，可以检测到10拷贝的PDCoV病原，比传统的RT-PCR检测方法敏感100倍[36]。1.3.1.6免疫组织化学技术免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）是根据抗原与抗体特异性结合的原理，通过显色剂来确定细胞组织中病原的方法[49,50]。目前IHC检测方法主要用于PDCoV的分离鉴定及致病性分析。Dong等从LLC-PK细胞中分离到了CHN-HN-2014毒株，并用IHC检测方法对其致病性进行了鉴定，结果表明该细胞适应株可以导致5日龄和21日龄仔猪发生腹泻[6]。Chen等利用建立的PDCoV组织免疫化学分析法，证明了该病毒对空肠中段、末端及回肠部位具有较强的组织嗜性，为PDCoV的致病机理、临床诊断、组织分布的研究奠定了基础[15]。1.3.1.7原位杂交技术原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)兴起于五六十年前，主要应用于细胞学和分子生物学的研究领域。Jung等利用原位杂交技术确定了PDCoV在肠道中的组织嗜性[5,51]。1.3.2血清学诊断方法1.3.2.1酶联免疫吸附试验（ELISA）作为一种灵敏、便捷的血清学诊断方法，ELISA方法已经广泛的应用于猪病的血清学检测[52-61]。Thachil等最早以真核表达的PDCoVS1蛋白为包被抗原建立了用于检测血清中PDCoV特异性IgG抗体的间接ELISA方法，该检测方法具有很高的敏感性和特异性，且不与TGEV、PEDV、PRCV阳性血清发生交叉反应，对968份血清检测显示PDCoV的阳性率为8.7%[33]。Su等根据PDCoV的N蛋白建立了间接ELISA方法，同样不与其他常见猪原病毒阳性血清发生交叉反应，并且具有良好的敏感性和特异性，应用该方法对黑龙江省319份血清进行了检测，结果显示PDCoV阳性率为11.59%[39]。Luo等根据PDCoV的M蛋白建立了间接ELISA方法，应用该方法对河北省2015年1月至2016年10月间871份血清进行了检测，结果显示PDCoV阳性率为11%[62]。6 1.3.2.2间接免疫荧光法（Indirectimmunofluorescenceassay,IFA）间接免疫荧光（Indirectimmunofluorescenceassay,IFA）的原理是通过已知的特异性抗体与待检抗原之间进行特异性反应，再与荧光标记的抗体进行结合，通过荧光显微镜观察。目前IFA法主要用于病毒的分离鉴定。Hu等最早通过IFA方法进行了PDCoV的分离鉴定，随后我国陈建飞、Dong等和本实验室均通过IFA方法进行了病毒的分离鉴定[6,21-23]。1.4疫苗与防控技术PDCoV作为最近两年出现的一种新的猪肠道腹泻病毒，到目前为止尚无商品化的疫苗用来防控此病。随着对PDCoV致病机理和免疫机理的进一步研究，未来商品化的疫苗和诊断试剂都将面世，控制该病的发生和流行[41]。1.5RNA干扰技术的研究进展RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是通过内源性或外源性双链RNA（doublestrandRNA,dsRNA）的介导，特异性降解相应序列的mRNA，导致靶基因的表达沉默，产生相应功能型缺失的现象，属于转录后水平的基因沉默[63-65]。现如今，RNA干扰技术已经与生物的生长发育及癌症的产生发生联系，而且在抗病毒和调控基因的表达方面发挥重要的作用[63,66-74]。RNA干扰技术已经成为了我们目前认识的一种在生物体内，用来保护机体不受外来侵害的一种保护机制，因此具有非常重要的生物学研究意义，以及非常好的前景[75-78]。近年来，随着RNAi技术的不断发展，在畜牧兽医行业已经广泛的应用了此技术，特别是在那些严重危害畜牧业健康发展、甚至危害人类健康的疾病中发挥着重要作用[79-82]。1.5.1RNAi的作用机制经过研究证实，RNAi主要通过dsRNA引起的靶mRNA的降解、翻译水平的调节、基因组甲基化修饰及结构的改变来发挥其调节作用[83-85]。1.5.2RNAi的特点RNAi有四个特征：第一，RNAi是转录后水平的基因沉默，即RNAi对靶基因位点是有选择性的。第二，RNAi具有高序列特异性。第三，RNAi对于基因的表达具有很高效率的抑制作用。第四，具有很高的稳定性。1.5.3RNAi的抗病毒机制RNAi的高效表达性、高特异性、高稳定性，使它成为了学者们研究抗病毒的策略目标[82,85,86]。该技术可能会避免传统抑制剂和疫苗所具有的缺点，因此RNAi目前在畜牧兽医领域用作抗病毒7 的研究具有很高的前景。其主要的抗病毒机制为病毒在细胞内复制会产生dsRNA复制中间体，并经过加工形成沉默复合体，从而与目的病毒mRNA发生特异性结合，将其切断或降解。研究学者已经可以根据siRNA的形成机制来体外合成siRNA，之后再通过病毒感染或者细胞转染等发挥抗病毒作用，起到治疗的目的。1.5.4RNAi在猪病毒感染的应用目前RNAi技术已经广泛的应用于抗病毒研究。