猪繁殖与呼吸综合征病毒上调PGE_2的机理研究

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分类号：单位代码：密级：公开学号：博士学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒上调的机理研究研宄生毕艳敏指导教师封文海教授申请学位门类级别理学博士专业名称微生物学研究方向分子病毒学与免疫学所在学院生物学院年月 Ph.D.DissertationStudyonthemechanismofPorcineProductiveandRespiratorySyndromeVirus-increasedPGE2Ph.DCandidate:YanminBiSupervisor:WenhaiFengMajor:MicrobiologyResearchField:MolecularVirology&ImmunologyCollegeofBiologicalSciences,ChinaAgriculturalUniversityBeijing,ChinaMay,2014 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中己经注明引用和致谢的内容外,论文中不包含本人和其他人己经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名时间：沁叫年右月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版,允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版,并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议)时间：年月曰学位论文作者签名：呀导师签名时间：年月日 摘要猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(引起的以妊娠母猪繁殖障碍、小猪呼吸道症状为主要特征的严重猪传染疾病。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(于年首次在中国发现’以高热、高致病性、高死亡率为典型特征。已有的研宄证明前列腺素氏是导致发热的关键因子,且环氧合酶介导的酶促反应是合成过程中的关键限速步骤。但是引起高热背后的机制以及和在其中的作用目前仍不清楚。在本研宄中,首先发现猪的死亡时间同小猪感染后期体温之间有明显的相关性,即感染后期体温越高的小猪死亡的时间也越早。并且显著增强感染小猪血清和肺泡灌洗液及感染猪肺泡巨暖细胞)中的分泌。然后通过、等方法我们发现能够显著上调中的和蛋白水平。较的特异性抑制剂来说,的特异性抑制剂预处理后能够更显著地抑制病毒诱导的。因此感染后通过上调的表达导致分泌水平升高。此外,抑制剂)能够显著降低及蛋白水平并使上清中的分泌下降。同时感染后能迅速上调中的磷酸化水平。这些结果提示及其磷酸化形式是引起表达升高的关键节点。克隆猪启动子序列并通过截短突变构建一系列梯度长度启动子荧光素酶报告载体。通过双荧光素酶报告载体实验,发现在启动子—区域存在诱导的转录因子的结合基序。利用生物信息学方法结合位点碱基突变实验显示在这一段区域存在的结合基序。染色质免疫共沉淀技术(进一步证实能够结合在启动子这段区域。感染后核质蛋白分离及激光共聚焦实验证明在感染早期即可显著上调细胞内的水平,并转移定位于核内。并且抑制可显著降低感染后的上调。利用技术进一步证明能够通过来上调的表达。这部分结果表明可以通过通路调控的磷酸化,入核结合到的启动子上,激活其转录。总的来说,本研宄从导致发热可能的关键因子派生,证明感染后促进的磷酸化。的下游信号分子在磷酸化后入核并结合在启动子序列区域上增强的转录表达。表达旳进而酶促提高？丑的分泌,可能是引起猪的高热的原因之一。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒,, AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)causedbypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(HP-PRRSV)ischaracterizedbyrespiratorydisordersinpigletsandreproductivefailureinsows.In2006,,, thephosphorylatedC/EBP-Pmigratestonucleiandbinds-404/-193regionCOX-1promotertoinitiateCOX-1transcription.TheupregulatedCOX-1augmentstheproductionofPGE2,whichmightbethereasonofHP-PRRSV-inducedfever.Keywords:PRRSV,PGE2,, 目录輕賺缩略词表第一章引言猪繁殖与呼吸综合征概述历史与分布临床症状猪繁殖与呼吸综合征病毒概述病原分子生物学特征的感染靶细胞与机制的流行病学特征感染率高易感动物传播与防治高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒发热致热原和激活物的概念致热源作用部位致热原的作用方式前列腺素,概述合成和发热信号通路增强子结合蛋白研究目的及意义 第二章实验材料和研究方法实验材料仪器主要实验试剂试剂配制菌种及质粒病毒和细胞细胞培养和病毒感染病毒的检测方法实验动物实验方法繁毒病毒紫外灭活攻毒以及体温检测和血清的获取原核表达质粒的构建及原核表达多克隆抗体制备流式细胞术检测胞内蛋白表达情况实时定量信号通路抑制试验实验启动子和突变质粒的构建质粒小量提取质粒转染实验双荧光素酶报告检测试验试验激光共聚焦检测量细胞组分核质分离染色质免疫共沉淀试验(统计学处理第三章通过通路上调从而导致上升实验结果与分析感染能够上调水平感染上调的水平多克隆抗体的制备感染能够上调蛋白水平的表达能够通过上调引起表达升高 3.1.6PRRSV通过信号通路诱导表达猪启动子的克隆和序列分析通过诱导磷酸化来激活表达导致致热源的分泌增加上调而不是并促进的分泌通过途径激活誠参考文献賴个人简介 縮略词表缩写英文名称中文名称猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病猪肺泡巨噬细胞环氧合酵前列腺素支气管肺泡灌洗胎牛血清磷酸盐缓冲液二甲基亚砜细菌脂多糖牛血清白蛋白互补反转录聚合酶链式反应酶联免疫吸附实验半数组织培养感染量千道尔顿千碱基藻红蛋白克或离心力单位小时分钟秒毫升微克微升微摩尔每升纳摩尔每升千碱基 中国农业大学博士学位论文第一章引言第一章引言猪繁殖与呼吸综合征概述历史与分布猪繁殖与呼吸综合征(,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(,引起的猪的一种髙度传染性疾病,临床上表现为母猪发热、厌食、流产、产死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍,以及仔猪呼吸道症状和高死亡率。年美国首先报道了该病的发生,,随后加拿大、德国、荷兰等一些国家也先后暴发了该病。年初,我国台湾地区也发现该病。年,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研宄人员第一次证实了此病也存在于我国。最初,人们由于不能确定其病因,故称其为“猪不育和呼吸道综合征”,“猪蓝耳病”等。年月,首届国际研讨会将此类疾病统称为猪繁殖与呼吸综合征。目前,遍及全球,成为危害养猪业最重要的传染病之一,被国际兽疫局(认定为类传染病,给世界养猪业造成了巨大的经济损失,至今未找到根除的有效方法。临床症状哺乳仔猪和母猪对最易感,症状表现为大体病变和显微病变。不同的毒株的毒力存在差异,导致病猪症状的严重性存在明显的差距。通常情况下日龄的仔猪感染后症状最为明显,死亡率达到左右。早产仔猪在出生后立即或几天内死亡,出生后仔猪表现出呼吸困难、肌肉震颤、四肢麻擦、打喷嚏以及嗜睡等症状,部分仔猪耳朵和躯体末端皮肤发银。妊娠初期的母猪感染后精神疲倦、出现厌食发热等症状,部分母猪出现肢体麻搏等神经性症状；妊娠后期则出现早产、流产、死胎、木乃伊胎及弱仔等症状。这些现象通常可以持续周,之后母猪会重新发情。感染的公猪表现出咳嗽、喷嚏和呼吸困难等呼吸道症状,同时出现食欲减退、运动障碍、性欲减弱、精液质量下降、射精量少等。临床解剖发现主要病变为肺弥漫性间质性肺炎和肺水肿,研究发现病猪的免疫器官和免疫细胞出现了严重损伤,导致出现免疫抑制,容易引起继发性感染,造成较高的发病率和死亡率。与经典的猪繁殖与呼吸综合征比较,感染高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒后的病猪以持续高热为主要特征,体温达以上；而且发病猪不分年龄段均会出现急性死亡；感染仔猪的发病率可达,死亡率达以上；妊娠母猪感染则会导致流产,流产率可达以上,严重的高达,但并不集中在妊娠的某个阶段。病猪临床症状主要表现为发烧、厌食；耳部、口鼻部及股内侧皮肤发红、出血斑、丘疫；咳嗽、气喘；还会出现后躯无力、不能站立或摇摆、抽搐等神经损伤症状部分发病猪还会出现顽固性腹湾。肉眼主要见肺出血激血,其他器官如心尖、肾脏、扁桃体、肝脏等也可见出血点。因为高致病性猪繁殖与呼吸综合征的患猪经常伴有继发性 中国农业大学博士学位论文第一章引言或混合性的感染,所以其临床症状一般表现不尽相同。猪繁殖与呼吸综合征病毒概述病原猪繁殖与呼吸综合征的病原体为猪繁殖与呼吸综合征病毒(,于年,由荷兰中央兽医研究所从自然感染和实验感染猪中首先用猪肺泡巨哩细胞(分离培养获得的一种未知病原,经鉴定是一种病毒,研宄人员用该研宄所所在地将其命名为病毒,随后德国和美国的科学家也陆续从本国病猪体内分离到类似的病毒。年,国际病毒学会议将该病毒正式命名为“猪繁殖与呼吸综合征病毒”。年,由郭宝清等人首次从国内疑似病例中分离到病毒。是一种有囊膜的单股、正链、不分节段的病毒,直径在到之间,为二十面体对称结构,有包膜包暴(图,属于尼多病毒目(、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属(。同属于动脉炎病毒属的病毒还有马动脉炎病毒、小鼠乳酸脱氢酶病毒(和猴出血热病毒(。—,慮,。—图病毒粒子示意图对、温度敏感,小于或大于条件下,感染力可下降°条件下病毒在个月内能够保持稳定,而：条件下仅需要、°条件下仅需要就可将病毒完全灭活。对外界抵抗力较弱,一些常见的消毒剂如面素类(消毒液、氧化类(双氧水、酸类(甲酸)、表面活性剂类(新洁尔灭)、酷类制剂等都能可以在较短时间内,使失去活性,对其具有很好的杀灭作用,而常规的酸碱处理也能得到良好的消毒效果。 中国农业大学博士学位论文第一章引言根据猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原特性,可以将其分为型和型,即欧洲型(和美洲型(,,两者之间的同源性约为欧洲型毒株之间高度保守,而美洲型毒株的变异率要显著高于欧洲型毒株。我国流行的以北美洲型(基因型)毒株为主,但呈现致病性和基因组变异的多样性。年出现的高致病毒株(也属于的突变型毒株,其发生了个左右氨基酸残基的缺失突变。分子生物学特征基因全长’末端为具有甲基化的帽子结构而’末端为多聚腺甘酸尾。