贺云霞等根据PRRSV的ORF2、ORF3和ORF4阅读框设计了siRNA，对其在Marc-145细胞上抑制PRRSV的基因表达进行了研究，取得了很好的效果[87]。高晓飞等通过RNAi抑制了PRRSV的N基因的表达，从而实现了在细胞水平上抑制病毒的复制，为新型PRRSV疫苗的研制奠定了基础[88]。赵孟孟等根据PRRSV的nsp9基因设计的siRNA可以在体外Marc-145细胞上抑制病毒的复制[89]。为了探索RNAi技术作为抵抗PEDV感染的策略可能，Shen等根据M、N和S基因构建了5个shRNA表达质粒，结果表明其中两个可以达到95.0%的抑制率，推测RNAi可能成为一种有前景的策略[75]。Zhou等根据TGEV的RNA依赖性RNA聚合酶构建了两个shRNA表达质粒（pEGFP-U6/P1和pEGFP-U6/P2），并[90]转染至ST细胞，结果表明两个质粒的抑制率分别达到95.2%和100%。冶贵生等通过化学合成的方法合成了NS3基因不同位置的三组干扰序列，再连接载体转染至PK-15细胞，结果表明三组[91]重组质粒都能抑制CSFV粒子的增殖。在后基因组时代，RNAi为生命科学提供了新的思路。但作为新兴的技术RNAi仍存在一些问[75,77,78,87,88,90,题，随着研究的深入，RNAi一定可以成为新型的基因治疗手段用于动物疫病的防治92-95]。1.6研究的目的及意义PDCoV目前已经成为了导致初生仔猪腹泻和死亡的重要病原，但目前尚无有效的方法来控制，其致病机理还有待进一步加以研究。PDCoV正成为养猪业的新挑战。本研究旨在能够通过病毒传代培养，能够获得河北本地区的细胞适应株，为以后研究其致病性以及致病机制奠定基础；通过RT-PCR方法进行全基因组的扩增，可以更好地了解本地区PDCoV的基因结构特点；通过间接ELISA方法的建立，为PDCoV流行病学调查提供一种可靠的血清学诊断方法；通过RNA干扰技术，探讨基于质粒表达的shRNA对PDCoV体外复制的抑制效应，旨在开发一条新的治疗途径，为PDCoV的防治提供一种新的思路及解决方法。8 2材料与方法2.1材料2.1.1病料本实验室采集的2015-2016年河北地区猪场49份腹泻仔猪粪便及肠道内容物。2.1.2细胞和菌株猪睾丸（ST）细胞由本实验室保存；大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)菌株由本实验室保存。2.1.3血清阳性血清：PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV、PCV2、PRV阳性血清由本实验室保存。待检血清：2017年1月至2017年12月收集的河北地区542份血样。PDCoV阴阳性血清：通过RT-PCR检测，收集得到。2.1.4主要试剂、试剂盒与耗材表1试验所需的主要试剂、试剂盒及耗材Table1Themainreagents,kits,andconsumablesrequirdforthetest试剂名称生产厂家TrizolreagentInvitrogen公司PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit宝生物工程（大连）有限公司DL2000/DL5000DNAMarker宝生物工程（大连）有限公司6×LoadingBuffer宝生物工程（大连）有限公司限制性内切酶EcoRⅠ、XholⅠ、BamHⅠ、HindⅢ宝生物工程（大连）有限公司T4DNA连接酶宝生物工程（大连）有限公司pMD19-T克隆载体宝生物工程（大连）有限公司LipoGeneTM2000PlusTransfectionReagentUSEverbright公司DAB显色试剂盒北京索莱宝生物科技有限公司FITC-羊抗鼠二抗北京索莱宝生物科技有限公司TritonX-100北京索莱宝生物科技有限公司NC膜、96孔酶标板北京索莱宝生物科技有限公司TMB单组份显色液北京索莱宝生物科技有限公司质粒小提试剂盒美国BIOMIGA公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒美国BIOMIGA公司His-TaggedProteinPurificationKit康为世纪生物科技有限公司9 2.1.5主要溶液的配置2.1.5.1细胞培养试剂胎牛血清：56℃灭活30min，每10min摇晃一次，灭活后分装。PBS（10mmol/L，PH7.4）：NaCl8.00g，KH2PO40.24g，Na2HPO41.44g，KCl0.20g，加入600mL三蒸水溶解后，NaOH调pH值7.4左右，用超纯水定容至1L，121℃高压灭菌后常温或4℃保存备用。7.5%NaHCO3：称取15gNaHCO3用三蒸水溶解后定容至200mL，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。4×DMEM浓缩液：按说明书配方进行配置，过滤除菌，4℃贮存。