全基因组至少包含有个开放阅读框(,即、、、、及基因,开放阅读框之间存在嵌套式重叠,结构复杂,通过个嵌套式亚基因进行翻译,。通过个嵌套式亚基因进行翻译。编码所有的非结构蛋白,包括、、、、另夕卜,和基因序列位于基因组的’端,长度占总基因组的,主要编码病毒复制所需要的复制酶和聚合酶。编码六种非结构蛋白,包括、、、和则先编码出多聚蛋白(个氨基酸残基,然后被所编码的蛋白酶切割,形成另外个非结构蛋白(。、、、、、和位于基因组’端,总长大约编码个病毒结构蛋白,依次分别为糖蛋白、小包膜蛋白(或、、、、、膜蛋白(和核衣壳蛋白(图、和的基因较短,分别包含在和中。、、和是病毒的次要结构蛋白,除蛋白外其他几个蛋白端均被糖基化；和蛋白是病毒的主要结构蛋白,这些蛋白几乎都参与了病毒的感染过程,见图。■■■、「、、、、、、、、—、；、、、、、、、、、卷图病毒基因组示, 中国农业大学博士学位论文第一章引言的感染细胞与机制动脉炎病毒科成员具有较窄的细胞嗜性,即单核巨唾细胞。对猪免疫系统具有独特的嗜性,其在体内感染时主要攻击的细胞是猪肺泡巨唾细胞(,在感染后在中大量复制,引起调亡及免疫功能丧失,这也是感染造成猪高死亡率的重要原因之一,除此之外,也可以感染其它组织器官中的巨噬细胞,比如淋巴结、扁桃体、脾、肝以及胸腺中的巨细胞,还有外周血单核细胞、骨髓中的未分化细胞,丨,。还有研宄表明,可以感染某些生殖细胞,例如猪的辜丸生精细胞(：包括精子细胞(和精母细胞(,。在体外培养系统中,可以感染非洲绿猴肾细胞系,及其衍生细胞系和,并可以复制与增殖。型对猪肺泡巨哩细胞比细胞系更敏感,但某些型毒株只能在细胞上复制。型通过多次传代才可以适应细胞。这种针对巨细胞的嗜性,与表面的受体硫酸乙酰肝素(、唾液酸點附素(,、有关,。并且据文献报道,感染原代细胞时,需要经过受体介导的内吞进入细胞,。如图。—害▲測图受体介导的进入细胞 中国农业大学博士学位论文第一章引言琉黢乙联肝素广泛存在于许多细胞的表面和细胞介质中,能够与许多病毒粒子结合,但对很多病毒来说,只与相互结合是不足以使其进入细胞的,还需要其他特异性的受体介导病毒的进入。在的感染过程当中,的主要作用是能够使吸附在表面,起到粘附因子的作用,但它对唾液酸粘附素所介导的内吞不是必须的,但在存在的条件下,能够增强唾液粘附素所介导的的内吞。唾液粘附素年,等发现了一个大小为的仅存在于上的受体。并通过一系列分析,将该蛋白列为唾液酸粘附素家族成员。该蛋白只存在于上,即使的易感细胞系等都不存在。在细胞中表达该蛋白,能够支持进入细胞,但并不导致病毒的脱壳,。唾液酸粘附素在感染过程中的主要作用是介导的内吞。是一种清道夫受体(。最初的研究认为由髓干细胞分化而来的多种亚群的巨睡细胞上都存在分子。等研究证明在和上都存在分子,暗示分子在感染过程中起着重要作用。从人细胞、细胞、鼠腹膜巨唆细胞、犬细胞中分离得到分子,将这些不同种属的分子转染非敏感细胞系(例如和细胞系等)后,这些细胞系能够支持的感染与复制。的研究也显示,唾液酸粘附素和对于病毒脱壳和进入是必须的。、、三者之间的关系：能够调节低水平的病毒的吸附,有助于病毒吸附,但是并不能将病毒内化；能够调节病毒的吸附和内化并且可以不需要的协助；受体在病毒脱壳和基因组的释放过程中发挥主要的作用。同时发现,蛋白结合硫酸乙酰肝素。的流行病学特征感染率高自从年发现以来,在欧洲、北美洲和亚洲等地都有报道该病的发生该病现在已经广泛的存在于世界各地的养猪场。血清学调查研宄显示,美国大部分州的猪场都有感染样本阳性率根据地区不同在到不等,平均阳性率在左右,在欧洲,有学者认为有半数左右的猪场感染了,。在我国猪群的感染率很高,猪群抗体阳性率在,不同地区和不同猪场,血清学阳性率高低有所不同,由此说明该病在我国各地的感染率是有差异的。并且在年左右出现了高致病性,其致病性更强、死亡率高于普通毒株,感染仔猪发病率可达、死亡率可达以上,妊娠母猪感染后出现严重流产症状,流产率可达以上,严重的可达甚至,育肥猪也同样会发病死亡。持续感染是的重要特征。 中国农业大学博士学位论文第一章引言易感动物各个年龄段的不分性别的猪都可被感染,一年四季都可发生,但冬季较为严重。呈地方性流行,但病情、症状差别较大,妊娠母猪和日龄仔猪更为易感,临床症状也更严重。高致病性猪繁殖与呼吸综合征,发病快、传染率和发病率高、治疗效果差、病死率高,病程仅周。传播与防治属于接触性传染病,可以通过空气传播、直接或间接接触以及精液传播等方式进行传播。病毒不耐热,在低温条件下可以存活较长时间￡,。这或许可以解释为什么在冬季发病率比其他季节高。猪只之间的传播最可能的渠道是通过空气,而且已经证实空气和机械,传播是主要的传播方式,在低温、高湿和少日光的冬季气候条件下,可能加快空气传播。也可以通过粘膜体液如眼、口、鼻、腹膜、阴道、精液等感染易感猪群。妊娠母猪感染病毒后,可通过胎盘将病毒传递给胎儿,导致妊娠后期的母猪出现流产、早产、死胎和木乃伊胎等症状。哺乳仔猪和断奶仔猪也是的主要宿主。仔猪还可能由于在哺乳期与感染年龄较大的猪接触受而受到感染。另一项加快传播的途径是公猪感染后可通过精液在猪群中广泛传播该病毒。多为隐性感染,在个体和群体水平上均可持续感染,这给防治带来一定的困难。目前防治该病的措施只能是一旦发现采取对症疗法,改善饲养环境,减小养殖密度。对发病地区进行封锁、限制流动,对患病猪实行扑杀、深埋等,将猪舍进行全面消毒,以控制蔓延。对未发病地区可以通过接种疫苗进行预防。 中国农业大学博士学位论文第一章引言高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒………—■…图年中国流行病学地理分布图年月,我国江西省首先暴发高致病性,且在很短时间内传播到湖南、湖北、江苏、浙江等周边省份,随后又迅速向我国其他地区蔓延(图。该病造成的死亡率不断攀升,给我国养猪业造成了巨大打击。虽然由于疫苗的使用,疫情逐渐缓和,但目前仍呈现地方性流行和散发。与普通毒株相比,高致病性毒株的主要特征是发病猪出现以上持续高热,病猪咳嗽伴有哮喘、严重呼吸困难等呼吸症状以及母猪繁殖障碍,。发病仔猪发病率可达死亡可达以上；母猪流产率可达以上,严重的可达。并且通过病理解剖能看到对各器官都表现出广泛的嗜性。与普通毒株相比感染后能够引起更为严重的急性肺损伤,表现为严重的肺部水肿以及中性粒细胞、肥大细胞、单核细胞等免疫细胞大量募集在肺部,而且血清中肿瘤坏死因子(,、白介素、白介素组胺(和血小板活化因子(,等也有明显升高,。与传统美洲株相比上存在个不连续的氨基酸缺失。先前研究通过反向遗传技术获得区域被毒株替换掉的重组毒株,该重组毒株虽然较毒力稍弱,但依旧能引起很高致死率。将的替换成的重组毒株毒力完全没有增强。这说明的毒力增强与这个氨基酸的不连续缺失没有直接相关性对感染机制的深入研宄有助于对该疾病的了解与防治。发热 中国农业大学博士学位论文第一章引言哺乳动物都具有相对稳定的体温,可以将体温维持在一定的范围之内,对保障机体正常的生命活动至关重要。在此范围之内,不同的种属和个体的体温会具有一定差异,并且个体的体温也呈现昼夜节律的变化。机体内几乎所有的生物化学过程都受到体温的调节。而体温的相对稳定是由位于下丘脑的体温调节中枢的调控来实现的。发热是在致热原的作用下使下丘脑体温调节中枢的调定点上移而引起的调节性体温升高。致热原和激活物的概念传统上把能引起人体或动物发热的物质,通称为致热原(。根据来源的不同可以将致热原划分为外源性致热原(和内生致热原(,分别用以表示来自体外或体内,。外源热原(、革兰氏阴性细菌：大肠埃希氏菌、伤寒杆菌、淋球菌、脑膜炎球菌等细菌的组成成分如肽聚糖、脂多糖等都属于强致热源。、革兰氏阳性细菌：从肺炎球菌、白色葡萄球菌、溶血性链球菌等能分离出有致热性的外毒素。、病毒感染：通过静脉注射把流感病毒、麻疫病毒注入家兔体内可引起动物体温的迅速升高。、致炎物和炎症灶激活物：有些致炎物如桂酸结晶、尿酸结晶等可以导致发热；抗原抗体复合物对产内生致热原细胞也有激活作用,许多自身免疫性疾病如系统红斑狼疫、类风湿、皮肌炎等都有表现顽固性发热症状。内生致热原年等首先发现在无菌生理盐液中培养的家兔腹腔无菌性渗出的白细胞,可以产生并释放致热原,因此将该种致热源称为白细胞致热原,。为表不其来自体内,又称之为内生致热原。主要是一些是由免疫细胞和部分非免疫细胞合成和释放的细胞因子,具有细胞间信息传递、免疫调节作用的一大类小分子蛋白质或多肽。其中部分细胞因子与发热反应关系密切,在发热中起重要作用。众多的研宄发现,与发热相关的细胞因子主要有以下几种：白介素家族(、受体措抗蛋白(、肿瘤坏死因子白介素(,、干扰素(、巨睡细胞炎症蛋白,。致热源作用部位哺乳类动物相对恒定的体温,是依赖体温调节中枢对产热和散热平衡的调控来维持的。体温调节中枢主要包括视前区前下脑(和次级中枢如延脑、桥脑、中脑、脊髓等。其中是体温调节中枢最主要的组成部分。当能够正常工作时,次级中枢就处于备用地位。而当失去正常功能(如出现疾病或外力损伤)时,次级中枢可能取代之而发挥积极作用。无论对体温调节或致热原的反应,可能都是如此。致热原的作用方式 中国农业大学博士学位论文第一章引言现有研究还无法确定内生性致热原(是否可以通过血脑屏障,但在给动物静脉内注射总需要经过一段潜伏期才能导致机体发热。因此有学者认为极有可能是要通过某个或多个介质,导致体温调定点上移,从而引起发热。研宄人员认为存在某种或某些中枢介质(也称中枢发热介质)参与发热的中枢调控。而目前报道可能参与调控的介质主要包括单胺类(去甲肾上腺素、轻色胺、前列腺素、、和比值等。而最受重视的是、。本文主要关注的是在诱导发热中的作用》前列腺素,概述前列腺素(是花生酸家族的成员,几乎身体的所有细胞都能够合成前列腺素。细胞可以组成性或者在炎症剌激、信号分子的刺激下由环氧合酶以花生四稀酸为底物生成,作为一个脂类调节物质,不被细胞储存,会被释放到细胞外,,在众多前列腺素中,含量最多的是。在维持体内平衡、炎症以及某些抗炎症,方面发挥着重要作用。通过抑制来减轻炎症的治疗策略己经有上百年的历史合成的合成一共分为三个阶段如图首先,细胞膜憐脂在磷脂酶(八的作用下,释放花生四稀酸。第二步,花生四稀酸作为前体物质被环氧合酶(,合成氛过氧化内过氧化物前列腺素,然后进一步合成氢内过氧化物前列腺素。第三步,在末端合成酶的作用下生成。每一步级联反应都是被几种非同工酶或者同一种酶的不同亚型催化进行的。例如,哺乳动物的家族包含许多成员,分为胞内酶(,和胞外酶(,。有两个亚型,分别是和。催化到的过程也是由几种催化进行的,包括胞内酶和微粒体酶(具体来说为： 中国农业大学博士学位论文第一章引言：處缘⑩‘丨丨」“、、、二、、、；图合成路线第一步：憐脂醇憐脂酵超家族,可以将膜憐脂上的酯键水解被分为四类：依赖型(,〗)、韩不依赖型(、血小板激活因子(,、乙酰水解酶(,。后两种在的合成过程中没有显著作用,所以本文略过不提。依赖性的憐脂酶家族包含个同工酶：、和,它们在哺乳动物组织中大量表达,在这三种同工酶中研宄的最详细的是。在静息细胞中,没有被激活的存在于胞楽中。炎症因子剌激后,能够在几分钟内被隣酸化然后转移到高尔基复合体(、内质网(、核膜上,,使其更接近下游的。憐酸化的转移至胞内膜结构上,会导致膜上脂肪酸主要是花生四稀酸(,的释放。除 中国农业大学博士学位论文第一章引言了这种转录后激活,刺激也可以上调兔肝脏巨唾细胞和下丘脑的的平。并且研究人员发现,从缺失的小鼠体内取得的免疫细胞,其合成能力明显下降,。进一步研宄发现如果敲除,小鼠体内的的表达水平也选择性下调,但的表达并没有受到影响。暗示能够选择性结合蛋白,共同起始下游的生成。在哺乳动物中,家族成员已经包括种酶,分别为和。在细胞内的定位以及激活机制与家族不同。大部分的家族成员会被释放到细胞外,从细胞膜上释放花生四稀酸。主要的激活机制是转录水平上调第二步：环氧合酶也称为前列腺素合成酶(,它是和血检素合成过程中的关键限速酶。它催化两步反应,将氧化成然后再合成见图。在一系列的和非酶机制下,被转化成为各种前列腺素、、、和,其中含量最丰富的为。存在个亚型：和。最近还有一个的剪切体被称为或者被成功克隆。和在结构和催化活性上都十分相似。它们的生物合成活性都可以被阿司匹林或者留醇类抗炎药物所抑制,。两个亚型都有的分子量,有大约个氨基酸的长度,具有的同源性。三维射线晶体成像显示,人和鼠的与他们的,的晶体结构十分接近,近乎重叠,都是以同源二聚体的形式存在,每个单体都包含个独立的结构域,分别为末端类表皮生长因子区、膜结合区和末端一个较大的球状催化区。尽管和有多的同源性并且催化相同的反应,但是他们有不同的调节途径而且有不同的生理功能,。和之间存在着微妙的动力学差异,在与其它的合成酶的耦合能力上存在不同,并且两者在内质网、核膜和核基质中的分布情况也不一样,这都是导致他们功能不同的原因。二者之间的定位与细胞类型有关,但总的来说被认为定位于细胞核外,而定位于细胞核内”°人类基因位于号染色体,长,由个外显子和个内含子构成,长。最初的研宄认为,在大多数组织和细胞中组成型表达,执行一系列持家功能(。在大多数物种中,胃部几乎所有的都是由催化合 中国农业大学博士学位论文第一章引言成的,胃部也有一部分组成表达的,但表达量很低,。胃部中的主要起到保护作用,增强粘膜血液流动,保护粘膜上皮,防止溃疡、出血等胃部疾病的发生。在肾脏中,机体正常情况下,对肾脏血流没有太大影响。当肾脏处于应激状态时(如充血性肾衰竭、肾功能不全),合成的增加,会使肾血管舒张,维持肾脏血流量,。在血小板中,只存在,它负责将合成,血栓素与血小板上的血检素受体结合,然后启动血小板形状改变从而聚集,通过这种方式介导止血反应。在中枢神经系统中,主要定位于小神经胶质细胞(,通过临床试验证明是神经炎症的主要参与者。启动子没有具有持家基因的特征,所以它被称作持家酶。虽然被认为是耐转录调控的,,但是有越来越多的研宄发现,可以被调控。有研究证明在流感病毒感染的小鼠模型中,而不是能促进的表达,并且控制炎症和体温反应。基质金属肽酶缺失的小鼠模型中,在巨嗟细胞中,通路会被补偿激活,负责增强血管的通透性。刺激星形胶质细胞后,能够通过依赖型通路上调下调,从而引起表达的升高。而肿瘤坏死因子有关的凋亡诱导配体能够上调髓系细胞系例如中的的表达而不影响,从而显著上调,。也有文献报道在体外实验中,很多有丝分裂原(、各种生长因子如神经生长因子(、成纤维细胞生长因子(,、血管内皮细胞生长因子(、烟草致癌物质(、佛波酯(、视黄酸(,以及组蛋白乙酰激酶抑制剂(都能够上调的表达也有研究报道一些激素能够上调表达’例如雌激素和孕酮(能刺激上皮细胞中的表达。与不同的是,基因被调控的机制研宄还不够充分,仅有几篇报道。年,等人报道,在人类启动子上存在转录因子可以结合的元件,组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(可以通过该元件刺激启动子,从而转录水平上调的表达；。雌激素刺激上皮细胞上调的表达,雌激素受体和转录因子贡献于这条通路,但二者之间是否结合以及相互作用机制并不清楚。在年,等研宄表明,在心肌细胞中,皮质类固醇(,能够激活糖皮质激素受体与转录因子相互作用,与启动子结合,从而激活其转录,在转录水平上调的表达,这几个例子表示,人类基因启动子转录起始位点上游不远处有一个富集区域,这个区域对于基因的调节有重要意义。 中国农业大学博士学位论文第一章引言的第二种形式被发现,其基因组被克隆,称为,这是近年来在前列腺素生物史中最重要的发现之一。人类基因位于号染色体,长,含有个外显子和个内含子,长。最初的研究认为,在大多数正常组织或静息细胞中并不表达,但随着研究发现在很多细胞组织中有一定的组成性表达,这与这些组织或细胞的功能有关。在中枢神经系统(,中,海马区和皮质谷氨酸神经元中有组成性表达,而这两者在突触活性尤其是长效突触形成中具有重要作用,,。由于肺部是一个直接与外界发生接触的器官,受到大量细菌、灰尘等刺激物的刺激。肺部为了应对各种刺激,保持着高于其他各器官的高水平同时研究也发现在肺部有较高水平的组成性表达,。在胃部和肾脏也可以检测到低水平的的表达。最初的研究认为,主要与炎症反应发生有关,很多炎症介质能够上调的表达,例如细胞因子、有丝分裂原、生长因子和致癌基因等都能够上调的表达,。然而,最近的一些研究显不在炎症的开始和治疗阶段均有作用。目前很多抗炎类药物都是以为点的,例如现在广泛应用的非固醇类抗炎药,,可以通过抑制活性从而抑制的产生,进而达到抗炎和止痛的目的。第三步：是合成级联反应中的末端合成酶,负责氧化环氧合酸产物成最终产物。该步反应也可以通过无酶催化,细胞通过还原性的谷胱甘肽作为辅助因子生成。等鉴别出第一个,约,属于超家族；这个蛋白现在被命名为,。不久,等纯化并克隆了另一个属于硫氧还原蛋白(家族被称为。等分离得到了功能性的。现有的研究证实,存在至少三种不同类型的分别为膜相关依赖型、膜相关非依赖型以及胞质依赖型广泛分布于各种组织和细胞中,定位在细胞核附近。是诱导型酶,许多促炎症反应因子都能诱导的合成例如等研宄报道高剂量的可以上调脑部及多种外周器官包括肺部和脾脏中的的水平而抗炎症反应的肾上腺皮质激素则可使下调。经过体外共表达实验发现,更多的是与核亚型的偶联在一起。在促炎因子的剌激下诱导的表达后与形成复合体进而催化合成,这部分解释了促炎因子刺激合成的延迟性,。尽管在花生四稀酸大量积累时也存在的偶联,但与的功能性偶联优先于。 中国农业大学博士学位论文第一章引言是等从牛的心脏微粒体中提取出来的一种新型是一种高尔基体膜相关蛋白。广泛分布于脑、心脏、骨路肌、肾脏以及肝脏中,但在精囊腺中没有表达细胞中的主要分布在胞质尤其是核周区含量比较丰富其发挥活性不依赖于,但对硫醇有显著的特异性需求。与可诱导性的不同,在不同细胞和组织中呈组成型表达,当局部组织发生炎症或是细胞损伤时的表达并不升高。然而在一些癌症病灶中如人的直肠癌,的表达明显上调。有趣的是,是唯一一种与两种蛋白均偶联的,在的合成过程中发挥重要作用。由此可见,不同类型的通过其与的不同偶联方式参与了的快速合成和慢速合成。是热休克蛋白的附属蛋白,广泛表达于睾丸、肾、心脏、脑等器官的细胞胞质中,,并且发现,在体外培养时,、和均不能刺激小鼠胶质细胞、成纤维细胞和上皮细胞上调。功能上与分布在核糖体膜上的偶联,的协同作用被认为是负责维持基础功能的的合成,以及应对销离子内流激动剂时迅速释放,。大量胞质型激活可导致胞质中的花生四稀酸浓度大量增加,此时可与协作将酶促反应来源的转化为。和发热最初的观念认为,在引起的发热中,细胞因子致热源应该能够直接运输到大脑,激起发热反应。然而在发热前后,脑脊液中并没有检测到这些可能的致热细胞因子。进一步研宄认为唯一可能的从外周将发热信号传递至脑部的途径就是神经元细胞。虽然诱导的可以激活迷走神经诱导发热丨,然而产生的速度明显慢于发热的发生。因此有理由推测存在另一种细胞因子能够应答直接介导发热,那么我们应该能够在发热之前或者同时,在脑脊液中检测到该细胞因子。而事实并非如此,细胞因子的产生速度远晚于发热。于是研究者认为有另一种因子能够迅速应答,并能够通过迷走神经引起发热反应。那么这个因子后来被证明是。 中国农业大学博士学位论文第一章引言深？八！十图发热产生的可能机制研究发现,静脉注射外源性致热因子(例如或者内源性致热因子(例如,都能够迅速上调外周血中含量。于是等在年提出这样的模型假设,不是细胞因子而是这个小分子脂类,它可能通过血脑屏障,到达下丘脑作用于腹正中视前核(区域,而引起发热。但是这种说法一直存在争议。等在实验中发现,在炎症模型中,通过在区域注射抑制剂,能够下调视前叶区域的水平,并降低体温,这表明有可能是该区域的导致发热,而不是外周血中的通过血脑屏障进入该区域而导致的发热。还有一种观点认为,外周器官所产生的可能通过直接刺激该器官的迷走神经将发热信号传递给大脑,最有利的证据是在迷走神经神经节上(有大量的受体。究竟是哪个部位的起到了引起发热的作用,到现在依旧存在争议,但是仍是外周导致发热最首要的触发分子。 中国农业大学博士学位论文第一章引言信号通路蛋白激酶几乎参与了细胞所有生命过程。丝裂原活化蛋白激酶(是细胞内的一类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。信号通路广泛存在于哺乳动物、植物和酵母等多种真核细胞中,负责将细胞外刺激信号转导至细胞内,然后将信号传入核内。参与细胞生长、发育、分裂和细胞间的功能同步等多种生理过程,并在细胞的恶性转化等病理过程中起重要作用,。级联反应的基本模式是高度保守的信号通路至少由三种蛋白激酶组成激酶的激酶)的激和。通过磷酸化的三级酶促级联反应,激活最终信号。通过磷酸化两个保守的丝氨酸残基来激活,通过隣酸化保守的苏氨酸和酷氨酸残基来激活。通过这一系列的级联反应将信号从质膜传到胞质和细胞核中,介导基因转录和蛋白的合成。家族包括个不同亚家族：细胞外信号调节的蛋白激酶；氨端激酶；丝裂原活化蛋白激；细胞外信号调节激酸又称。文献报道还有种样分子,分别是和。然而现有的研究并不能够确定这几个激酶是否也通过同样的磷酸化级联反应被激活,所以不认为它们属于家族。主要被丝裂原激活’而和级联信号可以被多种应激源、促炎细胞因子和炎症反应介质激活。几乎可以被上述所有的刺激因子激活。每一个级联反应的激活都需要一个小的结合蛋白(包括、或一个接头蛋白起始,它们负责将刺激信号从传递到,再依次传递到。其中和是这条通路的必须组成部分。和接头蛋白还可以直接将信号传递给起始级联信号通路。 中国农业大学博士学位论文第一章引言￡八广、丨、丨丨产、！：—！丨十一」、：“一十…」图级联反应家族中最早被发现的是的活化是将信号从细胞膜表面受体传递至细胞核的关键。的激活起始于外界刺激物与膜受体的结合,包括酪氧酸激酶受体(,、蛋白偶联受体(,和离子通道(,等。这些受体通过募集接头蛋白(或者转换因子(来激活位于细胞质膜或者其他细胞器膜上的。与此同时级别的激酶、和从细胞质转移到细胞质膜上,。通过憐酸化来激活从而继续传递信号,。激活的的端区域与结合并憐酸化通过经典基序人的是和的丝氨酸位点被隣酸化后激活。然后活化的接着隣酸化它唯一的底物的基序(人的的憐酸化位点为和,从而激活蛋白。激活的又可以碟酸化脯氨酸旁的丝氨酸和苏氨酸残基,和都是可以被识别的底物保守基序,但前者更为常见,。在这条级联信号中,对的激活机制目前并不清楚。最早发现的激活的激酶就是,包括和,两个蛋白髙度同源,同源性大于。 中国农业大学博士学位论文第一章引言的勒蛋白很广泛,到目前为止研宄发现,发现大约种不同的的磷酸化底物。最早被发现的的底物包括、细胞骨架成分(后续研究发现在调节转录因子、和,的激活方面也具有重要作用。通过经典的核转运信号(入核来完成对这些转录因子的磷酸化。在众多的底物中,有几个的加入延长了级联通路。最早被发现的是,在被隣酸化激活后可以再隣酸化等转录因子。禾口也陆续被发现属于,但是这些激酶不仅受调控,也可以被级联通路激活。到目前为止,是家族被阐述的最完整的和最清晰的信号通路分子,只需要短短几分钟的时间,级联反应将剌激信号由细胞外传递到核内。至少参与个磷酸化反应。信号通路通过激活一系列转录因子和改变蛋白活性,进一步调控细胞的代谢和生理功能。家族首先被鉴定的是一个的蛋白,随后家族其它成员陆续被克隆出来,分别是又称’和秘(、。几乎在所有细胞中都有表达,其余亚型则各自有各自的组织特异性表达。