1×DMEM细胞培养液：高压灭菌的三蒸水250mL，灭活的胎牛血清40mL，4×DMEM4U/mL双抗4mL，混合均匀后，用7.5%NaHCO100mL，2×103调节pH值7.4左右，4℃保存备用。1×DMEM细胞维持液：高压灭菌的三蒸水200mL，4×DMEM100mL，2×104U/mL双抗4mL，混合均匀后，用7.5%NaHCO3调节pH值至7.4左右，4℃保存备用。10×EDTA-胰酶溶液（2.5%）：胰酶2.5g，Na2EDTA0.2g，KCl0.2g，NaCl8.0g，Na2HPO4·12H2O2.89g，KH2PO40.2g，溶于100mL高压灭菌的三蒸水中，过滤除菌，分装，-20℃保存，使用时用高压灭菌的三蒸水做1:10倍稀释。2.1.5.2琼脂糖凝胶电泳用试剂10mg/mLEB贮存液：购自北京索莱宝生物公司。50×TAE浓缩液：Tris碱121g，冰乙酸28.55mL，EDTA7.3mL，用三蒸水溶解后，定容到500mL，常温保存。1×TAE电泳缓冲液：用取10mL50×TAE浓缩液，加入490mL三蒸水。1.5%琼脂糖凝胶：向100mL1×TAE溶液中加入1.5g琼脂糖，加热溶解后，待温度降至加入EB贮存液，使EB终浓度为0.5µg/mL。2.1.5.3SDS-PAGE溶液30%丙烯酞胺（W/V）：取丙烯酞胺7.25gN’N’-亚甲基丙烯酞胺，用200mL的蒸馏水溶解后定容至250mL容量瓶中（Ph≤8.8），4℃避光保存，备用。DL.1mol/LTris-HCl（pH8.8）：36.34gTris-碱用一蒸水溶解后定容至200mL，浓HCl调pH到8.8，室温保存。1mol/LTris-HCl（pH6.8）：24.2gTris-碱用一蒸水溶解后定容到250mL，浓HCl调pH至6.8，室温保存备用。10%过硫酸胺：取过硫酸胺1g，溶解于10mL的一蒸水中，分装后置于-20℃，保存备用。10 10%SDS：50gSDS溶解于适量的蒸馏水中（65℃水浴），定容至500mL，室温保存。5×SDS-PAGE电泳液（pH8.3）：取10%（W/V）SDS电泳贮存液100mL、15.1gTris碱和94gGly，溶解于一蒸水中，定容至1000mL，室温保存。考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于190mL的冰乙酸、甲醇和水的混合液（1:9:9）中，混匀溶解，过滤除去颗粒状物质，室温保存。脱色液：60mL蒸馏水中加入冰醋酸10mL、甲醇30mL，混匀后，室温保存。2×SDS上样缓冲液：200mmol/Lβ-巯基乙醇、100mmol/LTris-HCl（pH6.8）、4%SDS、20%甘油、0.2%溴酚蓝，-20℃保存备用。2.1.5.4WesternBlot溶液蛋白转印缓冲液：取3.03gTris碱和14.3gGly溶解于200mL的三蒸水中，再加入200mL甲醇，混匀后定容至1000mL，4℃保存。10×TBS：24.2gTris碱和80gNaCl溶于一蒸水中，浓盐酸调pH至7.5后，定容至1L。TBST洗涤液：每1000mL1×TBS中加入0.5mLTween-20，混匀、备用。封闭液（血清稀释液）：将5mL新生牛血清加入到95mL的洗涤液中，4℃保存备用。2.1.5.5ELISA用试剂包被液：NaHCO32.93g，Na2CO31.59g，溶于950mL蒸馏水中，调pH值为9.6，定容到1L，4℃保存。洗涤液：将0.25mLTween-20加入到500mLPBS溶液中，于4℃保存。封闭液（抗体稀释液）：将2mL新生牛血清加入到38mLPBST中，放置4℃，待用。终止液（2mol/LH2SO4）：取22.2mL浓H2SO4缓慢的加入到100mL的双蒸水中，最后定容至200mL，于4℃保存。2.1.6主要仪器表2试验所需的主要仪器Table2Themaininstrumentrequiredforthetest仪器名称型号生产厂家高速冷冻离心机Neofuge-13RHealForce超低温冰箱BCD-205TAHaier公司洁净工作台DL-CJ-2ND1北京东联全自动立式蒸汽灭菌器YXQLS18SI上海博讯医疗生物股份有限公司PCR仪T100BIO-RAD公司稳压稳流电泳仪DYY-8C北京六一仪器厂凝胶成像系统FluorChem-E、M、E型美国ProteinSimole11 超微量分光光度计ND-2000CThermoScientific公司二氧化碳培养箱HERACELL150iThermoScientific公司倒置显微镜BDS200-PMOPTEC奥特光学荧光显微镜MF50Leica酶标仪MultiskanFC型ThermerFish荧光定量PCR仪LightCycler96Roche2.2方法2.2.1PDCoVHB-BD株的分离与鉴定2.2.1.1引物的设计与合成参考GenkBank上登录的PDCoV/NH株（登录号：KU981059）基因序列，采用PrimerPremier5.0软件设计1对扩增PDCoVN基因的检测引物（预期扩增片段长度约为357bp），以及本实验室保存的PEDV、TGEV和PRoV的引物，如表3所示。表3检测引物Table3Primerfordetection引物名称引物序列扩增片段大小PDCoV-P15’-TAACTCCGCCATCAAAC-3’357bpPDCoV-P25’-CCACTTCCACGCTCCT-3’TGEV-F5’-GTGGTTTTGGTGTTAAATGC-3’869bpTGEV-R5’-CACTAACCAACGTGGACCTA-3’PEDV-F5’-TTCTGAGTCACGAACAGCCA-3’651bpPEDV-R5’-CATATGCAGCCTGCTCTGAA-3’PRoV-F5’-TAACTGGTTCTATGGACAC-3’211bpPRoV-R5’-ACAGAAAATGACGCAATA-3’2.2.1.2临床样本的处理本实验室采集了河北地区猪场49份腹泻仔猪粪便及肠道内容物。将样本用适量生理盐水悬浮，分装于1.5mL无菌的离心管中，并做好标记，放于-80℃冰箱备用。2.2.1.3样本材料RNA的提取根据Trizolreagent试剂说明书，具体操作过程如下：（1）将2.2.1.2中处理好的病料放于4℃离心机中，8000rpm离心3min收集上清（250μL）并移至另一1.5mL离心管中，加入750μLTrizol，混匀震荡2~3min，静置5min。12 （2）加入200μL氯仿，剧烈震荡1~2min，室温静置5min，12000rpm离心10min。（3）取上清，加入等体积异丙醇，-20℃静置1~2h。（4）取出离心管，12000rpm离心10min，弃去上清液，加入600μL75%DEPC水进行洗涤，7500rpm离心5min。（5）弃去上清。（6）加入RT-PCR洗脱液35μL，溶解核酸，进行下一步的反转录。2.2.1.4反转录合成cDNA参照PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit说明书操作：（1）取PCR反应管，以2.2.1.3中提取的总RNA为模板，配置20μL反转录体系依次加入以下组分：RNA8.0μLdNTPMixture1.0μLOligodTPrimer1.0μL（2）反应程序：65℃水浴5min，冰浴3min。（3）在PCR反应管中依次加入如下组分：RNaseFreedH2O4.5μL5×PrimeScriptBuffer4.0μLPrimeScriptRTase1.0μLRNaseInhibitor0.5μL（4）42℃水浴1h，70℃水浴15min进行终止。2.2.1.5RT-PCR检测以2.2.1.4中获得的反转录产物cDNA为模板，用表3中的检测引物进行PCR扩增，在20μLRT-PCR反应体系中依次加入如下组分：模板4.0μLdNTPMixture3.0μLTaKaRaTaq0.5μL上游引物1.0μL下游引物1.0μL10×PCRBuffer(Mg2+plus)2.5μLRNaseFreedH2O8.0μLTotal20.0μLPCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，49℃-55℃退火30s，72℃延伸30s-60s，一共35个循环；最后，72℃延伸10min。用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，根据凝胶成像系统观察（以DL2000Maker为分子量对照）扩增片段大小统计组织材料的检测结果。13 2.2.1.6阳性病料的处理为获得病毒分离接种物，将RT-PCR鉴定为PDCoV阳性的1Ml的原始样品用PBS稀释，涡旋混匀并4200g于4℃离心10min。分离上清液，用0.22μm滤器过滤，滤液用作病毒分离的接种物。2.2.1.7分离病毒与传代培养对于第一次接种，当T25细胞培养瓶中的细胞长满至80%时，加入100μL过滤液和900μL细胞维持液的混合液，于37℃、5%CO2培养箱中吸附1h后，用维持液洗两次，再加入10mL维持液，将细胞瓶放回培养箱中继续培养，每天观察其细胞病变。当接种2～3天后，细胞病变达到90%时，-80℃反复冻融三次，收毒。上清液存储于-80℃，用作后续传代培养的病毒种子液。对于连续传代培养，当T25细胞培养瓶中的细胞长至80%时，用维持液洗两次，之后加入上一代含有1%胰液素的1mL病毒液，细胞于37℃、5%CO2培养箱中培养2～3天后，80%细胞出现病变时，反复冻融三次后收集培养物，用作后续传代培养和RT-PCR鉴定。2.2.1.8RT-PCR鉴定取分离传代后的第9代病毒液进行核酸提取，并用RT-PCR进行特异性检测，方法见2.2.1.3-2.2.1.5。2.2.1.9病毒TCID50的测定消化生长旺盛的ST细胞，计数后铺于96孔细胞培养板，每孔2×104个细胞/200Μl。将细胞培养板置于37℃，5%CO2条件下培养24h。