上保守的隣酸化基序为在信号刺激下,的酷氨酸位点能够迅速被憐酸化。三个双特异性的和磷酸化的苏氨酸和酷氨酸残基,其中可以憐酸化个家族成员,而能激活、和但是不能激活。和都是高度特异性激,只激活而不激活其他信号通路中的蛋白。但除了能激活夕卜,还能激活通路。除此之外,其他的对的激活还依赖于来自细胞核的信号。活化的能对底物的或者基序进行磷酸化,偶尔也有活化非相邻残基的报道。研究发现,可以激活的底物非常广泛,例如转录因子、、的亚基、或者核小体组蛋白的蛋白质并进一步发挥生理调节功能。 中国农业大学博士学位论文第一章引言蛋白激酶是一组激活的磷脂依赖性蛋白丝氨酸苏氧酸激酶,目前己蹄选出了的个亚型,分别是、、、、小、、。蛋白激酶是蛋白偶联受体系统中的效应分子,在非活性状态下是水溶性的,游离存在于细胞质中,激活后成为膜结合型的蛋白。而蛋白激酶的激活是脂依赖性的,需要膜脂的存在,同时又是依赖性的。当胞外第一信号通过受体激活憐脂酶(后,使膜磷脂分解,产生细胞内的第二信使和。动员促使内质网中释放到细胞质中与韩调蛋白结合。则在的协同下激活质膜上的,然后引起级联反应,产生细胞应答。实验证明,在生理条件下,只有与膜结合才具有活性。激活的可使多种蛋白(如代谢途径中关键酶、离子通道、调控基因表达的转录因子等)的丝氨酸、苏氨酸发生隣酸化,从而影响细胞内生物活动调控,在调节细胞代谢、分化、增殖及癌变中具有十分重要的作用。增强子结合蛋白细胞内一切生命活动包括分化、增殖、应对剌激等都伴随一系列基因的表达。这个过程受到被称为转录因子的蛋白通过结合启动子和增强子上特异性的序列调节紀基因。在各种病理条件上发挥重要的功能。第一个蛋白是由实验室发现,在大鼠肝脏细胞中,这种蛋白被认为是一种热稳定因子,能够结合多个基因的启动子上的盒子。基因首先在年被克隆,对其进一步的研宄发现其端还有基本锌指蛋白(,该锌指蛋白参与了一系列转录因子的调控,。至年,家族的其他个成员陆续被发现,所有这些蛋白的端都包含有一个保守的结构域。迄今为止,不同的实验室发现并命名了多个成员。,建议采用系统命名法对这些成员命名：以为家族名字,后缀以希腊字母代表发现的顺序。因此,家族一共包括、、、、和《等蛋白,。家族成员的共同特征蛋白质序列中包括个相似的结构：端的亮氨酸拉链(、端的转录激活域、中间的结构域。与其他异构体之间有一个高度保守的端序列(同源性。依赖亮氨酸拉链序列与其他蛋白形成二聚体结合行使起始转录功能最理想的结合序列是回文序列,这里可以是或者可以是或者由于亮氨酸拉链的保守性,家族之间能形成稳定的异源二聚体结构,但异源二聚体不能识别基因启动子上的基序,除以外,该二聚体能够结合一种序列：代表嚷呤。 中国农业大学博士学位论文第一章引言最早由发现因为该蛋白能够结合到和与之相类似的应答元件上序列为所以被命名为,。的能够编码种异构体全长的的、的和的和是细胞中主要剪切体。由于额外二硫键的形成,激活能力要弱于,然而端的延长使得能够募集与结合调控一些沉默基因的激活。通常能与其他蛋白形成无功能的二聚体从而负向调节信号通路。发挥转录激活功能依赖细胞中的存在、的比例、二聚体形成的方式等,。总的来说,、和在转录激活中发挥不同的功能。依赖的紀基因的激活还进一步取决于启动子结构组成、细胞组织的类型和种属差异。上存在很多调控区域,包括的转录激活域、结合域以及这两个区域前的负调控区域和。位于端激活域附近的调控转录激活；则与活性的细胞特异性相关。在单核细胞和巨嘴细胞中,可被多种刺激因子、促分化、增殖等信号调控表达。和通过激活启动子上的和结合位点促进的表达和的合成,。还能够作用于自身的启动子来调控自身的表达,而胞内、信号通路能够正向调节的转录。在人的细胞中,维生素通过激活、、增强和蛋白的表达水平而抑制反而能上调现。在小鼠淋巴瘤中,细胞因子如强烈上调的水平的表达,并且研宄发现在细胞中,是通过结合激活启动子上基序诱导表达的。信号通路促进的表达,而信号则被发现导致大量的产生。病毒的、或刺激巨睡细胞通过、、的激活增强表达。 中国农业大学博士学位论文第一章引言,备—着一圖讓￡‘‘,、图过信号调节诱导分泌的参与调节脂肪细胞、乳腺细胞、肝细胞、单核细胞的分化和增殖,参与脂肪和能量代谢,参与炎症反应和肿瘤的发生,调控病毒的转录复制。在发挥重要功能的同时各种信号通路诱导表达也受到严密的调控。随着对研宄的深入,我们可能更好的理解相关病理疾病的发生和调节,更好的理解细胞信号的调节与转导。 中国农业大学博士学位论文第一章引言研究目的及意义高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(于年首次在中国发现,除了与普通毒株一样导致母猪流产、小猪死亡外还以高热、高致病性、高死亡率为典型特征。发热对于感染性疾病造成的损伤和死亡具有重要作用。然而目前基本没有研究报道诱导的发热和高死亡率的关系,以及与普通毒株如在诱导发热程度不同的原因还很不清楚。虽然已有的研究证明前列腺素是导致发热的关键因子,且环氧合酶介导的酶促反应是合成过程中的关键限速步骤。但是引起高热背后的机制以及和在其中的作用目前仍不清楚。本文的研宄基于和在机体发热过程中的重要作用,以感染为模型,深入探讨如何诱导发热,初步阐明其中的分子机制。主要讨论的问题有：、造成的高死亡率与发热的严重程度是否相关？病毒体内体外感染后的表达情况如何？、诱导哪一种参与的产生？、作用哪些信号通路促进的表达上升？在抑制这些信号后和的表达发生什么样的的变化？、在转录水平上是被何种转录因子调控并增强转录？转录因子又是如何被激活并结合在启动子上？带着这些疑问,基于体外感染细胞,利用分子生物学、、、、等多种技术手段,对诱导发热的机制进行了初步探讨,为了解感染诱发高热的研究和抗病毒研宄提供新的启示。 中国农业大学博士学位论文第二章实验材料和研宄方法第二章实验材料和研究方法实验材料仪器二氧化碳培养箱和低温冰箱购置于热电(科技有限公司。型紫外交联仪,公司产品；分光光度计,公司产品；型倒置焚光显微镜,公司产品；流式细胞仪,公司产品；焚光定量仪,公司产品；焚光素检测仪器,公司产品；活细胞工作站,公司产品。主要实验试剂细胞分离与培养相关试剂：高糖型培养基,培养基,公司产品,。保存；青霉素和链霉素液(双抗,北京迈晨科技产品,保存；胎牛血清(,,美国公司产品,保存；胰蛋白酶溶液,北京迈晨科技产品,保存；二甲基亚砜,公司产品。焚光定量相关试剂：购自公司,常温保存； 中国农业大学博士学位第二章实验材料和研究方法以及购自公司,保存；反转录酶购自公司’°保存；购自公司,°保存。信号通路抑制剂：通路抑制剂,稀释；通路抑制剂以及,稀释；通路抑制剂,稀释；通路抑制剂,稀释；通路抑制剂,稀释；以上抑制剂均为公司产品。抑制剂购自公司’抑制剂购自。相关试剂：预染蛋白质分子量标准购自公司；抗体购自公司；,购自公司；,购自公司；购自公司。检测用试剂盒购自公司；柯达医用射线胶片购自柯达公司；膜(、购自。免疫焚光及流式细胞术相关试剂：来自二脒基苯基引噪,公司产品。载玻片以及盖玻片购自。抗焚光衰减剂购自碧云天。购自多聚甲酸购自国药。 中国农业大学博士学位论文第二章实验材料和研宄方法试剂配制细胞冻存液：胎牛血清、按照的体积比均匀混合。磷酸盐缓冲液(调值至,加去离子水定容至,高压灭菌。相关试剂：细胞裂解液：,临用前加入。丙稀酰胺：丙稀酰胺,甲叉双丙烯酰胺,定容于中,过滤后°于棕色瓶保存。：称取碱溶解于中,浓盐酸调值到,然后用水定容至,室温保存。,：称取碱溶解于中,浓盐酸调值到,然后用水定容于,室温保存。：充分溶解于中,加热至°助溶,室温保存。过硫酸铵(过硫氨酸,充分溶解于中,°保存,不超过两周。蛋白质电泳上样缓冲液(甘油；；溴酧蓝,充分溶解,过滤后分装于保存。蛋白转印缓冲液(碱,甘氨酸甲醇蒸馈水定容至。封闭液：脱脂奶粉,溶于中,加入叠氮钠,°保存。洗液中加入。封闭液：脱脂奶粉,溶于中,加入叠氮钠,°保存。其他试剂：水：加至,室温过夜后高压灭菌；将牛血清白蛋白,溶于中,混句后°保存； 中国农业大学博士学位第二章实验材料和研究方法型细菌脂多糖),公司产品。,公司产品。菌种及质粒大肠杆菌克隆菌株及原核表达菌株￡为北京天根生物技术有限公司产品。携带有启动子的原核表达载体为美国公司产品。大肠杆菌使用含有抗生素的培养基培养。异丙基硫代比喃半乳糖苗为美国公司产品。病毒和细胞实验中所用到的病毒有和毒株,均为国内猪场病猪的体内分离得到的病毒株。本实验所用到的细胞一株适于感染的猴肾细胞系来源于细胞)为本实验室保存。原代肺泡巨唾细胞的提取过程具体为：解剖周左右大的猪(购置于北京猪育种管理中心,在尽量干净的环境中取肺(在切断气管前用止血钳夹住猪的气管),在超净工作台中进行肺部灌洗；用缓冲液(加青霉素和链霉素)分批次缓慢灌入肺中(大约,每次对灌满的肺进行肺部按摩,收集所有的灌洗液,离心收集细胞；收集的细胞用培养液(加双抗)进行洗漆；重复洗漆次；收集细胞,进行细胞计数,最后用细胞冻存液重悬细胞,进行分装冻存(每管约个细胞。细胞培养和病毒感染细胞用培养液(加的胎牛血清,,温度下二氧化碳进行培养,用加了血清的培养液(进行培养。可传代的细胞系,在细胞长满后用胰酶进行消化(不同的细胞消化时间也不同,细胞消化左右),然后重悬进行传代。原代细胞在使用时先进行细胞复苏,方法为液氮中取出的细胞在°下迅速解冻离心收集细胞,重悬进行培养。在复苏过程中,细胞与液态的冻存液尽量短时间接触,以防止对复苏细胞造成影响。病毒在感染细胞时,°融化后取一定量的病毒先与细胞吸附少量培养液,然后按实验需求补加培养液继续培养。 中国农业大学博士学位论文第二章实验材料和研宄方法病毒的检测方法将铺在孔板中,每孔左右,在恒温培养箱中培养将待测病毒液倍比稀释(一般是倍,将稀释好的病毒液接种到孔板中,每一个稀释度接种排个孔,每孔接种可自己选择接种量),用培养液补加到进行培养。每组设置对照组(即正常的细胞不接种病毒,观察天,然后进行统计。对有细胞病变出现的空确定为阳性孔,计算每个稀释度下的阳性率。最后用两氏法或法进行结果统计。两氏法：距离比例高于病变率的百分数高于病变数低于病变率的百分数)距离比例稀释度对数之间的差高于病变率的稀释度的对数法：：最高稀释度的对数稀释度对数之间的差阳性孔比率总和实验动物周龄大小的小猪,饲养在环境中,给予光照黑暗的节律环境。饮用水和食物为清洁级。所有对实验动物的操作符合中国农业大学实验动物条例和伦理要求。实验方法繁毒细胞和原代的猪肺泡巨唾细胞(用来繁殖病毒和进行实验。具体的步骤为或在细胞培养瓶中培养成单层细胞,弃去部分培养液,将适宜浓度的病毒悬液接种于细胞上接种在细胞上,接种在上,吸附后补加培养液至适宜体积,在二氧化碳培养箱中进行培养。每隔一定时间观察细胞是否发生病理变化(细胞獨亡明显或大面积脱落),有明显病理变化后,将细胞和细胞悬液放置于低温冰箱中,反复冻融次,离心收集上清液,用滤器过滤后分装于保存待用。 中国农业大学博士学位第二章实验材料和研宄方法病毒紫外灭活将病毒液置于型紫外交联仪中(公司产品),用强度为的紫外照射。将灭活病毒接种于细胞,一组细胞于后通过间接免疫荧光实验检测病毒感染情况,结果显示无明显荧光；另外一组细胞继续观察,天仍未出现细胞病变,表面病毒已经被完全灭活。攻毒以及体温检测将周龄大小的猪随机分成两组,每组只。鼻腔滴注攻毒。每天下午用温度计检测小猪直肠温度,每只检测次,取平均值,直至小猪死亡。和血清的获取猪血浓的制备：于攻毒感染后的第、、天抽取猪静脉血,加入消炎痛(处理,加抗凝剂。并以离心吸取上层血桨。于冻存备用检测含量。的制备：感染小猪后第天,小猪生理状态表现很差,临床症状表现为精神沉郁、进行性消瘦、呼吸急促、被毛粗乱、皮肤发红,即将死亡的时候进行尸检,以灌洗肺部获取肺泡支气管灌洗液》于冻存备用检测。