用DMEM细胞维持液将病毒原液作10倍倍比稀释（10-1-10-10倍稀释），将稀释好的病毒接种到96孔细胞培养板中，100μL/孔，每一个稀释度做12个重复；设置未感染病毒孔作为对照，重复12个孔。每天观察细胞的CPE，第五天时，记录出现CPE的细胞孔，按照Reed-Muench两氏法计算TCID50。2.2.1.10间接免疫荧光鉴定（IFA）6孔板中铺满ST细胞，用分离得到的病毒感染24h后弃上清，PBS洗涤后用冷的4%多聚甲醛4℃固定30min，弃去固定液PBS洗3次，加入0.2%TritonX-100室温透化15min，PBS洗涤三次之后加入5%的BSA，置于37℃温箱中封闭1h。PBS洗涤3次，加入鼠抗PDCoV阳性血清（1∶100稀释）37℃作用1h，PBS洗涤3次，加入用PBS作1∶100倍稀释的FITC-羊抗鼠二抗，37℃作用1h后在荧光倒置显微镜下观察结果。未感染病毒的ST细胞做阴性对照。14 2.2.2PDCoVHB-BD株全基因序列分析2.2.2.1全基因组引物设计参考GenkBank上登录的PDCoV/NH株（登录号：KU981059）基因序列，采用PrimerPremier5.0软件设计了16对特异性引物扩增PDCoVHB-BD株的全基因组，如表4所示。所用引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。表4扩增全基因引物序列Table4Theprimersusedforamplificationofthecompletegenome引物名称引物序列(5’-3’)位置片段大小(bp)PDCoV1FACATGGGGACTAAAGATAAAAATTATAG1-281580PDCoV1RGATACTTCATAACTCTGGCAATC1558-1580PDCoV2FTGATGTTCTGCTAGCCTT1485-15021862PDCoV2RCGAGTGTCAGAGGTGTGT3329-3346PDCoV3FCACTGATGTAGGCGATGA3282-32991581PDCoV3RCACGACTTTACGAGGATGA4844-4862PDCoV4FTCCATTTGGACCCACCTC4727-47441686PDCoV4RTAGCCTGCTGACTAAGACG6394-6412PDCoV5FAGTCAGCAGGCTATACGTGTGA6400-64211785PDCoV5RGAATGTTGTCTACTGCCCACGC8163-8184PDCoV6FGGAGGCGGTTCACAGTTGTA7996-80151807PDCoV6RGGTGGAAACCGTAACATTGCTG9781-9802PDCoV7FTGGCAGTTAAGATGTCCC9710-97271956PDCoV7RTGTAGCATTCCTCCTCGA11647-11664PDCoV8FCTAACTGCGCTCGGTTTA11539-115561812PDCoV8RGGTAGAATCGCTGGCTTT13333-13350PDCoV9FCTGTGGCAGGAGTGTCTA13060-130771620PDCoV9RGAAGTTTAATGAAGCGTTG14661-14679PDCoV10FAGTCATACGCTACCGCAACC14623-146421502PDCoV10RGCCATCGGCAACTCCTACT16106-16124PDCoV11FTGGCATGATTGTGGTGCAG16056-160741682PDCoV11RAACAGCTGTGTAGTTGGCAG17718-17737PDCoV12FCAACCGCACTAACTTACCTGT17654-176741672PDCoV12RTTCTGGTGGCCTCACAAGAA19306-19325PDCoV13FTCGTGAGTTAGAGAAGAAGCCTA19253-192751886PDCoV13RCTGTTGCCATTGCATACATACTG21116-21138PDCoV14FCATCAGCGTGTGTAGTGATGGTG20944-209661935PDCoV14RTGCCACACCAATGCAGATGAC22858-22878PDCoV15FATGGCATATTTTTCATGCATG22101-221211760PDCoV15RGTATGCTAAATGCAATTGGATTA23838-23860PDCoV16FCTCGTTGTTTTGCTTACAGTCTCGT23798-238221623PDCoV16RGCTCCATCCCCCCTATAAGCC25400-2542015 2.2.2.2细胞毒总RNA的提取根据Trizolreagent试剂说明书对第五代细胞毒进行总RNA提取，具体操作过程如2.2.1.3。2.2.2.3反转录合成cDNA详见2.2.1.4。