原核表达质粒的构建及原核表达通过序列比对得到猪序列中的保守序列,这段序列处于蛋白序列的端,序列为通过全基因合成技术合成含有三段重复的端氣基酸序列对应的核苷酸序列,每段之间以五个甘氨酸作为连接。合成前,针对大肠杆菌对密码子使用的偏好性对核苷酸序列进行优化。序列优化不仅去除了稀有密码子,将优化后的蛋白核苷酸序列亚克隆到原核表达载体上,命名为。将重组质粒酶切鉴定后送去生物公司测序。鉴定正确的重组质粒提取纯化,转化进入感受态细胞中,使用诱导重组蛋白的表达,浓度为诱导温度为°°,诱导时间为。待诱导结束,离心收集菌体,磷酸盐缓冲液(清洗菌体遍,使用重悬菌体。在超声波破碎仪中将菌体超生破碎,离心,上清中包含经诱导表达的可溶性重组蛋白,沉淀中包含经诱导表达的包涵体重组蛋白。参照使用说明,在柱上进行纯化。步骤： 中国农业大学博士学位论文第二章实验材料和研宄方法、在收集的菌体中加入左右洗液重悬。、转移菌体至烧杯中,置于冰上,进行超声破碎次两遍。条件：约,工作,歇,其间不时晃动烧杯。同时预冷离心机。、,离心。弃沉淀,留上清,上清用滤膜过滤。、在°的条件下,将过滤后上清与柱充分结合。、将洗液加到柱上,对柱上结合的杂蛋白进行清洗,一直洗到无杂蛋白,约洗液(洗的过程中用蛋白显色液检测洗下来的液体)。、然后加入目的蛋白洗脱液,与柱充分混合,然后开始洗脱目的蛋白。将洗脱下的目的蛋白每—管进行收集,每管取到蛋白显色液(中检测目的蛋白浓度。将浓度较大的管进行合并,用进行蛋白质量和浓度检测。、将纯化蛋白用超滤管进行超滤浓缩。多克隆抗体制备纯化后的蛋白与不完全弗氏佐剂)混合,用乳化器充分乳化后,取一小滴,滴在无菌水中检查乳化效果,液体在水面漂浮不扩散表示乳化完全。将乳化完全的蛋白皮下注射小藏。每隔天注射一次,注射次。最后一次注射天后采集小鼠血清。离心后°保存。抗体亲和性用方式检验。以纯化后的蛋白和感染后的为样品上样检测,以不同稀释梯度的小鼠抗血清和商业化的抗体为对照。进行蛋白免疫印迹实验。流式细胞术检测胞内蛋白表达情况接种后收集细胞方法同上。然后用多聚甲酸固定,离心收集细胞。阜素处理后用洗漆细胞,向细胞沉淀中加入用含的稀释的小鼠抗蛋白单克隆抗体,室温僻育。用洗涤细胞后,加入用含的稀释的焚光二抗艘育。再次用含的洗漆细胞,然后将细胞沉淀用重悬,内用流式细胞仪检测,结果用软件分析。同时将培养相同时长但没有接毒的作为对照。 中国农业大学博士学位第二章实验材料和研宄方法实时定量总的提取：釆用公司的总提取试剂盒提取中的总,提取步骤具体如下：、使用前每裂解液加入巯基乙醇。倒掉培养基,每孔加入丨裂解液至细胞培养板中,吹打裂解细胞,旋祸震荡。、收集裂解液到离心管中,加入等倍体积乙醇(至裂解液中,吹打混匀。、将柱子套在收集管中,转移混合液至柱子中。室温,￡离心弃去滤液。、把柱子套放在新的收集管中,加入至柱子上,按以上条件离心,弃去滤液,把柱子套放回收集管中。、消化。配置消化液(,混匀。将上述消化液转移至柱子膜的正中央,不要将消化液转移至柱子内壁。室温静置。、加丨至柱子,按以上条件离心,弃滤液。、把柱子套放回收集管中,加至柱子上,按以上条件离心,弃滤液。、把柱子套回新的收集管中,加至柱子上,按以上条件离心,弃滤液。、把柱子套回收集管中,离心空柱以甩干柱子基质。、把柱子装在离心管上,加入水至柱子基质上,室温静置离心洗脱出。浓度和纯度的测定： 中国农业大学博士学位论文第二章实验材料和研宄方法、按仪器操作说明运行分光光度计,先用水清洗电极,背景值清零；、每个样品取进行测定；、记录下数值。当比值在均可用,而小于说明含蛋白较多,大于可能有降解；—般大于均可,小于说明有小分子杂质(如盐分子等。总的反转录反应：采用作为下游引物,操作参照反转录酶使用说明进行。、在离心管中加入以下组分,混勾离心。反转录酶总体积、离心混匆,于仪中反应,反应程序为：°反应,°反应°反应,°保存。所得稀释后可直接进行实时定量反应或者°保存备用》引物设计及合成：目的基因和以及以及内参基因的引物由北京华大基因合成。序列如下表： 中国农业大学博士学位第二章实验材料和研究方法表实时定量反应引物序列引物名称接着按照下列组分配制反应液：模板总体积用荧光定量仪进行反应,反应条件为：：预变性；。,°共个循环；溶解曲线分析。以分析实验数据。信号通路抑制试验分别用或者不同浓度的信号通路抑制剂预孵育通路抑制剂,终浓度为；抑制剂,终浓度为至抑制剂终浓度为：抑制剂,终浓度为抑制剂终浓度为抑制剂,终浓度为然后在有抑制剂存在的情况下以接种毒株。病毒感染后,收集细胞并通过检测的水平或者收集细胞总蛋白通过检测和其它蛋白的蛋白水平；同时收集细胞上清液用于检测其中的水平。 中国农业大学博士学位论文第二章实验材料和研究方法实验检测蛋白和信号通路转录因子等分子的表达：收集细胞蛋白样品,裂解液加入蛋白酶抑制剂(和。每孔加入适量预处理的裂解液,收集裂解液到离心管中,冰上孵育充分裂解细胞后于,°离心,吸取上清至另一离心管中。并做蛋白定量(公司产品)、制胶：安装垂直电泳板,先后灌注分离胶和浓缩胶；、样品处理：调整样品蛋白浓度一致后,取样品含总蛋白,与的上样缓冲液混合,煮沸、上样：上样前°离心,将蛋白和样品依次加入上样孔,每孔上样体积相同,剩余孔以上样缓冲液补齐体积；、电泳：在浓缩胶部分以恒压进行电泳,进入分离胶后以恒压进行电泳,直到溴紛蓝染料前沿跑至胶底边缘上、转膜：取的膜在甲醇中浸泡处理后将胶和膜一同浸泡在转膜缓冲液中；从电转仪的阴极依次按照海绵一一三层滤纸一一胶一一膜—三层滤纸—海绵的顺序排好,清除气泡,夹好,置于转膜液中；以恒流电泳、封闭：将膜浸泡在的脱脂牛奶中,室温封闭、一抗解育：分别加入稀释的抗体,室温赔育、二抗孵育：用洗膜,,次；力口次,然后加入稀释的标记的羊抗兔多克隆抗体或羊抗小鼠多克隆抗体孵育,室温、化学发光：用洗膜,次,次。然后按照试剂盒(公司产品)实验步骤操作；压片曝光检测。 中国农业大学博士学位第二章实验材料和研宄方法启动子和突变质粒的构建为了找出的哪个功能区参与了病毒诱导的产生,通过扩增出启动子全长和各个截短片段,然后通过酶切位点和连接入焚光素酶报告载体。启动子区域克隆引物如表所示。得到的的启动子序列(至后亚克隆至焚光素酶报告载体载体,命名为。将截短突变的启动子序列分别克隆进焚光素酶报告载体构建截短鹿粒所用引物如表所示。表构断貭粒所用引物引物名称引物序列表注：边框代表酶切位点。核酸代表转录起始的位点上转录因子结合序列突变载体利用巢式以为模板,特异性引物序列为：；,其中小写字母代表突变的核酸碱基。质粒小量提取质粒提取参照无内毒素质粒小量提取试剂盒说明书。、将过夜培养的菌体于离心弃去上清。、将留有菌体的离心管中加入,用移液器充分混句,悬浮菌体沉淀。、向离心管中加入,温和的上下颠倒混勾次,使菌体充分裂解,室温静止溶液应变得清亮粘稠。、向离心管中加入,此时上下剧烈震荡混句,出现白色絮状沉淀,室温放置离心。 中国农业大学博士学位论文第二章实验材料和研宄方法、吸取上清加入异两醇,上下颠倒混勾。、柱平衡：向加入吸附柱的收集管中加入,,离心,弃去滤液,将吸附柱重新装入收集管。、将步骤中的混合溶液转移至吸附柱上,离心,将吸附柱重新装入收集管。、向吸附柱中加入,离心,弃去滤液。、重复步骤后,,离心弃去滤液,将吸附柱置于室温干燥。将吸附柱转移至新的收集管,向吸附柱中加入的或无菌水。室温放置离心。将质粒溶液收集。取样品检测质粒浓度和质量。并于°保存。质粒转染实验将细胞均勾铺在孔培养板上,待细胞密度至时进行转染实验。分别将截断突变质粒和代表双点突变焚光素酶质粒)提取纯化后,使用试齐公司产品)将质粒转染到细胞细胞中。转染后将细胞置于无菌培养箱,°、条件下培养后换液。接毒。后收集细胞,提取裂解液进行双突光酶活性报告检测。双焚光素酶报告检测试验实验进行按照双焚光素酶检测系统试剂盒说明书进行。此系统能够同时检测一个样品的两个焚光素酶报告基因活性。并由于共转染辅助基因的活性使得检测结果正态化,减少非特异性读数。、弃去培养基,洗漆次,弃去后加入裂解液。每个孔板一个孔加入体积。、室温条件下,温和的上下摇晃,在微型振荡器上震荡,使细胞充分裂解后转移裂解液至离心管中。、离心可选),取上清用于发光测定。、发光测定前,将平衡至室温。、设置发光测定仪器。取待测样品加入测量用离心管底部,小心不要带有气泡。 中国农业大学博士学位第二章实验材料和研究方法、取加入并小心混合。记录的发光单位。信号持续大约。取丨的试剂加入。将上述反应淬灭,同时启动海肾焚光素酶反应。检测活性单位。、分析数据。试验满足以下四点的能够达到较高的基因沉默效果：、的’端为、的’端为。、的端的个碱基中至少有个。、序列中没有连续个以上的片段。特异性序列设计和合成委托吉玛生物公司,并以带焚光标记的非特异性：为对照。一共有三条,序列为：、和。使用转染的步骤：、转染前一天,接种适当数量的细胞至？细胞培养板中,使细胞密度能够达到；、对于每个转染样品,按如下步骤准备混合液；稀释转染试剂使用前将转染试剂轻轻摇勾,然后取适量,用不含血清的优化培养基稀释,轻轻混和,室温辉育稀释用稀释轻轻混和；稀释好的经过的孵育后,与上述(稀释好的轻轻混和,室温静置以形成混和物。其间将细胞培养上清换为无血清无双抗。、将混合液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中,轻轻摇晃,使之混和； 中国农业大学博士学位论文第二章实验材料和研究方法、将培养板置于°的培养箱中培养至检测时间(。转染效率的检测：转染目的的同时转染,并在转染后焚光显微镜下观察转染效率。沉默效率的检测：转染和后检测目的基因表达蛋白的蛋白水平。激光共聚焦、做细胞爬片,注意：洗片子的和固定用的多聚甲酸一定要新鲜配制的(一周以内的都能用),因为和多聚甲酸放久了后,都会有自发焚光。、固定,破膜：细胞感染后用洗绦遍。用多聚甲醛室温固定洗次,每次。破膜。洗次,每次。、封闭：采用的马血清封闭,室温。、抗体的解育：根据文献和经验设定一抗的浓度(—抗室温孵育然后洗次,每次。、二抗孵育时要避光(,解育好后用充分冲洗,洗次,每次。、做好以上步骤后,将玻片取出来倒扣在滴过抗焚光衰减剂的载玻片上,小心用透明指甲油封片,注意不要移动玻片。将封好的载玻片样品转移至荧光显微镜下观察。不能马上观察可将样品保存于。、拍好的图片利用软件进行分析。检测量检测试剂盒购自公司(,具体操作详见试齐！盒说明书。细胞组分核质分离利用核质分离试剂盒(公司产品)分离细胞质和细胞核蛋白组分。具体步骤参照说明书。实验前和均加入蛋白酶抑制剂的和。蛋白酶抑制剂和由试剂盒提供。 中国农业大学博士学位第二章实验材料和研宄方法、用细胞刮伊收集细胞到离心管中,,°离心。、加入,剧烈震荡在冰上冰浴。、加入■丨冰浴的震荡器上剧烈震荡,冰浴。、润旋震荡,最大转速,离心。、立即转移上清(此为细胞质提取物)到预冷的离心管中,冰浴。、用预冷的核提取缓冲液重悬沉淀》、祸旋振荡,放置于冰上。、每隔重复步骤共冰浴。、立即转移上清至预冷的离心管。并放置冰上。提取物储存于待用。染色质免疫共沉淀试验(、细胞的复苏与处理、复苏于孔板,换液、复苏后,取其中一孔将细胞用细胞刮产刮下,进行细胞计数孔板一个孔约为个细胞。每孔接入病毒毒液病毒毒量为进行畔育,后补液至、细胞的固定与破碎在这段时间中,配制中需要用到的一些试剂。固定溶液：将浓度为的甲醛加入到中,充分混勾,并置于室温一段时间。溶液将与充分混勾,置于冰上。、甘氨酸解除固定溶液：甘氨酸缓冲液、和充分混勾,并置于室温。 中国农业大学博士学位论文第二章实验材料和研宄方法细胞刮除溶液：将与充分混合,置于冰上。、病毒刺激细胞后,将上清细胞弃掉,每孔加入固定溶液室温,摇床孵预。、将固定液弃掉,每孔加入冰预冷的,摇,弃掉。、每孔加入甘氨酸解除固定溶液,室温,摇床。、将解除固定溶液弃掉,每孔加入冰预冷？,摇,弃掉。、将细胞刮除溶液中加入的的终浓度为。每孔加入处理过的细胞刮除溶液,用细胞刮伊将细胞刮下。收集至个离心管中,。、离心,。、弃上清,用冰预冷的裂解缓冲液(加入蛋白酶抑制剂和轻轻上下颠倒混勾,并短时润旋震荡重悬,置于冰上在这期间准备工作液将母液(用甘油稀释倍,制成工作液该工作液可以在°保存周。、将细胞转移至的杜恩斯玻璃勾菜器。上下捣下,取少量置于显微镜下观察,大部分细胞已经破碎,细胞核成黑色点状,周围有细胞碎片,有少量细胞完整。注意在上下揭匀的过程中要慢,尽量减少泡沫的出现以及由此造成的损失。、将杜恩斯匆柴器中的细胞转移到离心管中,。、离心。、仔细去掉上清用的消化缓冲液加入的蛋白酶抑制剂与的将含有细胞核的沉淀重悬,并置于°。、将的工作液加入到已经预热的细胞核重悬液中,祸旋震荡混匆。置于°每短时祸旋一次。、后加入冰预冷的来终止酶切反应,置于冰上。、°、离心,小心将上清转移至离心管中,该上清中含有被酶切碎的染色质。 中国农业大学博士学位第二章实验材料和研宄方法、取出于°：冻存,留下用于解交联并检测浓度。解交联的步骤为：染色质溶液于°过夜；加入丨后于°温育加入蛋白并于°辉育；加入酷仿抽提并最大转速离心；转移水相至新的离心管中；加入…的乙酸钠和的无水乙醇,祸旋混句,静置至少；最大转速离心弃上清,加入乙醇,不要将沉淀悬起,吸干后溶解,琼脂糖凝胶电泳实验检测酶切效率。、免疫共沉淀、将被切碎的染色质转移至离心管中,留作组。、按照表格将反应中各组分加入到桂化处理过离心管中,根据之前的浓度来计算加入的染色质的量。磁珠在加入之前一定上下颠倒混勾。表格反应体系试剂实验组对照组表注：根据实验需要,反应中染色质的量可以在。、将离心管置于上下颠倒至少通常过夜。、离心,将管盖上的物质离下,将离心管置于磁棒上,将磁珠聚集。然后小心弃掉上清。、洗磁珠、用缓冲液洗磁珠一遍。用缓冲液洗磁珠两遍。、在最后一次洗的时候,尽量去掉除磁珠以外的洗液。 中国农业大学博士学位论文第二章实验材料和研究方法、将染色质洗脱,解交联和用蛋白酶处理、用洗脱缓冲液将洗好的磁珠重悬。、在室温条件下,上下颠倒混句。离心,将离心管盖上的残留物离下。、加入解交联缓冲液,用移液枪上下吹吸混勾。将离心管置于磁棒上,使磁珠聚集。、将含有染色质的上清转移至一新离心管中。、在这步中加入组,在中加入缓冲液和,终体积为。、将和样品置于°。、恢复室温后,短时离心,加入蛋白酶,充分混句,°。在此期间,将蛋白酶终止液置于室温、恢复室温后,加入蛋白酶终止液。、将上述液体用纯化回收试剂盒进行纯化与回收,最终溶于中。、回收后的进行检测。检测用引物如表所示。 中国农业大学博士学位第二章实验材料和研究方法表格检测用引物表——统计学处理利用软件进行数据分析和统计。每组实验至少包含三次重复,实验结果用检测以及单因素方差分析进行统计学分析,认为差异显著。利用皮尔逊分析进行相关性分析。 中国农业大学博士学位论文第三章通过通路上调从而导致上升第三章通过通路上调从而导致上升实验结果与分析感染能够上调水平感染后体温与其死亡天数呈负相关在感染成熟母猪、后备母猪、新生和哺乳仔猪以及生长肥育猪后,均能导致病猪体温升高。发热是把双刃剑,发热在一定范围内可能有利于宿主抵抗感染,中高度以上的发热可能会使重要代谢过程受阻而导致机体死亡。年在中国爆发的高致病以高热和高致死率为主要特征。因此我们分析了感染病猪的体温与死亡时间的相关性。用的病毒液滴鼻感染周的小猪,每天下午点钟对小猪进行直肠体温检测,连续周,记录并分析感染后期体温与死亡时间的相关性。结果显示,小猪在感染的天后开始出现死亡。我们选取了感染后期第天的头小猪体温并结合它们的最终死亡时间进行相关性分析。轴代表感染小猪的死亡天数,轴代表感染后期第六天的小猪体温(图,通过皮尔逊积矩相关系数来判断二者之间的相关性。结果显示感染后期第天的小猪体温与它们的最终死亡时间皮尔森相关系数,表明二者呈中度负相关性,即感染小猪第六天的体温越高,死亡时间越早。暗示小猪体温与引起的死亡之间存在一定的相关性。图小猪感染后期第六天的体温与其死亡天数相关性分析在体外感染上调表达通过之前的研究发现感染导致病猪发热与其死亡有一定相关性。那么发热的原因是什么,具体是什么导致了体温升高？之前有研宄表明,前列腺家族成员之一是外周发热最 中国农业大学博士学位第三章通过通路上调从而导致上升首要的原因。因此我们想检测感染后随时间变化的动力学曲线,检测是否影响了的表达水平。在体内体外感染的主要祀细胞为,于是我们用的病毒量体外感染细胞,分别于感染后、、、、和收取细胞上清,并通过试剂盒对每个时间点上清中的的含量进行检测。结果如图所示,感染后能够显著上调上清中水平,感染后上清中的水平随感染时间延长而增加,持续到感染后±约为不感染组倍。在毒株的感染上清中我们检测到相似的结果,毒株也能够刺激分泌。这说明体外感染的确能够导致细胞分泌的水平上调。并且有趣的是感染后时组上清中水平(±是组(±的倍,这说明较能够引起更高水平的,这与临床上感染的小猪体温更高更持久的现象相一致。暗示了较能够引起更强烈的发热反应的原因可能就在于感染后诱导分泌能力的不同。■§图和感染后上请中的动力学曲线分别用的和感染体外培养的细胞,分别于感染后、、、、、采集细胞清,用方法检测清的含量。,,, 中国农业大学博士学位论文第三章通过通路上调从而导致上升感染小猪能够上调外周血及肺泡灌洗液中水平体外实验表明的感染能够上调的表达,接着我们想验证在体内结果中是否也是如此。我们分别在感染后、、天采集病猪血架,通过检测血架中水平。结果如图,感染早期和天,血奖中水平有明显升高,在第天为士第天的含量为±。由于感染的主要器官是肺部,于是我们也采集了病猪临死前肺泡灌洗液(,与未感染的猪相比(±,感染了的病猪肺泡灌洗液中的水平(±显著升高约倍(图。虽然我们没有检测毒株感染小猪后血楽和中的表达水平,但是根据图的结果,可以推测的是毒株能刺激体内表达的含量可能也低于感染的病猪肺泡灌洗液和血架中的水平。￡—厂°了卞■—￡■〒卞。““田感染小猪后血菜及肺泡灌洗液中的变化用感染小猪,分别于感染后、和天采集血菜样本,并在采集时在血架中加入消炎痛,并在病猪临死前采集肺泡灌洗液样本,通过检测血架(及肺泡灌洗液(中水平。,, 中国农业大学博士学位第三章通过通路上调从而导致上升感染上调的水平通过之前的体外及体内实验,我们证实了感染后能够明显上调和肺泡灌洗液中的水平。而己有的研究证实在的合成通路中,和是该通路的最关键限速酶,因此为了探究感染诱导的升高是否与的表达水平有关,如果有相关性,是哪一种酶参与其中,我们用的病毒量去感染细胞,分别于、、、、收取细胞并提取细胞总通过实时定量技术确定和的水平的动力学变化情况。结果如图,感染后能够显著上调细胞中的水平,与未接毒组相比,在、和时分别有、和倍的升高。而感染后,细胞中的水平变化并不明显,仅在较未接毒组有轻微下调(图。为了研究升高与病毒毒量之间的相关性,我们用梯度数去感染细胞检测时,细胞中的表达情况,如图,的上调与感染的毒量成剂量依赖型关系。感染细胞的病毒量越多,在同一时间点诱导表达水平也相应越高。为的病毒量感染组相比于未接毒组有倍的提高。以上结果表明感染后的确能够上调中的水平。‘一一“二广门」一°￠—图感染后能够显著上调的水平分别用的或者等量的紫外灭活病毒感染细胞,用实时定量检测在感染后、、、、和的水平。(的检测与(—样。(以,的分别感染。后提取细胞总并利用实时定量检测 中国农业大学博士学位论文第三章通过通路上调从而导致上升的表达水平。,,,,同时我们也检测了同样条件下的毒株感染对细胞中的和水平的影响。如图感染后同样能够明显上调细胞中的的水平,但与不同的是,感染后能够迅速显著下调的表达,感染后下调至。■‘丄—图毒株感染上调的表达用的毒株)感染细胞,用实时定量技术检测感染后、、、和时细胞内和的水平。结果以为内参,以倍数表示变化情况。’’,多克隆抗体的制备重组质粒原核表达及重组蛋白原核表达与验证为了检测的蛋白表达水平,首先要制备抗猪的多克隆抗体。将设计好的猪抗原序列送于公司进行大肠杆菌密码子优化,优化后的序列在大肠杆菌表达菌株中可以高效表达。将合成后的序列克隆并构建到原核表达载体上,新构建的质粒命名为 中国农业大学博士学位第三章通过通路上调从而导致上升将鉴定正确的重组质粒转化进入感受态细胞中。使用诱导重组蛋白表达。后结束诱导,离心收集菌体,用将菌体清洗遍,然后用将菌体重悬。用超声波破碎仪将菌体破碎,然后离心,留上清(含有可溶性重组蛋白)和沉淀。利用柱将诱导表达的可溶性重组蛋白纯化出来,电泳检测。如图所示,在附近观察到目的蛋白条带,而没有转化质粒的￡对照、转化了空载体的对照组以及转化了但未诱导的对照组均未检测到相同大小的蛋白,以上结果说明重组蛋白在￡中表达成功。进一步实验发现,该重组蛋白在超声产物上清和沉淀中均有分布(图,并且大部分表达在上清中,说明大部分以可溶性蛋白形式被表达出来。通过亲和层析将可溶性重组蛋白纯化出来,如图所示,经电泳检测,只观察到单一条带,说明纯化出的重组蛋白纯度较高。；陳域上▲二亀！補‘：画垂—■■■匿漏醫丽疆吣—醫臺靈■：禱麵售围电泳检測重组蛋白表达将蛋白变性处理后在的胶上分离,然后用转膜系统将蛋白由胶转移至膜上。用商业化的标签抗体对该蛋白进行鉴定。如图所示,在附近得到到了阳性条带。图验证表达情况重组表达的蛋白和未感染的细胞蛋白上样跑胶(,验证标签表达。 中国农业大学博士学位论文第三章通过通路上调从而导致上升小鼠免疫及采血将纯化的重组蛋白作为免疫抗原分别对周龄的小鼠进行免疫,一共分三次免疫,每次相隔周,第三次免疫后天眼球少量采血用间接方法测定其血清效价,效价合格后,在最终摘眼球采血前天用纯化的重组蛋白经皮下注射进行加强免疫。具体免疫程序及佐剂见下表。表小鼠免疫程序免疫次数免疫方式抗原剂量(首次免疫皮下多点注射只等体积弗式不完全佐剂二次免疫皮下多点注射只等体积弗式不完全佐剂三次免疫皮下多点注射等体积弗式不完全佐剂小鼠免疫后血清效价测定及验证用抗原包被液将重组蛋白稀释至用稀释后的抗原包被孔板,°过夜。溶于？洗涤三次后,的脱脂牛奶于°封闭。将小鼠血清从开始倍比稀释,以未免疫小鼠血清做阴性对照,加入孔中进行效价检测。结果如表。免疫小鼠产生的抗血清效价大于。表小鼠最终血清效价将表达的重组蛋白进行电泳,转膜后进行鉴定,分别将血清进行梯度稀释,进行抗原抗体检测。如图,显示制备的多克隆抗体血清能与重组表达特异性结合。 中国农业大学博士学位第三章通过通路上调从而导致上升图检测抗血清有效性不同稀释度的抗血清检测重组蛋白。感染能够上调蛋白水平的表达之前的研究表明,感染后能够显著上调细胞中的水平。接下来,我们用的方法对感染后细胞中和的蛋白水平进行检测。分别用的、病毒感染,分别在感染、、、和收集细胞总蛋白,通过对蛋白变化情况进行检测。结果如图所示,感染后,的蛋白水平从开始上升一直持续到。而的蛋白水平在之未出现变化,从开始稍微下调。在毒株感染组,我们看到相似的蛋白变化水平(图但不同的是,在感染早期就出现下调一直持续到,且下调幅度明显,这也与其水平变化趋势基本一致。—讀膽、為—图检測感染后和的蛋白水平分别用和感染细胞。于感染后、、、、、时用裂解液裂解细胞提取细胞总蛋内。以为内参,采用方法检测和蛋白的表达水平。,,,,,为了进一步验证病毒感染后对和的影响,我们用同样毒量的感染细胞,时收取细胞,通过流式细胞术检测胞内和的蛋白表达水平。如图所示,在感染后蛋白水平上调(未感染组为土感染后 中国农业大学博上学位论文第三章通过通路上调从而导致上升为±图但是图基本没有变化。同时我们发现几乎所有的细胞都有表达这表明在中是组成型表达的,且和之前的实时定量及结果相符合,说明在中本底表达量较高。