2.2.2.4全基因RT-PCR反应以2.2.2.3部分中获得的反转录产物cDNA为模板，分别用表4中的16对全基因引物引物进行PCR扩增，在20μLRT-PCR反应体系中依次加入如下组分：模板4.0μLdNTPMixture3.0μLTaKaRaTaq0.5μL上游引物1.0μL下游引物1.0μL10×PCRBuffer(Mg2+plus)2.0μLRNaseFreedH2O8.5μLTotal20.0μL反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃-60℃退火30s，72℃延伸2min，一共35个循环；最后，72℃延伸10min。取全部PCR反应产物进行电泳检测（1.5%琼脂糖凝胶），根据凝胶成像系统观察（以DL2000Maker为分子量对照）扩增片段大小并统计结果。2.2.2.5全基因各基因片段PCR产物的回收与纯化具体操作过程详见琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（BIOMIGA）说明书。2.2.2.6PCR回收产物与pMD19-T载体连接将2.2.2.5中回收的目的基因与pMD19-T载体连接，建立10µL连接体系如下：pMD19-TVector（50ng/µL）0.5µLLigationSolutionI5.0µLPCR回收产物4.5µLTotal10.0μL16℃保温壶中过夜连接。16 2.2.2.7基因连接产物的转化（1）从-80℃取出实验室保存的感受态细胞，立即置于冰上。（2）将2.2.2.6中10μL连接产物加入到感受态细胞中，再分别经过冰浴、水浴、再冰浴；时间分别为30min，90s，3min。（3）向感受态混合物中加入700μLLB液体培养基，37℃震荡培养1h（200rpm）。（4）4000rpm离心5min，弃去部分上清液（剩余约200~300μL），将沉淀混匀，用涂布器均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，正面放置30min（37℃恒温箱），然后倒置培养12h。（5）挑取LB培养基上的白色单菌落，接种到含有5mLLB液的试管（加入5μLAmp）中扩大培养，在全温振荡培养箱中培养12~16h（37℃），将获得的菌液进行PCR鉴定。2.2.2.8全基因序列的测定及分析将PCR鉴定为阳性的克隆菌液送至北京中科希林生物科技有限责任公司进行测序，所得测序结果通过NCBI进行Blast比对，根据GenBank上已公布的国内外代表毒株进行序列对比分析，确定测序结果正确后，通过DNAStar软件对全基因进行拼接，用MEGA7.0.14软件中neighbor-joining法构建进化树，bootstrap值设置为1000来评估进化树的可信度，进行分离株与参考株之间的进化树分析。所参考的国内外代表毒株如表5所示。表5用于进行序列比对和进化树分析的HB-BD株及参考株Table5TheHB-BDisolatestrainandotherreferencestrainsofPDCoVandcoronavirusesusedforsequencealignmentandphylogeneticanalysis毒株地区登录号StrainLocationAccessionnoPDCoV/HB-BD-completegenomeChinaMF948005PDCoV/HB-BD-MgeneChinaKY129985PDCoV/HB-BD-NgeneChinaKY129986PDCoV/HB-BD-SgeneChinaMF037204CHN-JS-2014ChinaKP757892CH-HB-2014ChinaKP757891CH/SXD1/2015ChinaKT021234PDCoV/NHChinaKU981059CHN-TianjinChinaKY065120CH/Sichuan/S27/2012ChinaKT266822CHN-AH-2004ChinaKP757890HKU15-155ChinaJQ065043HKU15-44ChinaJQ065042PDCoV/CHJXNI2/2015ChinaKR131621OH11846USAKT381613OH1978USAKJ462462PA3148USAKJ584358IL2768USAKJ584355NE3579USAKJ584359MI6148USAKJ62001617 IN2847USAKJ569769SD3424USAKJ584356KY4813USAKJ584357OhioCVM1/2014USAKJ7692318734/USA-IA/2014USAKJ567050PDCoV/USA/lllinois133/2014USAKJ601777PDCoV/USA/lllinois136/2014USAKJ601779PDCoV/USA/lllinois134/2014USAKJ601778PDCoV/USA/lllinois121/2014USAKJ481931KNU14-04KoreaKM820765PDCoV/Swine/Thailand/S5011/2015ThailandKU051641PDCoV/Swine/Thailand/S5015L/2015ThailandKU051649PEDV/CH/JX-1/2013ChinaKF760557PEDV/CV777BelgiumAF353511PEDV/OH1414USAKJ408801TGEVH16ChinaFJ755618TGEV-virulent-PurdueUSADQ8117892.2.3重组表达质粒的构建及鉴定2.2.3.1S1基因表达引物的设计根据已经上传到GenBank的PDCoVHB-BD株S基因全序列（GenBank登陆号MF037204），使用Primer5.0软件设计1对特异性表达引物，并分别在上、下游引物5‘端添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，预期片段大小为865bp。B1：CCGGAATTCCACGAAGTGGAGGATGGGTTB2：CCGCTCGAGTGGATGGTCGAGTATTCTGTAATGT其中B1中下划线为内切酶EcoRⅠ酶切位点，B2下划线为内切酶XhoⅠ酶切位点2.2.3.2S1优势目的基因的扩增及纯化回收以全基因序列扩增片段中的重组质粒pMD19-T-S为模板，用B1、B2引物进行S1基因优势抗原表位区的PCR扩增，建立20μL反应体系：18 pMD19-T-S2.0μLdNTPMixture3.0μLTaKaRaTaq0.5μL上游引物1.0μL下游引物1.0μL10×PCRBuffer(Mg2+plus)2.0μLRNaseFreedH2O10.5μLTotal20.0μLPCR扩增条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。反应完成后，之后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测产物，PCR产物的回收方法同2.2.2.5。2.2.3.3重组质粒pMD19-T-S1的构建将2.2.3.2中的胶回收产物与pMD19-T载体连接，16℃过夜，转化方法同3.2.7，将重组质粒命名为pMD19-T-S1。2.2.3.4重组质粒的提取挑取单一白色菌落，于5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃200r/min，摇菌14h，具体步骤参照高纯度质粒小提试剂盒说明书进行操作。2.2.3.5测序鉴定具体操作方法同2.2.2.8。2.2.3.6重组质粒和原核表达载体的双酶切用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分别对重组质粒pMD19-T-S1和原核表达载体pET-32a进行双酶切，建立20µL酶切体系如下：10×bufferK20µLEcoRⅠ1µLXhoⅠ1µLpMD19-T-S1/pET-32a12µL灭菌ddH2O4µL总体系20µL混匀，37℃水浴锅中酶切3h，电泳检测。19 2.2.3.7双酶切产物的回收纯化操作方法如2.2.2.5。2.2.3.8重组表达质粒pET-32a-S1的构建将双酶切回收的S1目的片段与线性表达载体pET-32a连接，16℃过夜，建立10μL连接体系：10×T4DNA连接酶Buffer1µLT4连接酶（3U/μL）1µL线性原核表达载体5µL回收的目的基因3µL总体系10µL按照2.2.2.7的方法将连接产物转化至E.coliBL21感受态细胞。2.2.3.9重组表达质粒pET-32a-S1的提取操作方法同2.2.3.4。2.2.3.10重组表达质粒pET-32a-S1的双酶切鉴定用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对重组表达质粒进行双酶切，建立10µL酶切体系如下：10×bufferK1µLEcoRⅠ0.5µLXhoⅠ0.5µLpET-32a-S16µL灭菌ddH2O2µL总体系10µL混匀，酶切，电泳鉴定酶切产物。2.2.4重组表达质粒pET-32a-S1的诱导表达及重组蛋白的鉴定2.2.4.1重组表达质粒的诱导表达挑取单个菌落接种于5mLAmp/LB液体培养基中，37℃200r/min振荡12h。取200μL过夜培养的菌液转接至20mLAmp/LB液体培养基中，37℃200r/min振荡至OD600nm在0.6~0.8之间，加入20μLIPTG继续诱导培养，分别于诱导前和诱导后1，2，3，4，5，6，7h取菌，用SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况，同时设置空载体和诱导前菌体作对照。20 2.2.4.2重组蛋白的可溶性检测向100mL氨苄抗性的LB液体培养基中加入1mL培养12h的阳性菌液，37℃200r/min，摇菌至OD600nm到0.6~0.8之间，加IPTG诱导6h。4000r/min离心10min，弃上清，加入菌体裂解液，充分混匀，冰上超声波破碎约30min至菌体澄清。4℃12000r/min离心10min，分别收集上清和沉淀。