一—伽“囊■。,》——丁———“—图上调中丨的表达感染细胞,时收取细胞,通过流式细胞术检测〗和的蛋白水平。流式细胞方图结果代表图。(表达的平均焚光强度统计结果。(表达的平均焚光强度统计结果。,能够通过上调引起表达升高之前的研究证实感染后能够显著上调的和蛋白水平。是合成中的关键限速陶。下一步,为了验证感染后是否通过上调而引起表达升高,分别用的特异性抑制剂(和的特异性抑制剂塞来昔布(预处理预处理后接种。感染后,收集细胞上清,用检测上清中含量。结果如图与先前结果一致,病毒感染后能够显著上调上清中含量(士,预处理后能够显著抑制 中国农业大学博上学位第三章通过通路调从而导致丨,口？」〗卜升调的,在的的浓度条件下与未处理对照组相比抑制效果为士；在的浓度下抑制效果为左右(士。接着我们用与图一样的处理方式,以梯度浓度的预处理,在感染后收集上清检测表达情况。结果如图,在浓度为的情况下,感染诱导分泌的能力被强烈抑制(感染组±抑制剂预处理组土下降程度为。而且对最终合成的抑制效应从至越来越强,呈明显的剂量依赖性。一！：：‘图能够通过引起表达升高预处理不同浓度的抑制剂和抑制剂预处理后以感染丨丨。感染；时收集上清检测：；表达。(预处理不同浓度的抑制剂和后以感染丨丨感染后时收集上淸检测表达。之前的研宄证实,的上调水平与感染的病毒毒量有关,所以为了进一步证明是通过抑制了的酶活而不是抑制了病毒的复制导致下调,我们用不同剂量的预处理细胞,通过实时定量检测感染后细胞内的病毒拷贝量,如图,我们看到,当的处理剂量高达的时候,仍几乎不影响在细胞内的复制,通过图我们认为,感染后通过上调从而导致上升。 中国农业大学博士学位论文第三章通过通路上调从而导致上升一由：：§“图抑制剂不影响病毒在中的复制预处理不同浓度的抑制剂、和,后以感染。感染吋收细胞,提取细胞总并用检测胞内拷贝量。代表。通过信号通路诱导表达为了进一步确认哪些信号通路参与了对的调控,选用了种经典信号通路抑制剂,对这些信号通路封闭后再检测对的调控来判断哪条信号通路参与该其中。我们选用了抑制又称蛋白激酶,属于信号通路抑制剂；为通路抑制剂,抑制为通路抑制剂；是一种常用的通路抑制剂,它可以通透细胞,抑制,从而抑制后续的和的激活；为信号通路抑制剂,它可以抑制的隣酸化。接下来,分别用这种通路抑制剂预处理,后接毒(,在感染后收取细胞,提取总,通过对的水平进行检测,并提取细胞总蛋白,通过检测的蛋白水平变化。同时收集细胞上清,通过检测上清中的含量。 中国农业大学博士学位第三章通过通路上调从而导致上升结果如图,抑制剂)和抑制剂)能够在一定程度上抑制所引起表达的升高,且通路抑制效果更显著±倍。结果显示除上述两种通路抑制剂以外,信号通路抑制剂(也能够抑制的蛋白水平,但它并不调控的水平(图。那么抑制剂对于分泌的影响是怎样的？结果显示了这些通路的抑制剂在对下游产物的影响,我们可以看到结果与和蛋白变化情况基本一致(图。对的抑制效果非常明显(±低于水平。因此可能除了抑制的表达外,也能够影响等其他参与合成的酶类的表达。工丄。‘■■■■￡；；；：：；；、⑴—图诱导表达依赖通路预处理不同信号通路抑制剂：；：,或者：后感染,。技术检测不同抑制剂处理后细胞中的水平。(蛋白质免疫印迹检测同抑制剂处理后细胞中的蛋白水平表达。(感染后收集细胞培养上清,检测上清中的含量。’ 中国农业大学博士学位论文第三章通过通路上调从而导致上升有报道发现,通路可以调控通路,那么对上调的贡献是否是通过间接调控了通路而实现的,通路的激活以的憐酸化为标志。因此我们通过检测了各种抑制剂处理后,的憐酸化水平。如图所示,我们可以看到感染后能够显著上调的憐酸化水平,抑制剂)能够完全抑制掉引起的的憐酸化,而通路抑制剂显示也能够在一定程度上对的憐酸化水平有所抑制,这暗示通路抑制剂有可能是通过间接抑制通路来下调所上调的。：￡“图诱导表达依赖通路蛋质免疫印迹检测不同抑制剂处理后,细胞中总和憐酸化蛋白水平表达水平。在证明是参与上调的主要通路后,我们想进一步知道感染后细胞内的憐酸化水平如何变化。在感染后、、、、和收取细胞总蛋白,检测变化情况,同时检测总作为对照。我们发现,在感染后,的隣酸化水平开始上调一直持续到,在略有下降。与此同时细胞内总的量是不变的(图。为了进一步证实在上调中的重要作用,我们用梯度浓度的对进行预处理,然后接毒感染。感染后,检测细胞中、的蛋白表达水平。结果如图所示,能够显著抑制所引起的的隣酸化,同时伴随着蛋白水平的下调。 中国农业大学博士学位第三章通过通路上调从而导致上升⑻—編,■參■图能够有效激活信号通路在中的表达用的感染细胞,在感染后、、、、和提取细胞总蛋白,检测和的蛋白变化。(分别用,或的提前预处理接毒后收取细胞总蛋白,检测细胞内、和的蛋白水平。,,,猪启动子的克隆和序列分析猪启动子的克隆和序列分析通过之前的结果,我们知道能够通过通路诱导表达升高,为了进一步了解对的转录调控机制,我们对猪启动子序列进行克隆。根据猪义在序列号中的序列,设计特异性引物,成功克隆出长度为的片段,并通过生物信息学方法(对启动子上存在的转录因子结合位点进行分析,我们在这段启动子上预测到几个转录因子可能结合的基序,结果如图。以转录起始位点为,包括的上游区域和到的下游区域,在这段区域中最可能结合的转录因子包括以下几种、、、和在—为可能结合的基序,—为结合的基序,以及存在可能结合的基序。 中国农业大学博士学位论文第三章通过通路上调从而导致上升丁了■图猪启动子克隆与分析克隆长度为的猪启动子并进行测序。并通过生物信息学软件分析启动子上含有的转录因子结合位点。得到的转录因子结合序列如框所示。序列的位置以转录起始位点为。通过区域激活启动子为了检测启动子活性和刺激哪一段启动子区域激活转录,我们对己克隆启动子进行不同长度的截短突变并构建进载体,在得到不同长度截短突变的启动子焚光素酶报告载体后(图,与对照海肾质粒一同转入细胞中,然后用病毒进行感染,检测对不同长度的启动子的激活情况。如图所示：在病毒刺激后(±较不接毒组启动子活性(±上调,而当转入的启动子长度为时,接毒组和未接毒组之间启动子活性没有变化,说明不能激活长度启动子,除此之外转入及均不能被激活。通过该结果说明,启动子区域为应答区域,在区域中存在某些转录因子可以结合的基序,通过该基序激活启动子。 中国农业大学博士学位第三章通过通路上调从而导致上升繼續卿圳——十丨■—勘找丨图通过区域激活启动子图示对启动子进行一系列截短突变,构建的一系列不同长度启动子焚光素酶报告载体。黑色长方形代表转录起始点。(将上述报告载体分别转染细胞系,后感染毒株。在感染后后收细胞进行活性检测。—结合启动子上基序之前的研究结果显示,在启动子的之间存在某些转录因子可以结合的位点,而可以通过该转录因子激活启动子活性,从转录水平上调的表达。并且通过图的生物信息学分析,我们可以看到在区域存在两个转录因子可以结合的基序,包括可能结合的基序),—结合的基序)。而图的结果显示,通路抑制剂(并不能够抑制所上调的的水平,所以推测不能通过激活上调启动子活性。那么结合以上实验结果,我们认为可能通过激活启动子,为了验证我们的假设,我们通过将可能结合的基序—进行双点突变,以封闭这一段可能结合基序的结合活性。然后通过双焚光素酶报告载体实验检测这段基序在激活启动子中的应答。如图所示,能够激活长度的启动子,但是将突变后,接毒组与不接毒组的启动子活性相同,即不能再激活启动子。通过该结果我们认为通过作用于启动子从而上调的水平。 中国农业大学博士学位论文第三章通过通路上调从而导致上升—丨■丨一「—！图激活结合基序将启动子上预测的结合基序突变,构建焚光素酶报告载体,然后分别向中转染突变及不突变载体(接毒(,感染后收集细胞进行焚光活性检测。,与启动子直接结合通过之前的结果我们可以发现在的启动子上存在一个基序,可以通过该基序上调启动子活性,生物信息学技术分析表明该基序可能结合的转录因子为,那么我们想知道是否的确能够与的启动子结合,且图所转染的细胞系都为细胞,所以我们通过染色质免疫共沉淀实验来验证感染后,在中转录因子是否能够与相应的启动子区域结合。如图所示；我们可以看到,在感染后,的确能够结合启动子区域上,并且结合的基序位于在到这段启动子区域。这与前面的预测及双焚光素酶报告载体实验结果相一致,证明了在的启动子上存在可以结合的基序,且感染细胞后可以通过与该基序的结合上调启动子活性,从而在转录水平调控的表达。 中国农业大学博士学位第三章通过通路上调从而导致上升》——与启动子直接结合后动子直接结合。感染,后如材料方法所示进行实验。检测启动子序列。通过诱导憐酸化来激活表达感染后能够引起碟酸化之前的研究表明作用于对转录水平的调控,并且有在其他模型中有参与调控的报道(。而对于在调控中的作用暂时没有报道。我们想知道在感染后如何调控的活化,我们在,感染后、、、、和收取细胞总蛋白,检测总蛋白内的隣酸化水平和的变化,如图,我们看到感染后,细胞总蛋白中的的含量从开始升高,这种升高趋势一直持续到感染后时明显下降,与此同时我们看到细胞内总的的水平没有变化。作为一个转录因子,需要在核内结合到相应的启动子上从转录水平对相应基因进行调控。所以我们将总蛋白进行核质分离,分别检测细胞核及细胞质中和的蛋白水平变化。结果如图,我们可以看到,在感染早期,开始核内的的磷酸化水平就开始上调,一直到感染后上升趋势更为明显。同时细胞质内的在感染早期开始上升,到感染后,然后开始出现下降。这些结果表明,感染后能够上调的磷酸化水平,使其被激活,活化后的定位于核内,调控其祀基因的转录。 中国农业大学博士学位论文第三章通过通路上调从而导致上升同时为了更加直观看到如何激活,以及于核内的定位情况,我们采用激光共聚焦的技术,观察感染后及时在细胞内的分布情况。如图,我们看到在感染寸,在细胞质和细胞核中都有分布这与之前的研究报道结果相一致,在感染后,基本都位于核内。激光共聚焦结果与结果是一致的。邏嗎應■■■巳■■■■■■图感染后激活感染、、、、、后收集细胞总蛋白(最上)以及分胞质(最下)和胞核蛋由(中间)■检测和的表达水平。、、分别代表总蛋白、核蛋白以及胞质蛋白。(激光共聚焦检测定位情况。感染后利用特异性抗体进行间接免疫突光染色。‘ 中国农业大学博士学位第三章通过丨通路上调〗从而导致卜升处于信号通路的下游有报道称通路可以调控的憐酸化那么在我们的感染体系中,是否是通过对进行调控。我们用预处理细胞,然后进行接毒,在感染后收取细胞总蛋白,检测的变化情况。从图中可以看到,感染后后能显著上调细胞中的憐酸化水平,预处理过后会被下调,在浓度为时能够轻微调的磷酸化水平,浓度为时对下调更明显。以上结果结合前面信号通路抑制实验表明是蛋白激活的上游。泰十图抑制剂抑制的表达、、或的抑制剂预处理,感染。后收集细胞总蛋白,利用特异性抗体检测蛋白表达水平。,通过激活蛋白的表达前面的实验表明感染能够激活并入核。那么是否真的影响了的表达呢？为了进步确认在上调中的作用,我们设计了三条针对的特异性三条以的比例转染细胞,同时转染的序列。于转染后、收取细胞总以及总蛋白,通过检测的沉默效率,并同时检测蛋白、的表达水平。如图所示,转染的在有效抑制了的水平。同时特异性抗体检测蛋白发现,的特异性还显著抑制了其蛋白水平的表达,且干扰效率良好,持续时间到,可用于下一步检测实验(图】。图显示,的特异性 中国农业大学博士学位论文第三章通过通路上调从而导致上升显著下调了诱导的表达。这一结果表明在诱导的表达过程中具有重要的作用。干扰后蛋白表达受到抑制。以上实验表明,通过激活的蛋白表达。抑制明显削弱了的水平。而激活的则通过结合在的启动子序列上,增强的转录表达。通过的特异性干扰显著抑制的表达,明显下调诱导的蛋白。今思睡。一——訓雄酬補一■图通过激活蛋白的表达检测的干扰效率。(特祥性抗体检测的干扰效率。转染后,检测蛋白水平。 中国农业大学博士学位第三章通过通路上调从而导致上升讨论本研宄中,我们首次发现能够在体内体外诱导致热源的产生。进一步的研究发现上调了中的表达,抑制显著削弱诱导的的分泌。而对其分子机制的探讨表明,通过激活信号通路,激活的入核后结合在启动子序列上,促使表达增强和其产物：：分泌的增加。抑制或者干扰卩都会显著降低的表达。导致致热源的分泌增加尤其是高致病性以诱发高热不退为典型特征。研宄显示,感染弱毒株或株的病猪会出现短时间的发热,呼吸困难等现象；而感染了强毒株的猪症状更严重：嗜睡,食欲减退,呼吸困难,高热超过并持续数天不退。然而诱导发热的具体机制目前还没有报道。因此成为本研究最关心的问题。我们发现感染小猪后,能够诱导血清和中含量大量增加。在肺部生理、病理过程、发热中发挥重要的作用,。先前的研宄显示局部组织如肺部来源释放的通过血液循环进入大脑的下丘脑,激活位于视前叶室旁核的神经元细胞的受体之一),导致生热作用和发热的发生与这些报道一致的是,检测发现感染后小鼠血清中的的升高,这与发热是一致的,进而统计发现体温越高的小猪,死亡时间越早,暗示血清中的升高与小鼠死亡的相关性。也说明对于小猪发热和肺部病理特征的产生具有一定的作用。发热是宿主抵抗病原体入侵的早期屏障之一。发热是把双刃剑,发热在一定范围内可能有利于增强免疫系统功能,清除病原体。中高度以上的发热可能暂时影响大脑功能,持续高热或发生超高热,生物体内的酶会失去活性,从而导致重要代谢过程受阻而死亡。有趣的是,检测发现的另一个毒株相比于,其诱导中的产生能力要薄弱。这也与在临床上虽然能诱导发热但是体温和临床症状都要比感染轻微相一致。这就解释了为什么毒株导致发热更轻微。上调而不是并促进的分泌感染细胞后显著上调了的和蛋白水平。预处理的抑制剂可以完全削弱诱导表达的水平。也进一步验证了的确是诱导产生的关键酶。是合成途径中的关键限速酶。正常情况细胞不表达或者很低水平的表达。当受到外界刺激信号时,蛋白水平会在几个小时就快速上升另一方面,因其组成型表达在大部分细胞和组织中,常被认为是一个持家基因,在一些正常的生理功能中具有重要作用。 中国农业大学博士学位论文第三章通过通路上调从而导致上升然而近年来有报道发现也能在受到刺激的情况下上调表达,并在诱导的产生过程中具有重要功能,。举例来说,流感病毒感染小鼠第天,发现蛋白上调控制的分泌,进而调控发热反应。蛋白缺失的小鼠会在巨嘴细胞中旁路开发一条途径,参与血管通透性的增加,。越来越多的证据表明,这两种酶的表达模式已经不简简单单只是组成型和诱导型那么单一。在本文的研宄中,还发现在高浓度情况下仍旧未能够完全封闭的分泌。这暗示诱导的上调不仅仅依赖可能还有别的蛋白参与其中。另外有报道显示流感病毒通过、、刺激的产生。像以及其他可能的分子是否参与了诱导的还需要接下来进一步阐明。在不同的刺激条件和细胞类型上,这种与的界限也越来越模糊。蛋白表达结果表明细胞中存在基底表达的,而且中也有一定水平的分泌。而且中的含量也明显高于血清中的水平。肺部是产生和发挥功能的重要紀部位。在肺部的含量也常常高于其他组织,提示在正常生理条件下,肺部中一定程度的可能对于肺部生理功能的维持具有有益的作用。和副粘病毒感染时,攻可被强烈诱导。除了在炎性部位的诱导外,还组成表达在脑部、皮质、肾脏和肺部。但是在本研究中却发现一定程度上反而下调了中的表达。有趣的是,另一篇相关报道显示刺激星形胶质细胞产生中,上调了同时下调了的表达。而在细胞中增强的表达也能抑制的产生。说明和的表达之间可能存在相互措抗的关系。而且在我们的研宄中,发现的上调也的确早于的下降。然而的下降对于诱导的分泌具有怎样的作用还很不清楚,需要进一步的探讨。通过途径激活利用不同信号途径的抑制剂检测和水平,实验显示,诱导中和的增加是通过通路的。很多刺激条件下,在的产生过程都具有重要的作用。磷脂酰丝氨酸脂质体激活小胶质细胞中的产生就是通过刺激信号而不是而在人的肺上皮细胞上,刺激蛋白酶激活受体后通过的途径激起的表达分泌(。然而我们的结果还发现,利用和抑制剂同样也能够显著抑制约水平的含量。提升两条信号通路可能还通过别的途径参与了的增加。是蛋白的下游分子,利用抑制剂的确能够下调蛋白表达水平,这有可能就是为什么抑制也能够下调诱导的分泌的原因。另一方面,抑制剂没能抑制了的平,却明显抑制了蛋白水平和的分泌。后续相关机理的研宄还需要进行。 中国农业大学博士学位第三章通过通路上调从而导致上升通过克隆猪的启动子序列,发现激活启动子区域的基序,促进的表达。染色质免疫共沉淀也证明与启动子的直接或间接结合。说明能够在转录水平上调控的表达。研宄显示感染时,的确能够在转录水平调节蛋白的表达水平。虽然本研究看到与启动子区域可以结合,然而是如何结合到启动子区域上的,又是具体怎么调节转录的,还需要进一步研究。总的来说,本研究首次证明和发现诱导发热的初步分子机制。通过信号途径促进的大量表达,参与重要生理功能。然而本研究还有很多不足以及很多问题亟待解决。、在诱导的作用还没有做更深入的探讨。信号通路前后是否还有其他分子参与？是如何入核的？在感染细胞后,通过什么病毒蛋白激活了信号通路？这个问题的回答是否能够解释毒株致热作用轻微的原因。的产生对于感染肺部促进组织损伤具有怎样作用还需要在体内进一步探讨。对这些问题的回答将有助于理解的病原学,以及更好的理解病毒与宿主的相互作用关系。也为其他呼吸道病毒感染机制研究提供有价值的线索。 中国农业大学博士学位论文结论结论、感染后小猪体温与死亡时间具有明显的相关性,病毒感染能够诱导大量表达。体内实验也发现能够诱导血清和中表达大量增加。、感染后显著上调了的和蛋白水平。预处理的抑制剂强烈抑制了诱导表达的水平。也进一步验证了的确是诱导产生的关键酶。、利用不同信号途径的抑制剂检测和水平,显示诱导中和的增加是通过通路的。而通过实验、、干扰实验等发现通过激活的磷酸化,进而活化的入核结合在启动子序列上增强的表达水平。、本研究结论总结如下图所示：—— 中国农业大学博士学位 中国农业大学博士学位论文参考文献参考文献,丄”,,,,,,,,”,”,”,,,,,,,,,,””,,,,,,,,,,”,,,,,,,,,,,,”,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,””,”,,,,,,,,,,”,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,”,’,—, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,”,,,,,,,,,,,,,”,,,〗,,,,,,,,”,,,,,,,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,”,”””,,,,,,,,,,”,,,,,,,,,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,”,,,,,,”,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,”,”,,”,,,,”,”,,,,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,,”,,,,,,,”,”,’,,””’,”、,,,,,,,,”,,,,,”,,,,,,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,””,,””,,,,,,,,”,”,,,,,,,,,,,,,”,,,,,”,,,””,,”,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,”,’,,”,,,,,,,,,”,”,,,,””,,,’,,”,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,”,,,”,”,,,””,,,,,”,,,,,””,,”,,,,,,,”,,,”,,,,,,”,,’,”,,,,” 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,,,”,,”,,,,,,”’,,,,,,,”,,,,,,,’,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,””,,,,,,,,,,,,,,””,,,,”,,”,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,” 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,,,,”,,,,”,,,,,,,,,,,,,,,,,”,,,,,,,,’,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,,,,,,,,,,,,,,”,,,,,,,,,,,”,,,”,,,,,,,”, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,”,,,,,,,,,,,,”,,”,,,,,,,,,”,”,,,,,,,,””,”,”,,,’,,,,,,,,,,,” 中国农业大学博士学位论文参考文献”,,”,,,,,,,,,”,,,,,,,,,,,,,,,,,”,”,,,,,”,,,,,,,,,,,,,,””,,” 中国农业大学博士学位论文参考文献,,”,,,,,,,,,,,,,,,,,”,,,,,,,,”””,,,,,,,,,”,,,,,,— 中国农业大学博士学位论文致谢致谢这五年是我成长中的一个重要阶段,感谢在这五年中陪我成长的所有人。首先要感谢的是我的老师封文海教授,感谢您在五年前给我了一个机会,能让我有幸成为实验室的一员。几年来,封老师提供了一个自由宽松的科研环境,鼓励创新和探索,从课题的立题到实验设计和文章写作都给予了大力支持。从导师身上不仅学到了做科研的基本内涵,老师平易近人、乐于奉献、宽以待人的品质也点滴影响着我。感谢老师对我在第一次中期考核未通过后的理解和鼓励。在此感谢封老师的辛勤培养和谆谆教导。有一件事,我在此要特别提出。由于我的睡眠很不好,曾经一度因为这件事情想转硕,在我最困难的时候,是封老师和冯丽华老师帮我解决了这个问题,我非常感谢你们,是你们才让我在我的直博最后三年阶段专心于我的课题和实验,也同样感谢我的舍友王喜凤同学,谢谢你的体谅和帮助。再次感谢三位。感谢动物医学院的唐军教授对工作的指导和建议,还有崔迪、王占新等等,在许多实验技术方面,他们与我进行了细心的交流,特此感谢。衷心感谢我们实验室的所有同学：侯隽、全荣、傅毅、王良海、高丽、王雅兰、马志涛、刘嘉、赵海艳、陈鑫鑫、郭雪坤、张琼、杨倩、黄琛、余志彬、朱耀华、杜银萍、刘翼浩、李骏蔚、王红蕾、杜丽,是你们组成了我们这个集体,也使我农大几年的生活充满了乐趣,感谢你们的支持与帮助。衷心感谢我的家人,在你们无微不至的帮助和鼓励下,我才能顺利完成所有的学习生活,感谢你们的支持。感谢伍兵,谢谢你陪我克服了生活和工作中一个又一个的困难。最后感谢中科院和远在美国的朋友,谢谢你们帮我下文献以及对博士期间发表论文的细致修改与建议。再次向所有关心和帮助过我的人致以最诚挚的感谢！ 中国农业大学博士学位论文致谢 中国农业大学博士学位论文个人简介个人简介毕艳敏,女,生于年月,山东威海人学习经历：年月一年月山东师范大学生命科学学院大学本科年月一年月中国农业大学生物学院直博研宄生获奖情况：获年度科研成就奖。发表论文情况：,,,”,,,