沉淀用BindingBuffer充分溶解，SDS-PAGE检测上清和沉淀，确定重组蛋白是可溶性表达还是以包涵体形式表达。2.2.4.3重组蛋白的纯化用4-5mLBindingBuffer溶解沉淀，4℃10000r/min离心15min，取上清。用康为世纪生物技术有限公司的His标签纯化试剂盒（包涵体蛋白）进行蛋白纯化。1）将2mL填料混匀加入到层析柱中，静置10min，待凝胶全部沉淀下来，把底部的出液口打开，使乙醇流出。2）用5倍柱体积的去离子水冲洗镍柱，8倍体积的BindingBuffer平衡柱子。3）用1mL的注射器缓慢地向柱子中加入收集的上清，并收集流穿液。4）为了收集更多的目的蛋白，将流穿液再次过柱子。5）向柱子中加入15倍柱体积的BindingBuffer，冲洗杂蛋白。6）使用适量的ElutionBuffer洗脱目的蛋白，收集5管，每管1mL。7）使用5倍柱体积BindingBuffer冲洗镍柱，5倍柱体积去离子水洗柱子，再用3倍体积的20%乙醇平衡柱子，封柱后4℃保存。2.2.4.4重组蛋白Westernblot检测收集纯化的蛋白进行SDS-PAGE后，半干转印法将蛋白转印到NC膜上。用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，用TBST和TBS交替洗膜三次，每次5min。用TBS对PDCoV阳性血清进行1:100倍稀释，室温振荡1h后洗涤（同上）。在培养皿中加入1000倍稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，室温振荡2h后洗涤。在暗处将NC膜用DAB显色，达到预期颜色后，蒸馏水洗涤，终止显色。2.2.5血清中PDCoVIgG抗体间接ELISA检测方法的建立2.2.5.1抗原最佳包被浓度及血清最适稀释倍数的确定将纯化的PDCoVS1重组蛋白作为抗原，用包被液稀释成0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL的6个浓度梯度，以100μL/孔分别加到酶标板中，37℃包被2h后4℃过夜；弃液，250μLPBST洗涤3~5次，3min/次；加入封闭液（5%胎牛血清），150μL/孔，37℃作用2h后，弃液；加入1:25、1:50、1:100、1:200、1:400倍稀释的阴阳性血清，100μL/孔，组成方阵，37℃作用1h后，洗涤同上；每孔加入100μL的1:20000倍稀释的HRP-兔抗猪IgG，37℃作用1h后，洗涤同上；加入底物显色液TMB，100μL/孔，室温避光显色15min后，21 加入50μL终止液，用酶标仪测定OD450nm。当阳性血清OD450nm值接近1.0，且与阴性血清OD450nm的比值（即P/N）最大时，则为最佳的抗原包被浓度和血清稀释浓度。2.2.5.2酶标抗体最适稀释倍数和最适封闭液的确定将上述已经确定的最佳抗原浓度包被酶标板，100μL/孔，37℃作用2h，4℃包被过夜；弃液，用250μLPBST洗涤3~5次，3min/次；分别将5%新生牛血清、5%胎牛血清、5%脱脂奶粉和1%BSA作为封闭液，200μL/孔，37℃作用2h后，弃液；加入已经确定的最适工作浓度的血清，100μL/孔，37℃作用1h后，洗涤同上；将HRP-兔抗猪IgG分别做1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000倍稀释，加入到酶标板中，100μL/孔组成方阵，37℃、1h后，洗涤同上；加入底物显色液TMB，100μL/孔，室温、避光显色15min后，加入50μL终止液，测定OD450nm；当阳性血清OD450nm值接近1.0，且与阴性血清OD450nm的比值（P/N）最大时，则为最佳酶标抗体的浓度和最适封闭液。2.2.5.3包被条件的确定抗原分别进行4℃包被过夜、37℃孵育2h、37℃孵育1h后4℃包被过夜、37℃孵育2h后4℃包被过夜，其它操作方通同2.2.5.1。2.2.5.4封闭时间的确定最适封闭液于37℃分别作用30min、60min、90min、120min，其它操作方法同2.2.5.1。2.2.5.5一抗最佳作用时间的确定加入最佳稀释浓度的阴阳性血清，37℃分别作用30min、60min、90min、120min，其它操作方法同2.2.5.1。2.2.5.6二抗最佳孵育反应时间的确定HRP-兔抗猪酶标二抗于37℃分别作用30min、45min、60min、90min，其它操作方法同2.2.5.1。2.2.5.7底物显色时间的确定当一抗和酶标二抗反应后，加入TMB显色，分别在显色10min、15min、20min、25min时加入终止液，测定OD450nm值并计算P/N，确定最佳的底物显色时间。22 2.2.5.8阴阳性临界值的确定用建立的PDCoVS1蛋白间接ELISA方法检测30份PDCoV阴性血清，计算平均值X和标准方差SD。根据公式：阴阳性临界值=X+3SD，计算出阴阳性临界值。样品OD450nm值≥X+3SD时，判定为阳性；当样品OD450nm值